substances naturelles a visee antifongique : cas particulier des
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République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique UNIVERSITE D’ORAN FACULTE DES SCIENCES DEPARTMENT DE BIOLOGIE Thèse en vue de l’obtention d’un diplôme de Doctorat en Biologie Spécialité : Biochimie INTITULEE SUBSTANCES NATURELLES A VISEE ANTIFONGIQUE : CAS PARTICULIER DES POLYPHENOLS Présentée par : Mr. Boulenouar Noureddine Sous la direction de Mr Marouf Abderrazak - Président : Belkhodja Moulay, Professeur, Université d’Oran - Directeur : Marouf Abderrazak, Professeur, Université d’Oran - Co-directeur : Cheriti Abdelkrim, Professeur, Université de Béchar - Examinateur : Mehdadi Zoheir, Professeur, Université de SidiBel Abbes - Examinateur : Belahcene Miloud, Professeur, Université de Mostaganem - Examinateur : Bennaceur Malika, Maître de Conférences, Université d’Oran Année Universitaire 2010-2011 DEDICACE To the spirit of my Mother To my Father To the person who supported me during all this research period and made lot of sacrifices “My Wife” To my sweet daughters “Sirine & Soulaf” I’m really lucky to have this family To my wife’s family To my Brothers & Sisters Noureddine BOULENOUAR I REMERCIEMENTS اﻟﺤﻤد ﷲ Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Phytochimie et Synthèse Organique (Université de Béchar) en collaboration avec Laboratoire de Biochimie Végétale et Substances Naturelles (Université d’Oran). Mes vifs remerciements vont en premier lieu aux: Professeur MAROUF Abderrazak et Professeur CHERITI Abdelkrim, pour leurs encadrement et leurs soutien qui m’ont permis de mener à bien ce travail. Je remercie les membres de Jury de m’avoir fait l’honneur d’accepter de juger cette thèse; Professeur BELKHODJA Moulay, Professeur MEHDADI Zoheir, Professeur BELAHCENE Miloud, et Dr. BENNACEUR Malika. Mes chaleureux remerciements à la personne unique au niveau du LPSO, qui donne toujours l’énergie à notre laboratoire, qui donne toujours l’aide, Dr. BELBOUKHARI Nasser. Un grand merci aux membres du Laboratoire de Phytochimie et Synthèse Organique (LPSO, Université de Béchar), spécialement Mr. FOUZI A., Mr. SEKKOUM K., Mr. BOURMITA Y. et Mme. Cheikh N. A toutes les personnes qui m’ont aidé de près ou de loin, Merci ! Noureddine BOULENOUAR II SOMMAIRE Page DEDICACE I REMERCIEMENTS II SOMMAIRE III Liste des tableaux IX Liste des figures XI Liste des abréviations XII RESUME XIV ﻣﻠﺧــﺹ XVI ABSTRACT XVIII Production scientifique XX INTRODUCTION GENERALE 1 Partie Bibliographique CHAPITRE I: PALMIER DATTIER ET BAYOUD 1. Généralités sur le Palmier dattier 5 1.1. Introduction 4 1.2. Données botaniques 4 1.3. Aire de répartition du palmier dattier 6 1.4. Données écologiques 7 1.5. Le palmier dattier en Algérie 8 1.5.1. Données agronomiques 8 1.5.2. Diversité génétique 9 1.6. Importance socio-économique 9 2. Pathologie du palmier dattier 10 2.1. Le Bayoud ou Fusariose du palmier dattier 10 2.1.1. Données historiques 11 2.1.2. Symptômes 12 2.1.3. Nuisibilité 14 III 3. Le Champignon Fusarium oxysporum f. sp. albedinis 15 3.1. Position Taxonomique et caractéristiques morphologiques 15 3.2. Caractéristiques de croissance en culture 16 3.3. Morphologie 16 3.4. Biologie 17 3.5. Test du pouvoir pathogène 18 3.6. Méthodes de détection et d’inspection 19 3.7. Moyens de déplacement et de dispersion 20 3.8. Isolement 21 3.9. Répartition géographique 21 3.10. Stratégie de lutte contre le Bayoud 21 3.11. Différentes stratégies de lutte 24 3.11.1. Lutte Chimique 24 3.11.2. Mesures Prophylactiques 25 3.11.3. Lutte Génétique 25 3.11.4. Lutte biologique 26 Conclusion 27 REFERENCES 28 CHAPITRE II: PHYTOPATHOLOGIE ET METABOLITES SECONDAIRES 1. Phytopathologie 33 1.1. Introduction 33 1.2. Maladies causées par les pathogènes telluriques 33 1.3. Mécanismes d’infection 34 1.3.1. Interaction plante/champignon 35 1.4. Les phases d’infection 36 1.5. Développement et propagation des maladies 37 1.6. Diagnostic 38 1.7. Traitement 39 1.7.1. Traitement chimique 40 1.7.2. Contrôle biologique 41 IV 1.7.3. Traitement génétique 42 1.8. Evaluation et prévision 42 1.9. Phytopathologie, entre résistance et susceptibilité 43 1.10. Mécanismes qui provoquent la susceptibilité 44 1.10.1. Enzymes 44 1.10.2. Mycotoxines 48 1.10.3. Phytoalexines et Phytoanticipines 50 1.11. Résistance aux maladies 52 1.11.1. Mécanismes de résistance 52 1.11.2. Types de résistance 54 1.11.3. Critères pour les molécules de résistance 56 2. Métabolites secondaires 56 2.1. Mode d’action des métabolites secondaires 57 2.2. Composés phénoliques 58 2.2.1. Introduction 58 2.2.2. Classification 59 2.2.3. Flavonoïdes 60 2.2.4. Tanins 61 2.2.5. Coumarines 62 2.3. Saponines 63 2.4. Alcaloïdes 64 2.5. Rôle des polyphénols dans la défense des plantes 66 2.5.1. Composés phénoliques comme phytoanticipines 66 2.5.2. Fortification de paroi cellulaire par les composés phénoliques et lignine 67 2.5.3. Effet des champignons pathogènes sur les composés phénoliques fongitoxiques 68 2.5.4. Effet des champignons pathogènes sur les composés phénoliques liés aux parois cellulaires 69 2.6. Métabolites secondaires comme mécanisme de susceptibilité REFERENCES 69 70 V Partie Expérimentale CHAPITRE I: MATERIEL ET METHODES 1. Introduction 75 2. Plantes médicinales 75 2.1. Limoniastrum feei 75 2.2. Launaeae arborescens 76 2.3. Acacia raddiana 77 2.4. Asteriscus graveolens 78 2.5. Fredolia aretioides 79 3. Plantes toxiques 80 3.1. Calotropis procera 80 3.2. Citrullus colocynthis 81 3.3. Nerium oleander 82 3.4. Pergularia tomentosa 84 4. Procédures expérimentales 85 4.1. Matériel végétal 85 4.2. Souche fongique 85 4.3. Préparation des extraits de plante 86 4.4. Essai biologique et médias utilisés 86 4.5. Effet des extraits de plantes sur la virulence de Foa 87 4.6. Criblage phytochimique et bioautographie 87 4.6.1. Criblage phytochimique 88 4.6.1.1. Chromatographie sur couche mince (CCM) 88 4.6.1.2. Mise en évidence des saponosides 89 4.6.1.3. Révélation des flavonoïdes 90 4.6.1.4. Révélation des coumarines 90 4.6.1.5. Révélation des tanins 90 4.6.1.6. Révélation des alcaloïdes 91 4.6.2. Bioautographie 91 4.7. Isolement du composé le plus actif (CCF1) par LC-UV 92 4.8. Analyse du produit CCF1 par spectroscopie infrarouge 92 VI 4.9. Analyse du produit CCF1 par spectroscopie UV-Visible 93 4.10. Effet des extraits bioactifs sur l’activité cellulasique du Foa 93 5. Criblage phytochimique et bioautographie des rachis de Phoenix dactylifera L. 93 REFERENCES 95 CHAPITRE II: RESULTATS 1. Plantes médicinales 98 1.1. Rendement d'extraction 98 1.2. Test antifongique 98 1.3. Test de virulence 101 2. Plantes toxiques 102 2.1. Rendement d'extraction 102 2.2. Test antifongique 104 2.3. Test de virulence 105 3. Criblage phytochimique 107 3.1. Caractérisation des flavonoïdes 107 3.2. Caractérisation des tanins 110 3.3. Caractérisation des coumarines 111 3.4. Caractérisation des alcaloïdes 114 3.5. Caractérisation des saponosides 114 4. Bioautographie 119 5. Corrélation entre résultats de bioautographie et résultats du criblage phytochimique 120 6. Analyse du produit CCF1 par spectroscopie IR 120 7. Analyse du produit CCF1 par spectroscopie UV-Visible 123 8. Effet sur l’activité cellulasique du Foa 124 9. Criblage phytochimique des extraits de rachis des cultivars de palmier dattier 125 9.1. Caractérisation des flavonoïdes 125 9.2. Caractérisation des tanins 125 9.3. Caractérisation des coumarines 128 VII 9.4. Caractérisation des alcaloïdes 130 9.5. Caractérisation des saponosides 130 10. Bioautographie des extraits de rachis des cultivars de palmier dattier 130 CHAPITRE III: DISCUSSION 1. Plantes médicinales 131 1.2. Efficacité d’extraction 131 1.2. Effet antifongique 132 1.3. Test de virulence 133 2. Plantes toxiques 134 1.1. Efficacité d’extraction 134 1.2. Effet antifongique 135 1.3. Test de virulence 136 3. Criblage phytochimique 138 4. Bioautographie 140 5. Analyse spectroscopique du produit CCF1 142 6. Effet sur l’activité cellulasique du Foa 142 7. Criblage phytochimique et bioautographie des extraits des rachis 143 7.1. Criblage phytochimique 143 7.2. Bioautographie 144 REFERENCES 146 CONCLUSION & PERSPECTIVES 153 ANNEXES 154 VIII Liste des Tableaux N° Titre Page 1 Enzymes fongiques impliquées dans la dégradation des parois végétales. 46 2 Quelques fonctions des phénylpropanoïdes. 60 3 Classification des composés phénoliques. 62 4 Les plantes médicinales testées et leurs parties utilisées. 87 5 Les plantes toxiques et/ou médicinales testées et leurs parties utilisées. 87 6 Les extraits de plantes médicinales soumis au criblage phytochimique et bioautographie. 7 90 Les extraits de plantes toxiques soumis au criblage phytochimique et bioautographie. 91 8 Rendement d’extraction (%) à partir du poids sec de plante 101 9 Activité antifongique des extraits de plantes sur Fusarium oxysporum f. sp. albedinis comme diamètre de zone d’inhibition (mm). 103 10 Effet des extraits de plantes sur la virulence relative du Foa. 105 11 Rendement d’extraction (%) par rapport aux poids sec de la plante. 107 12 Effet antifongique des extraits des plantes toxiques et/ou médicinales sur Fusarium oxysporum f. sp. albedinis comme diamètre de zone d’inhibition (mm). 109 IX 13 Effet des extraits de plantes sur la virulence relative de Fusarium oxysporum f. sp. albedinis (sur tissus de tubercule de pomme de terre). 111 14 Caractérisation des flavonoïdes sur les chromatogrammes des extraits de plantes. 112 15 Caractérisation des tannins sur les chromatogrammes des extraits de plantes. 113 16 Caractérisation des coumarines sur les chromatogrammes des extraits de plantes. 116 17 Caractérisation des alcaloïdes sur les chromatogrammes des extraits de plantes. 117 18 Caractérisation des saponosides par l’indice de mousse (IM). 121 19 Corrélation entre Bioautographie et Criblage phytochimique des extraits bioactifs sur Foa. 122 20 Bandes d’absorption IR du produit CCF1 124 21 Effet des extraits bioactifs sur l’activité cellulasique du Foa. 126 22 Caractérisation des flavonoïdes dans les extraits des rachis de palmier dattier. 128 23 Caractérisation des tanins dans les extraits des rachis de palmier dattier. 129 24 Caractérisation des coumarines dans les extraits des rachis de palmier dattier. 130 25 Caractérisation des alcaloïdes dans les extraits des rachis de palmier dattier. 131 26 Effet antifongique sur Fusarium oxysporum f. sp. albedinis des extraits de rachis de cultivars de palmier dattier (400 µg) par bioautographie directe. X 132 Liste des Figures N° Titre Page 1 Schéma d’un palmier dattier (Phoenix dactylifera L.). 6 2 Dispersion unilatérale des symptômes sur les palmes de la couronne 14 3 Distribution et dispersion du Bayoud en Algérie et Maroc 22 4 Répartition géographique du Bayoud dans le monde 23 5 Photo de Limoniastrum feei. 78 6 Photo de Launaeae arborescens. 79 7 Photo de Acacia raddiana. 80 8 Photo de Asteriscus graveolens. 81 9 Photo de Fredolia aretioides. 82 10 Photo de Calotropis procera. 83 11 Photo de Citrullus colocynthis. 84 12 Photo de Nerium oleander. 85 13 Photo de Pergularia tomentosa. 86 14 Spectre infrarouge du produit CCF1 125 15 Structure chimique de Cucurbitacine 144 XI Liste des Abréviations ADN: Acide DésoxyriboNucléique. AE: Acétate d’éthyle. ANOVA: Analyse de la variance. AMPc: Adénosine MonoPhosphate cyclique. CCM: Chromatographie sur Couche Mince. CDA: Czapek-Dox Agar CIHEAM: Centre International des Hautes Etudes Agronomiques Méditerranéennes. CWDEs: Cell Wall Degrading Enzymes (Enzymes dégradantes de la paroi cellulaire) DCM: Dichlorométhane. FAO: Food and Agriculture Organization. Foa: Fusarium oxysporum f. sp. albedinis IAPSC: Inter-African Phytosanitary Council. IM: Indice de mousse. INPV: Institut National de la Protection des Végétaux. ITAS: Institut Technique d'Agronomie Saharienne. IUCN: International Union for Conservation of Nature. LPSO: Laboratoire de Phytochimie et Synthèse Organique (Université de Béchar). PCR: Polymerase Chain Reaction PDA: Potatoes Dextrose Agar PDB: Potatoes Dextrose Broth. PK A: Protéine Kinase A. PTN: Poids du Tissu Nécrosé. RAPD-PCR: Random Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain Reaction. Rf: Rapport frontal. RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism. RSA: Résistance Systématique Acquise. RSI: Résistance Systématique Induite. SNA: Synthetic Nutrient poor Agar. LC-UV: Chromatographie Liquide couplée à l’absorbance en Ultra Violet. mm: Millimètre ND: Non Détecté(e). XII OEPP: Organisation Euro-méditerranéenne de la Protection des Plantes. UE: Union Européenne. UNESCO: United Nations Educational, Scientific and Cultural Organization. UV: Ultra-Violet. VR: Virulence Relative. ∅: Diamètre de la zone d’inhibition. XIII RESUME Titre Substances Naturelles à Visée Antifongique: Cas particulier des polyphénols Présenté par Mr. Noureddine BOULENOUAR Encadreur Prof. Dr. Abderrazak MAROUF Co-Encadreur Prof. Dr. Abdelkrim CHERITI Dans la présente étude, neuf plantes du Sahara algérien (sud-ouest d'Algérie); cinq plantes médicinales: Acacia raddiana, Asteriscus graveolens (Forsk.), Limoniastrum feei, Fredolia aretioides Moq. et Coss., Launeae arborescens (Batt.) Murb.; et quatre plantes toxiques: Citrullus colocynhis (L.) Schrad, Calotropis procera Ait., Nerium oleander, Pergularia tomentosa. Deux parties de chaque plante ont été utilisées pour évaluer leurs extraits (extraction à reflux par quatre solvants: méthanol, acétate d’éthyle, dichlorométhane, hexane) pour l’activité antifongique sur Fusarium oxysporum f. sp. albedinis (Foa), l’agent causal de la maladie la plus grave du palmier dattier (Phoenix dactylifera L.). L’évaluation préliminaire a été réalisée par la technique de diffusion par disque et la virulence sur le tissu des tubercules de pomme de terre. Les extraits présentant une inhibition et/ou diminution de la virulence relative au dessous de 50 % ont subis un criblage phytochimique et une bioautographie directe. La bioautographie a été utilisée pour localiser l’activité antifongique sur le chromatogramme et étudier sa corrélation avec les données du criblage phytochimique. Les extraits bioactifs ont été testés sur l’activité cellulasique du Foa. En plus, les extraits des rachis de huit cultivars de palmier dattier ont été analysés par criblage phytochimique et bioautographie directe sur le Foa. Parmi soixante-douze extraits de plantes médicinale et/ou toxiques, trente un ont été choisis pour criblage phytochimique et bioautographie (17 extraits de plantes médicinale et XIV 14 extraits de plantes toxiques). Seulement sept extraits (22.58 %) ont présenté au moins une zone d’inhibition sur le chromatogramme. Les meilleurs résultats ont été présentés par l’extrait par acétate d’éthyle des fruits de Citrullus colocynthis (7.75 ± 1.06 mm) et des tiges d’Asteriscus graveolens (7.00 ± 1.41 mm). Le criblage phytochimique a mis en évidence la présence de flavonoïdes, tannins, coumarines, et alcaloïdes chez toutes les plantes étudiées. La présence des saponosides n’a été confirmée que pour Fredolia aretioides. La corrélation entre criblage phytochimique et bioautographie a démontré que les composés responsables de l’activité antifongique sont des polyphénols dans certains cas et des alcaloïdes ou autres métabolites secondaires dans d’autres cas. L’inhibition de l’activité cellulasique n’est pas toujours été liée à l’inhibition de la croissance. D’après les analyses chromatographiques et spectroscopiques, le composé le plus actif « CCF1 » isolé à partir des fruits de Citrullus colocynthis est probablement la cucurbitacine E. Parmi trente-deux extraits des rachis de cultivars de palmier dattier, huit extraits de six cultivars ont présenté au moins une zone d’inhibition. Les meilleurs résultats sont représentés par l’extrait dichlorométhanique des rachis du cultivar « Bent-Cherk » (6.50 ± 1.41) et l’extrait par acétate d’éthyle des rachis du cultivar « Rotbi » (6.00 ± 1.41). Les cultivars de palmier dattier ont présenté certaines similarités concernant la présence, l’absence et nombre de composés des métabolites secondaires testés. La corrélation entre criblage phytochimique et bioautographie montre que la majorité des composés, bioactifs sur le Foa, semblent être des polyphénols. Le caractère de résistance, tolérance ou sensibilité n’a pas affecté significativement les résultats du criblage phytochimique ni la bioautographie. Donc, le mécanisme de défense naturel, in vivo, contre le Foa est majoritairement lié à l’action des polyphénols. La différence entre les cultivars résistants, tolérants ou sensibles serait donc liée au mécanisme d’action. Mots clés: Palmier dattier, Bayoud, Fusarium oxysporum f. sp. albedinis, plantes médicinales, plantes toxiques, polyphénols, antifongique. XV ﻣﻠﺧــﺹ اﻟﻌﻨﻮان ﻣﻭﺍﺩ ﻁﺑﻳﻌﻳﺔ ﻟﻬﺩﻑ ﻣﺿﺎﺩ ﻓﻁﺭﻱ :ﺣﺎﻟﺔ ﻣﺗﻌﺩﺩﺍﺕ ﺍﻟﻔﻳﻧﻭﻝ إﻋﺪاد ﺍﻟﺳﻳﺩ ﺑﻭﻟﻧﻭﺍﺭ ﻧﻭﺭ ﺍﻟﺩﻳﻥ اﻟﻤﺸﺮف: ﺃ.ﺩ .ﻣﻌﺭﻭﻑ ﻋﺑﺩ ﺍﻟﺭﺯﺍﻕ اﻟﻤﺸﺮف اﻟﻤﺸﺎرك ﺃ.ﺩ .ﺷﺭﻳﻁﻲ ﻋﺑﺩ ﺍﻟﻛﺭﻳﻡ ﻓﻲ ﻫﺫﺍ ﺍﻟﺑﺣﺙ ،ﺗﻡ ﺩﺭﺍﺳﺔ ﺗﺳﻊ ﻧﺑﺎﺗﺎﺕ ﻣﻥ ﺍﻟﺻﺣﺭﺍء ﺍﻟﺟﺯﺍﺋﺭﻳﺔ )ﺍﻟﺟﻧﻭﺏ ﺍﻟﻐﺭﺑﻲ( ،ﺧﻣﺱ ﻧﺑﺎﺗﺎﺕ ﻁﺑﻳ َﺔLimoniastrum feei, Fredolia aretioides Moq et Coss, Launeae : arorescens (Batt) Murb, Acacia raddiana, Asteriscus graveolens (Forsk), ﻭ ﺃﺭﺑﻊ ﻧﺑﺎﺗﺎﺕ ﺳﺎﻣﺔCitrullus colocynthis (L) Schrad, Calotropis procera : ،Ait, Nerium oleander, Pergularia tomentosa.ﺗﻡ ﺍﺳﺗﺧﺩﺍﻡ ﺟﺯﺋﻳﻥ ﻣﻥ ﻛﻝ ﻧﺑﺗﺔ ﻟﺩﺭﺍﺳﺔ ﻣﺳﺗﺧﻠﺻﺎﺗﻬﺎ ﻛﻣﺿﺎﺩ ﻓﻁﺭﻱ ﺿﺩ )Fusarium oxysporum f. sp. albedinis (Foa ،ﺍﻟﻌﺎﻣﻝ ﺍﻟﻣﺳﺑﺏ ﻷﺧﻁﺭ ﻣﺭﺽ ﻋﻧﺩ ﺍﻟﻧﺧﻳﻝ >ﺍﻟﺑﻳﻭﺽ< .ﺍﻟﺗﻘﻳﻳﻡ ﺍﻟﻣﺑﺩﺋﻲ ﺗﻡ ﺑﺗﻘﻧﻳﺔ ﺍﻻﻧﺗﺷﺎﺭ ﻣﻥ ﺍﻷﻗﺭﺍﺹ ﻭ ﺍﻟﻘﺩﺭﺓ ﺍﻟﺳﻣﻳﺔ ﻋﻠﻰ ﻧﺳﻳﺞ ﺩﺭﻧﺎﺕ ﺍﻟﺑﻁﺎﻁﺎ .ﺍﻟﻣﺳﺗﺧﻠﺻﺎﺕ ﺍﻟﺗﻲ ﺃﻋﻁﺕ ﺗﺛﺑﻳﻁﺎ ﻭ /ﺃﻭ ﺃﻧﻘﺻﺕ ﺍﻟﻘﺩﺭﺓ ﺍﻟﺳﻣﻳﺔ ﺍﻟﻧﺳﺑﻳﺔ ﺇﻟﻰ ﺃﻗﻝ ﻣﻥ ) (%50ﺗﻡ ﺩﺭﺍﺳﺗﻬﺎ ﺑﻭﺍﺳﻁﺔ ﺍﻟﺗﺣﻠﻳﻝ ﺍﻟﻔﻳﺗﻭﻛﻣﻳﺎﺋﻲ ﻭ /ﺃﻭ ﺍﻟﻔﺻﻝ ﻣﻊ ﺩﺭﺍﺳﺔ ﺍﻟﺗﺄﺛﻳﺭ ﺍﻟﺣﻳﻭﻱ " ."Bioautographieﺗﻡ ﺍﺳﺗﺧﺩﺍﻡ " "Bioautographieﻟﺗﺣﺩﻳﺩ ﻣﻭﻗﻊ ﺍﻟﻣﻭﺍﺩ ﺍﻟﻣﺿﺎﺩﺓ ﻟﻠﻔﻁﺭ Foaﻋﻠﻰ ﺻﻔﻳﺣﺔ ﺍﻟﻔﺻﻝ ﻭﺭﺑﻁﻬﺎ ﻣﻊ ﻣﻌﻁﻳﺎﺕ ﺍﻟﺩﺭﺍﺳﺔ ﺍﻟﻔﻳﺗﻭﻛﻳﻣﻳﺎﺋﻳﺔ .ﺗﻣﺕ ﺩﺭﺍﺳﺔ ﺗﺄﺛﻳﺭ ﺍﻟﻣﺳﺗﺧﻠﺻﺎﺕ ﺍﻟﺑﻳﻭﻓﺎﻋﻠﺔ ﻋﻠﻰ ﺍﻷﻧﺯﻳﻣﺎﺕ ﺍﻟﻣﺣﻠﻠﺔ ﻟﻠﺳﻠﻳﻠﻭﺯ .ﺇﺿﺎﻓﺔ ﺇﻟﻰ ﺫﻟﻙ ،ﺗﻡ ﺩﺭﺍﺳﺔ ﻣﺳﺗﺧﻠﺻﺎﺕ ﺍﻟﻌﺭﻕ ﺍﻟﻭﺳﻁﻲ ﻷﻧﻭﺍﻉ ﻣﻥ ﻧﺧﻳﻝ ﺍﻟﺑﻠﺢ ﺑﺎﻟﺗﺣﻠﻳﻝ ﺍﻟﻔﻳﺗﻭﻛﻳﻣﻳﺎﺋﻲ ﻭ ﺍﻟﻔﺻﻝ ﻣﻊ ﺩﺭﺍﺳﺔ ﺍﻟﺗﺄﺛﻳﺭ ﺍﻟﺣﻳﻭﻱ " "Bioautographieﻋﻠﻰ .Foa ﻣﻥ ﺑﻳﻥ ﺇﺛﻧﺎﻥ ﻭ ﺳﺑﻌﻭﻥ ﻣﺳﺗﺧﻠﺹ ﻣﻥ ﺍﻟﻧﺑﺎﺗﺎﺕ ﺍﻟﻁﺑﻳﺔ ﻭ /ﺃﻭ ﺍﻟﺳﺎﻣﺔ ،ﺗﻡ ﺍﺧﺗﻳﺎﺭ ﻭﺍﺣﺩ ﻭﺛﻼﺛﻭﻥ ﻣﺳﺗﺧﻠﺹ ﻟﻠﺗﺣﻠﻳﻝ ﺍﻟﻔﻳﺗﻭﻛﻳﻣﻳﺎﺋﻲ ﻭ ") "Bioautographieﺳﺑﻌﺔ ﻋﺷﺭ ﻣﺳﺗﺧﻠﺹ ﻣﻥ ﺍﻟﺑﺎﺗﺎﺕ ﺍﻟﻁﺑﻳﺔ ﻭ ﺃﺭﺑﻌﺔ ﻋﺷﺭ ﻣﺳﺗﺧﻠﺹ ﻣﻥ ﺍﻟﻧﺑﺎﺗﺎﺕ ﺍﻟﺳﺎﻣﺔ( .ﻓﻘﻁ ﺳﺑﻌﺔ ﻣﺳﺗﺧﻠﺻﺎﺕ ) (22,58 %ﺍﻟﺗﻲ ﺃﻅﻬﺭﺕ ﻣﻭﻗﻊ XVI ﺗﺛﺑﻳﻁ ﻭﺍﺣﺩ ﻋﻠﻰ ﺍﻷﻗﻝ ﻋﻠﻰ ﺻﻔﻳﺣﺔ ﺍﻟﻔﺻﻝ .ﺃﻓﺿﻝ ﺍﻟﻧﺗﺎﺋﺞ ﻗﺩﻣﺕ ﻣﻥ ﻣﺳﺗﺧﻠﺹ ﻓﻭﺍﻛﻪ ﺍﻟﺣﻧﻅﻝ " "Citrullus colocynthisﺑﺄﺳﻳﺗﺎﺕ ﺍﻷﻳﺛﻳﻝ ) 1,06 ±7,75ﻣﻠﻡ( ﻭ ﻣﺳﺗﺧﻠﺹ ﺳﻳﻘﺎﻥ "ﺍﻟﻁﻔﺱ" " "Asteriscus graveolensﺑﺄﺳﻳﺗﺎﺕ ﺍﻻﻳﺛﻳﻝ )1,41,± 7,00ﻣﻠﻡ( .ﺃﻅﻬﺭ ﺍﻟﺗﺣﻠﻳﻝ ﺍﻟﻔﻳﺗﻭﻛﻳﻣﻳﺎﺋﻲ ﻭﺟﻭﺩ ﺍﻟﻔﻼﻓﻭﻧﻭﻳﺩﺍﺕ ،ﺍﻟﻌﻔﺻﻳﺎﺕ ،ﺍﻷﻟﻛﻠﻭﻳﺩﺍﺕ ﻭ ﺍﻟﻛﻭﻣﺎﺭﻳﻧﺎﺕ ﻋﻧﺩ ﺟﻣﻳﻊ ﺍﻟﻧﺑﺎﺗﺎﺕ ﺍﻟﻣﺩﺭﻭﺳﺔ .ﻭﺟﻭﺩ ﺍﻟﺻﺑﻭﻧﻭﺯﻳﺩﺍﺕ ﻟﻡ ﻳﺗﻡ ﺗﺄﻛﻳﺩﻩ ﺇﻻ ﺑﺎﻟﻧﺳﺑﺔ ﻟﻧﺑﺎﺕ "ﺍﻟﺩﻗﻊ" " . "Fredolia aretioidesﺃﻅﻬﺭ ﺍﻟﺭﺑﻁ ﺑﻳﻥ ﻧﺗﺎﺋﺞ ﺍﻟﺗﺣﻠﻳﻝ ﺍﻟﻔﻳﺗﻭﻛﻳﻣﻳﺎﺋﻲ ﻭ " "Bioautographieﺃﻥ ﺍﻟﻣﻭﺍﺩ ﺍﻟﻣﺳﺅﻭﻟﺔ ﻋﻥ ﺍﻟﻔﻌﻝ ﺍﻟﻣﺿﺎﺩ ﻟﻠﻔﻁﺭ Foaﺗﻣﺛﻝ ﻣﺗﻌﺩﺩﺍﺕ ﺍﻟﻔﻳﻧﻭﻝ ﻓﻲ ﺑﻌﺽ ﺍﻟﺣﺎﻻﺕ ﻭ ﺗﻣﺛﻝ ﺍﻷﻟﻛﻭﻳﺩﺍﺕ ﺃﻭ ﻧﻭﺍﺗﺞ ﺃﺧﺭﻯ ﻟﻸﻳﺽ ﺍﻟﺛﺎﻧﻭﻱ ﻓﻲ ﺣﺎﻻﺕ ﺃﺧﺭﻯ .ﺗﺛﺑﻳﻁ ﻋﻣﻝ ﺍﻟﺳﻳﻠﻭﻻﺯ ﻻ ﻳﺭﺗﺑﻁ ﺩﺍﺋﻣﺎ ﺑﺗﺛﺑﻳﻁ ﺍﻟﻧﻣﻭ ﻋﻧﺩ ﺍﻟﻔﻁﺭ .ﺃﻅﻬﺭﺕ ﺍﻟﻣﻌﻁﻳﺎﺕ ﺍﻟﺗﺣﻠﻳﻠﻳﺔ ﻭ ﺍﻟﻣﻘﺎﺭﻧﺔ ﺃﻥّ ﺍﻟﻣﺭﻛﺏ ﺍﻷﻛﺛﺭ ﻓﺎﻋﻠﻳﺔ " "CCF1ﻣﻥ ﻧﺑﺎﺕ Citrullus colocynthisﺃﻗﺭﺏ ﻟﺻﻳﻐﺔ .Cucurbitacine E ﻣﻥ ﺑﻳﻥ ﺇﺛﻧﺎﻥ ﻭ ﺛﻼﺛﻭﻥ ﻣﺳﺗﺧﻠﺹ ﻣﻥ ﺍﻟﻌﺭﻕ ﺍﻟﻭﺳﻁﻲ ﻷﻧﻭﺍﻉ ﻣﻥ ﻧﺧﻳﻝ ﺍﻟﺑﻠﺢ ،ﺃﻅﻬﺭﺕ ﺛﻣﺎﻧﻳﺔ ﻣﺳﺗﺧﻠﺻﺎﺕ ﻣﻥ ﺳﺗﺔ ﺃﻧﻭﺍﻉ ﻣﻭﻗﻊ ﺗﺛﺑﻳﻁ ﻭﺍﺣﺩ ﻋﻠﻰ ﺍﻷﻗﻝ .ﺃﻓﺿﻝ ﺍﻟﻧﺗﺎﺋﺞ ﻗﺩﻣﺕ ﻣﻥ ﻣﺳﺗﺧﻠﺹ ﺍﻟﻌﺭﻕ ﺍﻟﻭﺳﻁﻰ "ﻟﺑﻧﺕ ﺍﻟﺷﺭﻙ" ﺑﺛﻧﺎﺋﻲ ﺍﻟﻛﻠﻭﺭﻭﻣﻳﺛﺎﻥ )1,41 ± 6,00ﻣﻠﻡ( ﻭ ﻣﺳﺗﺧﻠﺹ ﺍﻟﻌﺭﻕ ﺍﻟﻭﺳﻁﻲ "ﻟﻠﺭﻁﺑﻲ" ﺑﺄﺳﻳﺗﺎﺕ ﺍﻻﻳﺛﻳﻝ )1,41 ± 6,00ﻣﻠﻡ( .ﺃﻅﻬﺭﺕ ﺃﻧﻭﺍﻉ ﺍﻟﻧﺧﻳﻝ ﺍﻟﻣﺩﺭﻭﺳﺔ ﻧﻭﻉ ﻣﻥ ﺍﻟﺗﺷﺎﺑﻪ ﻓﻳﻣﺎ ﻳﺧﺹ ﻭﺟﻭﺩ ،ﻏﻳﺎﺏ ﻭ ﻋﺩﺩ ﻣﺭﻛﺑﺎﺕ ﺍﻷﻳﺽ ﺍﻟﺛﺎﻧﻭﻱ ﺍﻟﻣﻌﻧﻳﺔ ﺑﺎﻟﺩﺭﺍﺳﺔ .ﺃﻅﻬﺭ ﺍﻟﺭﺑﻁ ﺑﻳﻥ ﺍﻟﺗﺣﻠﻳﻝ ﺍﻟﻔﻳﺗﻭﻛﻳﻣﻳﺎﺋﻲ ﻭ " "Bioautographieﺃﻥ ﺃﻏﻠﺑﻳﺔ ﺍﻟﻣﺭﻛﺑﺎﺕ ،ﺫﺍﺕ ﻓﻌﺎﻟﻳﺔ ﺿﺩ ،Foaﺗﻣﻳﻝ ﻷﻥ ﺗﻛﻭﻥ ﻣﺗﻌﺩﺩﺍﺕ ﺍﻟﻔﻳﻧﻭﻝ .ﻟﻡ ﺗﺅﺛﺭ ﺧﺎﺻﻳﺔ ﺍﻟﻣﻘﺎﻭﻣﺔ ،ﺍﻟﺗﻘﺑﻝ ﺃﻭ ﺍﻟﺿﻌﻑ ﻷﻧﻭﺍﻉ ﺍﻟﻧﺧﻳﻝ ﻓﻲ ﻧﺗﺎﺋﺞ ﺍﻟﺗﺣﻠﻳﻝ ﺍﻟﻛﻳﻣﻳﺎﺋﻲ ﻭ ﻻ ﻧﺗﺎﺋﺞ " ."Bioautographieﺇﺫﻥ ،ﺁﻟﻳﺔ ﺍﻟﺩﻓﺎﻉ ﺍﻟﻁﺑﻳﻌﻲ ،ﺿﺩ Foaﻣﺭﺗﺑﻁﺔ ﺍﺭﺗﺑﺎﻁ ﻗﻭﻱ ﺑﻌﻣﻝ ﻣﺗﻌﺩﺩﺍﺕ ﺍﻟﻔﻳﻧﻭﻝ .ﻟﺫﻟﻙ ،ﺍﻻﺧﺗﻼﻑ ﺑﻳﻥ ﻫﺫﻩ ﺍﻷﻧﻭﺍﻉ ﻣﻥ ﺣﻳﺙ ﺍﻟﻣﻘﺎﻭﻣﺔ ،ﺍﻟﺗﻘﺑﻝ ﺃﻭ ﺍﻟﺿﻌﻑ ﻣﺭﺗﺑﻁ ﺑﺂﻟﻳﺔ ﺍﻟﺗﺄﺛﻳﺭ. ﺍﻟﻛﻠﻣﺎﺕ ﺍﻟﺭﺋﻳﺳﻳﺔ :ﻧﺧﻳﻝ ﺍﻟﺑﻠﺢ ،ﺍﻟﺑﻳﻭﺽ ، Fusarium oxysporum f. sp. albedinis ،ﻧﺑﺎﺗﺎﺕ ﺳﺎﻣﺔ ،ﻣﺗﻌﺩﺩﺍﺕ ﺍﻟﻔﻳﻧﻭﻝ ،ﻣﺿﺎﺩ ﻓﻁﺭﻱ ،ﻧﺑﺎﺗﺎﺕ ﻁﺑﻳﺔ. ABSTRACT XVII Title Natural Substances as Antifungal Agents: Special case of polyphenols Presented by Mr. Noureddine BOULENOUAR Supervisor Prof. Dr. Abderrazak MAROUF Co-Supervisor Prof. Dr. Abdelkrim CHERITI In the present study, nine plants from the Algerian Sahara (South-West of Algeria); five medicinal plants: Acacia raddiana, Asteriscus graveolens (Forsk.), Limoniastrum feei, Fredolia aretioides Moq. et Coss., Launeae arborescens (Batt.) Murb.; and four poisonous plants: Citrullus colocynhis (L.) Schrad, Calotropis procera Ait., Nerium oleander, Pergularia tomentosa. Two parts from each plants were used to evaluate their extracts (heat reflux extraction using methanol, ethyl acetate, dichloromethane, hexane) for antifungal activity against Fusarium oxysporum f. sp. albedinis (Foa), the causal agent of the most dangerous disease of date palm (Phoenix dactylifera L.). The preliminary evaluation was realized by disc diffusion technique and virulence on potato tuber tissue. The extracts showed an inhibition and /or decrease of the relative virulence below (50%) were used for phytochemical screening and direct bioautography. The direct bioautography was used to localize antifungal activity on the chromatogram and correlate with phytochemical screening data. The bioactive extracts were tested on cellulolytic activity of Foa. In addition, the rachis extracts of eight date palm cultivars were analyzed by phytochemical screening and direct bioautography against Foa. Among seventy-two extracts from medicinal and/or poisonous plants, thirty-one were chosen for phytochemical screening and bioautography (17 extracts from medicinal plants and 14 from poisonous plants). Only seven extracts (22.58 %) had shown at least one inhibition zone on the chromatogram. The best results were represented by ethyl acetate extract of Citrullus colocynthis fruits (7.75 ± 1.06 mm) and ethyl acetate extract of XVIII Asteriscus graveolens stems (7.00 ± 1.41 mm). The phytochemical screening demonstrated the presence of flavonoids, tannins, coumarins and alkaloids in all plants tested. The presence of saponins was confirmed only for Fredolia aretioides. The correlation between bioautography and phytochemical screening showed that the compounds responsible of antifungal activity are polyphenols in some cases and alkaloids or other secondary metabolites in others. The inhibition of cellulolytic activity is not always related to inhibition of fungal growth. Regarding the chromatographic and spectroscopic data, the most active compound “CCF1” isolated from Citrullus colocynthis fruits is probably cucurbitacine E. Among thirty-two extracts from date palm rachis, eight extracts from six cultivars had shown at least one inhibition zone. The best results were represented by dichloromethane extract of “Bent Cherk” rachis (6.50 ± 1.41) and ethyl acetate extract of “Rotbi” rachis (6.00 ± 1.41). The date palm cultivars had presented some similarities concerning the presence, absence and compounds number of secondary metabolites tested. From the correlation between phytochemical screening and bioautography, the majority of bioactive compounds against Foa seem to be polyphenols. So, the natural defence mechanism, in vivo, against Foa is mostly related to polyphenols action. For this reason, the difference between resistant, tolerant and sensitive cultivars is related to mechanism of action. Key words: Date palm, Bayoud, Fusarium oxysporum f. sp. albedinis, medicinal plants, poisonous plants, polyphenols, antifungal. POSL Production Scientifique XIX Tous les travaux de cette étude ont été réalisés au niveau du Laboratoire de Phytochimie et Synthèse Organique (LPSO) (Université de Bechar, Algérie) en collaboration avec Laboratoire de Biochimie Végétale et Substance Naturelle (Université d’Oran, Algérie). Cette étude a fait l’objet d’un article international, deux articles nationaux, 2 communications internationales et 2 communications nationales. Deux autres articles ont été soumis à deux journaux internationaux (voir annexes). Articles internationaux - Boulenouar N., Marouf A. et Cheriti A. 2009. Effect of Some Poisonous Plants on Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. Journal of Biological Sciences, 9(6): 594-600. - Boulenouar N., Marouf A., Cheriti A. et Belboukhari N. 2010. Medicinal Plants Extracts as Source of Antifungal Agents against Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. Journal of Agricultural Science and Technology. (Accepté). - Boulenouar N., Marouf A., Cheriti A. et Belboukhari N. 2010. Antifungal Activity and Phytochemical Screening of Extracts from “Phoenix dactylifera L.” Cultivars. Natural Product Research. (Accepté). Articles nationaux - Boulenouar N., Marouf A. et Cheriti A. 2008. Effect of Three Saharian Medicinal Plants Extracts on Fusarium oxysporum f. sp. albedinis, the Causal Agent of Bayoud. Annales de l’Université de Bechar, 4: 90-95. - Boulenouar N., Marouf A. et Cheriti A. 2009. Le BAYOUD: Symptômes et Lutte. Annales de l’Université de Bechar, 5: 63-67. Communications XX - Boulenouar N., Marouf A. et Cheriti A. 2007. 1st Phytochemistry & Biosubstances Conference, Bechar University, Bechar 3-4 November 2007, Algeria. p.40. - Boulenouar N., Marouf A. et Cheriti A. 2008. Effect of Some Saharian Medicinal Plants Extracts on Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. 3ème Symposium international sur les plantes médicinales et aromatiques (SIPMA 3) & 1er Congrès International sur les Molécules Bioactives (CIMB 1), Oujda 29-30 Mai 2008, Maroc. p.180. - Boulenouar N., Marouf A. et Cheriti A. 2009. Evaluation of Antifungal Effect of Some Medicinal Plants Extracts on Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. Congrès International sur les Plantes Aromatiques et Médicinales, Université Cadi Ayyad, Marrakech 28-30 Mars 2009, Maroc. - Boulenouar N., Marouf A. et Cheriti A. 2009. Nerium oleander and Pergularia tomentosa as Source of Antifungal Agents Against Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. 2nd Phytochemistry & Biosubstances Conference, Bechar University, Bechar 4-5 Novembre 2009, Algeria. p.18. XXI INTRODUCTION GENERALE 0 INTRODUCTION GENERALE À travers l'histoire, l'humanité a été toujours intéressée par les composés naturels des sources prébiotiques, microbiennes, végétales et animales. Divers extraits de fleurs, de plantes et d'insectes ont servit à l'isolement de composés qui ont été employés pour différents buts. Beaucoup de produits naturels, tels que les hormones végétaux, ont un rôle de régulation, alors que d'autres fonctionnent comme défense chimique contre les ravageurs (Ikan et al., 2008). Fusarium oxysporum f. sp. albedinis (Killian et Maire) Gordon est un champignon tellurique responsable de la fusariose des palmiers dattiers connu sous le nom de « Bayoud ». Cette maladie continue à détruire les palmeraies en Algérie et au Maroc sans aucun traitement efficace (Chakroune et al., 2005; OEPP, 2005). Les plantes produisent des centaines de milliers de composés qui inhibent souvent l'invasion et la croissance des micro-organismes pathogènes (Duke et al., 2008). Ces composés de diversité structurale considérable qui ne peut être assortie par la créativité des chimistes de synthèse, « les métabolites secondaires » sont censés fournir aux organismes producteurs un avantage de survie (Bahar et al., 2008). Ces même métabolites secondaires, principalement les polyphénols (flavonoïdes, tanins, coumarines,…), peuvent être une source pour avoir un traitement efficace de la maladie du Bayoud sans aucun effet néfaste sur l’environnement. Telle est l’hypothèse sur laquelle est basée cette étude. A cet effet, nous utilisons différents plantes (médicinales et/ou toxiques) et cultivars (résistants, sensibles, tolérants, …) afin d’évaluer l’effet de leurs métabolites secondaires sur l’agent causal du Bayoud. L’objectif est d’analyser l’effet des extraits de neuf plantes médicinales et/ou toxiques du Sud-Ouest d’Algérie sur le Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. Les extraits les plus efficaces vont subir une bioautographie directe et criblage phytochimique pour évaluer la relation entre l’effet antifongique et classe du composé responsable. Le(s) composé(s) le(s) plus actif(s) va (vont) être isolé(s) pour subir d’autres analyses en vue de sa caractérisation. D’un autre coté, les extraits des rachis de huit cultivars de palmier dattier (avec différent degré de résistance ou sensibilité au Foa) vont être testés par bioautographie et analysés par criblage phytochimique. L’effet antifongique est lié, dans la 1 plupart des cas, à l’effet sur les enzymes de pathogénicité (cellulases,…), donc les molécules avec effet antifongique sur les systèmes cellulaires seront analysés sur les systèmes acellulaires. Références Bahar M., Deng Y., Fletcher J. N. et Kinghorn A.D. 2008. Plant derived natural products in drug discovery and development: an overview. In: Selected Topics in the Chemistry of Natural Products. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., p11-48. Chakroune K., Bouakka M. et Hakkou A. 2005. Incidence de l’aération sur le traitement par compostage des sous produits du palmier dattier contaminés par Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. Canadian Journal of Microbiology, 51: 69-77. Duke S.O., Rimando A.M., Schrader K.K., Cantrell C., Meepagala K.M., Wedge D.E., Tabanca N. et Dayan F.E. 2008. Natural Products for Pest Management. In: Selected Topics in the Chemistry of Natural Products. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., p209-251. Ikan R. 2008. The Origin and the Nature of Natural Products. In: Selected Topics in the Chemistry of Natural Products. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. p. 1-9. OEPP/EPPO. 2005. Fiche informative sur les organismes de quarantaine N° 70, Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. p. 06. 2 PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE 3 PALMIER DATTIER & BAYOUD 4 CHAPITRE I: PALMIER DATTIER ET BAYOUD 1. Généralités sur le Palmier dattier 1.1. Introduction Le Palmier dattier, en plus de son intérêt alimentaire, constitue pour les populations des régions sahariennes l’arbre qui fournit un grand nombre de productions diverses qui sont très utiles aux familles des phoeniciculteurs, pour former ce qu’on appelle l’écosystème oasien (Ben Abdallah, 1990; Djerbi, 1991; Ouinten, 1996). En effet, le recouvrement assuré par la frondaison du palmier dattier crée un microclimat au niveau des oasis. La création de ce microclimat est favorable à la vie des hommes, de leurs cultures et de leur cheptel. L’association de cultures variées et de l’élevage autorise non seulement des productions d’auto-consommation et d’autoapprovisionnement mais également de rente (Ben Abdallah, 1990; Djerbi, 1991, Ouinten, 1996). 1.2. Données botaniques Du point de vue botanique, le palmier dattier, du nom latin Phœnix dactylifera L., appartient au genre Phoenix, sous famille des Coryphoideae, famille des Arecaceae. C’est une monocotylédone arborescente, généralement, à tronc monopodique (Bounaga, 1991; Ouinten, 1996; FAO, 2002). Les racines du palmier dattier se ramifient peu ou pas et le bulbe volumineux émerge en partie au-dessus du niveau du sol qui donne un système racinaire fasciculé. Il peut comporter trois types de racines (figure 1): les racines respiratoires (zone I), les racines de nutrition (zone II) et les racines d’absorption (zone III et IV) (FAO, 2002). Le volume de sol occupé par le système racinaire du palmier dattier peut atteindre une vingtaine de m3 (Bounaga, 1991; Ouinten, 1996). Les palmes qui constituent les feuilles du palmier dattier sont insérées sur le stipe (le tronc). En forme d’hélices très rapprochées, elles forment plusieurs couronnes. La palme est formée de deux parties: (1) le pétiole, gaine très développée, est entouré à sa base d'un feutrage; (2) le limbe est épineux à la base et constitué de folioles dans les deux tiers supérieurs (Bounaga, 1991; Ouinten, 1996). (Figure 1). 5 Figure 1: Schéma d’un palmier dattier (Phoenix dactylifera L.) (Munier, 1973). Chez le palmier dattier, les fleurs mâles et les fleurs femelles sont portées par des individus différents, il est donc dioïque. L’inflorescence ou spadice résulte de la germination des bourgeons axillaires situés à la base des palmes, dans la région coronaire. Le spadice est enveloppé d’une grande bractée membraneuse, la spathe. Les fleurs sont insérées sur un axe charnu ramifié. Les fleurs mâles possèdent six étamines. Les fleurs 6 femelles ont un ovaire à trois ovules; un seul de ces trois se développe par fleur (Bounaga, 1991; Ouinten, 1996). Chez le palmier dattier, la fécondation est toujours croisée (les fleurs d'un palmier femelle sont fécondées par le pollen d'un autre palmier, mâle). Pour cela, un certain taux de diversité génétique est assuré par le caractère dioïque du palmier dattier (FAO, 2002). En phoeniciculture, on conserve un palmier mâle pour 50 femelles. Dans ces conditions, la pollinisation naturelle par le vent est forcément limitée. Pour pallier à ce problème, l’intervention humaine est nécessaire pour effectuer la pollinisation manuelle et donc, assurer une bonne fécondation. Chez les Palmae on peut rencontrer des taxons hermaphrodites (rares), monoïques avec ou sans séparation des inflorescences, et des taxons dioïques (Bounaga, 1991). Le fruit du palmier dattier est une baie appelée datte. Elle est formée de: (1) Un mésocarpe fibro-charnu, (2) Un endocarpe membraneux uni à la gaine, (3) Une graine appelée communément noyau contenant un embryon circulaire et un albumen corné formé de matières cellulosiques (Ouinten, 1996; FAO, 2002). Dans les palmeraies, certains palmiers changent de sexe d’une année à l’autre (existence d’anomalies génétiques). Des palmiers mâles peuvent présenter des inflorescences femelles la même année. Ces palmiers appelés « Fous » sont souvent stériles et sont généralement éliminés par les cultivateurs (Bounaga, 1991). 1.3. Aire de répartition du palmier dattier Primitivement, le palmier dattier était cultivé dans les zones arides et semi-arides du continent africain. Il fut propagé par la suite en dehors de ces aires, comme arbre fruitier et/ou d’ornement. Il fut introduit avant le XVème siècle sur les côtes de l’Afrique orientale. Dans l’intervalle XVIème au XIXème siècle, il s’est introduit dans le continent américain, aux îles Comores, à Mascaraignes, à Madagascar, en Australie, et enfin en Afrique du Sud. Donc, l’aire de répartition du palmier dattier couvre les cinq continents. Sa distribution géographique est assez large dans l’hémisphère Nord (Ouinten, 1996; FAO, 2002; Chakroune et al., 2005). 7 Le palmier dattier a été introduit dans de nombreux pays (Argentine, Brésil, Afrique du Sud, Etats-Unis), mais il ne fait l’objet d’une exploitation intensive qu’en Afrique du Nord, au Moyen-Orient et aux Etats-Unis d’Amérique. En dehors de ces aires, le dattier est conduit soit en culture extensive, soit entretenu comme arbre d’ornement (Bounaga, 1991; Ouinten, 1996). Les zones les plus favorables pour le palmier dattier sont comprises entre 24° et 34° de latitude Nord (Maroc, Algérie, Tunisie, Libye, Egypte, Irak, etc.). Les limites extrêmes s’étendent sensiblement entre 10° de latitude Nord (Somalie) et le 39° de latitude Nord (Elche en Espagne ou Turkmenistan) (Ben Abdallah, 1990). Aux Etats-Unis, la culture s’étend du 33° au 35° parallèle. Au-delà des ces limites, il n’existe que des surfaces négligeables de dattiers, par exemple, dans l’hémisphère Sud (Australie, Amérique du Sud) (FAO, 2002). 1.4. Données écologiques Le palmier dattier est une espèce thermophile mais qui peut supporter, avec un retard ou un arrêt du développement, des températures de -15 °C. L’activité végétative se manifeste à partir de 7 à 10 °C et elle atteint son intensité maximale de végétation entre 30 et 37 °C, ces données diffèrent selon le cultivar. Pour cela, cette espèce fruitière est connue pour sa tolérance aux conditions climatiques extrêmes d’aridité et de continentalité. (Ouinten, 1996; Chakroune et al., 2005). En général, le palmier dattier est cultivé à des altitudes ne dépassant pas quelques centaines de mètres. Certaines palmeraies sont situées à de très faibles altitudes et même à des altitudes inférieures au niveau de la mer (Ouinten, 1996). D’autre part, il existe des oasis en altitude dépassant 1000 m, par exemple, les oasis les plus hautes sur le plateau Tassili et Tibesti peuvent atteindre 1000 m à 1500 m d’altitude (Bounaga, 1991). Le palmier dattier est associé aux milieux arides et semi-arides (pluviométrie < 100 mm/an), mais comme toute espèce végétale il nécessite des ressources hydriques disponibles (souterraines et/ou irrigation). Le palmier dattier est donc considéré comme une plante phréatophytique et héliophile. Les besoins en eau d’irrigation ont été estimés à 0,5 m3/palmier/jour ou 60 m3/hectare/jour (Bounaga, 1991; Ouinten, 1996). 8 1.5. Le palmier dattier en Algérie 1.5.1. Données agronomiques La production mondiale de dattes a augmenté exponentiellement pendant les trois dernières décennies. En 1962, la production était 1,8 millions de tonnes, 6,4 millions de tonnes en 2000 et 7 millions de tonnes en 2008. L’Algérie se place au sixième rang des producteurs de dattes avec une production de près de 552 765 tonnes en 2008 (FAO, 2010). Le nombre total des palmiers au monde est d’environ 100 millions; en Algérie, le nombre est de 9 millions couvrant une superficie de 87 000 ha (FAO, 2002). Parmi les variétés cultivées, c’est « Deglet Nour » qui est la plus appréciée tant sur le marché national que pour l’exportation. L’Algérie est également le deuxième producteur mondial de Deglet Nour. En Europe, elle est au deuxième rang des fournisseurs avec 9 800 tonnes (19% des dattes importées en Europe) (FAO, 2000). Le rendement moyen du palmier dattier est de 35 kg par arbre. Selon la variété, entre 43 et 46 kg/arbre pour Deglet Nour, entre 30 et 36 kg/arbre pour la datte molle, entre 27 et 44 kg/arbre pour la datte sèche. Parmi les facteurs qui provoquent le déclin du rendement des palmeraies, l’âge des palmiers et les maladies qui les touchent tel que le Bayoud (Messar, 1996). La période maximale d’exploitation du palmier dattier en milieu oasien est en moyenne de 50 ans (la durée de vie du palmier dattier peut dépasser 70 ans). Cette limite d’exploitation est souvent due à la difficulté d’entretenir des palmiers (tissus du stipe détériorés, faible diamètre du stipe, hauteur très importante (20 à 30 m)) (Bounaga, 1991; Ouinten, 1996). Le palmier dattier peut être multiplié par voie végétative ou par voie sexuée (FAO, 2002). Le processus de reproduction végétative est assuré par le développement des bourgeons axillaires, situés à l’aisselle des palmes, qui donne naissance à des rejets appelés drageons, lorsqu’ils sont produits dans la partie basale du stipe, et gourmands, lorsqu’ils sont produits à la partie moyenne de celui-ci. La reproduction végétative réalisée par les cultivateurs se fait grâce aux drageons. En moyenne, chaque palmier produit 10 rejets en dix ans (ce nombre varie selon l’âge et le cultivar) (Ferry et al. 1991; Ouinten, 1996). 9 Dans le cas de la reproduction sexuée, le fruit de la pollinisation entre plant mâle et plant femelle (graine), germe et donne naissance à une plantule. Ces plants sont appelés Khalts, et ont des chances égales d’être mâle ou femelle. La détermination du sexe peut être déterminé durant le développement des inflorescences (de 5 à 8 ans) (Bounaga, 1991; Ouinten, 1996). 1.5.2. Diversité génétique Lorsque les agriculteurs laissent pousser des palmiers issus de graines, ils favorisent l’apparition de nouvelles variétés sans aspect phénotypique ni génotypique connu. Cela caractérise les lits d'oued et même dans certaines palmeraies conduites selon le mode traditionnel (Bounaga, 1991). Les palmiers de production dattière acceptable, sont multipliés par récupération et plantation des rejets qu'ils produisent (Ferry et al. 1991). C'est ainsi que la majorité des cultivars connus a été sélectionnée et constitue actuellement des clones de quelques centaines de pieds, pour les uns, et quelques milliers ou dizaines de milliers de palmiers, pour les autres. La distinction entre cultivars se fait, essentiellement, sur la vigueur du palmier et la morphologie des fruits et des palmes. Certains cultivars peuvent être identifiés grâce à des critères biochimiques (Ouinten, 1996). L’aire phoénicicole algérienne couvre deux millions de kilomètres carrés. Huit cents cultivars ont été recensés pour une population de six à dix millions de palmiers dattiers. Au Maroc, 1300 cultivars ont été recensés (Ouinten, 1996). La répartition des cultivars de palmier dattier à travers les zones phoénicicoles mondiales dépend directement des conditions bioclimatiques qui influent sur la tolérance et la qualité des fruits (Bounaga, 1991). Ainsi, les dattes du cultivar Deglet Nour collectées, en Algérie, à Tolga ou à Biskra sont de très bonne qualité alors que celles, du même cultivar, provenant du Mzab sont généralement plus sèches et plus petites, donc de qualité nettement inférieure (Ouinten, 1996). 1.6. Importance socio-économique Le palmier dattier a facilité la création d’un environnement convenable dans les régions désertiques. Il permet la création d’un milieu typique favorable à la pratique d’autres cultures sous-jacentes (arboricoles, céréalières, maraîchères…), garantissant ainsi une certaine autonomie économique du milieu oasien (Chakroune et al., 2005). En outre, 10 les diverses utilisations du palmier dattier et de ses produits dans la vie des habitants des oasis montrent le rôle primordial qu’il tient dans ces régions (FAO, 2002). Du point de vue économique, l’exploitation du palmier dattier constitue une source de revenus financiers appréciable pour les habitants des oasis. Toutes les parties du palmier dattier sont utilisables: les dattes de bonne à moyenne qualité sont une source alimentaire pour l’homme; les folioles des palmes, les noyaux et les dattes de mauvaise qualité alimentent les animaux domestiques. Le bois du stipe ainsi que la nervure principale et le pétiole des palmes servent de matériaux de construction. Donc, l’importance socioéconomique du palmier dattier pour les habitants des oasis est due au rôle que joue cette plante dans le système oasien. Le palmier constitue, ainsi, le pilier sur lequel repose tout le système oasien (Ouinten, 1996). 2. Pathologie du palmier dattier Le terme pathologie signifie une partie de la médecine qui étudie les maladies, leurs causes et leurs symptômes (définition, dictionnaire Larousse). Selon les phéniciculteurs, les principales maladies qui touchent les palmiers dattiers sont, suivant la région, Boufaroua ou Ghobar, Khamedj, Bayoud, Sem ou Djereb, Mejnoun, Bélaat ... dans un ordre qui définira l’importance (selon les phéniciculteurs). Ces maladies ou ces pathologies du palmier peuvent entraîner, soit la mort du palmier, soit des symptômes particuliers avec une baisse ou une perte totale de la production (Bounaga et Djerbi, 1990). Selon les scientifiques, le terme pathologie est classé sous les termes de: (1) maladies à ravageurs ou prédateurs, arthropodes principalement (insectes et acariens); (2) maladies physiologiques ou indéterminées, (3) maladies cryptogamiques à champignons, bactéries et ou virus (dont la plus grave reste le Bayoud). (2) et (3) étant recouverts par le mot anglais « diseases » (Bounaga et Djerbi, 1990). 2.1. L e Bayoud ou fusar iose du palmier dattier Les fusarioses sont des maladies très répandues, très destructives, spectaculaires, et effrayantes (Louvet, 1991). Elles apparaissent en tant que fanage plus ou moins rapide, brunissement, et mort des feuilles et des pousses succulentes des plantes suivies de la mort de la plante entière. Ces maladies se produisent en raison de la présence et les activités du 11 microbe pathogène dans le xylème. Les plantes entières peuvent mourir dans une durée de quelques semaines, ou peuvent survivre jusqu'à plusieurs mois ou années après l'infection. Tant que la plante infectée est vivante, les champignons responsables restent dans les tissus vasculaires (xylème) et certaines cellules environnantes. Seulement quand la plante infectée est tuée par la maladie, ces champignons entrent dans d'autres tissus et sporulent sur ou près de la surface de la plante morte (Agrios, 2005). Il y a quatre genres des champignons qui causent les maladies vasculaires: Ceratocystis, Ophiostoma, Fusarium, et Verticillium (Agrios, 2005). La plupart des champignons qui causent les fusarioses du genre Fusarium appartiennent à l'espèce Fusarium oxysporum (Boullard, 1997). Le palmier dattier, malgré sa résistance à tous les facteurs abiotiques, est menacé par la fusariose vasculaire qui est une maladie cryptogamique causée par un champignon tellurique Fusarium oxysporum f.sp. albedinis (Killian et Maire, 1930). La plante-hôte principale de ce champignon est le palmier dattier «Phoenix dactylifera L. ». Les cultivars de bonne qualité sont sensibles au Bayoud (Mejhoul, Deglet Nour, etc.). Les autres cultivars de moyenne qualité (Sair Laylet, Takerboucht) et mauvaise qualité (Bou Sthammi, Tadment, Iklane, Bou Feggous, Moussa) ont une bonne résistance (Chakroune et al., 2005; OEPP, 2005). Le Fusarium oxysporum f. sp. albedinis est signalé sur d'autres plantes cultivées dans les palmeraies telle que Lawsonia inermis, luzerne, et des espèces de Trifolium. Ces plantes sont porteuses du pathogène sans manifester de symptômes et sont largement cultivées en Afrique du Nord et au Proche-Orient (OEPP, 2005). 2.1.1. Données historiques Il est difficile de préciser la date et le lieu de la première apparition du Bayoud. Cette maladie existe depuis plus d’un siècle en Afrique du nord, répandue surtout au Maroc et en Algérie. Selon les témoignages des agriculteurs, cette maladie a été observée pour la première fois dans la vallée du Draà au Maroc, avant 1870. Cette maladie a atteint en un siècle l’ensemble des palmeraies marocaines et les palmeraies du Sud-Ouest et centre du Sahara en Algérie. Elle a suivi un axe Nord-Sud dans les palmeraies de l’Ouest 12 du pays, et elle continue à progresser vers le centre. Le Bayoud continue à décimer annuellement 4,5 à 12 % des palmeraies (Bounaga et Djerbi, 1990; Djerbi, 1991; Ouinten, 1996; Chakroune et al., 2005). 2.1.2. Symptômes a) Symptômes exter nes Le Bayoud attaque aussi bien les palmiers jeunes qu'adultes, de même que leurs rejets basaux. Les premiers symptômes externes de la maladie font leur apparition sur une ou plusieurs feuilles de la couronne moyenne. Les feuilles affectées prennent une teinte plombée (gris cendré) et ensuite se décolorent d'une façon particulière: les pennes situées d'un côté de la feuille commencent à blanchir d’où le nom arabe de « Bayoud » dérivant d’Abiod = Blanc et la maladie progresse de la base vers l'apex. Quand tout ce côté a été affecté, le flétrissement commence de l'autre côté, en sens inverse cette fois-ci, de l'extrémité de la feuille vers sa base, jusqu'à la mort de la feuille (Bounaga et Djerbi, 1990; OEPP, 2003; OEPP, 2005). Cette maladie vasculaire provoque le flétrissement par blocage de la circulation de l’eau dans les vaisseaux conducteurs qui résulte comme brunissement et formation de thylles (Corbaz, 1990; Duhoux et Nicole, 2004). Les palmiers atteints de cette maladie meurent souvent au bout de 6 mois à 2 ans. Au cours de ce processus de décoloration et dépérissement des pennes, une coloration brune qui se manifeste dans le sens de la longueur, sur le côté dorsal du rachis, avance de la base vers l'apex de la fronde. Cela est lié au passage du mycélium dans les faisceaux vasculaires du rachis. Ensuite, la palme va prendre une forme arquée, similaire à une plume mouillée, et pend le long du tronc. Ce processus peut durer de quelques jours à plusieurs semaines (Bounaga et Djerbi, 1990; OEPP, 2003; OEPP, 2005) (Figure 2). En passant vers le cœur de l’arbre (bourgeon terminal), les mêmes symptômes peuvent ensuite apparaître sur les feuilles adjacentes ou opposées. L'arbre meurt quand le mycélium atteint le bourgeon terminal. Finalement, les rejets à la base de l'arbre sont attaqués (Bounaga et Djerbi, 1990; OEPP, 2003; OEPP, 2005). 13 Figure 2: Dispersion unilatérale des symptômes sur les palmes de la couronne moyenne (FAO, 2002). Comme cas particuliers, les symptômes peuvent se développer de façon différente. La coloration brune apparaît au milieu du rachis, côté dorsal, et progresse vers le haut jusqu'à que tous les tissus sont affectés provoquant un dépérissement de l'apex. Le flétrissement des pennes se poursuit vers le bas jusqu'à la mort des feuilles. Les symptômes précoces peuvent aussi être différents, on détecte parfois un jaunissement généralisé avant l'apparition des symptômes typiques, surtout en hiver et en automne (Bounaga et Djerbi, 1990; OEPP, 2003; OEPP, 2005). Le palmier peut mourir 6 mois à 2 ans après l'apparition des premiers symptômes, en fonction du cultivar et des conditions de plantation (Bounaga et Djerbi, 1990; OEPP, 2003; OEPP, 2005). b) Symptômes inter nes L’examen d’un palmier malade permet de voire un petit nombre de racines malades, rougeâtres, sans proportion avec les dégâts observés sur l'arbre. Ces racines 14 malades correspondent aux faisceaux vasculaires du stipe qui ont pris une coloration brunrougeâtre, en plus du parenchyme et sclérenchyme environnants. Les taches sont larges et nombreuses vers la base du stipe. Au cours de leur ascension dans l'arbre, les faisceaux vasculaires colorés se séparent et leurs chemins tortueux, à l'intérieur des tissus sains, peuvent être suivis (FAO, 2002; OEPP, 2005). Une coupe des frondes qui manifestent des symptômes externes, permet de voir une couleur brune rougeâtre et des faisceaux vasculaires très colorés. D’après les données des symptômes internes, on considère qu’il y a une continuité des symptômes vasculaires qui existent depuis les racines jusqu'aux feuilles apicales du palmier. Aucun symptôme n’a été signalé sur les pédoncules, fleurs ou fruits (FAO, 2002; OEPP, 2005). 2.1.3. Nuisibilité a) Impact économique Les types et les quantités de pertes provoquées par les maladies des plantes varient avec l'espèce, les produits végétaux, le microbe pathogène, la localité, l'environnement, les mesures de contrôle pratiquées, et les combinaisons de ces facteurs. La quantité de perte peut s'étendre jusqu'à 100 %. Les plantes ou les produits végétaux peuvent être réduits du point de vue quantité ou qualité (Agrios, 2005). La fusariose causée par l’espèce Fusarium oxysporum est une maladie à impact économique très important touchant plusieurs plantes dans le monde dont la plus importante dans l’espace oasien est le Bayoud (El-Hassni et al., 2005). Le Bayoud comme maladie dangereuse provoque la destruction des palmeraies en Algérie et au Maroc. En un siècle, il a détruit plus des deux tiers des palmeraies de dattiers marocains (12 millions d'arbres) et plus de 3 millions d’arbres en Algérie. Ce fléau provoque la mort de 4,5 à 12 % des palmiers-dattiers par an (Tantaoui et Boisson, 1991; Djerbi, 1991; OEPP, 2005). Cette maladie a accentué le phénomène de désertification et a appauvrit les phoeniciculteurs qui finissent par émigrer vers les grands centres urbains. En plus, la perte des meilleurs cultivars provoque une perte d’une source de revenus et de devises indispensable. Le Bayoud est une catastrophe pour toutes les régions productrices de dattes dans le monde. Il provoque la disparition progressive des cultivars à intérêt économique 15 (qualité et quantité). Des oasis à 300-400 palmiers par ha sont réduits aujourd'hui à 40- 50 palmiers par ha (Djerbi, 1991; OEPP, 2005). 3. Le Champignon Fusarium oxysporum f. sp. albedinis Le champignon Fusarium oxysporum f. sp. albedinis (Foa) est l’ agent d’ un flétrissement vasculaire du palmier-dattier (Phoenix dactylifera L.), appelé maladie du Bayoud. La nature tellurique du Foa fait que les principaux moyens de transmission sont les spores et mycélium dans le sol (FAO, 2002). La contamination a lieu principalement par les racines et s’ étend dans les plantes par le système vasculaire. Les principaux moyens de dissémination sont: les rejets, le sol, les hôtes tolérants, les tissus de palmier-dattier ou l’ eau d’ irrigation infectés (OEPP, 2003). 3.1. Position taxonomique et caractéristiques morphologiques Le genre Fusarium se compose de champignons très communs de sol, y compris de nombreux pathogènes de plante. Ces espèces peuvent coloniser l’air et l’eau en plus du sol. (Ouinten, 1996; Hanson, 2008). Fusarium oxysporum est un microbe pathogène commun de plantes avec une distribution mondiale. Comme espèce, il endommage probablement plus les récoltes agricoles que les autres microbes pathogènes de plantes (Boullard, 1997). Il existe plus de 120 formes spéciales et races décrites capables de causer la fusariose chez beaucoup de récoltes agricoles (Katan, 1999; Agrios, 2005; Maude, 2006). Fusarium oxysporum appartient à l’ ordre des Moniliales, famille des Tuberculariacées. Parmi les neuf espèces communément reconnues chez le genre Fusarium, les phytopathologistes s’ intéressent particulièrement à l’ espèce Fusarium oxysporum, à cause des pertes de récolte que ces souches pathogènes provoquent sur les plantes cultivées (Ouinten, 1996). La forme sexuée n’ a été observée chez aucun représentant de cette espèce, aussi a-telle été classée provisoirement au sein d’ un groupe appelé « Champignons imparfaits », Deutériomycètes ou Adelomycètes (Ouinten, 1996; Boullar d; 1997; Fer nandez et al., 1998). 16 3.2. Car actér istiques de cr oissance en cultur e Parmi les données importantes concernant un microbe pathogène sont leurs caractéristiques de croissance en culture. Le Foa peut être isolé à partir de: (a) palmier (tissus internes décolorés), (b) porteurs sains sur un milieu PDA, ou (c) à partir de la terre sur milieu sélectif. Les cultures fraîchement isolées sont rose saumon, mais les cultures maintenues sur milieu synthétique par transferts d'inoculum massifs tournent au rose, pourpre, pêche ou violet (OEPP, 2005). Le mycélium aérien sur PDA et CDA est délicatement floconneux et clairsemé. La production abondante de conidies donne une apparence visqueuse aux cultures (au début de la croissance), et sont roses (sur l’ envers de la boîte, surtout sur milieu PDA). Le Foa est caractérisé par une croissance lente (6,0 –8,5 cm de diamètre en 8 jours à 25 °C sur milieu PDA) (OEPP, 2003). 3.3. M or phologie Chez le Foa, les conidies se subdivisent en deux groupes, les microconidies et les macroconidies. Sur milieu SNA, les microconidies sont portées par des monophialides courtes et non ramifiées (mesurant 8–14 µm de longueur) issus latéralement des hyphes ou de conidiophores peu ramifiés; généralement abondantes, variables, ovales à ellipsoïdes, droites à légèrement courbées, mesurant 5–12 x 2,2–3,5 µm et produites dans une substance visqueuse. Sur le même milieu, les macroconidies sont clairsemées chez certaines souches, portées sur des conidiophores plus ramifiés ou à la surface de sporodochies ressemblant à celles de Tubercularia, à parois fines, ayant généralement trois à cinq cloisons, fusoïdes à subulées et pointues aux deux extrémités, parfois fusoïdes à falciformes, certaines ayant une extrémité courbée et une base pédicellée, mesurant 27– 46 x 3–5 µm (3 cloisons) à 50–66 x 3,5–5 µm (6–7 cloisons). Les spores à trois cloisons sont les plus communes (OEPP, 2003; 2005). Les chlamydospores, forme la plus résistante, se caractérisent par (sur milieu SNA): des parois lisses à rugueuses, de 7–11 µm de longueur, généralement abondantes, terminales ou intercalaires, généralement solitaires mais rarement en paires ou en chaînes. Puisque la morphologie des spores sur milieu PDA ou sur l’ hôte est généralement très variable et n’ est donc pas fiable, la détermination de certaines critères de ce champignon nécessite des conditions précises (milieu de culture, …) (OEPP, 2003; 2005). 17 3.4. Biologie Fusarium oxysporum f. sp. albedinis demeure pendant l'hiver dans les tissus de palmier sous la forme de chlamydospores. La libération de ces chlamydospores, après désintégration de ces tissus, permet de les placer dans le sol où elles demeurent à l'état dormant (FAO, 2002). Les porteurs sains (le henné, la luzerne ou le trèfle) constituent l’autre endroit où le Foa peut persister (OEPP, 2005). Ce champignon est caractérisé par une répartition irrégulière dans le sol. Généralement, on le trouve entre 0 et 30 cm de la surface du sol, mais parfois jusqu'à 1 m. Les chlamydospores sont peu nombreuses par rapport aux conidies mais peuvent survivre dans le sol pendant plus de 8 ans (même dans des conditions défavorables). L’infection d’un palmier par le Foa ne nécessite qu’un petit nombre de propagules et quelques racines infectées peuvent provoquer la mort de cet arbre (OEPP, 2005). Le changement des conditions défavorables en conditions favorables permet aux chlamydospores de germer et de pénétrer aux tissus vasculaires à travers les racines. Une fois le mycélium atteint la tige, il commence à produire des microconidies dans les vaisseaux conducteurs (xylème). Ces microconidies sont transportées vers le haut par la sève jusqu’à l’empêchement du mouvement par une paroi transversale. Pour le Foa, ce problème est résolu par la germination des microconidies, le tube germinatif pénètre dans la paroi et la formation de microconidies reprend de l'autre côté de la paroi. L’infection se progresse vers les palmes de la couronne moyenne et la mort de l'arbre intervient quand le champignon atteint avec ses toxines le bourgeon terminal. Au cours de sa progression, le Foa s'échappe du xylème et colonise le parenchyme environnant par un mycélium inter et intracellulaire avec l’excrétion des mycotoxines, ce qui donne la coloration brune rougeâtre caractéristique des tissus internes des palmiers malades. Après la mort de l'arbre, le mycélium continue à se développer dans les tissus morts et forme de nombreuses chlamydospores dans les cellules du sclérenchyme (OEPP, 2005). Comme remarque générale, qui n’est pas liée seulement au Bayoud, les facteurs qui favorisent la croissance rapide du palmier dattier favorisent aussi la progression de la maladie du Bayoud. Parmi ces conditions, c’est la température de croissance, elle est entre 21 et 27,5 °C pour une croissance optimale; entre 18 et 32 °C pour une croissance 18 importante, mais cette croissance s’arrête en dessous de 7°C et au-delà de 37°C (OEPP, 2005). 3.5. Test du pouvoir pathogène L’ infection provoquée des plantules de palmier est la méthode la plus simple qui peut être utilisée (comme alternative au test de PCR) pour tester le pouvoir pathogène des cultures pures de Foa. Cette méthode est simple du point de vue technologique mais nécessite beaucoup de temps. Le protocole nécessite les conditions suivantes: a). Les plantules de Phoenix dactylifera issues de semis doivent être cultivées dans des conditions exemptes de maladie dans des sacs en polyéthylène transparent. b). Le champignon ne doit pas avoir été stocké sur milieu PDA ou autre milieu riche. c). Le champignon doit être transféré du SNA au PDA (solide ou liquide) à 25 °C et une suspension de 106 spores par mL doit être préparée après une semaine. d). La suspension de spores est pipetée sur les racines des plantules au stade deux feuilles (âgées d’ environ trois mois). Les premiers symptômes sont visibles après 3 semaines. Le taux de mortalité est noté à intervalle régulier pendant 2 mois après l’ inoculation. Outre cette inoculation, deux inoculations témoins sont incluses, l’ une avec un isolat pathogène de Foa et l’ autre avec un isolat non pathogène de Fusarium oxysporum. Le test de pouvoir pathogène est valide si la mortalité finale dépasse 20 % pour l’ isolat pathogène connu et aussi pour l’ isolat étudié, et que les plantules inoculées avec l’ isolat non pathogène ne présentent pas de signe de maladie. Le palmier dattier est génétiquement variable à cause de sa nature dioïque, et il faut donc utiliser au moins 50 plantules dans le test de pouvoir pathogène (OEPP, 2003). 3.6. Méthodes de détection et d’inspection Malgré que les méthodes disponibles ne soient pas fiables à 100 % pour le diagnostic du Bayoud, il existe certaines techniques mieux que d’ autres. Par exemple, l’ identification du champignon en se basant sur son isolement et sur l’ identification de la culture pure par des méthodes moléculaires ou des tests de pouvoir pathogène est plus fiable que les méthodes liées aux symptômes de cette maladie (flétrissement vasculaire). L’ identification uniquement à partir des symptômes externes et internes n’ est donc pas 19 sûre. Des résultats négatifs aux tests de pouvoir pathogène ne permettent pas d’ exclure la présence du pathogène, et dans ce cas les isolats de Fusarium oxysporum suspects doivent être envoyés à un spécialiste pour un test de PCR. D’ autres méthodes, comme les caractéristiques culturales du champignon (obtenues par une culture monospore), la compatibilité végétative des mutants et l’ analyse RFLP ont jadis été utilisées, et ont servi à démontrer l’ homogénéité de Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. (OEPP, 2003; OEPP, 2005). En se basant sur une méthode de PCR (mise au point par une collaboration entre le Maroc et la France pour identifier le Foa), deux paires d'amorces ont été sélectionnées et donnent des résultats satisfaisants lorsqu'elles sont utilisées ensembles pour détecter tous les isolats de ce champignon (OEPP, 1997). L'établissement de la carte d'identité génétique de Foa a permis de mettre au point un outil d'identification rapide et fiable du champignon, basé sur une technique moléculaire. Cet outil peut aider dans la lutte contre le Bayoud avec quelques heures seulement, comparé à plusieurs mois nécessaires pour diagnostiquer avec certitude la maladie chez les palmiers dattiers. Pour qu’il soit efficace, un tel outil devrait être utile aux organismes chargés de la surveillance phytosanitaire des palmeraies ou du contrôle des exportations de matériel végétal, ainsi qu'à tous ceux qui travaillent à l'amélioration du palmier dattier (Fernandez, 1998). Fr eeman et M aymon (2000) ont démontré que l’ utilisation du RAPD-PCR n’ est pas suffisante pour différencier Foa des autres isolats pathogéniques et saprophytiques du Fusarium oxysporum. Par contre, la PCR en utilisant des primers de Foa spécifiques « Foaspecific primers » donne des résultats plus précis. 3.7. Moyens de déplacement et de dispersion La dispersion des champignons s’ effectue par les spores ou le mycélium qui constitue l’ appareil végétatif (Duhoux et Nicole, 2004). Le Foa peut se disséminer par des rejets, terre ou porteurs sains contaminés provenant de zones infectées, par du tissu de dattier infecté, morceaux de rachis infectés en particulier, et par l'eau d'irrigation passant par des palmeraies infectées (FAO, 2002). Les semences et fruits ne le disséminent pas (OEPP, 2005). 20 L’accumulation des sous-produits du palmier dattier, utilisés jadis pour la vie quotidienne de l’oasien, constitue des points noirs de pollution dans les palmeraies. La décomposition de cette biomasse, dont une partie est contaminée par l’agent responsable du Bayoud, constitue un vecteur de propagation de la maladie et une source de l’alimentation du sol en champignon pathogène (Chakroune et al., 2005). Dans une palmeraie, la maladie se dissémine par contact entre racines saines et racines malades. L'étendue de cette dispersion dépend des pratiques culturales (fertilisation, irrigation copieuse, etc.) et des conditions climatiques (température) (OEPP, 2005) (Figure 3). 3.8. L’isolement Pour l’ isolement, une procédure normalisée et simple consiste à: a). Stériliser en surface des morceaux de tissu vasculaire décoloré (racines, rachis, frondes, tiges) dans de l’ éthanol à 50 % pendant une minute. b). Rincer ces morceaux dans de l’ eau. c). Incuber à 20–25 °C sur milieu gélosé. Figure 3: Distribution et dispersion du Bayoud en Algérie et Maroc (FAO, 2002). 21 Les Fusarium spp. peuvent dégénérer rapidement et (à long-terme) perdre leur pouvoir pathogène parce qu’ ils sont très instables en culture, en particulier sur les milieux riches comme le PDA. Pour cela, il est nécessaire d’ isoler et de cultiver les isolats de Fusarium sur des milieux peu nutritifs, comme le milieu SNA (Synthetic Nutrient poor Agar ). Concernant les milieux riches, comme le Czapek Dox Agar (CDA) et le milieu PDA, ils doivent être utilisés uniquement pour l’ observation des caractéristiques macroscopiques en culture, telles que la couleur. Pour la conservation, le champignon doit être prélevé seulement sur du milieu SNA (OEPP, 2003). 3.9. Répartition géographique Selon OEPP (2005), le Fusarium oxysporum f. sp. albedinis est très répandu sur le palmier dattier au Maroc et en Algérie; toutes les oasis marocaines sont affectées. En Algérie, le Bayoud n'est présent que dans les oasis centrales et occidentales; il a atteint Metlili (1950), Ghardaia (1965) et El-Goléa (1978), mais a été éradiqué de cette dernière oasis par traitement chimique. Sa présence en Tunisie, Libye, et Egypte n’est pas confirmée. Des signalements en France et en Italie existent, mais ils concernent l’espèce Phoenix canariensis (Figure 4). Figure 4: Répartition géographique du Bayoud dans le monde (OEPP/EPPO, 2006). 22 3.10. Stratégie de lutte contre le Bayoud Tenant compte de la gravité de cette maladie, il faut une stratégie de lutte à court, moyen et long terme. Selon les moyens disponibles, la stratégie de lutte s’articule sur les approches complémentaires suivantes (a) l’arrêt ou du moins le ralentissement de la progression de la maladie, (b) la sélection de cultivars et de clones résistants au Bayoud et de bonne qualité dattière, (c) la multiplication rapide du matériel sélectionné par la culture in Vitro et sa diffusion. Les mesures prophylactiques accompagnées d’opérations d’éradication ne feront que ralentir la maladie mais ne pourront jamais l’arrêter (Djerbi, 1991; Brac de la Prrière et Benkhelifa, 1991). On a signalé le problème de la dissémination du Foa par les sous-produits de palmier, et comme mesure de protection et pour atténuer la gravité de la progression de cette maladie, on peut envisager le recyclage des sous-produits du palmier dattier pour une réutilisation bénéfique. Chakroune et al. (2005) ont démontré que le compostage est une technique intéressante pour la valorisation de ces matières organiques. Ce processus de fermentation aérobique aboutit à la formation d’un compost, facteur de protection, de stabilité et de fertilité du sol. L’utilisation de ce compost, comme amendement organique, pourra remédier aux problèmes de l’appauvrissement et de la salinisation des sols du milieu oasien et contribuer à la lutte contre des maladies des plantes. Une autre méthode utilisée pour la lutte contre le Bayoud consiste en la sélection de palmiers de haute qualité dattière et résistants à cette maladie soit parmi les populations naturelles (1ère voie) soit parmi celles issues de croisements contrôlés (2ème voie) : La première voie, à court terme, consiste à identifier parmi les populations locales de palmier dattier les individus de haute qualité se trouvant en foyer de Bayoud. Cette approche a permis l’installation de 1057 clones au Maroc (Zagora et Errachidia) et quelques centaines en Algérie (Adrar) (Saaidi, 1990; Djerbi, 1991). La deuxième voie, à moyen et long terme, consiste à créer de nouveaux clones de palmier dattier, résistants au Bayoud et de haute qualité par croisements contrôlés. Ce programme a permis la production d’un million de graines issues de différents croisements, de 200 000 jeunes palmiers en cours de test et environ 20 000 palmiers résistants au Bayoud en observation à Zagora et à Adrar. Ce programme de sélection a permis une 23 première sélection en 1989 d’une centaine de génotypes de haute qualité dattière et résistants au Bayoud (Saaidi, 1990; Djerbi, 1991). Malgré les résultats préliminaires encourageants de ces deux voies, d’autres problèmes sont apparus (les clones qui ont été résistants deviennent sensibles, …). 3.11. Différentes stratégies de lutte Le choix de la plupart des moyens efficaces pour contrôler une maladie cryptogamique dépend d'une connaissance détaillée de la récolte et du microbe pathogène particulier et d'une considération des facteurs économiques. Un certain nombre de principes sont impliqués (Waller et Cannon, 2002). L'extirpation d'une maladie après son installation comporte la destruction des hôtes, l'élimination des parties de plante infectées, d'autres mesures sanitaires comme la rotation, la stérilisation, ou la désinfection du sol, et le traitement fongicide des plantes affectées en croissance (Waller et Cannon, 2002). La lutte contre le Bayoud repose sur des mesures de quarantaine strictes. Cela est du à l’absence de traitement efficace pour cette maladie (FAO, 2002). La désinfection du sol est très coûteuse et difficile. La lutte chimique n'est envisageable que si on découvre précocement le point de départ d'une nouvelle infection dans une région saine. Dans ce cas, on peut traiter le sol avec du bromure de méthyle. Des sols résistants au Bayoud ont été identifiés au Maroc et en Algérie; les mécanismes de la résistance de ces sols peuvent être de type biotique ou abiotique ouvrant une porte pour de nouvelles stratégies de lutte (OEPP, 2005). Depuis sa première apparition avant 1870 et après une cinquantaine d’années de recherches, on signale qu’il n y a pas de traitement curatif et on ne connaît que peu sur l’interaction palmier dattier/Foa, spécialement le mécanisme de défense de la plante. Il existe chez les plantes des mécanismes de défense stimulés par l’agent pathogène (physiques, biochimiques). Ces connaissances sont nécessaires pour l’utilisation des méthodes préventives telle que la résistance induite (Daayf et al., 2003). 24 3.11.1. Lutte Chimique A cause du coût élevé et des risques encourus, la lutte chimique s’avère pratiquement impossible. Le seul cas où elle peut être envisagée serait pour l’éradication d’un nouveau foyer dans une zone saine (FAO, 2002). Un essai a déjà été mené à ElGoléa, en 1978, avec succès puisque le Bayoud n’y a pas été rencontré depuis. L‘utilisation du bromure de méthyle et de la chloropicrine semble donner de bons résultats (Bounaga et Djerbi, 1990). Le bromure de méthyle et chloropicrine ont été parmi les produits chimiques les plus utilisés contre les ravageurs telluriques. Ils sont extrêmement toxiques mais ne sont pas spécifiques à l’espèce pathogène seulement. Dans plusieurs pays, ces composés sont contrôlés par les législatures des produits toxiques et ne sont pas disponibles commercialement. L’application doit être réalisée par des opérateurs agrées et avec des mesures de sécurité extrêmes (l’injection sous des couches en polythène…). Un accord international est tenu pour prévenir l’utilisation de ces composés au début du 21ème siècle (Hollomon, 2002). 3.11.2. Mesures Prophylactiques L'exclusion d'une maladie des zones non affectées peut être possible par quarantaine, restriction du mouvement des plantes et des parties de plante, certification et autres mesures législatives (Waller et Cannon, 2002). Fusarium oxysporum f.sp. albedinis est un organisme de quarantaine A2 de l'OEPP et revêt aussi une importance de quarantaine pour l'IAPSC. À cause de son fort potentiel de dissémination, il représente de très graves risques d'ordre humain, social et économique à d'autres régions productrices de dattes de la région OEPP (Algérie, Tunisie, et d'autres pays d'Afrique du Nord) et aussi au Proche-Orient. L'Algérie et le Maroc ont mis en place des quarantaines internes sur toutes les oasis infestées pour empêcher le mouvement de rejets des zones infestées vers les zones saines (OEPP, 2005). L'OEPP/EPPO recommande aux pays phoénicicoles d'interdire l'importation du matériel végétal suivant en provenance de pays où le Bayoud est présent: a). Tout matériel végétal de palmier-dattier: rejets, feuilles, artisanat, etc. (mais pas les fruits); 25 b). Terre et végétaux destinés à la plantation (avec racines, boutures) accompagnés de terre; c). Végétaux destinés à la plantation de Lawsonia inermis (excepté les semences) (OEPP, 2005). Les mesures prophylactiques restent une nécessité absolue pour préserver les palmeraies de I’Est algérien et celles de Tunisie (Bounaga et Djerbi, 1990; FAO, 2002). 3.11.3. Lutte génétique La résistance des plantes hôtes est la méthode principale de contrôle pour la plupart des maladies. Le perfectionnement de la résistance chez les plantes est un composant important dans le contrôle de la plupart des maladies (Brown, 1995). Ceci peut être réalisé par les plantes en croissance dans des conditions qui augmentent les mécanismes de résistance déjà opérationnels, ou en incorporant des facteurs de résistance génétiquement contrôlés par la multiplication et récemment par génie génétique (Waller et Lenné, 2002). La lutte génétique se fait par la recherche de cultivars résistants provenant soit de prospections soit de croisements dirigés, soit de populations naturelles issues de graines: les Khalts, testés dans des terrains infestés. Elle se poursuit au Maroc et en Algérie dans les stations de recherches agronomiques (Zagora et Errachidia au Maroc; Adrar en Algérie). Des cultivars d’autres pays sont aussi introduits dans les essais. Malgré les résultats promoteurs obtenus, les palmiers qui paraissent résistants se sont avérés sensibles 8 à 10 ans après leur plantation (Saaidi, 1990; Bounaga et Djerbi, 1990; Louvet, 1991; Tantaoui et Moisson, 1991). Selon El Hassni et al. (2005), parmi les mécanismes d’action des isolats non pathogéniques de Fusarium oxysporum figure l’induction de la résistance par stimulation de la défense dont laquelle sont impliquées les barrières structurales et les enzymes de défense (chitinases, β-1,3- glucanases, peroxidases et polyphénoloxidase…). Le mécanisme de défense du palmier dattier peut aussi être amélioré par l’affaiblissement de la pathogénicité du Foa, en se basant sur ce point. En plus, les différences entre les cultivars du point de vue résistance à un pathogène sont liées aux gènes de résistance qui codent pour des molécules spécifiques à ce mécanisme (Agrios, 2005). 26 3.11.4. Lutte biologique Cette technique prend une ampleur très importante dans la lutte contre les phytopathogènes. Elle est basée sur l’utilisation des microorganismes qui permettent la protection contre la maladie. Le mécanisme est réalisé par une interaction directe ou indirecte (Scott, 1995). L’effet direct est généralement le résultat d’un antagonisme entre l’agent de biocontrôle et l’agent pathogène lié à l’antibiose ou une compétition nutritive et/ou parasitisme. L’effet indirect résulte de la stimulation du mécanisme de défense de la plante contre l’agent pathogène. Dans le cas du palmier dattier, on n’a pas beaucoup de données concernant les microorganismes qui peuvent le protéger contre le Bayoud (El Hassni et al., 2007). Des essais intéressants ont été réalisés pour améliorer les sols sensibles (sensibilité du palmier au Bayoud) et les rendre résistants en introduisant des micro-organismes spécifiques. Mais il serait illusoire de penser pouvoir protéger efficacement et en permanence par de tels moyens une culture pérenne comme le palmier (Louvet, 1991). Malgré que le contrôle biologique est devenu mieux établi particulièrement contre les microbes pathogènes telluriques où les préparations des champignons antagoniques tels que les espèces de Trichoderma disponibles commercialement dans quelques pays, le meilleur moyen de la défense contre beaucoup de maladies (comme seul moyen dans certains cas) est la plantation des cultivars résistants (Waller et Cannon, 2002). Conclusion Parmi toutes les pathologies du palmier dattier, le Bayoud reste la plus grave. Même celles qui entraînent des pertes à la récolte sont préoccupantes mais peuvent trouver des solutions: mesures prophylactiques, nettoyage et traitements chimiques ou biologiques. En plus, malgré les travaux réalisés sur le Bayoud pendant plus de cinquante ans on ne connaît pas tout sur cette maladie (même pour certaines questions majeures). Pour cela, il faut une mobilisation et une coordination parfaite entre les recherches (les pays concernés surtout) pour focaliser les buts et les travaux, parce que les travaux isolés, à but momentanés, à but personnel ne seront jamais efficaces. Il a été démontré l’importance de poursuivre les recherches entamées en Algérie, au Maroc et en Tunisie sur: (1) Les causes et les type de résistance; 27 (2) Le champignon; (3) Les sols des palmeraies; (4) Le palmier dattier, variabilité, sa morphogenèse; (5) La culture in vitro pour multiplier les clones sélectionnés (Bounaga et Djerbi, 1990; Messar, 1996). 28 REFERENCES Agrios G. N. 2005. Plant Pathology. 5th edition, Elsevier Publishing, p. 922. Ben Abdallah A. 1990. La Phoeniciculture. In: Les systèmes agricoles oasiens, Options méditerranéennes, série A/ N°11, Montpellier: CIHEAM, pp: 105-120. Boullard B. 1997. Dictionnaire: Plantes et Champignons. Editions ESTEM, p. 875. Bounaga N. et Djerbi M. 1990. Pathologie du palmier dattier. Les systèmes agricoles oasiens, Options méditerranéennes, série A/ N°11 : 127-132. Bounaga N. 1991. Le palmier dattier: Rappels biologiques et problèmes physiologiques. Dans: Physiologie des arbres et arbustes en zones arides et semi-arides. Groupe d’Etude de l’Arbre, Paris- France, 323-336. Brac de la Perrière R.A. et Benkhelifa A. 1991. Progression de la fusariose du palmier dattier en Algérie. Sécheresse, 2(2): 119-128. Brown J. K. M. 1995. Pathogen’s Responses to the Management of Disease Resistance Genes. In: Advances in Plant Pathology. Vol. 11, Academic Press Limited, 75-102. Chakroune K., Bouakka M. et Hakkou A. 2005. Incidence de l’aération sur le traitement par compostage des sous produits du palmier dattier contaminés par Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. Canadian Journal of Microbiology. 51: 69-77. Corbaz R. 1990. Principes de phytopathologie et de lutte contre les maladies des plantes. 1ère édition. Presses Polytechniques et Universitaires Romandes, p. 286. Daayf F., El-Bellaj M., El-Hassni M., J’Aiti F. et El-Hadrami I. 2003. Elicitation of Soluble Phenolics in Date Palm (Phoenix dactylifera) Callus by Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. Environmental and Experimental Botany, 49: 41-47. 29 Djerbi M. 1991. Biotechnologie du palmier dattier (Phoenix dactylifera L.): Voie de propagation des clones résistants au Bayoud et de haute qualité dattière. Les systèmes agricoles oasiens, Options méditerranéennes, série séminaires, N°04 : 31-38. Duhoux E. et Nicole M. 2004. Atlas de Biologie Végétale: Associations et interactions chez les plantes. 1ère édition, DUNOD, p. 166. El-Hassni M., Verdeil J. L. et El-Hadrami I. 2005. An hypoaggressive Fusarium oxysporum isolate induces polyphenoloxidase activity in the date palm seedling allowing their protection against the Bayoud disease. Plant Pathology Journal, 4(2): 96-102. El-Hassni M., El-Hadrami A., Daayf F., Cherif M., Ait Barka S et El-Hadrami I. 2007. Biological control of Bayoud disease in date palm: selection of micoorganisms inhibiting the causal agent and inducing defense reactions. Environmental and Experimental Botany, 59: 224-234. FAO. 2000. Etude des principaux marchés européens de la datte et du potentiel commercial des variétés non traditionnelles. Etude réalisée par Bernard Ordines. FAO, p 54. FAO. 2002. Date Palm Cultivation. FAO, Rome. 156 Rev.1. FAO. 2010. Production des Aliments et des Produits Agricoles. FAOSTAT Database. Disponible sur: http://faostat.fao.org Ferry M., Toutain G. et Monfort S. 1991. La Multiplication du Palmier Dattier (Phoenix dactylifera L.). In: Physiologie des arbres et arbustes en zones arides et semi-arides. Groupe d’Etude de l’Arbre, Paris- France, 353-363. Fernandez D.1998. De Nouveaux Espoirs pour les Palmiers Dattier d’Afrique du Nord Menacés par le Bayoud. IRD, fiche scientifique N°72. Fernandez D., Ouinten M., Tantaoui A., Geiger J-P., Daboussi M-J. et Langin T. 1998. Fot 1 Insertions in the Fusarium oxysporum f. sp. albedinis Genome Provide Diagnostic PCR 30 Targets for Detection of the Date Palm Pathogen. Applied and Environmental Microbiology, 64 (4): 633–636. Freeman S. et Maymon M. 2000. Reliable Detection of the Fungal Pathogen Fusarium oxysporum f. sp. albedinis, Causal Agent of Bayoud Disease of Date Palm, Using Molecular Techniques. Phytoparasitica, 28(4): 341-348. Hanson J. R. 2008. The Chemistry of Fungi. RSC publishing. p.221. Hollomon D. 2002. Fungicides. In: Plant Pathologist’s Pocketbook. 3rd edition, CABI Publishing, 336-344. Katan T. 1999. Current Status of Vegetative Compatibility Groups in Fusarium oxysporum. Phytoparasitica, 27(1): 273-277. Louvet J. 1991. Que Devons-nous Faire pour Lutter Contre le Bayoud. In: Physiologie des Arbres et Arbustes en Zones Arides et Semi-arides. Groupe d’Etude de l’Arbre, ParisFrance, 337-346. Matthews G.A. 2002. The Application of Chemicals for Plant Disease Control. In: Plant pathologist’s pocketbook. 3rd edition, CABI Publishing, 345- 353. Maude R. B. 2006. Onion Diseases. In: The Epidemiology of Plant Diseases. 2nd edition, Springer, 491-520. Messar E.M. 1996. Le secteur Phoénicicole Algérien : Situation et Perspectives à l’Horizon 2010. Edition CIHEAM, Options Méditerranéennes. pp.23-44 Munier P. 1973. Le Palmier Dattier: Techniques agricoles et productions tropicales. Ed. Maisonneuve et Larose, p.217. OEPP/EPPO. 1997. Nouvelles Informations sur Fusarium oxysporum f.sp. albedinis. Service d’information, Paris, No.08: 97/152. 31 OEPP/EPPO. 2003. Normes OEPP: Protocoles de Diagnostic pour les Organismes Réglementés. Bulletin OEPP/EPPO, 33, 265-269. OEPP/EPPO. 2005. Fiche Informative sur les Organismes de Quarantaine N° 70, Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. p. 06. Ouinten M. 1996. Diversité et Structure Génétique des Populations Algériennes de Fusarium oxysporum f. sp. albedinis, Agent de la Fusariose Vasculaire (Bayoud) du Palmier Dattier. Mémoire doctorat. Université Montpellier II, p.153. Saaidi M. 1990. Amélioration Génétique du Palmier Dattier: Critères de sélection, techniques et résultats. In: Les systèmes agricoles oasiens. Option: méditerranéennes, série A/n°11: 133-153. Scott J. K. 1995. Classical Biological Control of Plant Pathogens. In: Advances in Plant Pathology. Vol. 11, Academic Press Limited, 131-146. Tantaoui A. et Boisson C. 1991. Compatibilité Végétative d’Isolats du Fusarium oxysporum f. sp. albedinis et de Fusarium oxysporum de la Rhizosphère du Palmier Dattier et des Sols de Palmeraies. Phytopathologie méditerranéenne, 30: 155-163. Waller J.M. et Cannon P.F. 2002. Fungi as Plant Pathogens. In: Plant pathologist’s pocketbook. 3rd edition, CABI Publishing, 75- 93. Waller J.M. et Lenné J.M. 2002. Disease Resistance. In: Plant pathologist’s pocketbook. 3rd edition, CABI Publishing, 328- 335. 32 PHYTOPATHOLOGIE & METABOLITES SECONDAIRES 33 CHAPITRE II: PHYTOPATHOLOGIE ET METABOLITES SECONDAIRES 1. Phytopathologie 1.1. Introduction La phytopathologie est la science qui étudie les maladies des plantes et essaye de donner plus de chance à la survie des plantes lorsqu’elles sont soumises à des conditions environnementales défavorables ou en contact avec des microorganismes parasites qui causent les maladies (Vidhyasekaran, 2004). En plus, c’est une science qui a des buts pratiques et nobles pour protéger les aliments de l’homme et les animaux. Les maladies causées principalement par les microorganismes, les insectes, et les herbes néfastes détruisent annuellement entre 31 et 42 % de toutes les récoltes dans le monde entier (Agrios, 2005). Les maladies des plantes peuvent résulter de l'attaque par des champignons, des bactéries, des virus, des insectes ou des plantes parasites (Vidhyasekaran, 2004). Les insectes peuvent également agir en tant que vecteurs des maladies des plantes et fournir des moyens pour que les microbes pathogènes entrent dans les plantes. Cependant, ce n'est pas vrai que toutes les interactions champignon-plante causent des problèmes à la plante. La croissance de certaines plantes, telles que les orchidées, dépend d'un champignon. Certains micro-organismes peuvent faciliter la dégradation de certains constituants chez les plantes (Hanson, 2008). Les organismes mycorrhizaux s'élevant autour du système de racine peuvent faciliter la dégradation de l'humus et le dégagement des minerais et du phosphate pour la plante (Walters et Daniell, 2007). Les champignons pathogènes représentent environ 10 000 espèces, dont certaines sont des biotrophes (parasites obligatoires), alors que d’autres n’infectent les plantes que pour accomplir une partie de leur cycle. Leur reproduction est assurée par voie sexuée ou asexuée. Les champignons imparfaits ne connaissent pas de forme sexuée ; ils ne se reproduisent que par voie asexuée (Duhoux et Nicole, 2004). 1 .2. Maladies causées par les pathogènes telluriques Le sol est un habitat favorable pour les micro-organismes et est habité par un large éventail de bactéries, champignons, algues, virus et protozoaires. Les sols contiennent un 34 grand nombre de micro-organismes, habituellement entre un et dix millions par gramme de sol (les bactéries et champignons sont les plus répandus). Quelques micro-organismes présents dans le sol peuvent également infecter les plantes. Ces microbes pathogènes telluriques peuvent accomplir leur cycle de vie dans le sol, ou peuvent dépenser une partie dans les parties aériennes de la plante (Corbaz, 1990; Lucas, 2006). Les microbes pathogènes telluriques exigent une plante susceptible pour le développement de leur phase parasite, mais ils peuvent persister dans le sol comme saprophytes sur des résidus, ou en tant que formes résistantes et dormantes, pendant plusieurs semaines à plusieurs années, selon leur biologie. Les phases parasites et saprophytes peuvent être affectées par les caractéristiques physico-chimiques et biologiques du sol. Les microbes pathogènes telluriques affectent généralement le système racinaire des plantes ou la base de la tige, se développant dans certains cas sur des parties supérieures de la plante menant aux maladies vasculaires (Agrios, 2005; Lucas, 2006). Les maladies vasculaires ont des effets sur la translocation des aliments et de l'eau à travers les vaisseaux conducteurs et vers les cellules menant à la chlorose et flétrissement (Hanson, 2008). Les champignons se trouvent dans le sol sous forme de spores. Outre les spores de propagation, asexuées, et celles de maintien, sexuées, on trouve dans le sol des sclérotes, amas de mycélium, très résistant aux éléments extérieurs et exerçant la même fonction que les spores sexuées. Les chlamydospores représentent elles aussi un élément de longue durée, bien qu’issues de multiplication asexuée. Il y a donc dans le sol une plus grande variété d’éléments infectieux que sur les feuilles où dominent les spores de propagation (Corbaz; 1990). De tels microbes pathogènes peuvent causer des dommages importants aux récoltes en limitant la prise d'eau et d'éléments nutritifs (nécrose de racine) et/ou le transfert vers les parties supérieures de la plante (maladie vasculaire), ou en réduisant la qualité des produits végétaux souterrains (la putréfaction de racine ou de tubercule,...) (Lucas, 2006). 1.3. Mécanismes d’infection Comment les microbes pathogènes attaquent leurs plantes hôtes? C’est l'une des questions les plus intéressantes en pathologie des plantes. Les champignons causent 35 environ 10.000 maladies différentes aux plantes. Les maladies fongiques des plantes causent des pertes économiques en réduisant la germination des graines, destruction des plantes et en sécrétant les métabolites secondaires. La colonisation réussie de la plante, y compris la prise des aliments et la reproduction, dépend considérablement d'un mode efficace de l'infection. Les champignons parasites de plantes ont développé diverses stratégies pour acquérir leurs hôtes, et pour établir le contact direct avec eux (Struck, 2006). Les micro-organismes pathogènes, des agents biotiques transmissibles qui peuvent causer la maladie, désignés généralement sous le nom de microbes pathogènes, causent généralement des maladies chez les plantes en perturbant le métabolisme des cellules à travers les enzymes, toxines, régulateurs de croissance, et d'autres substances qu'ils sécrètent et en absorbant les substances alimentaires des cellules hôtes pour leur usage personnel (Strange, 2003). Quelques microbes pathogènes peuvent également causer la maladie en se multipliant dans le xylème ou le phloème des plantes, bloquant de ce fait le transport ascendant de l'eau ou du mouvement des sucres ou autres substances (Agrios, 2005). Les mécanismes d'infection des champignons pathogènes sont hautement variables. Pendant les phases précoces du procédé d'infection avant d'envahir le tissu végétal, le développement des champignons dépend considérablement des conditions environnementales favorables telles que l'humidité extérieure, l'hygrométrie, la température et la lumière. Dans certains cas, l'approvisionnement en aliments sur la surface peut également avoir une influence sur la germination (Struck, 2006). 1.3.1. Interaction plante/champignon L'interaction phytopathogénique entre un champignon et une plante comporte une combinaison d’étapes enzymatiques et chimiques. Une image généralisée peut fournir des informations sur cette interaction (Hanson, 2008). Les champignons pathogènes infectent les plantes pour avoir la nourriture et se multiplier, selon le type de champignon, l'organe et le tissu qu'ils infectent, les champignons pathogènes interfèrent avec les fonctions physiologiques différentes de la plante et mènent au développement de différents symptômes. Ainsi, un champignon pathogène qui infecte et tue les fleurs d'une plante interfère avec la capacité de la plante à se reproduire. Un champignon pathogène qui 36 infecte et tue les racines réduit la capacité de la plante à absorber l'eau et les aliments. De même, un champignon pathogène qui infecte et tue les feuilles ou détruit leur chlorophylle mène à la réduction de la photosynthèse, et ainsi de suite. Dans la plupart des cas, le rapport entre les symptômes de la maladie et les fonctions physiologiques affectées est évident et compréhensible. Dans d'autres cas, ce rapport est plus complexe et l'explication n'est pas toujours simple (Agrios, 2005). Parmi les découvertes récentes, plusieurs gènes qui codent pour la biosynthèse des métabolites fongiques phytotoxiques sont groupés et par conséquent leur expression pourrait être réglée par un composé simple (Hanson, 2008). 1.4. Les phases d’infection Pour bénéficier des éléments nutritifs nécessaires à la croissance, les champignons parasites vont se heurter à des barrières physiques efficaces de la plante: la cuticule foliaire, l’écorce des tiges et des racines ou les parois cellulaires. Peu de champignons exercent une action mécanique suffisante pour franchir ces obstacles; ils pénètrent alors par les ouvertures naturelles (exemple, stomates), ou les blessures, ou après la digestion des structures de surface. Pour coloniser et détruire la plante, ils déploient des armes chimiques très variées parmi lesquelles les enzymes, les toxines, les hormones et les polysaccharides représentent un arsenal dont l’importance dans la pathogénie varie cependant d’un parasite et d’une plante à l’autre (Strange, 2003; Duhoux et Nicole, 2004). Il existe plusieurs étapes pour que le pathogène puisse réussir l’infection, les principales sont : 1.4.1. Attachement des spores fongiques La première étape de l'infection est l'adhérence des propagules fongiques sur la surface de plante. Un processus obligatoire est essentiel pour résister au déplacement par le vent ou l'eau. Bien que l'adhérence sur les surfaces de la plante soit commune parmi toutes les espèces fongiques, il y a des différences concernant les facteurs qui induisent le procédé d'attachement et dans la composition du matériel adhésif (Agrios, 2005; Struck, 2006; Hanson, 2008). 1.4.2. Germination des spores Il n'est pas clair ce qui déclenche exactement la germination des spores, mais la stimulation par le contact avec la surface de l'hôte, l'hydratation et l'absorption du matériel ionique de faible poids moléculaire de la surface de l'hôte, et la disponibilité des aliments jouent un rôle. Les spores ont également des mécanismes qui empêchent leur germination 37 jusqu'à ce qu'ils sentent de telles stimulations ou quand il y a trop de spores dans leur proximité. Une fois que la stimulation pour la germination ait été reçue par la spore, cette dernière mobilise ses réserves de nourriture stockées, telles que les lipides, les polyols, et les glucides, et les dirige vers la synthèse rapide de la membrane et la paroi cellulaire pour la formation et l'élongation du tube germinatif. Ce dernier est une structure spécialisée distincte du mycélium fongique, s'élevant souvent pour une distance très courte avant qu'il ne se différencie en appressorium (Corbaz, 1990; Agrios, 2005; Hanson, 2008). 1.4.3. Entrée du tissu végétal Les microbes pathogènes fongiques peuvent pénétrer à travers les blessures, les ouvertures naturelles telles que les stomates et les lenticelles, les stigmates, ou en perçant la surface de la plante et en entrant par pénétration active (utilisant les enzymes de dégradation ou par force mécanique) (Duhoux et Nicole, 2004; Agrios, 2005; Struck, 2006). Chez beaucoup de champignons, la pénétration de la paroi, par l'action enzymatique ou par pression, est lancée par la différentiation de l'appressorium qui s’attache fermement à son substrat et augmente la surface de contact entre le champignon et l'hôte. L’appressorium provoque une pression de turgescence élevée qui permet de pénétrer la paroi cellulaire de la plante (Agrios, 2005; Struck, 2006). L’appressorium génère un hyphe d’infection qui pénètre sous l’épiderme pour envahir les parenchymes. Dans le cas des cycles plus complexes, comme celui des agents de rouille, le mycélium intercellulaire adhère à la paroi de la cellule végétale et différencie un haustorium intracellulaire dont la fonction est de détourner les réserves au profit du champignon. Chacune de ces étapes résulte d’un déterminisme chimique, topographique, mécanique ou thermique (Duhoux et Nicole, 2004). 1.5. Développement et propagation des maladies Les cellules vivantes des plantes sont des systèmes complexes dans lesquels beaucoup de réactions biochimiques interdépendantes ont lieu. Ces réactions et processus complexes sont bien organisés durant la vie normale. La perturbation d’une quelconque d'entre ces réactions métaboliques cause la rupture des processus physiologiques qui soutiennent la plante et mène au développement de la maladie (Deadman, 2006). La 38 formation de spores est l’une des formes d’adaptation des champignons à certains changements de l’environnement (Aylor, 2003). La transmission des spores fongiques ou d'autres propagules à l'intérieur et entre des populations de plantes est un processus important dans le développement des maladies des plantes, et la connaissance des moyens de la transmission d'un microbe pathogène est nécessaire pour le choix des mesures de contrôle appropriées (Strange, 2003). Il existe différents mécanismes de propagation de microbe pathogène de plante comme les spores fongiques, particules virales et les bactéries (des cellules et des spores). Le transport des spores fongiques par le vent peut se produire à de longues distances et aux hautes altitudes. Les champignons produisent généralement des spores dormantes ou d'autres structures résistantes qui fournissent des moyens de survie. Beaucoup de microbes pathogènes telluriques peuvent être dispersés (spores fongiques) par les eaux souterraines (l'eau de pluie ou l'eau d'irrigation) ou par des opérations agricoles et peuvent provoquer localement des épidémies intenses (Waller et Cannon, 2002; McCartney et al., 2006). La dispersion a été longtemps identifiée en tant que principe fondamental au développement des épidémies de maladie des plantes, parce que sans dispersion beaucoup d'épidémies échoueraient pour progresser. Ces dernières années, l'agriculture, particulièrement dans le monde développé, a relevé une pression croissante de produire des récoltes d’une manière soutenable et favorable à l'environnement. En conséquence, il y a des besoins urgents pour des systèmes plus efficaces de gestion de la maladie. La compréhension de la dynamique temporelle et spatiale des épidémies de la maladie est cruciale au développement de tels systèmes (McCartney et al., 2006). 1.6. Diagnostic Le diagnostic de la maladie, pendant les études sur l'épidémiologie ou généralement comme control, diffère de plusieurs manières de l'identification et de la taxonomie des micro-organismes causaux ou d'autres agents pathogènes (Strange, 2003). Une plante serait malade quand ses fonctions normales sont anormales. Ces troubles peuvent être provoqués par les agents pathogènes, résulter des anomalies génétiques, du déséquilibre minéral, de la pollution ou d'un certain nombre de facteurs abiotiques (Fox et Narra, 2006). 39 Les symptômes qui sont observés sont le résultat accumulé de nombreux changements au niveau cellulaire (Strange, 2003). Parfois l'indication la plus évidente qu'une plante est malade est l'aspect végétatif ou fruitier du microbe pathogène. Ce dernier se nomme souvent les signes d'infection. Chez quelques plantes malades, les seuls symptômes ou signes sont internes et ainsi l'évaluation exige la dissection, de ce fait détruisant l'hôte (Fox et Narra, 2006). 1.7. Traitement Les maladies indigènes sont contrôlées par un certain nombre de méthodes: culturales, rotation de récolte et en employant des produits chimiques pour traitements des graines, stérilisation et amendements des sols. Les techniques de lutte chimique ont joué un rôle majeur dans le contrôle des microbes pathogènes. Puisque les fongicides sont généralement efficaces et dans certains cas, les seules méthodes de contrôle, ils augmentent la confiance sur leur utilisation. Cependant, les pesticides sont mauvais pour l'environnement et les consommateurs souhaitant consommer les aliments sans pesticides; leur utilisation est donc contrôlée (Hardwick, 2006). L'identification de la source d'un microbe pathogène fongique est une étape principale en concevant la lutte efficace contre la maladie car ceci peut permettre l'élimination ou la réduction de la source avant que les épidémies de la maladie puissent commencer (Waller et Cannon, 2002). Les techniques de contrôle qui éliminent ou réduisent le microbe pathogène peuvent être résumées dans les points suivants: 1. Méthodes de culture qui suppriment ou réduisent le microbe pathogène (extirpation de l'hôte, rotation de récolte, hygiène, créant des conditions défavorables au microbe pathogène). 2. Méthodes biologiques qui suppriment ou réduisent le microbe pathogène (sols suppressifs). 3. Réduction de la quantité d'inoculum de microbe pathogène par les micro-organismes antagoniques (microbes pathogènes telluriques, microbes pathogènes aériens). 4. Méthodes physiques qui suppriment ou réduisent l'inoculum (traitement par chaleur, en éliminant certaines longueurs d'onde de la lumière, en séchant les grains et les fruits 40 stockés, la lutte contre la maladie par réfrigération, la lutte contre la maladie par radiation, les fossés comme barrières contre les maladies transmises par les racines d'arbre). 5. Méthodes chimiques qui suppriment ou réduisent l'inoculum (traitement de sol avec des produits chimiques, la fumigation, la désinfestation des entrepôts, le contrôle des insectes vecteurs) (Agrios, 2005). 1.7.1. Traitement chimique 1.7.1.1. Utilisation des fongicides Les fongicides sont l'un des éléments principaux des stratégies modernes de protection des cultures mais la résistance aux fongicides les plus modernes et les plus systémiques a évolué dans au moins quelques populations de microbes pathogènes (Corbaz, 1990; Brown, 2006). 1.7.1.2. Types de fongicides Les produits chimiques employés pour contrôler les maladies des plantes se divisent en trois groupes selon leur mode biologique d'action: a. Stérilisants et fumigènes Ceux-ci ont un large éventail d'activité, mais ne sont pas généralement appliqués aux plantes en croissance. Ils suppriment les microbes pathogènes (et les parasites) et stérilisent effectivement le sol et les produits. Ils sont les inhibiteurs multisites (Corbaz, 1990; Hollomon, 2002). Comme exemple, le bromure méthylique (l'utilisation du bromure méthylique a été éliminée dans les pays d'UE dès 2005 et son utilisation dans les pays en voie de développement limitée à 2015) habituellement mélangé à la chloropicrine a été le stérilisant de sol chimique le plus populaire car le fumigène pénétrera le sol efficacement. Le bromure méthylique est extrêmement toxique et devrait être appliqué par les personnes qualifiées comme gaz sous le polythène ou le recouvrement imperméable multicouche. D'autres fumigènes sont dazomet et metam-sodium. Un solide, tel que le dazomet, peut être dispersé au dessus du sol et être incorporé par culture. Après une période de traitement, qui varie avec le fumigène utilisé, le sol doit être aéré avant la culture. Avant d'employer le sol traité, un test avec des graines de cresson (espèce à germination rapide) indiquera si la phytotoxicité est susceptible de se produire (Matthews, 2002). 41 b. Protectants Une fois appliqués à la graine ou aux récoltes en croissance, ceux-ci établissent une barrière chimique protectrice couvrant toutes les surfaces de l'hôte afin d'empêcher l'infection. La plupart des protectants ne sont pas systémiques et nécessitent la répétition des applications pour protéger le nouveau feuillage. Les fongicides protectants récemment présentés, tels que les strobilurins et les quinolines, se déplacent comme vapeur dans la récolte et s'accumulent dans la couche de cire de nouvelles feuilles pendant qu'ils émergent. En termes de quantité, les fongicides protectants sont les plus utilisés à l'échelle mondiale (Hollomon, 2002). c. Eradicants Appliqué à la graine ou aux récoltes en croissance, ceux-ci sont absorbés et migrent vers le haut dans le xylème pour protéger systémiquement la plante. La croissance des microbes pathogènes est arrêtée, mais rarement des membres de ce groupe sont fongicides. Sur les récoltes boisées, ils tendent à être employés comme protectants. Habituellement, ils agissent à un seul site biochimique de cible (Hollomon, 2002). Le contrôle chimique des maladies des plantes est devenue plus difficile pendant que plusieurs fongicides efficaces ont perdu leur autorisation d'utilisation, et certains pathogènes ont évolué pour être résistants aux fongicides généralement utilisés (Duke et al., 2008). 1.7.2. Contrôle biologique La lutte biologique est née d’un certain échec de la lutte chimique, essentiellement du à de nombreux abus, à la présence des résidus ainsi qu’à une absence de vue globale des différents problèmes, en particulier l’impact sur l’environnement. Les traitements chimiques ont augmenté considérablement, jusqu’à devenir dans certains cas insupportables sur le plan économique (Corbaz, 1990). Les agents de biocontrôle permettent la protection contre la maladie par un antagonisme avec l’agent pathogène, qui implique une interaction directe ou indirecte (Scott, 1995). L’effet direct est généralement le résultat d’un antagonisme entre l’agent de biocontrôle et l’agent pathogène lié à l’antibiose ou une compétition nutritive et/ou 42 parasitisme. L’effet indirect résulte de la stimulation du mécanisme de défense de la plante contre l’agent pathogène (El Hassni et al., 2007). Bien que le traitement chimique représente une solution rapide, facile et totale, la lutte biologique n’a qu’une efficacité relative mais elle est intéressante sur tous les plans (Corbaz, 1990). Le contrôle biologique des phytopathologies est comme alternatif dans les cas ou les autres méthodes de traitement sont difficiles à appliquer. La littérature présente plusieurs exemples de pathogènes qui ont été contrôlés biologiquement par des espèces antagonistes (Calvo et al., 2005). 1.7.3. Traitement génétique L’utilisation des cultivars résistants est l’une des stratégies de lutte les plus efficace et rentable. Il est possible que cette méthode sera plus utilisée les prochaines années pour faire plaisir aux consommateurs d’avoir des aliments sains et un environnement propre. Cependant, l’efficacité des cultivars résistants dans la gestion de la maladie est possible limitée par la variabilité pathogénique dans les populations des pathogènes (JiménezGasco et al., 2004). La résistance est généralement liée à la capacité de bloquer l’agent pathogène par certains mécanismes contrôlés par des gènes appelés « gènes de résistance » (Hammerschmidt, 2007). La principale méthode pour le contrôle des maladies est la résistance des plantes hôtes (Brown, 1995). Les plantes en croissance peuvent augmenter les mécanismes de résistance (déjà opérationnels) ou en incorporant des facteurs de résistance génétiquement contrôlés par la multiplication et récemment par génie génétique (Waller et Lenné, 2002; Hammerschmidt, 2007). 1.8. Evaluation et prévision L'évaluation de la maladie est le processus qui produit toutes les données qui mesurent le progrès de la maladie. Il est donc critique que les méthodes d'évaluation de la maladie soient bien définies et normalisées à l'étape la plus préliminaire possible (Teng et James, 2002). Les prévisions de la maladie sont exigées pour trois raisons principales, la première est économique, la deuxième sécurité et la troisième est l'utilisation justifiée. L'issue 43 économique est de réduire le coût de production par l'application opportune des mesures de contrôle, habituellement sous forme de fongicides. Ceci évite le gaspillage inutile des fongicides qui sont alors habituellement appliqués au début de l'épidémie (Hardwick, 2006). Les maladies des plantes ont été étudiées la première fois en raison des pertes de rendement qu'elles causent, pourtant le développement des techniques et des programmes pour estimer ces pertes ont été relativement négligés comparés à d'autres spécialisations en phytopathologie. Les évaluations fiables de perte de rendement sont une chose nécessaire au développement de n'importe quel programme raisonnable et économique de protection des plantes. Le coût de la perte doit être connu de sorte qu'il puisse être comparé au coût de contrôle (Teng et James, 2002). Les mesures de protection incluent la pulvérisation des plantes exposées aux épidémies, qui peuvent être prévisibles, traitement de graine contre les microbes pathogènes telluriques, traitement des produits stockés et l'utilisation des préservatifs de bois de construction. Les pratiques culturales telles que la synchronisation de la plantation et de la moisson pour réduire les possibilités de l'infection et la modification des conditions de sol pour déstabiliser le pathogène et favoriser les antagonistes (Waller et Cannon, 2002). 1.9. Phytopathologie, entre résistance et susceptibilité Les plantes ont développé des systèmes de détection et de réponse sophistiqués qui déchiffrent les signaux du microbe pathogène, induisent la synthèse de divers composés antifongiques et enrichissent leurs composants de paroi cellulaire pour se défendre (Vidhyasekaran, 2004). Pour que la pathogénie réussisse, les microbes pathogènes doivent surmonter ces mécanismes de défense en produisant des signaux appropriés. Suivant la perception des signaux de microbe pathogène, plusieurs voies de signalisation sont activées chez les plantes induisant la résistance aux microbes pathogènes. L'effet des signaux de plante et de microbe pathogène permet à la plante un control fin de la réponse de défense, et au microbe pathogène de succomber à l'environnement toxique de la plante, ayant pour résultat la susceptibilité de la maladie ou la résistance. La résistance et la susceptibilité sont souvent déterminées au niveau unicellulaire (Vidhyasekaran, 2008). La plante réagit à la tentative de pénétration très tôt en suivant deux voies différentes: (a) La 44 mobilisation de substances existantes et (b) Production d’armes chimiques nouvelles (Corbaz, 1990). Il a été montré que le contact physique du microbe pathogène, appelé le "premier contact", est susceptible de lancer divers systèmes de signalisation et de transduction dans le procédé d'infection fongique (Vidhyasekaran, 2004).. Le premier contact ou le contact extérieur initial peut induire les spores fongiques pour germer et différencier pour former des structures d'infection, telles que l'appressorium (Vidhyasekaran, 2008). 1.10. Mécanismes qui provoquent la susceptibilité Les principaux groupes de substances sécrétées par les microbes pathogènes qui semblent être impliquées dans la production de la maladie, directement ou indirectement, sont les enzymes, les toxines, les régulateurs de croissance, et les polysaccharides. Ces substances varient considérablement quant à leur importance dans la pathogénicité, et leur importance relative peut être différente d'une maladie à l'autre. Ainsi, dans certaines maladies les enzymes semblent être les plus importantes, tandis que dans d'autres, les régulateurs sont apparemment les substances principales impliquées. Les enzymes, toxines, et les régulateurs de croissance, probablement dans cet ordre, sont considérablement plus communs et probablement plus importants dans le développement de maladie des plantes. Quelques microbes pathogènes produisent des composés qui agissent en tant que suppresseurs des réponses de la défense de la plante hôte (Duhoux et Nicole, 2004; Agrios, 2005). 1.10.1. Enzymes Le premier contact physique d’un champignon avec sa plante hôte concerne des polymères végétaux importants: la cutine, la subérine ou la cellulose. Les parois cellulaires sont riches en cellulose, hémicelluloses, pectines, protéines, voire lignines (Duhoux et Nicole, 2004). La destruction de la paroi cellulaire de plante par de nombreux champignons phytopathogéniques est un aspect important du procédé d'infection. Les champignons pathogènes produisent des enzymes, qui dégradent la paroi cellulaire pour faciliter la pénétration et pour obtenir des aliments de la cellule. La dégradation microbienne de la cuticule et les enzymes dégradantes de la paroi cellulaire (CWDEs) comme les cutinases, les cellulases et les pectinases ont en général un impact important sur 45 la pathogénie, elles sont omniprésentes dans beaucoup d'interactions plante-pathogène (Tableau 1) (Struck, 2006; Vidhyasekaran, 2008). Généralement, la dégradation de la paroi cellulaire d’une plante comporte un effet concerté et/ou synergique de plusieurs familles d'enzymes comprenant les cellulases, les xylanases, les pectinases et les protéases adaptées aux différents polymères de la paroi cellulaire. Assortissant à la complexité des composants de la paroi cellulaire de plante, les microbes pathogènes fongiques peuvent produire un large éventail d'enzymes extracellulaires capables de dégrader la paroi cellulaire. Ces enzymes peuvent être essentielles pour la pathogénicité (Struck, 2006). Ces enzymes agissent en tant que facteurs de virulence, mais certains d'entre eux peuvent agir en tant qu'éliciteurs. La cellulase cause l'accumulation rapide des phytoalexines dans des cultures cellulaires de Nicotiana tabacum, une augmentation de la production du capsidiol et du debneyol, et la production de deux phytoalexines inconnues. La pectolyase est une enzyme dégradante de la paroi cellulaire et également un éliciteur, qui est un inducteur efficace de dépolarisation de la membrane cellulaire du N. tabacum (Vidhyasekaran, 2008). Tableau 1: Enzymes fongiques impliquées dans la dégradation des parois végétales (Duhoux et Nicole, 2004). Constituant cellulaire Cellulose Enzyme Cellulase et β-glucosidase Fonction Hydrolyse Endo- et exoglucanase Hémicelluloses Hémicellulase, xylanase,… Hydrolyse Pectines Pectine lyase Hydrolyse Pectine méthyl-estérase Hydrolyse ester Polygalacturonase Hydrolyse Lignines Ligninase, laccase, lignin-peroxydase Oxydation Cutine Cutinase Hydrolyse Subérine Oxydase et lipase Oxydation, hydrolyse Protéines Protéase, protéinase Hydrolyse 46 1.10.1.1. Cutinases La pénétration de la cuticule pourrait être réalisée par la dégradation du polymère de cutine par les cutinases qui sont des sérines estérases appartenant à la classe des hydrolases (Agrios, 2005; Struck, 2006). Il a été montré que les cutinases et autres estérases sont impliquées dans l'adhérence de quelques champignons. Les conidies de Blumeria graminis f. sp. hordei, pathogène d'orge, libèrent rapidement un liquide lors du contact avec une feuille d'orge. Le dégagement de l'exsudat sur la surface des feuilles d'orge a eu comme conséquence une perte apparente d'intégrité structurale de la surface cuticuleuse fondamentale. L'exsudat contenant une activité de cutinase a été impliqué dans l'érosion de la cuticule de feuille. L'érosion cuticuleuse présente une surface qui déclenche l'identification, qui lance le procédé d'infection (Vidhyasekaran, 2008). Les cutinases sont des facteurs de pathogénicité pour les champignons qui doivent pénétrer la surface de l'hôte directement. La virulence de certains pathogènes s'est avérée être liée à leur capacité de produire des cutinases. La virulence des isolats de Fusarium solani f. sp. pisi a été liée à leur capacité de produire la cutinase. Le blocage de la cutinase de F. solani f. sp. pisi a donné naissance à des mutants qui n'ont aucune pathogénicité (Agrios, 2005; Vidhyasekaran, 2008). 1.10.1.2. Cellulases La cellulose est le polysaccharide principal de la paroi. Elle se compose d'unités de glucose dans une configuration en chaînes, reliées par des liaisons β-1,4-glycosidiques. L'hydrolyse enzymatique de la cellulose exige l'action d'endo-glucanase (endo-β-1,4 glucanase) et des exo-glucanases (β-1,4-cellobiohydrolase et β-glucosidase) (Marouf et Tremblin, 2009). La dégradation de la cellulose dans les parois de cellule a été démontrée par des études histologiques. La cellulose dans les racines de tabac a été marquée en employant l'exo-glucanase complexé avec l'or. Le marquage a diminué dans les tissus de racine de tabac inoculés avec Phytophthora parasitica var. nicotianae, indiquant la dégradation de la cellulose pendant la pathogénie fongique. Ces études histologiques ont démontré la participation des cellulases dans la pathogénie fongique (Vidhyasekaran, 2008). 47 Plusieurs microbes pathogènes sont connus pour leur production d’enzymes cellulolytiques. Venturia inaequalis, le microbe pathogène de pomme, produit en cultures 12 isozymes de cellulase avec des points isoélectriques de 3.7-5.6. Ces enzymes ont pu être isolées également dans des feuilles de pomme atteintes du microbe pathogène (Vidhyasekaran, 2008). Il a été montré que les cellulases sont produites par plusieurs champignons, bactéries, nématodes phytopathogéniques et les plantes supérieures parasites. Les champignons saprophytiques, principalement certains groupes de basidiomycètes, et à degré inférieur, les bactéries saprophytiques causent la dégradation de la majeure partie de la cellulose dans la nature (Agrios, 2005). Dans les tissus vivants de la plante, les enzymes cellulolytiques sécrétées par les microbes pathogènes jouent un rôle dans le ramollissement et la désintégration du matériel de la paroi cellulaire. Elles facilitent la pénétration et la diffusion du microbe pathogène dans l'hôte et causent l'effondrement et la désintégration de la structure cellulaire, facilitant de ce fait au microbe pathogène de provoquer la maladie. Les enzymes cellulolytiques peuvent plus loin participer indirectement au développement de la maladie en libérant des chaînes de cellulose, des sucres solubles qui servent comme nourriture pour le microbe pathogène et, dans les maladies vasculaires, par la libération de grandes molécules de cellulose dans les voies conductrices, qui perturbent le mouvement normal de l'eau (Vidhyasekaran, 2004). 1.10.1.3. Pectinases La cuticule est la première couche couvrant les parois externes des cellules épidermiques. Les pectinases sont des enzymes qui dégradent les pectines. Ces dernières se composent principalement d'un mélange d'acide polygalacturonique avec des branches de plusieurs sucres (Vidhyasekaran, 2008). Ils se trouvent au niveau des parois cellulaires de plante et dans les lamelles moyennes. Les pectines existent sous de nombreuses formes et sont dégradées par les enzymes telles que la pectine lyase, la polygalacturonase, et la pectine méthylestérase (Marouf et Tremblin, 2009). Ces enzymes semblent jouer un rôle de pathogénicité chez quelques champignons. Les pectinases, sont codées par des familles de multigènes, et la preuve de leur importance comme facteurs essentiels de pathogénicité est difficile. Néanmoins, la rupture du gène codant une pectate lyase chez des espèces de Colletotrichum a produit des mutants avec une pathogénicité réduite (Agrios, 2005). 48 La production des enzymes pectolytiques est également réprimée quand le microbe pathogène se développe en présence du glucose. Cependant, dans quelques combinaisons résistantes hôte-microbe pathogène, les enzymes pectolytiques semblent obtenir la réponse de la défense de plante par le dégagement des fragments pectiques de la paroi cellulaire qui fonctionnent comme éliciteurs endogènes des mécanismes de défense de l'hôte (Agrios, 2005). 1.10.2. Mycotoxines Les mycotoxines sont des métabolites fongiques toxiques qui sont libérés par relativement peu de champignons mais présents universellement (Corbaz, 1990). Plusieurs mycotoxines sont carcinogènes prouvés, peuvent perturber le système immunitaire, et peuvent retarder la croissance des animaux ou des humains (Agrios, 2005). Les toxines agissent directement sur les constituants cellulaires causant des désordres physiologiques irréversibles aux cellules infectées. Les modifications de la perméabilité membranaire, l’inhibition de l’activité de certaines enzymes et de leur transcription, ou l’altération des facteurs de croissance constituant l’essentiel de l’action des toxines à l’encontre des cellules végétales (Duhoux et Nicole, 2004). L'importance des mycotoxines dans le développement fongique de la maladie a été démontrée par différentes manières. Les microbes pathogènes toxinogènes mutants en toxines n'ont pas causé les symptômes de la maladie sur les cultivars susceptibles. Le saprophyte devient pathogène par l'insertion du (des) gène(s) de toxine(s). L'addition des toxines aux isolats avirulents d'un microbe pathogène ou saprophyte peut le rendre pathogène et les symptômes de la maladie peuvent se développer (Vidhyasekaran, 2008). Quelques toxines agissent en tant que poisons protoplasmiques généraux et affectent beaucoup d’espèces végétales représentant différentes familles. D'autres sont toxiques seulement à quelques espèces ou variétés de plantes et sont complètement inoffensifs à d'autres (Duhoux et Nicole, 2004; Agrios, 2005). Les espèces de Fusarium produisent divers métabolites toxiques. La fusarine C est un métabolite mutagénique de F. monoliforme. Les fumonisines sont un autre groupe de mycotoxines qui ont été isolées. Ils ont été associés à une forte incidence de cancer de l'oesophage et de plusieurs maladies animales. La simple molécule monoliformine est également une toxine (Strange, 2003; Hanson, 2008). Voici quelques exemples de mycotoxines: 49 1.10.2.1. Trichothécènes Les trichothécènes comme nivalenol, deoxynivalenol (vomitoxine) et toxine T2 sont les contaminants majeurs du blé, orge, maïs et autres aliments. Ils sont parmi les agents causaux des problèmes de santé chez l’homme et les animaux (Lee et al., 1986). Les trichothécènes ont le squelette fondamental de sesquiterpénoïde. L'aleukia toxique alimentaire est une mycotoxicose qui est produite par des champignons du genre Fusarium en croissance sur les céréales. La maladie est caractérisée par des dommages au niveau du système hémopoïétique. Aux étapes initiales, il y a inflammation et lésions de la peau et, comme la maladie progresse, elle cause des atrophies de la moelle osseuse et provoque la mort par suite (Hanson, 2008). Beaucoup de champignons producteurs de trichothécènes sont pathogènes de plantes. Trichothécènes, diacetoxyscirpénol et toxine T2 sont des exemples tout à fait communs et produisent le roussissement du feuillage de certaines plantes. Il y a une autre preuve indirecte qui implique les trichothécènes dans la phytotoxicité. Par exemple, un isolat de F. tricinctum, qui a été isolé dans le gazon qui avait subi un flétrissement jaune, a donné un bon rendement de toxine T2 (Strange, 2003; Hanson, 2008). 1.10.2.2. Zéaralénone Zéaralénone (toxine F-2) est une mycotoxine avec activité oestrogénique et une cancérogénicité suspectée qui est produite par Fusarium telle que F. graminearum. Elle peut causer des troubles de fertilité. L'alcool, zéaranol, est employé en médecine vétérinaire comme agent anabolique. En particulier, il se lie au récepteur d'oestrogène et stimule la synthèse protéique (Lee et al., 1986; Hanson, 2008). 1.10.2.3. Aflatoxines Les aflatoxines sont connues la première fois lors de la mort des milliers de dindes et de canards à Londres en 1960. Les investigations ont prouvé que la maladie n'a pas été transmise entre les oiseaux mais a été associée à leur alimentation, qui avait provenu d'un moulin à Londres. Les aflatoxines ont été identifiées comme le métabolite toxique responsable de cette maladie. Environ 20 aflatoxines ont été maintenant isolées, dont le B1, le B2, les G1 et les G2. On les rencontre dans de nombreux aliments y compris les noix 50 comestibles, les graines oléagineuses et les céréales sur lesquelles A. flavus s'est développé comme organisme de détérioration (Agrios, 2005; Hanson, 2008). Les aflatoxines sont extrêmement toxiques, ils apparaissent dans le lait des animaux consommant les aliments contaminés, attaquent principalement le foie, et sont mutagéniques, tératogéniques, et cancérogènes. Durant ces dernières décennies, plusieurs cas d'aflatoxicose se sont produits dans les pays tropicaux où beaucoup d'adultes dans les populations rurales consomment souvent le maïs moisi. Les examens de sang ont indiqué la présence des aflatoxines chez ces personnes (Strange, 2003; Agrios, 2005). 1.10.2.4. Acide fusarique L’acide fusarique (acide 5-butylpicolinique) a été découvert pour la première fois durant la culture de Fusarium heterosporum Nees. Ce composé est parmi les premiers métabolites fongiques impliqués dans la pathogénie. L’acide fusarique peut augmenter la toxicité des autres mycotoxines (Bacon et al., 1996). L’acide fusarique est un phytotoxine bien connue. Il est produit par plusieurs espèces de Fusarium, particulièrement les souches pathogènes de F. oxysporum qui provoquent le flétrissement chez un nombre important de plantes. Bien que l’acide fusarique ne soit pas considéré comme un mycotoxine, il joue le rôle d’un agent chélateur et possible qu’il est intégré dans certaines maladies du développement anormal des os chez les animaux. De plus, l’acide fusarique est toxique aux souris (DL50 = 80 mg/kg), cet effet est lié à son action hypotensive. L’acide fusarique a plusieurs propriétés pharmacologiques importantes (Marasas et al., 1984). 1.10.3. Phytoalexines et phytoanticipines Les plantes produisent plusieurs métabolites secondaires qui sont distincts des composants du métabolisme primaire, du fait qu’ils sont généralement non essentiels pour les processus métaboliques de base de la plante (Vidhyasekaran, 2008). De nombreux métabolites secondaires présentent une action antifongique. Il y a deux types de métabolites secondaires antifongiques: les phytoalexines (métabolites secondaires induisibles) et les phytoanticipines (métabolites secondaires constitutifs) (Garcion et al., 2007). 51 Les phytoalexines, connues depuis plusieurs décennies, sont produites par les plantes sous l'attaque microbienne mais peu d'enzymes fongiques ont montré la capacité de les dégrader (Strange, 2003; Agrios, 2005). Plus de 300 phytoalexines ont été identifiées et caractérisées. Elles constituent un groupe de substances chimiques hétérogènes. Plusieurs phytoalexines appartiennent à la classe structurale des phénylpropanoïdes. La flavanone, l'isoflavone, le stilbène, le diphényle, le bibenzyl, la coumarine, l'aurone, l'anthocyanidine, et les groupes d'acides anthraniliques de phytoalexines ont été rapportés dans les plantes infectées. Un autre groupe principal de phytoalexines appartient à la classe des terpénoïdes. Le sesquiterpène, le diterpène, et les phytoalexines de triterpènes ont été rapportés dans le riz, la pomme de terre, le tabac, et le cacao. Les composés d'indol constituent un autre groupe de phytoalexines. Certaines phytoalexines sont des alcaloïdes, tandis que quelques autres sont des composés contenant de l'azote. Quelques phytoalexines appartiennent aux composés dérivés d'acide gras (Vidhyasekaran, 2008). Les composés formés en réponse à un stress peuvent se produire de deux façons au moins. Dans une réponse, la plante peut former des composés à travers le tissu à une distance considérable du site d'infection. Dans une autre réponse, la plante peut former des composés spécifiquement au lieu d'infection. Cela peut inclure seulement quelques cellules et dans de rares cas, aussi peu qu’une ou deux cellules (Strange, 2003). En général, ces composés sont appelés des métabolites de stress ou plus souvent comme phytoalexines. Par définition, les phytoalexines sont formées en réponse à une infection. Les phytoalexines présentent souvent une toxicité à des agents pathogènes spécifiques. Dans ce cas, il existe une relation génétique entre l'expression de la synthèse de phytoalexines et l'organisme qui provoque cette synthèse (Vermerris et Nicholson, 2006). Des substances de défense contre les micro-organismes, particulièrement les champignons, sont synthétisées la plupart du temps en réponse à une infection. Ces substances de défense induisibles, qui sont formées au bout de quelques heures, s'appellent les phytoalexines (alekein, Grec, pour défendre) (Strange, 2003). Beaucoup de phytoalexines agissent en tant qu'antibiotiques contre un large éventail de champignons et bactéries pathogènes (Heldt, 2005). 52 1.11. Résistance aux maladies La résistance à la maladie est une propriété commune à toutes les plantes (Waller et Lenné, 2002). Le concept de la résistance est central à n'importe quel programme de gestion de la maladie de plante. D'autres pratiques en matière de lutte contre la maladie, y compris l'utilisation des techniques d'intervention chimiques, les techniques de contrôle des cultures et le contrôle biologique peuvent tous être employées pour réduire au minimum les dommages de récolte. Chacune d'elles, peut être vue essentiellement comme complément de la résistance de la plante à la maladie (Deadman, 2006). La résistance se rapporte à la capacité de la plante hôte à éviter, complètement ou partiellement, l'effet d'un microbe pathogène. L'échelle de cette capacité peut varier d'une légère suppression du développement de la maladie à une grande résistance lorsque la pathogénie est inachevée. Si les effets sont assez grands, les taux de reproduction de microbe pathogène sont ralentis dans la mesure où la population du microbe pathogène remplace simplement les individus perdus mais sans augmenter la taille. Si les effets de résistance sont petits, la maladie augmente plus ou moins rapidement et, par conséquent, d'autres techniques de contrôle seront exigées (Duhoux et Nicole, 2004; Deadman, 2006). 1.11.1. Mécanismes de résistance La résistance d’une plante à un microbe pathogène se réalise d’une façon générale par la perturbation des facteurs essentiels pour la pathogénie tels que le manque de reconnaissance entre l'hôte et le microbe pathogène ou manque des récepteurs de l'hôte et les sites sensibles pour les toxines ou le manque des substances essentielles pour le microbe pathogène (Agrios, 2005). Parmi les mécanismes de défense est la présence des barrières naturelles qui existent chez toutes les plantes. Les barrières mécaniques incluent la cuticule, les tissus épidermiques, la couche de liège dans l'écorce et sur les blessures guéries et les parois cellulaires épaissies dans beaucoup de tissus (Strange, 2003). D'autres mécanismes de résistance peuvent impliquer les dispositifs morphologiques qui protègent les parties susceptibles de la plante telles que les fleurs ou les bourgeons contre, par exemple, les maladies de fumeron. Les dommages de l'une de ces barrières permettent l'entrée de beaucoup de groupes de microbes pathogènes dont quelques virus transmis par des moyens mécaniques, les bactéries et beaucoup de champignons pathogènes. Les pratiques 53 culturales qui évitent d'endommager les récoltes et favorisent la guérison rapide des blessures facilitent l'opération de ces mécanismes de défense (Waller et Lenné, 2002). Bien que plusieurs de ces barrières soient préformées, elles peuvent être renforcées après l'infection. Ce renforcement inclue l'épaississement et la subérisation ou la lignification des parois cellulaires à côté des hyphes fongiques et la production des thylles dans les tissus de xylème. En plus, les barrières chimiques contiennent les gommes, les tanins et d'autres substances présentes dans les tissus externes de certains organes (Waller et Lenné, 2002). Les plantes produisent également comme substances de défense des composés d'oxygène agressifs, tels que les radicaux superoxyde (•O-2), H2O2, l'oxyde d'azote (NO), et les enzymes, telles que les β-glucanases, les chitinases, et les protéinases, qui endommagent les parois des cellules bactériennes et fongiques (Heldt, 2005). 1.11.1.1. Rôle des éliciteurs dans la résistance Les plantes possèdent un système de surveillance efficace déclenchant des mécanismes de défense dès l'identification des champignons pathogènes essayant de les envahir. La première réaction de la plante qui déclenche des réponses de défense est la perception d'une molécule appelée l'éliciteur (produit des microbes pathogènes) (Strange, 2003). Plusieurs types de molécules d'éliciteur sont sécrétés par le microbe pathogène et ceux-ci incluent Chitooligosaccharides, chitosanes, oligoglucanes, glucomannanes, élicitines, xylanases, protéines, glycoprotéines, sphingolipides, jasmonates, ergostérol, toxines, cellulases, et pectolyases. Les enzymes fongiques peuvent également libérer quelques éliciteurs d'origine de la plante hôte. Ces éliciteurs peuvent être nécessaires pour activer divers gènes de défense, et le réseau de ces molécules d'éliciteur peut coordonner et augmenter l'expression des gènes de défense. La production de ces éliciteurs à l'emplacement d'infection est important en déclenchant la réponse de défense du l'hôte (Heldt, 2005; Vidhyasekaran, 2008). Ces divers éliciteurs sont liés aux récepteurs spécifiques sur la surface externe de la membrane plasmique des cellules de la plante. L'attachement de l'éliciteur libère des cascades de signal, dans lesquelles les protéines kinases et les substances de signal telles que l'acide salicylique et l'acide jasmonique participent, pour induire finalement la transcription des gènes pour la synthèse des phytoalexines, des composés d'oxygène réactif, et des enzymes de défense (Strange, 2003; Heldt, 2005). 54 Les éliciteurs peuvent également provoquer la mort de la cellule infectée et les cellules environnantes. En d'autres termes, les cellules infectées et leurs entourages commettent le suicide. Ceci peut être provoqué par les cellules infectées produisant les phénols, qui empoisonnent non seulement elles-mêmes mais également leurs environnements. Cette mort programmée de cellules, appelée réponse hypersensible, sert à protéger la plante. Les parois des cellules autour du tissu nécrotique sont renforcées par une plus grande biosynthèse de lignine, et de cette façon la plante se barricade contre la propagation de l'infection (Heldt, 2005). 1.11.1.2. Rôle des lectines dans la résistance Les lectines sont des protéines qui se lient spécifiquement à certains sucres et se produisent avec de grandes concentrations dans beaucoup de types de graines, causent la lyse et l’inhibition de croissance de beaucoup de champignons (Strange, 2003). Cependant, les cellules externes des plantes contiennent des quantités variables d'enzymes hydrolytiques, comme les glucanases et les chitinases, qui peuvent causer la dégradation des constituants de la paroi cellulaire des microbes pathogènes, contribuant de ce fait à la résistance. L'importance de l'un ou l'autre de ces types d'inhibiteurs à la résistance n'est pas actuellement connue, mais la concentration de certaines de ces substances augmente rapidement lors de l'infection et jouent un rôle majeur dans la défense des plantes à l'infection (Agrios, 2005). 1.11.2. Types de résistance Quand une plante est susceptible et le pathogène est agressif, il mène à la maladie, et la maladie est virulente. Mais si le pathogène est tué ou au moins sa croissance est retardée, ceci s'appelle une réaction incompatible, et la plante est considérée comme résistante. Souvent juste un seul gène peut déterminer la susceptibilité ou la résistance entre le pathogène et l'hôte (Heldt, 2005). 1.11.2.1. Résistance active ou passive Si on considère l'expression de résistance dans les plantes, il est nécessaire d'examiner si cette expression fait partie d'une réponse passive ou active. Il existe plusieurs situations qui peuvent se présenter: 1. Le composé "A" est présent dans la plante et est toxique pour un pathogène potentiel. Le composé est présent dans des cellules ou des tissus que l'agent pathogène doit 55 entrer en contact avec, à un moment quelconque au cours de la tentative d'infection. Le composé n'est pas métabolisé, mais peut être modifié par l'agent pathogène. Cet exemple constitue une forme de résistance passive. 2. Une substance préformée est dégradée ou métabolisée en un autre composé par l'hôte en réponse directe à l'agent pathogène et c'est ce composé qui représente la toxicité à l'agent pathogène. Ce mécanisme est considéré comme un moyen de résistance active (Vermerris et Nicholson, 2006). 1.11.2.2. Résistance systémique acquise (RSA) et résistance systémique induite (RSI) Une résistance systémique s’exprime au niveau de la plante entière et lui permet de résister non seulement à l’agresseur d’origine, mais aussi à une large gamme d’autres parasites. Le développement d’une résistance systémique dans les tissus non infectés dépend d’un réseau élaboré de communications intercellulaires (Duhoux et Nicole, 2004). La résistance de la plante aux pathogènes peut être systémiquement induite par une molécule endogène de signal produite à l'emplacement de l'infection qui est alors transférée à d'autres parties de la plante. Ce phénomène s'appelle la résistance systémique acquise (RSA) (Strange, 2003). La découverte du signal putatif est de grand intérêt à beaucoup de botanistes parce que de telles molécules ont des utilisations possibles en tant que "produit naturel" de lutte contre la maladie. L'accumulation de salicylate est l'une des premières étapes en RSA; cependant, le salicylate lui-même est trop rapidement biodégradé pour être employé comme inducteur exogène de résistance. Des composés synthétiques ont été employés pour induire une résistance qui ressemble au RSA (Duhoux et Nicole, 2004; Duke et al., 2008). En réponse à l'attaque de pathogène, les acides gras de la cascade de jasmonate sont formés de l'acide α -linolénique lié à la membrane par peroxydation médiée par lipoxygénase. Analogue à la cascade de prostaglandines dans les mammifères, on pense que l'acide α-linolénique participe à un système de signalisation basé sur des lipides où les jasmonates induisent la synthèse des inhibiteurs de protéinase et phytoalexines (fongicides naturels) comme certains flavonoïdes, alcaloïdes, et terpénoïdes (Duke et al., 2008). Ce type d'induction de résistance se nomme en tant que résistance systémique induite (RSI) (Strange, 2003). 56 1.11.2.3. D’autres types de résistance Lorsque les plantes sont résistantes à certains microbes pathogènes parce qu'elles appartiennent à des groupes taxonomiques qui sont en dehors du groupe cible de ces microbes, cette résistance s’appelle « résistance de non-hôte ». Si les plantes possèdent des gènes de résistance dirigée contre les gènes de virulence du pathogène, c’est une « résistance vrai, ou résistance gène-pour-gène ». Le cas où les plantes échappent ou tolèrent l'infection pour différentes raisons, on parle d’une « résistance apparente ». Chaque type de plante, par exemple, pomme de terre, maïs, ou orange, est un hôte à un petit et différent ensemble de microbes pathogènes. Les non-hôtes sont complètement résistants aux microbes pathogènes des autres plantes même dans les conditions les plus favorables pour le développement de la maladie (résistance de non-hôte) (Agrios, 2005). 1.11.3. Critères pour les molécules de résistance Il existe plusieurs critères pour décider si un composé joue un rôle important dans la résistance à un agent pathogène. Ces critères sont les suivants: 1. Le composé doit être présent dans ces parties de la plante où l'agent pathogène entrera en contact avec. Par exemple, les feuilles du pommier contiennent le phloridzine et de son aglycone phloretine, mais ces composés ne sont pas présents dans les fruits. 2. Le composé doit être présent à des concentrations suffisamment élevées pour affecter l'agent pathogène. Par exemple, le maïs contient l’acide hydroxamique cyclique DIMBOA (2,4-dihydroxy-7-méthoxy-1 ,4-benzoxazine-3-one) préformé. La concentration de DIMBOA diminue et elle n’est pas assez élevée en premier temps pour être considéré comme agent toxique aux champignons. 3. Directement liée au critère ci-dessus est l'exigence que le composé soit "disponible" dans l’hôte sous forme ou lieu où il peut exprimer sa toxicité. Cela peut conduire vers une question pour savoir si le composé est changé par extraction. Est-ce que ce composé est cloisonné dans une cellule et peut-être inaccessible à l'agent pathogène? Est-ce qu’il est présent dans un seul tissu? 4. Un autre critère qui doit être respecté est le temps d'apparition du composé. Même s’il est préformé, le composé doit être à une concentration suffisante in vivo exprimée par temps de résistance (Vermerris et Nicholson, 2006). 57 2. Métabolites secondaires En plus des métabolites primaires, tels que les glucides, les acides aminés, les acides gras, les cytochromes, les chlorophylles, et les intermédiaires métaboliques des voies anaboliques et cataboliques, qui se produisent dans toutes les plantes. Les plantes contiennent également une grande variété de substances, appelées les métabolites secondaires, sans la fonction métabolique directe apparente. Certains métabolites secondaires sont limités à quelques espèces de plante, où ils accomplissent des fonctions écologiques spécifiques, telles que l’attraction des insectes pour transférer le pollen, ou aux animaux pour consommer des fruits et de cette façon pour propager la graine, et pour agir en tant que pesticides naturels (Heldt, 2005). L’intérêt des métabolites secondaires a considérablement augmenté ces dernières années en raison de la diversité de leurs effets comme antioxydants, antiviraux, antibactériens, et anticancéreux (Makkar et al., 2007). 2.1. Mode d’action des métabolites secondaires Les plantes, en raison de leur teneur en protéines et en glucides, sont une source importante de nourriture pour beaucoup d'animaux, tels que les insectes, les escargots, et beaucoup de vertébrés. Ces composés sont impliqués dans la défense contre les herbivores et les pathogènes, la régulation de la symbiose, le contrôle de la germination des semences, et l'inhibition chimique des espèces de plantes en compétition (allélopathie), qui sont une partie intégrante des interactions des espèces dans les communautés végétales et animales et l'adaptation des plantes à leur environnement (Makkar et al., 2007). Beaucoup de plantes se protègent en produisant des protéines toxiques (des inhibiteurs par exemple, d'amylase ou de protéinase, ou des lectines), qui altèrent la digestion des herbivores. Par exemple, en réponse aux chenilles, les plantes de maïs mobilisent une protéase qui détruit l'intestin de ces dernières. Dans certaines plantes, ces pesticides naturels s'élèvent à 10 % de la matière sèche (Heldt, 2005). Les métabolites secondaires exercent la plupart de leurs effets par action à travers interactions avec les enzymes ou les protéines. Tandis que certains de ces composés agissent en tant que substrats au niveau des récepteurs et imitent les substances endogènes dans l'organisme cible, d'autres perturbent les interactions protéine-protéine nécessaires pour la fonction normale de cellules (Bahar et al., 2008). Par conséquent, on peut conclure 58 que cette capacité des métabolites secondaires d'agir sur la physiologie des autres espèces les rend comme source potentielle impressionnante de médicaments (Duke et al., 2008). Plusieurs réactions de résistance biochimiques sont produites en réponse à l'infection et celles-ci ont été intensivement étudiées souvent pour comprendre le processus de la pathogénie. Quand le tissu est endommagé, des systèmes enzymatiques sont stimulés et en général des substances polyphénoliques protectrices sont produites appelées « phytoalexines ». Ces effets sont déclenchés par les substances exogènes telles que les enzymes pectolytiques et cellulytiques et les toxines produites par le microbe pathogène en tant qu'élément du processus de la pathogénicité (Vidhyasekaran, 2004). Les phytoalexines sont des produits biochimiques toxiques produits par les cellules vivantes en réponse à l'infection ou aux dommages. Elles ont été largement impliquées dans les mécanismes de résistance aux maladies. Le type de phytoalexine produit dépend du type de plante (Waller et Lenné, 2002). 2.2. Composés phénoliques 2.2.1. Introduction Les composés phénoliques représentent un large groupe de molécules avec une variété de fonctions dans la croissance, le développement et la défense des plantes. Les composés phénoliques incluent les molécules de signal, les pigments et les arômes qui peuvent jouer un rôle attractif ou répulsif, en plus des composés qui protègent la plante contre les insectes, les champignons, les bactéries et les virus. La majorité des composés phénoliques sont présents sous forme d’esters ou de glycosides plutôt que de composés libres. Les tanins et les lignines sont des polymères phénoliques. Les tanins sont utilisés commercialement comme colorants et astringents, et les lignines sont responsables de la rigidité structurale des cellules et des tissus et sont essentiels pour le développement vasculaire (Heldt, 2005; Vermerris et Nicholson, 2006). La toxicité des composés phénoliques a été démontrée en augmentant artificiellement leur synthèse chez quelques plantes. Le traitement des plantes de tomate susceptibles avec l'acide quinique ou la phénylalanine a augmenté leur contenu phénolique, et cette augmentation de contenu phénolique a eu comme conséquence la résistance au F. oxysporum f. sp. lycopersici. Quand des plantes de tomate ont été alimentées avec du catéchol, une accumulation des phénols totaux a été observée et elle a eu comme 59 conséquence la suppression de l'expression des symptômes de la maladie après infection par F. oxysporum f. sp. lycopersici. Les composés phénoliques peuvent être des phytoanticipines importantes impliquées dans la pathogénie fongique (Vidhyasekaran, 2008). La phénylalanine et la tyrosine sont constituées par la voie du shikimate. Puisque les composés phénoliques dérivés des deux acides aminés contiennent un anneau phénylique avec la chaîne latérale de C3, ils se nomment collectivement des phénylpropanoïdes. Les flavonoïdes, y compris les flavones, les isoflavones, et les anthocyanidines, contiennent, comme la structure des phénylpropanes, un deuxième anneau aromatique qui est formé de trois molécules de malonyl CoA. Ceci s'applique également aux stilbènes, mais ici, après l'introduction du deuxième anneau aromatique, un atome de C du phénylpropane est enlevé (Tableau 2) (Heldt, 2005). Tableau 2: Quelques fonctions de phénylpropanoïdes (Heldt, 2005). Coumarines Antibiotiques, toxines contre les animaux brouteurs Lignanes Antibiotiques, toxines contre les animaux brouteurs Lignines Constituants de la paroi cellulaire Subérine et Cutine Formation de couches imperméables Stilbènes Antibiotiques, spécialement fungicides Flavonoïdes Antibiotiques, signal pour interaction avec les symbiontes, pigments de fleurs, substances de protection contre la lumière UV Tanins Tannage, fongicides, protection contre les herbivores 2.2.2. Classification Le terme « phénoliques » couvre un très grand groupe de composés chimiques. Ces composés peuvent être classés par plusieurs manières. Harborne et Simmonds (1964) ont classé ces composés dans les groupes basés sur le nombre de carbones dans la molécule (Tableau 3). Une autre classification a été utilisée par Swain et Bate-Smith (1962) qui ont regroupé les phénols comme "communs" et "moins communs". Ribéreau-Gayon (1972) a regroupé les phénols en trois familles comme suit: 60 1. Largement distribués, présents chez tous les végétaux, ou d’une importance pour une plante spécifique. 2. Phénols qui sont moins présents, nombre limité de composés connus. 3. Constituants phénolique présents comme polymères (Vermerris et Nicholson, 2006). 2.2.3. Flavonoïdes Les flavonoïdes sont une classe de métabolites secondaires des végétaux provenant de la condensation d'un acide cinnamique avec trois groupements de malonyl-CoA. Tous les flavonoïdes proviennent de cette première réaction, qui est catalysée par l'enzyme chalcone synthase (Bloor, 2001). Les flavonoïdes sont classés en flavonols, flavones, catéchines, flavanones, anthocyanidines, et isoflavonoïdes. De puissants effets biologiques ont été décrits par de nombreuses études in vivo et in vitro représentés principalement par les effets antioxydants (Tableau 3) (Hollman, 2001). Les flavonoïdes et les polyphénols, dérivés de sources végétales ou animales, comportent un nombre considérable, supérieur à 4000 analytes individuels. En tant que groupe, les flavonoïdes sont des métabolites secondaires contenant la structure d'un cycle pyrane entouré par au moins deux cycles phényles, désignés comme A et B. Les différences entre les classes sont liées aux changements du noyau C (présence d'une double liaison, un groupement 3-hydroxy, et / ou un groupement 4-oxo), et dans le nombre et la position des groupements hydroxyles et méthoxyles dans les cycles A et B, et le type de sucre attaché ou le degré de polymérisation (Milbury, 2001; Pietta et Mauri, 2001). Les flavonoïdes ont reçus un grand intérêt en raison de leur activité pharmacologique. Environ 50 espèces de plantes, ont été utilisées comme remèdes à base de plantes en fonction de leur teneur en flavonoïdes. En outre, des flavonoïdes issus de plantes médicinales sont disponibles dans différent pays comme anti-inflammatoires, antispasmodiques, antiallergiques, antiviraux. Les effets pharmacologiques de flavonoïdes sont dus à leurs groupements fonctionnels (Pietta et Mauri, 2001). 61 Tableau 3: Classification des composés phénoliques (Vermerris et Nicholson, 2006). Structure Classe C6 Composés phénoliques simples C6-C1 Acides phénoliques C6-C2 Acétophénones et acide phénylacétique C6-C3 C6-C3 Acides cinnamiques, aldéhydes et alcools cinnamyliques Coumarines, isocoumarines, et chromones C15 Chalcones, aurones, dihydrochalcones C15 Flavanes C15 Flavones C15 Flavanones C15 Flavanonols C15 Anthocyanidines C15 Anthocyanines C30 Biflavonyls C6-C1-C6, C6-C2-C6 Benzophénones, xanthones, stilbènes C6, C10, C14 Quinones C18 Betacyanines Lignanes, néolignanes Dimères ou oligomères Lignine Polymères Tanins Oligomères ou polymères Phlobaphène Polymères Les flavonoïdes se produisent dans la plupart des tissus végétaux et, en particulier, dans les vacuoles. Ils se produisent également comme mélanges de composants simples et polymériques dans les écorces et le duramen. Parmi les diverses fonctions des flavonoïdes, certains agissent en tant que molécules de signalisation pour certaines fonctions dans des relations spécifiques plante/microbe. Plusieurs d'entre eux sont inhibiteurs ou toxiques aux microbes pathogènes et certains d'entre eux, par exemple, médicarpine, agissent en tant que phytoalexines et sont impliqués dans la défense inductible des les plantes contre les champignons (Agrios, 2005). Il est important que les microbes pathogènes puissent survivre en présence de divers flavonoïdes dans les parois cellulaires ou ils puissent les neutraliser ou les décomposer. Peu est connu sur le mécanisme des microbes pathogènes, 62 bien que la liaison des composés phénoliques avec les molécules de sucre (glycosylation) semble neutraliser la toxicité de beaucoup de composés phénoliques (Vidhyasekaran, 2004). 2.2.4. Tanins Les tanins sont un terme collectif pour une série de polyphénols de plantes employés dans le tannage des peaux crues pour produire le cuir. Les tanins sont largement distribués chez les plantes et se produisent particulièrement en quantités élevées dans l'écorce de certains arbres (par exemple, chêne) (Heldt, 2005). Ce sont des composés polyphénoliques qui sont largement classés par catégorie dans deux groupes importants : (1) tannins hydrolysables, se composant d'un noyau central glucidique auquel des acides carboxyliques phénoliques sont liés par liaisons esters; et (2) tannins condensés, ou proanthocyanidines, se composant des oligomères de deux flavan-3-ols ou plus, tels que la catéchine, l'épicatéchine, ou la gallocatéchine correspondant. Les tanins ont une affinité très élevée pour les protéines et forment des complexes protéine-tanin. L'ingestion d'une plante contenant les tanins condensés diminue l'utilisation nutritive des protéines due en grande partie à la diminution de la prise alimentaire. D'autre part, les tanins hydrolysables sont potentiellement toxiques aux animaux. La consommation des aliments contenant des quantités élevées de tanins hydrolysables causent la toxicité du foie et du rein et mènent à la mort des animaux (Makkar et al., 2007). Les tannins protègent les plantes contre l'attaque par les micro-organismes. L'infection des cellules d'une plante par des micro-organismes est souvent lancée par la sécrétion des enzymes pour la digestion lytique des parois des cellules de la plante. Ces enzymes agressives sont inactivées quand les tanins sont liés à elles (Heldt, 2005). Les analyses de tanins sont généralement classées par catégorie dans deux groupes: méthodes chimiques et méthodes de précipitation de protéines. D'autres méthodes qui ne tombent pas sous ces catégories sont les analyses gravimétriques, les essais biologiques de tanins, l'analyse par polyéthylène glycol par marquage au carbone 14 (Makkar et al., 2007). 63 2.2.5. Coumarines Les coumarines sont des composés naturels qui contiennent la partie caractéristique benzo[α]pyrone (2H-benzopyrane-2-one). Ils sont particulièrement abondants chez les Apiaceae, les Rutaceae, les Fabaceae, et autres familles de plantes. Différents dérivés de coumarine ont été isolés. Habituellement les substituants sont aux positions C5, C6, C7 et C8 [par exemple, umbelliferone (7-hydroxycoumarin), hierniarin (7-methoxycoumarin), esculetin (6,7-dihydroxycoumarin), scopoletin (6-methoxy-7-hydroxycoumarin), osthenol (7-hydroxy-8-prenylcoumarin), osthol (7-methoxy-8-prenylcoumarin), et d'autres]. En plus des dérivés simples de coumarine, certaines familles produisent les furano- et pyranocoumarines (Glowniak, 2004). La 7-Hydroxycoumarine, également appelée umbelliferone, est synthétisée à partir de l'acide p-coumarique par hydroxylation et la formation d'un ester intermoléculaire, une lactone. L'introduction d’un groupe C2 dans l'umbelliferone conduit au psoralène, une furanocoumarine. L'illumination avec la lumière UV transforme le psoralène en substance toxique. Le psoralène réagit avec les bases de pyrimidine de l'ADN, entraînant le blocage de la transcription et les mécanismes de réparation de l'ADN et finalement la mort de la cellule. Quelques variétés de céleri contiennent de forte concentration en psoralène et provoque l'inflammation de la peau chez les ouvriers impliqués dans la récolte. Beaucoup de furanocoumarines ont les propriétés antibiotiques. Dans certains cas, ils sont les composants constitutifs des plantes, tandis que dans d'autres cas, ils sont formés seulement après l'infection (Heldt, 2005). Les furanocoumarines sont produites par beaucoup de plantes, particulièrement dans les espèces d'Apiaceae, de Fabaceae, de Rutaceae, et de Moraceae (Glowniak, 2004). Les furanocoumarines sont des composés hétérocycliques dérivés de la coumarine par l'addition d'un anneau de furfuranne aux positions 6, 7 (furanocoumarines linéaires) ou 7, 8 (furanocoumarines angulaires). Les furanocoumarines angelicine, bergaptene, psoralène, trimethylpsoralene, xanthotoxine, isopimpinelline, et le sphondine ont été identifiées dans les plantes de céleri. La Xanthotoxine et bergaptene sont les furanocoumarines détectées dans le panais et le persil (Vidhyasekaran, 2008). Les furanocoumarines de Ruta graveolens possèdent une activité antifongique visà-vis de plusieurs champignons pathogènes de plante. 7-Hydroxycoumarine, 464 hydroxycoumarine, et 7-methoxycoumarine sont actives sur les espèces de Colletotrichum qui causent la maladie d'anthracnose de fraise (Duke et al., 2008). 2.3. Saponines Les saponines sont des glycosides de poids moléculaire élevé combinant un sucre et un stéroïde aglycone ou une molécule de triterpène. Les saponines peuvent être divisées en trois groupes importants: saponines triterpénoïdiques, saponines stéroïdiques, et saponines stéroïdales alcaloïdiques. Les avenacines sont les principales phytoanticipines triterpénoïdes détectées chez l'avoine, tandis que l'α-tomatine est la principale saponine stéroïdale de glycoalcaloïde détectée chez la tomate et qui a une activité antifongique contre plusieurs champignons. Les saponines sont impliquées dans la résistance aux maladies chez certaines plantes. La présence des groupes polaires (sucre) et non polaires (stéroïde ou triterpène) fournit aux saponines les propriétés tensio-actives fortes qui sont responsables de beaucoup de leurs effets bénéfiques (Strange, 2003; Agrios, 2005; Makkar et al., 2007; Vidhyasekaran, 2008). La capacité des champignons pathogènes de coloniser les tissus de tomate s'est avérée due à leur résistance intrinsèque à l'α-tomatine au niveau de la membrane. Des isolats de Fusarium solani mutants en stérol montrent une résistance accrue à l'α-tomatine et pouvaient infecter les fruits verts de tomate, qui contiennent plus de 20 fois d’αtomatine que les fruits rouges. Le type sauvage de F. solani est pathogène seulement aux fruits mûrs. Les résultats suggèrent que la composition de la membrane de l’hôte est importante pour déterminer la capacité des champignons à infecter la tomate (Vidhyasekaran, 2008). Quelques saponines sont impliquées dans le blocage du développement fongique de la maladie. Les avénacines dans l'avoine et la tomatine dans la tomate, par exemple, sont les saponines importantes impliquées dans la défense contre le développement fongique. Cependant, les microbes pathogènes virulents produisent l'avénacinase et la tomatinase pour dégrader ces saponines. Ces enzymes sont des facteurs importants de pathogénicité des champignons pathogènes affectant l'avoine et la tomate (Agrios, 2005; Vidhyasekaran, 2008). 65 2.4. Alcaloïdes Les alcaloïdes représentent divers groupes d'amines secondaires, tertiaires, ou cycliques. Environ 5500 alcaloïdes sont connus, comportant la plus grande classe simple des métabolites secondaires (Makkar et al., 2007). Il n'y a pas une seule définition des alcaloïdes complètement satisfaisante, mais les alcaloïdes incluent généralement « des substances basiques qui contiennent un ou plusieurs atomes d'azote, habituellement en association en tant qu'élément d'un système cyclique » (Roberts et Wink, 1998). Chimiquement, les alcaloïdes sont un groupe très hétérogène, s'étendant des composés simples comme la coniine, l'alcaloïde principal de la cigûe, Conium maculatum, à la structure pentacyclique du strychnine, la toxine de l'écorce du Strychnos. Beaucoup d'alcaloïdes sont des terpénoïdes en nature, par exemple, solanine, l'alcaloïde stéroïdal de la pomme de terre (Solanum tuberosum). D'autres sont principalement des composés aromatiques (par exemple, colchicine) (Makkar et al., 2007). Les alcaloïdes sont souvent toxiques aux humains, et beaucoup ont des activités physiologiques et neurologiques dramatiques. Les espèces de Phalaris contiennent des alcaloïdes de tryptamine qui causent la mort. Le Datura stramonium contient des alcaloïdes de tropane tels que l’hyoscyamine dont consommation cause la paralysie et le l’augmentation des battements de coeur menant à la mort. Un test simple mais nullement infaillible pour les alcaloïdes sur feuille fraîche ou fruit est le goût amer qu'ils donnent. La quinine, par exemple, est l'une des substances les plus amères connues et est significativement amère à une concentration molaire de 1.10-5 (Makkar et al., 2007). Les alcaloïdes appartiennent à un groupe de métabolites secondaires qui sont souvent synthétisés à partir d'acides aminés et contiennent un ou plusieurs atomes d’azote comme constituants des hétérocycles. Plusieurs de ces alcaloïdes agissent en tant que substances de défense contre les animaux et les micro-organismes. Puisque les alcaloïdes sont habituellement des bases, ils sont stockés sous la forme protonée, la plupart du temps dans la vacuole, qui est acide. L'homme antique a employé les alcaloïdes sous forme d'extraits de plante comme poisons, stimulants, et narcotiques, et comme médicament. En 1806, l'assistant en pharmacie Friedrich Wilhelm Sertürner a isolé la morphine des clous de girofle. Encore 146 années ont dû passer avant que la structure de la morphine ait été finalement résolue en 1952 (Heldt, 2005). 66 Les alcaloïdes sont classés selon leurs hétérocycles. La coniine, un alcaloïde de pipéridine, est un poison très efficace dans la cigüe. Socrates est mort quand il a été forcé de boire ce poison. La nicotine, qui est également très toxique, contient une pyridine et un anneau de pyrrolidine. Elle est formée dans les racines des plantes de tabac et est portée avec la sève de xylème dans les tiges et les feuilles. Le sulfate de nicotine, un sous-produit de l'industrie du tabac, est employé comme insecticide très efficace (par exemple, pour les serres de fumigation). Aucun insecte n'est connu pour être résistant à la nicotine (Heldt, 2005). 2.5. Rôle des polyphénols dans la défense des plantes 2.5.1. Composés phénoliques comme phytoanticipines et/ou phytoalexines Lorsqu’on considère des substances produites par des plantes qui agissent comme agents protecteurs contre les pathogènes et insectes, il faut considérer en premier lieu si ces composés sont présents avant le moment de l’infection ou sont synthétisés en réponse à l’infection. Lorsque ces composés sont présents à la tentative d'infection; ils sont connus comme « métabolites antimicrobiens préformés ». Ces composés préformés sont une partie d'un mécanisme de résistance passive. En général, ces métabolites préformés ont un spectre large de toxicité pour les bactéries et champignons, mais ces composés ont un niveau relativement faible de toxicité. Ainsi, les composés préformés sont présents dans toutes les espèces de plantes et aident les plantes à éloigner les agents pathogènes qui ne sont pas considérées très agressifs. Ils sont aussi appelés phytoanticipines (Agrios, 2005; Vermerris et Nicholson, 2006). Certains composés phénoliques communs qui sont toxiques aux microbes pathogènes sont produits et s'accumulent à une vitesse plus rapide après infection, chez une variété résistante de plante par rapport à une variété susceptible (Agrios, 2005). Plusieurs composés phénoliques et phénylpropanoïdes qui peuvent agir en tant que phytoanticipines ont été détectés chez les plantes (Strange, 2003). L'acide chlorogénique et l'acide caféique sont les acides phénoliques communs détectés chez l’aubergine (Solanum melongena). Des acides féruliques, p-coumariques, et syringiques sont généralement trouvés dans des cultivars de blé. Le flavonoïde épicatéchine joue un rôle majeur comme phytoanticipine chez l’avocat. Plusieurs isoflavonoïdes tels que le genisteine, le wighteone, et le luteone ont été détectés dans le lupin (Luteus lupinus). Les concentrations de ces isoflavonoïdes 67 augmentent dans le lupin après infection avec Fusarium oxysporum (Vidhyasekaran, 2008). La production des phytoalexines est un phénomène général, important dans le cadre de l’infection et de la résistance. Toutefois, peu de phytoalexines sont en relation avec la résistance variétale (Corbaz, 1990). Certains terpènes et composés phénoliques sont classés dans le groupe des phytoalexines (Duhoux et Nicole, 2004), de même que certains sesquiterpènes. La rishitine, dérivé isoprénoïde, se trouve sous forme de traces dans les rondelles coupées mais atteint jusqu’à 120 mg/kg poids frais dans les tissus infectés. Elle se forme au moment ou les hyphes ont une croissance intercellulaire. Deux autres isoprénoides, α-solanine et α-chaconine, sont accumulés en cas de blessure. La scopoline, un dérivé de la coumarine, formée dans les tissus en réponse à des infections virales, fongiques mais non pas par blessure. D’autres phytoalexines ont été décrites, en particulier le gossypol, un phénol qui se trouve normalement dans les glandes des feuilles et des tiges de coton, et qui est accumulé en cas d’infection par Verticillium albo-atrum (Corbaz, 1990). 2.5.2. Fortification de la paroi cellulaire par les composés phénoliques et lignine La paroi cellulaire des plantes est la première barrière et la pénétration semble être la première condition pour la pathogénie des champignons pathogènes. Les parois cellulaires sont des complexes de polysaccharides (cellulose, hémicelluloses, et pectines), des protéines, de la lignine, la cutine, la subérine, et certains composés minéraux (Duhoux et Nicole, 2004; Vidhyasekaran, 2008). Quand le microbe pathogène essaye de pénétrer la paroi cellulaire de l'hôte en produisant une série d'enzymes, la plante hôte enrichie sa paroi cellulaire avec les composés phénoliques fixant sur la paroi, la subérine, et autres substances. Les produits de dégradation de la paroi cellulaire déclenchent également les défenses de l'hôte. Un équilibre sensible existe entre la susceptibilité et la résistance, et la modulation de la production des enzymes dégradantes de la paroi cellulaire par les microbes pathogènes détermine le développement de la maladie ou la résistance. Les parois cellulaires peuvent participer au dialogue moléculaire entre les plantes et les microbes pathogènes (Vidhyasekaran, 2004; Vidhyasekaran, 2008). 68 La résistance induite chez l'orge contre Blumeria graminis f. sp. hordei s'est avérée due au dépôt des composés phénoliques dans les parois cellulaires. Les composés phénoliques sont accumulés également dans les cellules épidermiques attaquées par appressorium chez l'avoine infectée par Blumeria graminis. L'acide férulique, l'acide pcoumarique, et l'acide sinapique sont les composés phénoliques prédominants liés aux parois cellulaires, et les lignines sont les composés phénoliques polymérisés. Les composés phénoliques et les lignines liés aux parois cellulaires peuvent contribuer à la résistance aux maladies. L'acide férulique et l'acide p-coumarique sont les composés phénoliques prédominants du tissu de maïs. Les acides déshydroféruliques peuvent empêcher la dégradation de la paroi cellulaire provoquée par les enzymes. Certains composés phénoliques empêchent la production de cutinase par les microbes pathogènes. Ces observations suggèrent que les composés phénoliques liés aux parois sont capables d’induire la résistance en bloquant les activités des enzymes dégradantes des parois (Agrios, 2005; Vidhyasekaran, 2008). L'autofluorescence (indique la présence des composés phénoliques) dans les parois cellulaires est associée aux manifestations de résistance. Dans les variétés susceptibles, les microbes pathogènes suppriment l'accumulation des composés phénoliques dans les parois cellulaires épidermiques. Ces observations suggèrent que dans des interactions susceptibles, l'accumulation phénolique dans la paroi cellulaire est supprimée. La quantité et la vitesse d'accumulation des composés phénoliques dans la paroi cellulaire dans des interactions susceptibles sont inférieures par rapport aux interactions résistantes (Vidhyasekaran, 2004; Vidhyasekaran, 2008). 2.5.3. Effet des champignons pathogènes sur les composés phénoliques fongitoxiques Les microbes pathogènes peuvent surmonter l’effet des composés phénoliques par l’un des mécanismes suivants: 1- Le microbe pathogène peut dégrader les composés phénoliques en produits non-toxiques 2- Il peut bloquer la synthèse intense des composés phénoliques par les plantes 3- Il peut bloquer les enzymes de la synthèse des composés phénoliques 4- Il peut bloquer le métabolisme phénolique par des molécules de suppression 5- Il peut bloquer le métabolisme phénolique en produisant des toxines 6- Il peut bloquer l’oxydation des composés phénoliques en inhibant la polyphénol oxydase 69 7- Les composés phénoliques sont fongitoxiques mais ils peuvent ne pas s’accumuler à un niveau fongitoxique pendant la pathogénie dans certaines interactions plante-pathogène (Vidhyasekaran, 2008). 2.5.4. Effet des champignons pathogènes sur les composés phénoliques liés aux parois cellulaires Plusieurs études ont indiqué que les microbes pathogènes peuvent supprimer l'accumulation des composés phénoliques dans la paroi cellulaire (Vidhyasekaran, 2004). Quand le Sphaerotheca fuliginea, le mycète de la rouille pulvérulente, a été inoculé à des plantes résistantes de cantaloup, les cellules épidermiques infectées ont émis l'autofluorescence de leur lumen, indiquant la présence des composés phénoliques. Ces derniers étaient présents dans les parois cellulaires de la variété résistante à 24-96 h après inoculation, mais les cellules pénétrées de la variété susceptible n'ont montré aucune autofluorescence (Vidhyasekaran, 2008). 2.6. Métabolites secondaires comme mécanisme de susceptibilité Les spores des champignons telluriques restent dispersées dans le sol pendant des mois ou des années dans un état de dormance jusqu'à l'apparition d'un hôte qui stimule leur germination (Corbaz, 1990; Lucas, 2006). Les flavonoïdes exsudés par les racines et les graines agissent en tant que signal stimulateur en induisant la germination des spores, tel est le cas, par exemple, chez H. haematococca (anamorphe: Fusarium solani). Le traitement des spores de H. haematococca avec les inhibiteurs spécifiques de PKA AMPcdépendante a empêché la capacité des flavonoïdes de stimuler la germination des spores. Les résultats suggèrent que la voie de l’AMPc est impliquée dans la germination de spores induite par les flavonoïdes. Les niveaux de l’AMPc dans les macroconidies de H. haematococca sont transitoirement induits par traitement par des flavonoïdes. Il existe une corrélation entre la force de l'induction des niveaux de l’AMPc par les flavonoïdes et l'inhibition de l'activité enzymatique de la phosphodiestérase. Les observations suggèrent que les flavonoïdes modulent les niveaux de l’AMPc par l'inhibition directe de la phosphodiestérase (Vidhyasekaran, 2008). 70 REFERENCES Agrios G. N. 2005. Plant Pathology. 5th edition, Elsevier Publishing, p. 922. Aylor D. E. 2003. Spread of Plant Disease on a Continental Scale: Role of Aerial Dispersal of Pathogens. Ecology, 84(8): 1989-1997. Bacon C. W., Porter J. K., Norred W. P. et Leslie J. F. 1996. Production of Fusaric Acid by Fusarium species. Applied and Environmental Microbiology, 62(11): 4039-4043. Bahar M., Deng Y., Fletcher J.N. et Kinghorn A.D. 2008. Plant Derived Natural Products in Drug Discovery and Development: An overview. In: Selected Topics in the Chemistry of Natural Products. World Scientific Publishing Co. Lte. Ltd., 11-48. Brown J. K. M. 1995. Pathogen’s Responses to the Management of Disease Resistance Genes. In: Advances in Plant Pathology. Vol. 11, Academic Press Limited, 75-102. Brown J. K. M. 2006. Surveys of Variation in Virulence and Fungicide Resistance and their Application to Disease Control. In: The Epidemiology of Plant Diseases. 2nd edition, Springer, 81-115. Calvo M. A., Arosemena L., Agut M., Adelantado C. et Aissaoui H. 2005. Biological Control of Bayoud in the Palm Trees by Strains of Arthrinium. Journal of Biological Sciences, 5(2): 536-538. Corbaz R. 1990. Principes de Phytopathologie et de Lutte Contre les Maladies des Plantes. 1ère édition. Presses Polytechniques et Universitaires Romandes, p. 286. Deadman M. L. 2006. Epidemiological Consequences of Plant Disease Resistance. In: The Epidemiology of Plant Diseases. 2nd edition, Springer, 139-57. Duhoux E. et Nicole M. 2004. Atlas de Biologie Végétale: Associations et interactions chez les plantes. 1ère édition, DUNOD, p. 166. 71 Duke S. O., Rimando A. M., Schrader K. K., Cantrell Ch., Meepagala K. M., Wedge D. E., Tabanca N. et Dayan F. E. 2008. Natural Products for Pest Management. In: Selected Topics in the Chemistry of Natural Products. World Scientific Publishing Co. Lte. Ltd., 209-251 El-Hassni M., El-Hadrami A., Daayf F., Cherif M., Ait Barka S. et El-Hadrami I. 2007. Biological Control of Bayoud Disease in Date Palm: Selection of Micoorganisms Inhibiting the Causal Agent and Inducing Defence Reactions. Environmental and Experimental Botany, 59: 224-234. Fox R. T. V. et Narra H. P.2006. Plant Disease Diagnosis. In: The Epidemiology of Plant Diseases. 2nd edition, Springer, 1-42. Garcion Ch., Lamotte O. et Métraux J-P. 2007. Mechanisms of Defence to Pathogens: Biochemistry and Physiology. In: Induced Resistance for Plant Defence: A Sustainable Approach to Crop Protection. Blackwell Publishing, 109-132. Glowniak K. 2004. Coumarins: Analysis by TLC. In: Encyclopedia of Chromatography, Ed. Marcel Dekker, Inc., New York. Hammerschmidt R. 2007. Introduction: Definitions and Some History. In: Induced Resistance for Plant Defence: A Sustainable Approach to Crop Protection. Blackwell Publishing, 1-8. Hardwick N. V.2006. Disease Forecasting. In: The Epidemiology of Plant Diseases. 2nd edition, Springer, 239-267. Hanson J. R. 2008. The chemistry of Fungi. RSC publishing. p.221 Heldt H-W. 2005. Plant Biochemistry. 3rd edition, Elsevier Academic Press, p.630 Hollman P. C. H. 2001. Determination of Flavonols in Body Fluids. In: Methods in Enzymology, Flavonoids and other Polyphenols, vol. 335. Academic Press. 72 Hollomon D. 2002. Fungicides. In: Plant Pathologist’s Pocketbook. 3rd edition, CABI Publishing, 336-344. Jiménez-Gasco M. M., Navas-Cortés J. A. et Jiménez-Diaz R. M. 2004. The Fusarium oxysporum f. sp. ciceris / Cicer arietinum pathosystem: A Case Study of the Evolution of Plant Pathogenic Fungi into Races and Pathotypes. International Microbiology, 7: 95-104. Lee U-S., Jang H-S., Tanaka T., Toyasaki N., Sugiura Y., Oh Y-J., Cho C-M. et Ueno Y. 1986. Mycological Survey of Korean Cereals and Production of Mycotoxins by Fusarium isolates. Applied and Environmental Microbiology, 52(6): 1258-1260. Lucas P. 2006. Diseases Caused by Soil-born Pathogens. In: The Epidemiology of Plant Diseases. 2nd edition, Springer, 373-386. Makkar H. P. S., Siddhuraju P. et Becker K. 2007. Plant Secondary Metabolites. Humana Press Inc., p.130. Marasas W. F. O., Nelson P. E. et Tousson T. A. 1984. Toxigenic Fusarium Species: Identity and Mycotoxicology. Pennsylvania State University Press, p.328. Marouf A. et Tremblin G. 2009. Abrégé de Biochimie Appliquée. EDP Sciences, Collection Grenoble Sciences, France, p. 483. Matthews G. A. 2002. The Application of Chemicals for Plant Disease Control. In: Plant Pathologist’s Pocketbook. 3rd edition, CABI Publishing, 345- 353. McCartney H. A., Fitt B.D.L. et West J.S. 2006. Dispersal of Foliar Plant Pathogens: Mechanisms, gradients and spatial patterns. In: The Epidemiology of Plant Diseases. 2nd edition, Springer, 159-192. Milbury P. E. 2001. Analysis of Complex Mixtures of Flavonoids and Polyphenols by High-Performance Liquid Chromatography Electrochemical Detection Methods. In: Methods in Enzymology, Flavonoids and other Polyphenols, vol. 335. Academic Press. 73 Pietta P. et Mauri P. 2001. Analysis of Flavonoids in Medicinal Plants. In: Methods in Enzymology, Flavonoids and other Polyphenols, vol. 335. Academic Press. Roberts M. F. et Wink M. 1998. Alkaloids: Biochemistry, Ecology and Medicinal Application. Plenum Press, p. 486. Scott J. K. 1995. Classical Biological Control of Plant Pathogens. In: Advances in Plant Pathology. Vol. 11, Academic Press Limited, 131-146. Strange R. N. 2003. Introduction to Plant Pathology. John Wiley & Sons Ltd., p. 497. Struck C. 2006. Infection Strategies of Plant Parasitic Fungi. In: The Epidemiology of Plant Diseases. 2nd edition, Springer, 117-137. Teng P. S. et James W. C. 2002. Disease and Yield Loss Assessment. In: Plant Pathologist’s Pocketbook. 3rd edition, CABI Publishing, 25-38. Vermerris W. et Nicholson R. 2006. Phenolic Compound Biochemistry. Springer, p. 276 Vidhyasekaran P. 2004. Concise Encyclopedia of plant Pathology. Food Product Press, p. 619. Vidhyasekaran P. 2008. Fungal Pathogenesis in Plant and Crops “Molecular Biology and Host Defense Mechanisms. CRC Press, Second edition, p.509. Waller J. M. et Cannon P. F. 2002. Fungi as Plant Pathogens. In: Plant Pathologist’s Pocketbook. 3rd edition, CABI Publishing, 75- 93. Waller J. M. et Lenné J. M. 2002. Disease Resistance. In: Plant pathologist’s pocketbook. 3rd edition, CABI Publishing, 328- 335. Walters D. et Daniell T. 2007. Microbial Induction of Resistance to Pathogens. In: Induced Resistance for Plant Defence: A Sustainable Approach to Crop Protection. Blackwell Publishing, 143-156. 74 PARTIE EXPERIMENTALE 75 MATERIEL & METHODES 76 CHAPITRE I: MATERIEL ET METHODES 1. Introduction La maladie du Bayoud cause un grand problème pour le palmier dattier et d’une manière directe pour la population du Sahara. Le grand problème est lié principalement à l’inefficacité des traitements utilisés traditionnellement et même les recherches entamées depuis plus de cinquante ans n’ont rapporté que de faibles résultats. Dans le but de résoudre ce problème basant sur le principe de la défense naturelle, exercée par les métabolites secondaires et principalement les polyphénols, notre étude va cibler deux points essentiels. Le premier, évaluation des extraits de plantes (Sud-Ouest d’Algérie) pour leur effet antifongique par des tests préliminaires, ensuite, les extraits bioactifs vont subir des tests plus avancés pour cibler la (les) molécule(s) bioactive(s). Le deuxième, évaluer la défense naturelle chez les cultivars du point de vue métabolites secondaires, et faire une corrélation entre la nature des polyphénols présents dans les rachis et le caractère de ces cultivars (sensibilité, résistance, tolérance) vis-à-vis le Foa. L’évaluation de l’effet antifongique sera réalisée sur les systèmes cellulaires et acellulaires. 2. Plantes médicinales 2.1. Limoniastrum feei a. Description botanique Limoniastrum feei est une espèce appartenant à la famille des PLUMBAGINACEAE. Cette dernière comporte de nombreux représentants dans le monde, surtout dans les terrains salés, deux genres au Sahara, quatre espèces au Sahara septentrionale et centrale (Figure 5). Limoniastrum feei est un arbuste bas, de 10-40 cm, à feuilles plus longues et plates serrées en rosettes au sommet des rameaux; hampes florifères sans feuilles, se terminant par des inflorescences courtes, très fragiles, à fleurs entourées de bractées coriaces épineuses et d’un rouge violacé. Rocailles, tout le Sahara septentrionale marocain et algérien, dans le périmètre Anti Atlas, Biskra (Ozenda, 2004). 77 b. Utilisation populaire Limoniastrum feei est utilisée essentiellement dans le traitement des maux gastriques, contre le rhume et les maladies du foie (hépatite A), et comme antibactérien, antifongique, antimicrobien ainsi que pour le traitement de bronchite (Belboukhari et Cheriti, 2005). c. Classification Famille: PLUMBAGINACEAE Genre: Limoniastrum Espèce: Limoniastrum feei Nom vernaculaire: Meleft khadem Figure 5: Photo de Limoniastrum feei (LPSO Data Base). 2.2. Launeae arborescens a. Description botanique Launeae arborescens appartient aux ASTERACEAE, cette famille de plantes qui comportent environ 1100 genres et plus de 20000 espèces. Launeae arborescens est une plante à feuilles non toutes à la base, en rosettes sur les tiges et les rameaux mais le plus souvent disparues avant la floraison; buisson de 4-12 dm, très épineux; feuilles incisées en lobes étroits non denticulés; capitules de 1 à 2 cm de diamètre. Sahara septentrionale et occidentale, au Sud jusqu’à Beni-Abbès et au Tademait (Ozenda, 2004). Il croit dans des pâturages, des steppes, des rocailles désertiques (Boullard, 2001) (Figure 6). 78 b. Utilisation populaire Launeae arborescens est très utilisée par la population locale dans le traitement des troubles gastriques, ulcérations, diarrhées, et comme anti-inflammatoire, et antimicrobien (Belboukhari et Cheriti, 2006 a; b). En dépit d’une certaine toxicité de son latex (vésicant) on y recours pour traiter (avec prudence): les affections de gorge, des angines, des boutons et furoncles. En infusion légère, la drogue se révèle vermifuge pour les enfants, et on use de la poudre de racines comme antidiabétique; cette espèce a été utilisée à des fins abortives (Boullard, 2001). c. Classification Famille: ASTERASEAE Genre: Launeae Espèce: Launeae arborescens Nom vernaculaire: Oum lbina. Figure 6: Photo de Launeae arborescens (LPSO Data Base). 2.3. Acacia raddiana a. Description botanique Le genre Acacia compte environ 600 espèces réparties pour la plupart dans les régions tropicales et subtropicales (Benzyane et al., 1999). Acacia raddiana est un arbre de 2 à 10 m de hauteur, à rameaux âgés d’un blanc d’ivoire, à longues épines droites. Fleurs blanchâtres ; gousses contournées en spirale (Ozenda, 2004) (Figure 7). 79 b. Utilisation populaire L’Acacia raddiana est utilisée en cas de: allergie, avitaminose, convulsion, dermatose, diarrhée, œdème, entérite, fièvre, troubles gastriques, impotence, infections, ictère, problèmes ophtalmiques, problèmes pulmonaires, traitement des plaies (Duke, 2007). c. Classification Famille: FABACEAE Genre: Acacia Espèce: Acacia raddiana Nom vernaculaire: Talh Figure 7: Photo d’Acacia raddiana (LPSO Data Base). 2.4. Asteriscus graveolens a. Description botanique Asteriscus graveolens est un arbuste bas, à écorce blanche et crevassée dans les parties âgées, à rameaux très étalés naissant peu au-dessous des capitules; feuilles d’un vert pale, étroites et profondément découpées, très velues, les supérieures presque entières et entourant le capitule qu’elles dépassent longuement; involucres à bractées coriaces, indurées à maturité; fleurs jaunes; écailles du réceptacle allongées et dures, dépassant longuement les achaines, ceux-ci en cône renversé, arqués, velus, à quatre côtes très saillantes, tronqués au sommet et à aigrette remplacée par une couronne de quatre écailles membraneuses déchiquetées. Très commun dans tout le Sahara, surtout dans les dépressions argilo-sablonneuses (Ozenda, 2004) (Figure 8). 80 b. Utilisation populaire Cette plante est utilisée pour calmer la fièvre et les douleurs céphaliques (maux de tête, névralgies, etc.), le traitement des troubles gastro-intestinaux, les bronchites, les inflammations (Cheriti et al., 2007), les problèmes pulmonaires, la sinusite et le traitement de stérilité chez les femmes (IUCN. 2005). c. Classification Famille: ASTERACEAE Genre: Asteriscus Espèce: Asteriscus graveolens Nom vernaculaire: Tafs Figure 8: Photo d’Asteriscus graveolens (en bas) (LPSO Data Base). 2.5. Fredolia aretioides a. Description botanique Plante formant des touffes compactes hémisphériques pouvant dépasser 50 cm de diamètre, constituées par des rameaux très serrés les uns contre les autres et dont les interstices sont bourrés de sable; feuilles opposées très serrées, glauques, dures et terminées chacune par une épine courte; fleurs peu visibles, par deux ou trois au sommet des rameaux. Commun dans le Sahara oranais, dans les régions de Beni-Ounif et Igli surtout, plus rare vers l’Est dans les régions de Laghouat, Biskra et Touggourt, vit sur les regs durs où il forme souvent des peuplements étendus (Ozenda, 2004). C’est une plante endémique d’Algérie et Maroc (IUCN, 2005) (Figure 9). 81 b. Utilisation populaire Cette plante est essentiellement utilisée dans le traitement des infections urinaires, comme diurétique, antirhumatismal, et comme antidote pour divers poisons (IUCN, 2005). c. Classification Famille: CHENOPODIACEAE Genre: Fredolia Espèce: Fredolia aretioides Nom vernaculaire: Degaa Figure 9: Photo de Fredolia aretioides (LPSO Data Base). 3. Plantes toxiques 3.1. Calotropis procera a. Description botanique C. procera (Ait.), arbuste de 2 à 2,50 m de haut portant des fleurs odorantes de 2 à 3 cm de largeur, ornementales par leur corolle blanche à lobes violacés. Les fruits, verts et subglobuleux, sont remplis de graines à aigrettes blanches. Les pétales de cette espèce sont plus ou moins dressés. Son aire couvre l'Inde occidentale et centrale, l'Iran et l'Afrique tropicale. Le latex de C. procera contient le coagulum des résines et du caoutchouc. Le latex renferme d'autre part de la trypsine, un lab-ferment actif et un poison cardiaque. Cette espèce a cependant 1a réputation d'y indiquer la présence d'une couche d'eau assez proche du sol (UNESCO, 1960) (Figure 10). 82 b. Utilisation populaire Cette plante est largement utilisée en médecine traditionnelle. Selon la partie de la plante, la méthode et la voie d’administration, elle est utilisée pour: toux, filarioses, anasarque, dents, femmes présentant une dystocie, hypertension artérielle, menace d’avortement, morsure de serpent, crise d’asthme, coqueluche, tuberculose, lèpre, antiseptique, douleurs ostéo-articulaires, douleurs rhumatismales, céphalées, diarrhées, syphilis, épilepsie, dermatose, plaies (cicatrisant) (Cisse, 2005). Figure 10: Photo de Calotropis procera (LPSO Data Base). c. Classification Famille: ASCLEPIADACEAE Genre: Calotropis Espèce: Calotropis procera Nom vernaculaire: Krenka. 3.2. Citrullus colocynthis a. Description botanique Herbe annuelle ou vivace à tige procombante ou grimpante. Les feuilles, alternes, longues de 5 à 10 cm, ont un limbe découpé en 5 à 7 lobes séparés par des sinus larges, le lobe central est parfois ovale. Les fleurs monoïques, solitaires, apparaissent l'été à l'aisselle des feuilles. La corolle de couleur jaune comporte cinq lobes. Le fruit est sphérique et lisse, d'abord d'un vert tacheté, puis jaunâtre à maturité. Il contient une pulpe tendre et spongieuse et des graines. La Coloquinte est originaire des parties les plus chaudes de l'Asie et de l'Afrique. Elle se trouve en Arabie, en Syrie et en Egypte, ainsi que dans les 83 étendues arides et sablonneuses du nord-ouest, du centre et du sud de l'Inde. On la cultive dans certaines régions de l'Espagne et à Chypre (UNESCO, 1960) (Figure 11). b. Utilisation populaire Cette plante est utilisée en médecine traditionnelle pour le diabète, dermatoses, odontalgie, infections génitales, algies rhumatoïdes, plaies, et piqûre de scorpion (Maiza et al., 1993). Figure 11: Photo de Citrullus colocynthis (LPSO Data Base). c. Classification Famille: CUCURBITACEAE Genre: Citrullus Espèce: Citrullus colocynthis Nom vernaculaire: Hdedj. 3.3. Nerium oleander a. Description botanique Nerium oleander est un arbuste de 2-4 m de hauteur avec des tiges et branches. Les grandes feuilles peuvent atteindre 10 cm de long, persistantes, coriaces, simples, entières, lancéolées, avec une veine médiane et un certain nombre de veines secondaires parallèles. 84 Les fleurs ont un parfum fort et sont liées aux corymbes terminaux. Le calice est deux à trois fois plus court que le tube de la corolle. Les étamines sont enfermées et insérées au milieu de la corolle. Le fruit est cylindrique composé de follicules de 4-8 cm de long. Il renferme beaucoup de graines. La floraison s’étend de Mars à Juin. Deux sous-espèces sont signalées: kuridicum (Turquie d’Asie) et oleander (endémique de la Méditerranée) (IUCN, 2005) (Figure 12). Figure 12: Photo de Nerium oleander (LPSO Data Base). b. Utilisation populaire Les parties utilisées de cette plante sont principalement les racines et feuilles. Elle est indiquée pour: gangrène, eczéma, céphalées, grippe, mal de dents, chute de cheveux, lésions dermiques légères (IUCN, 2005). c. Classification Famille: APOCYNACEAE Genre: Nerium Espèce: Nerium oleander Nom vernaculaire: Defla 3.4. Pergularia tomentosa a. Description botanique Arbuste d'environ 50-60 cm de long, atteignant 1 m dans les bonnes conditions. Les plus jeunes tiges s'enroulent autour des plus anciennes boisées. Les tiges sont couvertes de 85 poils. Les feuilles, opposées, sont duveteuses et en forme de cœur. Les fleurs sont petites avec cinq pétales jaune-blanchâtres. Les fruits sont des follicules oblongs et globuleux. Au plus léger contact, les feuilles et fruits de cette plante secrètent un fluide collant blanc. La floraison se fait au printemps au Sahara du Nord et à n'importe quel moment de l'année au Sahara centrale (IUCN, 2005) (Figure 13). b. Utilisation populaire Pergularia tomentosa est utilisée pour le tannage des peaux (le suc laiteux qui s'écoule de la plante brisée fait tomber les poils). L’utilisation pour le traitement de certaines maladies est liée aux latex, feuilles et racines (avec différentes préparations et voies d’administration). Cette plante est utilisée pour : bronchites, tuberculose, morsures de serpent, effet laxative, antihelminthique, dermatoses, et comme dépilatoire (IUCN, 2005). Figure 13: Photo de Pergularia tomentosa (LPSO Data Base). c. Classification Famille: ASCLEPIADACEAE Genre: Pergularia Espèce: Pergularia tomentosa Nom vernaculaire : Ghelga, Umjloud, La’amaya. 4. Procédures expérimentales 4.1. Matériel végétal Au cours de la période de Décembre 2007 à Janvier 2008, cinq plantes médicinales (Limoniastrum feei, Launeae arborescens (Batt.) Murb., Fredolia aretioides Moq. et Coss., 86 Asteriscus graveolens (Forsk) et Acacia raddiana) et quatre plantes toxiques et/ou médicinales (Citrullus colocynhis (L.) Schrad, Calotropis procera Ait., Nerium Oleander et Pergularia tomentosa) ont été récoltées de leur habitat naturel dans la région de Bechar (sud-ouest d'Algérie). Toutes les espèces ont été identifiées au niveau de l'agence nationale pour la protection de la nature (Bechar, Algérie) et un spécimen est conservé au niveau de l'herbier du Laboratoire de Phytochimie et de Synthèse Organique (LPSO), Université de Bechar, Algérie. Les plantes fraîches récoltées ont été séchées à l'air et à l'ombre et chaque partie de chaque plante a été séparée. Les plantes et parties utilisées sont données dans les Tableaux 4 et 5. Tableau 4: Les plantes médicinales testées et les parties utilisées. Familles Espèces Code LPSO FABACEAE Acacia raddiana CA00/37 ASTERACEAE Asteriscus graveolens CA00/14 CHENOPODIACEAE Fredolia aretioides CA00/42 ASTERACEAE Launeae arborescens CA99/25 PLUMBAGINACEAE Limoniastrum feei CA99/14 Partie utilisée Feuilles Ecorces Feuilles Tiges Partie aérienne Racines Partie aérienne Racines Partie aérienne Racines Tableau 5: Les plantes toxiques et/ou médicinales testées et les parties utilisées. Familles Espèces Code LPSO Partie utilisée CUCURBITACEAE LPSO/PT/01 Feuilles et tiges Citrullus colocynthis Fruits ASCLEPIADACEAE LPSO/PT/02 Feuilles Calotropis procera Tiges APOCYNACEAE LPSO/PT/03 Feuilles Nerium oleander Tiges ASCLEPIADACEAE LPSO/PT/04 Feuilles Pergularia tomentosa Tiges 4.2. Souche fongique La souche fongique utilisée dans cette étude est de l'espèce Fusarium oxysporum f. sp. albedinis (Foa), l'agent causal de la maladie du Bayoud qui affecte les palmiers dattiers 87 (Phoenix dactylifera L). La souche utilisée dans cette étude a été obtenue à partir de l'Institut Technique d'Agronomie Saharienne (ITAS), Adrar, Algérie. 4.3. Préparation des extraits de plante Le méthanol, l'acétate d'éthyle, le dichlorométhane et l'hexane ont été utilisés en tant que solvants organiques avec leurs polarités différentes pour extraire les substances actives des tissus végétaux en utilisant l'extraction sous reflux. Dans chaque séquence d'extraction, 10 g de chaque partie de plante séchée en poudre ont été mélangées avec 80 mL de solvant dans un ballon de 250 mL surmonté d'un réfrigérant pour refroidissement. La température d'extraction est contrôlée à la température d'ébullition du solvant pendant 2 heures. Les poids secs (après filtration et évaporation) ont été déterminés et les extraits ont été maintenus dans des tubes à 5 °C. 4.4. Essai biologique et médias utilisés Un nombre suffisant de disques en papier Whatman (6 mm de ∅ et 1 mm d’épaisseur) ont été stérilisés à l'autoclave à 121 °C pendant 15 min, et gardés à 70 °C pendant une nuit pour assurer le séchage. Chaque disque a été imbibé par l’un des extraits dissous dans un volume approprié de solvant pour avoir un poids bien déterminé dans chaque disque (200, 400, 800 ou 1600 μg) et maintenu à 40 °C à sec (toutes les manipulations ont été faites en conditions stériles). Une suspension de spores du champignon a été préparée en transférant la culture de 7 jours du Foa sur le milieu PDA (Potatoes Dextrose Agar, contenant: extrait de pommes de terre 4 g, glucose 20 g, agar 15 g, eau distillée 1 L) vers le milieu SNA (Synthetic Nutrient poor Agar, contenant: KH2PO4 1 g, KNO3 1 g, MgSO4-7H2O 0,5 g, KCl 0,5 g, glucose 0,2 g, saccharose 0,2 g, agar 15 g, eau distillée jusqu'à 1 L) pour induire la formation de spores. Les boites contenant la culture de Foa sur la SNA (10 jours) étaient utilisées pour la récupération des spores. La surface de chaque boite était submergée avec 10 mL d’eau stérilisée pour déloger les spores fongiques puis l’eau récupérée était filtrée pour éliminer les fragments de mycélium. La concentration des spores de Foa était ajustée à 106 spores/mL par dilution et comptage. Le test antifongique a été réalisé par la technique de diffusion en agar. Des boîtes de Pétri stériles (90 mm ∅) contenant le milieu PDA ont été inoculées avec 100 μL de la 88 suspension de spores de Foa (106 spores/mL). Les disques stériles (6 mm ∅) contenant les extraits de plantes (200 μg, 400 μg, 800 μg, 1600 μg) ont été déposés sur le PDA inoculé (incubation à 21°C pendant 5 jours). Les résultats ont été obtenus en tant que diamètre de zone d'inhibition (millimètre) à partir de trois disques pour chaque expérience. 4.5. L'effet des extraits de plantes sur la virulence de Foa L'analyse de virulence a été réalisée comme décrite par Herrmann et al. (1996) avec légères modifications. Des tubercules de pommes de terre (Solanum tuberosum L.) étaient stérilisés en surface par l’hypochlorite de sodium à 1 % pendant 5 min et lavés trois fois avec de l'eau stérile. Après avoir été séchées, les pommes de terre ont été coupées en tranches de 6 mm d'épaisseur et placées sur du papier filtre stérile, imbibé d'eau stérile, dans des boîtes Pétri stériles. Les disques contenant les extraits de plantes (200 μg, 400 μg, 800 μg, 1600 μg)étaient appliqués sur des tranches de pommes de terre. Après 5 min, chaque tranche de pommes de terre a été infectée par un cercle de culture de 7 jours du Foa sur PDA (12 mm ∅, côté mycélien vers le bas) et incubée à 21 °C et à l'obscurité pendant 6 jours au bout desquels les tissus nécrosés ont été pesés. Les résultats ont été comparés à la virulence de Foa (disques sans extraits de plante) en tant que virulence relative (VR). Le control négatif était représenté par des disques passant tout le protocole sans utilisation des extraits de plante. Aucun produit antifongique connu n'était signalé être efficace sur Foa pour être utilisé en tant que control positif. 4.6. Criblage phytochimique et bioautographie Se basant sur les résultats obtenus du test antifongique et du test de virulence pour les neuf plantes (deux parties de chaque plante) avec quatre solvants (Méthanol, Acétate d’éthyle, Dichlorométhane, et Hexane), les extraits qui ont montré un effet d’inhibition ou ont diminué la VR en dessous de 50 % étaient choisis pour le criblage phytochimique et bioautographie. Dans ces conditions, dix-sept extraits de plantes médicinales et quatorze extraits de plantes toxiques ont été choisis. Les plantes, parties de plante et les solvants d’extraction sont présentés dans les Tableaux 6 et 7. 4.6.1. Criblage phytochimique: La révélation des Flavonoïdes, Tanins, Coumarines et Alcaloïdes a été réalisée par pulvérisation de réactifs sur les plaques CCM développées. Concernant les saponosides, le test est réalisé par calcul d’indice de mousse. 89 Tableau 6: Les extraits de plantes médicinales soumis au criblage phytochimique et bioautographie. Plantes Parties Solvant d'extraction Méthanol Feuilles Hexane Méthanol Acacia raddiana Les écorces Acétate d’éthyle Hexane Acétate d’éthyle Partie aérienne Dichlorométhane Launeae arborescens Racines Acétate d’éthyle Partie aérienne Acétate d’éthyle Limoniastrum feei Racines Acétate d’éthyle Acétate d’éthyle Dichlorométhane Feuilles Hexane Asteriscus graveolens Acétate d’éthyle Tiges Dichlorométhane Partie aérienne Hexane Fredolia aretioides Racines Acétate d’éthyle 4.6.1.1. Chromatographie sur couche mince (CCM) Les méthodes chromatographiques sont les méthodes les plus importantes de l'analyse immédiate. Elles permettent de séparer les constituants d'un mélange plus ou moins complexe mais là ne se borne pas leur intérêt car elles peuvent également assurer dans certaines conditions l'identification et la détermination quantitative des substances (Burgot et Burgot, 2002). La recherche de composés organiques est réalisée, sur les différents extraits préparés à partir des différents organes par des examens chromatographiques par CCM. Le choix de l’éluant a été effectué à la suite de plusieurs essais préliminaires pour trouver celui qui donne la meilleure séparation. Parmi les mélanges de solvants qui ont été testés: - BAW : Butanol /Acide acétique/Eau - Méthanol / Hexane - Acide acétique / Hexane - Acétate d'éthyle / Chloroforme - Acétate d'éthyle / Méthanol - Méthanol / Heptane 90 - Acétate d'éthyle / Hexane - Acétate d'éthyle / Heptane Tableau 7: Les extraits de plantes toxiques soumis au criblage phytochimique et bioautographie. Plantes Parties Solvant d'extraction Méthanol Hexane Feuilles et tiges Acétate d’éthyle Citrullus colocynthis Dichlorométhane Méthanol Fruits Acétate d’éthyle Méthanol Feuilles Acétate d’éthyle Nerium oleander Méthanol Tiges Acétate d’éthyle Feuilles Hexane Calotropis procera Feuilles Méthanol Méthanol Pergularia tomentosa Tiges Hexane Technique A l’aide d’une micropipette, 5 μL (contenant 400 μg d’extrait) de chaque solution (extrait + solvant d’extraction) ont été déposés sur la plaque. L’éluant a été préparé dans une cuve recouvrant le fond à 0,5 cm de hauteur. La cuve a été laissée fermée jusqu’à saturation puis la plaque de CCM sur silice 60F254 a été déposée. La migration du solvant d’élution entraîne les substances en fonction de leurs affinités respectives pour le couple de phases, stationnaire et mobile. L’identification des métabolites séparés se fait par examination des résultats de la séparation à la lumière visible et/ou sous UV à 254 nm et ensuite à 365 nm (on utilise cette méthode de détection en priorité car elle n'endommage pas la plaque) puis par révélation par des réactifs spécifiques des composés recherchés. 4.6.1.2. Mise en évidence des saponosides: Le dosage des saponosides a été réalisé par le calcul de l’indice de mousse (IM) selon la méthode décrite par Dohou et al. (2003). Dans un erlenmeyer de 250 mL, 2 g de matière végétale sont introduits avec 100 mL d’eau distillée et portés à ébullition. Le 91 mélange a été maintenu en ébullition modérée pendant 30 min. Après filtration, le filtrat a été ajusté à 100 mL avec de l’eau distillée. Le décocté a été réparti successivement en 1, 2,….10 mL dans une série de 10 tubes à essai numérotés de 1 à 10. Le volume a été ajusté dans chaque tube à 10 mL avec de l’eau distillée. Ensuite, chaque tube a été agité pendant 15 secondes à raison de 2 agitations par seconde puis laissé au repos pendant 15 mn. Si la mousse est égale ou proche de 1 cm dans le Xème tube, alors l’indice de mousse est calculé par la formule suivante : IM =hauteur de mousse (en cm) dans le Xème tube x 5 / 0,0X. La présence de saponines dans la partie utilisée de la plante est confirmée avec un indice supérieur à 100. 4.6.1.3. Révélation des flavonoïdes: Les plaques de CCM contenant les extraits de plantes ont été pulvérisées par une solution éthanolique avec 5 % d’AlCl3. L'apparition de couleur jaune verdâtre sous UV à 365 nm indique la présence des flavonoïdes. 4.6.1.4. Révélation des coumarines: La caractérisation des coumarines a été réalisée par la « réaction de Borntrager » qui consiste à pulvériser la plaque à l’aide d’une solution de KOH éthanolique à 10 %. L'apparition de couleur rouge au visible indique la présence des anthraquinones, tandis qu’une couleur jaune sous UV 365 nm indique la présence des anthrones, furanocoumarines, ou pyranocoumarines. 4.6.1.5. Révélation des tanins: La plaque est pulvérisée à l’aide d’une solution de FeCl3 à 1 % dans le méthanol à 80 %. L'apparition d’une couleur bleu-noire indique la présence de tanins galliques; une couleur brun-verdâtre indique la présence des tanins catéchiques. 4.6.1.6. Révélation des alcaloïdes: La révélation des coumarines a été réalisée par le « Réactif de Marquis », formé par le mélange de 10 mL de formaldéhyde avec 100 mL d'acide sulfurique. Le changement de 92 couleur des spots indique la présence des alcaloïdes ou bien des hydrocarbures aromatiques. 4.6.2. Bioautographie On peut classer la bioautographie en trois modes: bioautographie de contact, bioautographie d’immersion et bioautographie directe. Dans cette étude, on a utilisé la bioautographie directe qui présente l’avantage d’être une technique convenable pour la détection des extraits de plantes complexes, économique, tout en facilitant l’évaluation rapide. Le processus de la bioautographie directe peut être divisé en trois parties: (1) culture du micro-organisme à tester; (2) séparation chromatographique; (3) traitement pour la détection post-chromatographique (Horvath et al., 2004a; b). (1) Culture du Foa: La culture de Foa a été réalisée sur milieu PDA à partir des spores. Ensuite, le champignon a été repiqué sur milieu SNA pour avoir une concentration suffisante en spores (106 spores/mL). (2) Séparation chromatographique: Dans cette étape, deux plaques de CCM ont été réalisées, l’une pour la révélation des métabolites, l’autre pour le test antifongique (détection post-chromatographique). La quantité déposée pour chaque extrait est d’environ 400 µg. (3) Détection post-chromatographique: La 2ème plaque a subit les traitements suivants: - Immersion de la plaque dans PDB (Potatoes Dextrose Broth, milieu de culture liquide) contenant une concentration en spores égale à 106 spores/mL pendant 10 s. - Incubation à 21 °C pendant 4 jours (dans un environnement humide). - Immersion de la plaque dans une solution d’un sel d’iodonitrotetrazolium chloride (INT) (2 mg/mL). - Laisser agir pendant 24 h à 21 °C. - Immersion dans l’éthanol (70 %) pendant 10 s pour arrêter la croissance. 93 - Les zones d’inhibition étaient visibles comme zones claires sur un fond de couleur rouge. Le degré d’inhibition est représenté par le diamètre de la zone d’inhibition. En plus, les Rf des zones d’inhibition étaient calculés. - Les plaques CCM de contrôle étaient représentées par des plaques passant toutes les étapes, sauf, pour certaines sans extraits, pour d’autres sans champignon. 4.7. Isolement du composé le plus actif (CCF1) par LC-UV L’isolement du produit CCF1, qui est le produit le plus actif sur Foa, a été réalisé par chromatographie liquide couplée à l’absorbance UV. D’après les résultats de la bioautographie, le produit CCF1 a un rapport frontal (Rf) égal à (0,82) en utilisant une phase mobile constituée d’acétate d’éthyle/heptane (75/25) et plaque de silice comme phase stationnaire. Une quantité suffisante de gel de silice a été mise dans une colonne en verre. La colonne est liée par son coté supérieur à une pompe péristaltique (donne une pression à l’efflux de la phase mobile, acétate d’éthyle/heptane: 75/25). Après le premier passage de la phase mobile, l’extrait des fruits de Citrullus colocynthis mélangé avec l’acétate d’éthyle est injecté dans la colonne. A son coté inférieur, la colonne est liée à un spectrophotomètre UV-Visible réglé à la longueur d’onde λ = 254 nm pour donner des valeurs d’absorbance instantanées des produits sortant. Puisque le produit CCF1 a un Rf supérieur à 0,70, le produit isolé a été analysé en changeant la phase mobile (diminution de la polarité) pour confirmer que le produit CCF1 est pur (cette étape a été réalisée malgré que la détection UV suffit). 4.8. Analyse du produit CCF1 par spectroscopie infrarouge Un milligramme du produit isolé (CCF1) a été mélangé avec 200 mg de KBr dans un mortier jusqu’à homogénéisation. Le mélange a été étendu uniformément dans une matrice spéciale et soumis à une haute pression pour obtenir une pastille adéquate. Les pastilles doivent être préparées soigneusement pour obtenir des spectres IR interprétables. 94 4.9. Analyse du produit CCF1 par spectroscopie UV-Visible Une petite quantité du produit CCF1 a été diluée dans 2 mL de méthanol. Le mélange a été analysé par UV en utilisant un spectrophotomètre UV-Visible dans l’intervalle de longueur d’onde de 200 à 400 nm. 4.10. Effet des extraits bioactifs sur l’activité cellulasique du Foa 4.10.1. Obtention des cellulases du Foa Dans un erlenmeyer, 500 mL de milieu de culture Czapek-Dox cellulose inoculé par des spores de Foa (106 spores/mL) ont été incubés à 21 ºC sous agitation modérée pendant 96 h. Après l’incubation, le milieu a été filtré, le filtrat du milieu contenant les cellulases a été versé dans des flacons (5 mL dans chaque flacon). Les flacons étaient conservés à -18 ºC jusqu’à utilisation. 4.10.2. Test de l’effet sur l’activité cellulasique Le test a été réalisé sur milieu cellulose (2 %) agar (1,5 %) (10 mL dans chaque boite Pétri). Les extraits bioactifs sur Foa ont subit une CCM. Chaque chromatogramme, après évaporation de l’éluant, a été mis renversé sur le milieu cellulose-agar pendant 120 min pour favoriser la diffusion. Le filtrat contenant les cellulases (5 mL) a été ensuite versé sur le milieu cellulose après l’enlèvement du chromatogramme et incubé à 21 ºC pendant 120 min pour favoriser l’activité cellulasique. Après la période d’incubation, le milieu est coloré avec une solution d’iode (2 % p/v) et d’iodure de potassium (3 % p/v) dans l’éthanol (70 %) pour une durée de 5 min ensuite lavé à l’eau distillée. Les zones présentant une inhibition de l’activité cellulasique sont colorées en marron foncé. La coloration utilisée était basée sur les recherches réalisées par Kasana et al. (2008) et Abu-Bakar et al. (2010). L’évaluation de l’effet sur l’activité cellulasique est exprimée par le diamètre (mm) et Rf des zones d’inhibition ou activation. Des tests de control ont été réalisés avec des boites passant tout le protocole mais sans filtrat ou sans extrait (le filtrat était remplacé par le milieu de culture). 5. Criblage phytochimique et bioautographie des rachis de Phoenix dactylifera L. Les rachis de 8 cultivars de palmier dattier (Phoenix dactylifera L.): Tiwraghine Lhorra (S), Taqerbucht (R), Feggus (S), Ghares (V), Bent-Cherk (S), Kseiba (S), BaydhDjaje (I), et Rotbi (T), ont été classés selon les données de Brac de la Prrière et Benkhelifa (1991). Les caractères vis-à-vis Fusarium oxysporum f. sp. albedinis sont: 95 Sensibilité (S), Tolérance (T), Résistance (R), Variabilité (V), et Inconnu (I). Les rachis ont été récoltés à partir des oasis du Sud-Ouest Algérien, découpés, séchés à l’ombre et broyés. L’extraction a été réalisée à reflux par 4 solvants (méthanol, acétate d’éthyle, dichlorométhane, hexane). Les extraits ont subit les mêmes procédures concernant le criblage phytochimique et la bioautographie que les plantes utilisées dans cette étude. Le but est de faire une corrélation entre ces cultivars (sensibilité, tolérance, résistance,…) avec les résultats du criblage phytochimique et l’effet des extraits sur le Foa par bioautographie. Design des expériences et analyse des données Les expériences ont été réalisées en blocs aléatoires complets. Les données recueillies ont été soumises au test ANOVA, test de corrélation et l'analyse des fréquences en utilisant le logiciel Statistica V. 5 (Statsoft, ed'97) et les traitements enregistrés ont été considérés significatifs à p <0,05. 96 REFERENCES Abu-Bakar N. K., Abd-Aziz S., Hassan M. A. et Ghazali F. M. 2010. Isolation and Selection of Appropriate Cellulolytic Mixed Microbial Cultures for Cellulases Production from Oil Palm Empty Fruit Bunch. Biotechnology, 9(1): 73-78. Belboukhari N. et Cheriti A. 2005. Antimicrobial Activity of Aerial Part Crude Extracts from Limoniastrum feei. Journal of Plant Sciences, 4: 496-498. Belboukhari N. et Cheriti A. 2006a. Antibacterial and Antifungal Activities of Crude Extracts from Launeae arborescens. Pakistan Journal of Biological Sciences, 9(1):1-2. Belboukhari N. et Cheriti A. 2006b. Phytochemical Investigation of the Bioactive Extracts from Launaea arborescens. Pakistan Journal of Biological Sciences, 9(15): 2930-2932. Benzyane M., Blerot Ph. et Giot P. 1999. Le Grand Livre de la Forêt Marocaine. Edition Mardaga. p. 280. Boullard B. 2001. Plantes Médicinales du Monde: Croyances et réalités. Edition ESTEM, Paris. p.660. Brac de la Prrière R. A. et Benkhelifa A. 1991. Progression de la fusariose du palmier dattier en Algérie. Sécheresse, 2(2): 119-128. Burgot G. et Burgot J-L. 2002. Méthodes Instrumentales d’Analyse Chimique et Applications. 1ère édition. Edition Médicale Internationales. p.306. Cheriti A. et Belboukhari N. 2007. Flavonoids of Limoniastrum feei. Research Journal of Phytochemistry, 1(2): 74-78. Cheriti A., Saad A., Belboukhari N. et Ghezali S. 2007. The Essential Oil Composition of Bubonium graveolens (Forsk.) Maire from the Algerian Sahara. Flavour and Fragrance Journal, 22(4): 286-288. 97 Cisse B. S. 2005. Propriétés Pharmacochimiques de Calotropis procera Ait. (Asclepiadaceae), Effets Anti-inflammatoires et Anti-microbiens des Extraits des Ecorces de Racines. Thèse de Doctorat, Université de Bamako, Mali. p. 133. Dohou N., Yamni K., Tahrouch S., Idrissi Hassani L. M., Badoc A. et Gmira N. 2003. Screening Phytochimique d’une Endémique Ibéro-Marocaine, Thymelaea lythroides. Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 142: 61-78. Eveleigh D. E., Mandels M., Andreotti R. et Roche Ch. 2009. Measurement of Saccharifying Cellulase. Biotechnology for Biofuels, 2: 21. Herrmann M., Zocher R. et Haese A. 1996. Enniatin Production by Fusarium strains and its Effect on Potato Tuber Tissue. Applied and Environmental Microbiology, 62 (2): 393398. Horvath G. Y., Botz L., Kocsis B., Lemberkovics E. et Szabo GY. 2004a. Antimicrobial Natural Products and Antibiotics Detected by Direct Bioautography Using Plant Pathogen Bacteria. Acta Botanica Hungarica, 46(1-2): 153-165. Horvath G. Y., Szabo GY., Lemberkovics E., Botz L. et Kocsis B. 2004b. Characterization and TLC-Bioautographic Detection of Essential Oils from Some Thymus Taxa. Determination of the Activity of the Oils and their Components Against Plant Pathogenic Bacteria. Journal of Planar Chromatography, 17: 300-304. IUCN. 2005. A Guide to Medicinal Plants in North Africa. IUCN Centre for Mediterranean Cooperation, Malaga (Spain). Kasana R. C., Salwan R., Dhar H., Dutt S. et Gulati A. 2008. A Rapid and Easy Method for the Detection of Microbial Cellulases on Agar Plates Using Gram’s Iodine. Current Microbiology, 57: 503-507. Maiza K., Brac de la Perrière R. A. et Hammiche V. 1993. Pharmacopée Traditionnelle Saharienne: Sahara Septentrional. Acte du 2ème Colloque Européen d’Ethnopharmacologie 98 et de la 11ème Conférence Internationale d’Ethnomédecine, Heidelberg, 24-27 Mars, 169170. Ozenda P. 2004. Flores et Végétation du Sahara. 3ème édition. Edition CNRS. Paris. p662. UNESCO. 1960. Les Plantes Médicinales des Régions Arides. Recherches sur les zones arides, Paris, p.99 99 RESULTATS 100 CHAPITRE II: RESULTATS 1. Plantes médicinales 1.1. Rendement d'extraction Le rendement maximal d'extraction est représenté par le méthanol (9,80 %) pour les tiges d’Asteriscus graveolens. Le rendement minimal d'extraction est représenté par le hexane (0,37 %) pour la partie aérienne de Limoniastrum feei (Tableau 8). Tableau 8: Rendement d’extraction (%) à partir du poids sec de plante. Espèces de Partie Solvant utilize pour l’extraction plante Utilisée Méthanol AE DCM Hexane Feuilles 8,91 1,11 1,85 2,80 Acacia raddiana Ecorse 6,85 2,82 1,48 1,18 Partie aérienne 5,08 3,56 5,69 1,26 Launeae arborescens Racines 5,62 1,81 0,69 2,90 Partie aérienne 6,33 1,30 0,53 0,37 Limoniastrum Feei Racines 2,27 0,86 0,84 1,03 Feuilles 9,53 4,72 4,13 3,27 Asteriscus graveolens Tiges 9,80 7,04 0,61 0,93 Partie aérienne 4,69 1,05 0,78 1,17 Fredolia aretioides Racines 4,40 0,57 0,67 0,74 EA: Acétate d’éthyle, DCM: Dichlorométhane. 1.2. Test antifongique En ce qui concerne les effets contre Foa, les extraits des cinq plantes médicinales ont montré un effet détectable au moins dans deux tests comme pour Launea arborescens (l'extrait d'acétate d'éthyle des racines à 800 µg et 1600 µg) confirmant la présence des substances antifongiques chez ces plantes (Tableau 9). L'analyse des fréquences a démontré que 86.88 % des expériences réalisées ont représenté des effets non détectés. En plus, 10.62 % des résultats ont montré un effet faible sur le Foa avec des diamètres des zones d'inhibition (∅: 8-14 mm). Seulement 2.50 % des résultats ont montré des effets antifongiques modérés sur Foa avec des diamètres des zones d'inhibition (∅: 15-20 mm). Sur 160 expériences réalisées, aucune n'a présenté un effet fort sur Foa (diamètre de zone d'inhibition > 20 mm). 101 Sur la base des résultats obtenus, l'analyse de la variance (test d'ANOVA) a démontré que l'effet des solvants utilisés pour l'extraction sur Foa était significatif (p < 0.05) ; les effets antifongiques ont été représentés principalement par l'acétate d'éthyle, l'hexane et le méthanol. Pour les extraits d'acétate d'éthyle, 13 sur 40 expériences (32.50 %) ont montré des effets notables sur Foa; le pouvoir antifongique le plus important (∅: 19 mm) étant celui des extraits d'acétate d'éthyle de la partie aérienne de Limoniastrum feei (1600 µg). Cinq sur 40 expériences (12.50 %) réalisées avec les extraits hexaniques ont démontré des effets notables sur Foa; le pouvoir antifongique le plus important (∅: 16 mm) a été celui des extraits hexaniques de la partie aérienne de Fredolia aretioides. Les extraits méthanoliques ont montré des effets sur la Foa seulement pour l'Acacia raddiana (effet faible, ∅: 8-14 mm). Les extraits obtenus par le dichlorométhane n'ont aucun effet discernable sur Foa. L'effet du poids d'extrait dans les disques (200, 400, 800 et 1600 µg) sur Foa était significatif (p < 0.05). A 200 µg, seulement une expérience sur 40 ont eu un effet discernable (∅: 12 mm) représenté par l'extrait d'acétate d'éthyle du Limoniastrum feei (partie aérienne). A 400 µg, deux expériences sur 40 ont donné un effet discernable représenté par l'extrait d'acétate d'éthyle de la partie aérienne de Limoniastrum feei (∅: 11 mm) et l’extrait d'acétate d'éthyle des feuilles d'Asteriscus graveolens (∅: 10 mm). A 800 µg, huit expériences sur 40 ont montré des effets discernables (∅: 8-14 mm) représentés majoritairement par les extraits d'acétate d'éthyle (n = 5, 62.50 %). A 1600 µg, dix expériences sur 40 ont montré des effets discernables (∅: 10-19 mm) représentés principalement par les extraits d'acétate d'éthyle (n = 5, 50.00 %) et les extraits hexaniques (n = 3, 30.00 %). 1.3. Test de virulence Dix extraits de cinq plantes médicinales (deux parties pour chaque plante) à différentes quantités (200, 400, 800 et 1600 µg) (n = 160) ont été utilisés pour examiner leur effet sur la virulence de Foa (sur le tissu de tubercule de pomme de terre). 102 Tableau 9: Activité antifongique des extraits de plantes sur Fusarium oxysporum f. sp. albedinis comme diamètre de zone d’inhibition (mm). Poids d’extrait dans le disque (µg) Espèces Partie Solvant 200 400 800 1600 Méthanol ND ND 10 12 Feuilles Acétate d’éthyle ND ND ND ND Dichlorométhane ND ND ND ND Acacia Hexane ND ND ND 10 Raddiana Méthanol ND ND ND 11 Ecorse Acétate d’éthyle ND ND 13 18 Dichlorométhane ND ND ND ND Hexane ND ND ND ND Méthanol ND ND ND ND Partie Acétate d’éthyle ND ND ND ND aérienne Dichlorométhane ND ND ND ND Launeae Hexane ND ND ND ND arborescens Méthanol ND ND ND ND Racines Acétate d’éthyle ND ND 11 15 Dichlorométhane ND ND ND ND Hexane ND ND ND ND Méthanol ND ND ND ND Partie Acétate d’éthyle 12 11 14 19 aérienne Dichlorométhane ND ND ND ND Limoniastrum Hexane ND ND ND ND feei Méthanol ND ND ND ND Racines Acétate d’éthyle ND ND ND ND Dichlorométhane ND ND ND ND Hexane ND ND ND ND Méthanol ND ND ND ND Feuilles Acétate d’éthyle ND 10 11 10 Dichlorométhane ND ND ND ND Asteriscus Hexane ND ND 8 10 graveolens Méthanol ND ND ND ND Tiges Acétate d’éthyle ND ND ND ND Dichlorométhane ND ND ND ND Hexane ND ND ND ND Méthanol ND ND ND ND Partie Acétate d’éthyle ND ND ND ND aérienne Dichlorométhane ND ND ND ND Fredolia Hexane ND ND 9 16 aretioides Méthanol ND ND ND ND Racines Acétate d’éthyle ND ND 9 13 Dichlorométhane ND ND ND ND Hexane ND ND ND ND ND: Non détecté. 103 Après 6 jours d'incubation à l'obscurité, les lésions nécrotiques étaient visibles comparés aux expériences sans culture de Foa et/ou extraits de plantes. La présence des nécroses dépend des extraits et/ou de l'effet de Foa. Les résultats sont présentés en tant que virulence relative (VR) comparée à la virulence de Foa sans extraits de plantes. Aucune corrélation n'est détectée entre le poids d'extrait dans les disques (200, 400, 800 et 1600 µg) et la VR (p < 0.05), et aussi entre la zone d'inhibition (mm) et la VR (p < 0.05) (Tableau 10). L'analyse des fréquences a démontré que la majorité des tests (n = 97, 61.25 %) a montré une diminution du VR de Fao sur le tissu de tubercule de pomme de terre (< 100 %). Seulement 3 sur 160 tests (1.88 %) ont présenté une VR approximativement égale à (100 ± 1 %). Seize sur 160 tests (37.50 %) ont montré une VR supérieure à celle du Foa (> 100 %). La valeur maximale de la VR est présentée par les extraits méthanoliques (1600 µg) des racines de Fredolia aretioides (PTN= 414.3 mg, VR = 625 %). La valeur minimale de la VR est présentée par l'extrait d'acétate d'éthyle (400 µg) de la partie aérienne du Launea arborescens (PTN = 19.7 mg, VR = 30 %). L'analyse de la variance (ANOVA) confirme que l'effet de plantes médicinales sur la virulence du Foa est significatif (p < 0.05) mais l'effet de la partie utilisée ne l’est pas (p < 0.05). Pour chaque plante, trente-deux tests ont été réalisés. En référence à la réduction du VR, qui signifie la diminution au-dessous de (100 %), nous pouvons classer les cinq plantes médicinales comme suit: Asteriscus graveolens (25 sur 32 tests: 78 %), Launea arborescens (23 sur 32 tests: 72 %), Limoniastrum feei (21 un sur 32 tests: 66 %), Acacia raddiana (17 sur 32 tests: 53 %), Fredolia aretioides (11 sur 32 tests: 34 %). En référence à l'augmentation du VR, qui signifie l'augmentation au-dessus de (100 %), nous pouvons classer les cinq plantes médicinales comme suit: Fredolia aretioides (21 sur 32 tests : 66 %), Acacia raddiana (15 sur 32 tests: 47 %), Limoniastrum feei (10 sur 32 tests: 31 %), Launeae arborescens (8 sur 32 tests: 25 %), Asteriscus graveolens (6 sur 32 tests: 22 %). Le test d'ANOVA démontre que l'effet du type de solvant sur la VR du Foa est significatif (p < 0.05). Pour chaque solvant, quarante tests ont été réalisés. On a observé le meilleur effet pour les extraits de dichlorométhane (29 sur 40 tests: 72 %) comparé à d'autres solvants: acétate d'éthyle (27 sur 40 tests: 68 %), hexane (25 sur 40 tests: 62 %), 104 Tableau 10: Effet des extraits de plantes sur la virulence relative du Foa. Poids d’extrait par disque (µg) Espèces de Partie Solvant 200 400 800 1600 plante Utilisée PTN VR PTN VR PTN VR PTN VR (mg) (%) (mg) (%) (mg) (%) (mg) (%) Méthanol 100.2 151 78.9 119 95.8 144 62.6 94 Feuilles AE 73.2 110 49.8 75 38.5 58 44.6 67 DCM 70.0 106 95.2 144 75.1 113 59.6 90 Acacia Hexane 217.8 329 89.2 135 79.2 119 49.5 75 raddiana Méthanol 94.5 143 51.5 78 60.8 92 86.6 131 Ecorse AE 63.6 96 103.4 156 42.0 63 44.9 68 DCM 131.8 199 82.4 124 52.2 79 34.5 52 Hexane 55.5 84 42.5 64 32.0 48 33.1 50 Méthanol 38.0 57 40.8 62 44.0 66 66.9 101 Partie AE 43.0 65 19.7 30 51.2 77 52.4 79 aérienne DCM 44.1 67 57.2 86 47.5 72 30.1 45 Launeae Hexane 59.0 89 56.8 86 69.3 105 97.8 148 arborescens Méthanol 76.1 115 106.1 160 81.4 123 111.5 168 Racines AE 58.0 87 25.4 38 32.3 49 38.8 59 DCM 48.5 73 35.9 54 43.4 65 71.9 108 Hexane 68.5 103 38.7 58 47.4 71 55.0 83 Méthanol 72.3 109 77.0 116 119.0 179 111.9 168 Partie AE 59.7 90 56.5 85 71.7 108 65.6 99 aérienne DCM 78.9 119 43.5 66 51.9 78 53.0 80 Limoniastrum Hexane 59.5 90 76.1 115 63.2 95 47.5 72 feei Méthanol 46.5 70 36.5 55 52.5 79 88.1 133 Racines AE 58.3 88 37.3 56 35.4 53 31.5 48 DCM 43.3 65 39.3 59 72.6 110 57.6 87 Hexane 46.8 71 33.6 51 46.9 71 71.6 108 Méthanol 53.3 80 42.6 64 70.4 106 83.2 125 Feuilles AE 22.1 33 59.6 90 52.0 78 121.6 183 DCM 42.1 63 27.1 41 40.5 61 27.1 41 Asteriscus Hexane 78.9 119 78.3 118 37.6 57 55.2 83 graveolens Méthanol 36.8 56 64.4 97 58.5 88 50.7 76 Tiges AE 50.6 76 63.8 96 28.2 43 38.1 57 DCM 32.3 49 47.1 71 38.1 57 52.9 80 Hexane 53.4 81 47.5 72 67.0 101 71.7 108 Méthanol 88.0 133 45.5 69 70.7 107 127.0 192 Partie AE 67.4 102 71.8 108 76.8 116 121.0 183 aérienne DCM 37.3 56 47.0 71 70.6 106 82.7 125 Fredolia Hexane 69.1 104 62.2 94 48.0 72 54.9 83 aretioides Méthanol 73.1 110 249.2 376 321.4 485 414.3 625 Racines AE 136.8 206 324.1 488 74.0 112 87.7 132 DCM 49.4 75 71.2 107 55.7 84 39.3 59 Hexane 43.2 65 44.8 68 91.6 138 78.3 118 AE: Acétate d’éthyle, DCM: Dichlorométhane, PTN: Poids du tissu nécrosé (mg), VR: Virulence relative (%), la virulence relative était comparée à la virulence du Foa sans extrait de plante (représenté par 100%, correspond à 66.3±1.7 mg de tissu de pomme de terre nécrosé). 105 méthanol (16 sur 40 tests: 40 %). En se basant sur l'augmentation du VR (> 100 %), nous pouvons classer les quatre solvants comme suit: méthanol (23 sur 40 tests: 58 %), hexane (14 sur 40 tests: 35 %), acétate d'éthyle (12 sur 40 tests: 30 %), dichlorométhane (11 sur 40 tests: 28 %). 2. Plantes toxiques 2.1. Rendement d'extraction Le rendement maximal d'extraction est représenté par le méthanol (21.91 %) pour les feuilles de Calotropis procera. Le rendement minimal d'extraction est représenté par le dichlorométhane (1.07 %) pour les tiges de Pergularia tomentosa. Les rendements peuvent être arrangés dans l'ordre décroissant suivant: méthanol (moyen: 13.24 %, minimum: 8.46 %, maximum: 21.91 %), acétate d'éthyle (moyen: 4.75 %, minimum: 2.90 %, maximum: 10.16 %), hexane (moyen: 3.05 %, minimum: 2.07 %, maximum: 6,94) puis dichlorométhane (moyen: 2.20 %, minimum: 1.07 %, maximum: 3.83 %) (Tableau 11). 2.2. Test antifongique Parmi tous les tests réalisés (n = 128), seulement 29 tests (soit 22.65 %) ont montré un effet détectable. L'analyse des fréquences démontre que (12.50 %) des résultats ont montré un pouvoir antifongique faible contre le Foa (diamètre des zones d'inhibition: 8-15 mm). Seulement (10.16 %) des expériences ont montré un effet antifongique modéré (diamètre des zones d'inhibition: 15-20 mm). Sur les 128 tests réalisés, aucun test n'a présenté un effet élevé d'inhibition sur Foa (diamètre des zones d'inhibition > 20 mm) (Tableau 12). Sur la base des résultats obtenus, l'analyse de la variance (ANOVA test) a démontré que l'effet de solvant (utilisé pour l'extraction) sur la culture de Foa était significatif (p < 0.05). Pour les extraits méthanoliques, 12 sur 32 expériences (37.50 %) ont montré des effets détectables. Neuf sur 32 expériences (28.12 %) réalisées avec les extraits hexaniques ont démontré des effets détectables. Huit sur 32 expériences (25.00 %) réalisées avec des extraits d'acétate d'éthyle ont montré des effets détectables. Quant à l'intensité de l'effet antifongique, on observe que l'effet le plus important est représenté par l'extrait hexanique des tiges de Pergularia tomentosa (∅ = 20 mm) puis par les extraits méthanoliques de Citrullus colocynthis (feuilles et tiges) et de Nerium oleander (feuilles, tiges) avec des 106 zones d'inhibition (∅ = 19 mm). Les extraits dichlorométhaniques n'ont eu aucun effet détectable sur Foa (Tableau 12). Tableau 11: Rendement d’extraction (%) par rapport aux poids sec de la plante. Solvant d’extraction Espèce Partie de plante utilisée Methanol AE DCM Hexane Feuilles et tiges 17.09 5.80 3.83 2.39 Citrullus colocynthis Fruits 8.46 10.16 3.05 6.94 Feuilles 21.91 2.90 2.05 2.11 Calotropis procera Tiges 10.99 2.93 1.47 3.18 Feuilles 11.25 3.78 3.10 2.80 Nerium oleander Tiges 13.37 5.45 1.25 2.22 Feuilles 9.33 3.88 1.77 2.07 Pergularia tomentosa Tiges 13.53 3.12 1.07 2.68 EA: Acétate d’éthyle, DCM: Dichlorométhane. Pour tous les effets détectables, l'augmentation du poids d'extrait entraîne une augmentation du diamètre de la zone d'inhibition, exceptés l'extrait d'acétate d'éthyle des feuilles de Nerium oleander (effet stable entre 400 et 800 µg) et l'extrait hexanique des feuilles de Calotropis procera (diminution de 1 mm entre 800 à 1600 µg). Par ailleurs, on observe que les meilleurs effets sur Foa se situent à 1600 µg. A 200 µg, seulement 3 sur 32 tests (9.38 %) ont démontré des effets détectables, dans l'intervalle (∅: 9-11 mm). A 400 µg, seulement 5 sur 32 tests (15.62 %) ont présenté des effets détectables, dans l'intervalle (∅: 10-16 mm). A 800 µg, 8 sur 32 tests (25.00 %) ont montré des effets détectables, dans l'intervalle (∅: 9-17 mm). A 1600 µg, 13 sur 32 tests (40.62 %) ont démontré des effets détectables, dans l'intervalle (∅: 9-20 mm) (Tableau 12). 2.3. Test de virulence Huit extraits de quatre plantes toxiques (deux parties pour chaque plante) à différentes quantités (200, 400, 800 et 1600 µg) (n=128) ont été employés pour examiner leur effet sur la virulence de Foa (sur le tissu de tubercule de pomme de terre). Après 6 jours d'incubation dans l'obscurité, des lésions nécrotiques étaient visibles comparés aux morceaux sans culture de Foa et/ou extraits de plantes. La présence de la nécrose dépend des extraits et/ou de l'effet de Foa. Les résultats sont présentés en tant que virulence relative (VR) comparée à la virulence du Foa sans extraits de plantes (Tableau 9). Aucune corrélation n'est détectée entre le poids d'extrait dans les disques (200, 400, 800 et 1600 µg) et la VR (p < 0.05), et entre la zone d'inhibition (mm) et VR (p < 0.05). 107 L'analyse des fréquences a démontré que la moitié des tests (n = 64, 50.00 %) a montré une augmentation de la VR du Foa sur le tissu de tubercule de pomme de terre (> 100 %). Cinquante-cinq sur 128 tests (42.99 %) a représenté une diminution du VR (< 100 %), parmi eux, seulement 2 (3.64 %) ont montré une diminution du VR au-dessous de (50 %). La diminution du VR au-dessous de (50 %) a été observé pour les extraits méthanoliques (VR = 46 %) et dichlorométhanique (de VR = 48 %) des feuilles et tiges de Citrullus colocynthis. Seulement 9 sur 128 expériences (7.03 %) ont montré une VR approximativement égal à la VR du Foa (100 ± 1 %). Le maximum de la VR (235 %) a été montré par l'extrait dichlorométhanique des fruits de Citrullus colocynthis. L'analyse de la variance (ANOVA test) a montré un effet significatif des parties de plante sur la VR du Foa (p < 0.05). Deux parties ont été choisies pour chaque plante: (feuilles) et (tiges) pour le Calotropis procera, Nerium oleander et Pergularia tomentosa, (feuilles de tiges) et (fruits) pour Citrullus colocynthis. Concernant l'effet bénéfique sur la VR du Foa (diminution du VR au-dessous de 100 %), les parties de plante sont présentées par ordre décroissant: extraits des feuilles et tiges, 12 sur 16 tests (75.00 %); extraits des feuilles, 22 sur 48 expériences (45.83 %); extraits des fruits, 7 sur 16 tests (43.75 %), puis, extraits des tiges 14 sur 48 tests (29.17 %). 3. Criblage phytochimique 3.1. Caractérisation des flavonoïdes La présence des flavonoïdes a été révélée sur plaque CCM après pulvérisation de AlCl3 et observation sous UV 365 nm. Les Rf des spots montrant un résultat positif sont présentés dans le Tableau 14. D'après les résultats obtenus, le nombre d’extraits qui ont donné un résultat positif concernant les flavonoïdes représente 58.06 % (18 sur 31 expériences). Concernant les solvants utilisés pour l’extraction, les résultats positifs ont été notés dans 9 extraits sur 12 dans le cas de l’acétate d’éthyle, 6 sur 8 pour les extraits méthanoliques, 2 sur 4 pour les extraits dichlorométhaniques et 1 sur 7 pour les extraits hexaniques. 108 Tableau 12: Effet antifongique des extraits des plantes toxiques et/ou médicinales sur Fusarium oxysporum f. sp. albedinis, exprimé par le diamètre de la zone d’inhibition (mm). Poids d’extrait (µg) Espèce Citrullus colocynthis Partie Feuilles et tiges Fruits Feuilles Calotropis procera Tiges Feuilles Nerium oleander Tiges Feuilles Pergularia tomentosa Tiges Solvant 200 400 800 1600 Méthanol Acétate d’éthyle ND ND ND ND ND 9 19 13 Dichloromethane ND ND ND ND Hexane Méthanol Acétate d’éthyle Dichloromethane Hexane Méthanol Acétate d’éthyle Dichloromethane Hexane Méthanol Acétate d’éthyle Dichloromethane Hexane Méthanol Acétate d’éthyle Dichloromethane Hexane Méthanol Acétate d’éthyle Dichloromethane Hexane Méthanol Acétate d’éthyle Dichloromethane Hexane Méthanol Acétate d’éthyle Dichloromethane Hexane ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 11 ND ND 10 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 9 ND 11 ND ND ND ND ND ND 12 ND ND ND ND ND 16 ND ND 13 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 10 10 16 ND ND ND ND ND ND 15 ND ND ND ND 16 16 ND ND 15 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 17 11 17 9 ND ND ND ND ND 14 ND ND ND ND 19 17 ND ND 19 9 ND ND 11 ND ND ND 9 ND ND 20 ND: Non détecté. 109 Tableau 13: Effet des extraits de plantes sur la virulence relative de Fusarium oxysporum f. sp. albedinis (sur tissus de tubercule de pomme de terre). Poids d’extrait dans les disques (µg) 200 400 800 1600 Espèces Partie Solvant PTN VR PTN VR PTN VR PTN VR (mg) (%) (mg) (%) (mg) (%) (mg) (%) Méthanol 63.1 95 47.6 72 66.7 101 89.2 135 Feuilles AE 30.2 46 59.0 89 46.5 70 40.0 60 et DCM 72.0 109 66.4 100 64.4 97 32.1 48 tiges Citrullus Hexane 35.7 54 33.7 51 43.0 65 37.2 56 colocynthis Méthanol 45.7 69 66.7 101 86.1 130 57.1 86 Fruits AE 78.7 119 57.0 86 43.6 66 35.6 54 DCM 155.8 235 85.0 128 50.0 75 58.8 89 Hexane 77.4 117 66.0 100 78.8 119 76.4 115 Méthanol 65.7 99 102.4 154 77.0 116 42.4 64 Feuilles AE 45.4 68 51.9 78 58.2 88 66.0 100 DCM 52.3 79 88.5 133 68.3 103 81.3 123 Calotropis Hexane 51.5 78 60.9 92 68.6 103 85.7 129 procera Méthanol 94.5 143 86.9 131 60.7 92 109.2 165 Tiges AE 77.2 116 101.1 152 51.6 78 87.4 132 DCM 67.5 102 68.4 103 80.8 122 105.3 159 Hexane 96.6 146 56.5 85 72.5 109 57.0 86 Méthanol 72.8 110 36.5 55 72.1 109 70.7 107 Feuilles AE 63.6 96 63.4 96 36.6 55 42.1 63 DCM 54.6 82 98.8 149 70.6 106 62.7 95 Nerium Hexane 50.0 75 60.8 92 58.4 88 36.5 55 oleander Méthanol 84.2 127 74.2 112 69.1 104 92.2 139 Tiges AE 104.6 158 53.1 80 83.5 126 81.8 123 DCM 97.5 147 93.6 141 73.9 111 76.9 116 Hexane 73.2 110 115.4 174 94.9 143 91.0 137 Méthanol 49.6 75 71.6 108 72.8 110 88.7 134 Feuilles AE 54.5 82 85.2 129 69.6 105 72.8 110 DCM 62.8 95 85.3 129 61.7 93 66.2 100 Pergularia Hexane 127.3 192 153.7 232 75.1 113 79.8 120 tomentosa Méthanol 77.0 116 106.6 161 71.9 108 66.7 101 Tiges AE 73.7 111 68.2 103 65.6 99 56.5 85 DCM 53.2 80 63.0 95 39.3 59 61.7 93 Hexane 38.5 58 34.7 52 53.0 80 44.1 67 EA: Acétate d’éthyle, DCM: Dichlorométhane, PTN: Poids du tissu nécrosé (mg), VR: Virulence relative (%), la virulence relative était comparée à la virulence du Foa sans extrait de plante (représenté par 100%, correspond à 66.3±1.7 mg de tissu de pomme de terre nécrosé). Concernant les parties de plante comme source d’extraits, le nombre de résultats positifs par rapport au nombre total d’expériences réalisé par chaque partie est comme suit : 3 sur 4 pour les feuilles et tiges, 6 sur 9 les feuilles, 1 sur 4 pour la partie aérienne. Les deux extraits de fruits (Citrullus colocynthis) ont montré un résultat positif, tandis que les deux extraits d’écorce (Acacia raddiana) ont montré un résultat négatif. 110 Les tests des flavonoïdes sont positifs dans 5 extraits sur 6 dans le cas de Citrullus colocynthis, 4 sur 5 pour Asteriscus graveolens, 2 sur 3 pour Pergularia tomentosa, 1 sur 2 pour Fredolia aretioides, 2 sur 4 pour Nerium oleander et 2 sur 5 pour Acacia raddiana. Les deux extraits de Limoniastrum feei ont montré un résultat positif, mais les extraits de Calotropis procera et Launeae arborescens ont présenté un résultat négatif. L’analyse des Rf des spots a montré que le nombre de spots qui ont présenté un résultat positif (concernant les flavonoïdes) est égal à 23 spots avec des Rf dans l’intervalle [0.00-0.88] dont 16 ont un Rf= 0.00 dans le système de solvant acétate d’éthyle/heptane (75/25) (Tableau 14). 3.2. Caractérisation des tanins Les tanins ont été caractérisés par pulvérisation des chromatogrammes avec une solution de FeCl3. La couleur bleue noire indique la présence des tanins galliques, tandis que la couleur brun-verdâtre indique la présence des tanins catéchiques. Les Rf des spots présentant un résultat positif pour les tanins sont présentés dans le Tableau 15. La comparaison entre les solvants a mis en évidence que l’acétate d’éthyle est le meilleur concernant le nombre de résultats positif: 9 sur 12 extraits soit 75.00 % du nombre total d’extraits réalisé par ce solvant Le méthanol représente 62.25 % (5 sur 8), tandis que l’hexane et le dichlorométhane n’ont montré aucun résultat positif. Plus de la moitié des extraits de feuilles (55.56 %) ont donné un résultat positif pour les tanins. Pour les écorces, les parties aériennes et les fruits et tiges, la moitié des extraits a réagit positivement avec le FeCl3. Quatre sur 4 des extraits de Nerium oleander et 2 sur 2 des extraits de Limoniastrum feei ont réagit positivement avec le FeCl3. Les extraits d’Acacia raddiana (3 sur 5), d’Asteriscus graveolens (2 sur 5), de Pergularia tomentosa (2 sur 3), de Launea arborescens (2 sur 3), de Fredolia aretioides (1 sur 2), et de Citrullus colocynthis (2 sur 6) ont montré un résultat positif pour les tanins. 111 Acétate d’éthyle DCM Méthanol Hexane Tableau 14: Caractérisation des flavonoïdes sur les chromatogrammes des extraits de plantes dans le système de solvant: acétate d’éthyle/heptane (75/25). Solvant Plantes Parties Flavonoïdes Rf D'extraction Feuilles ND / Acacia raddiana Ecorces ND / Asteriscus graveolens Feuilles ND / Fredolia aretioides Partie aérienne ND / Citrullus colocynthis Feuilles et tiges + 0.00 Calotropis procera Feuilles ND / Pergularia tomentosa Tiges ND / Feuilles + 0.00 Acacia raddiana Ecorces ND / Feuilles et tiges + 0.00 Citrullus colocynthis Fruits + 0.00 Feuilles + 0.00 Nerium oleander Tiges ND / Feuilles + 0.00 Pergularia tomentosa Tiges + 0.00 Launeae arborescens Partie aérienne ND / Feuilles + 0.00 Asteriscus graveolens Tiges + 0.00 Citrullus colocynthis Feuilles et tiges ND / + 0.65 Acacia raddiana Les écorces + 0.76 Partie aérienne ND / Launeae arborescens Racines ND / + 0.00 Partie aérienne Limoniastrum feei + 0.15 Racines + 0.00 Feuilles + 0.00 Asteriscus graveolens + 0.00 Tiges + 0.87 + 0.15 Fredolia aretioides Racines + 0.88 Feuilles et tiges + 0.00 Citrullus colocynthis Fruits + 0.00 + 0.00 Feuilles Nerium oleander + 0.34 Tiges ND / ND: Non détecté; +: Présence. 112 Tableau 15: Caractérisation des tannins sur les chromatogrammes des extraits de plantes dans le système de solvant: acétate d’éthyle/heptane (75/25). Solvant d'extraction Hexane Plante Partie Tanins galliques Rf Tanins catéchiques Rf Acacia raddiana Feuilles Les écorces ND ND / / ND ND / / Feuilles ND / ND / Partie aérienne Feuilles et tiges Feuilles ND / ND / ND / ND / ND / ND / Tiges ND / ND / + + 0.00 0.00 ND ND / / ND / ++ 0.00 Pergularia Feuilles Les écorces Feuilles et tiges Fruits Feuilles Tiges Feuilles ND +++ ++ ND / 0.00 0.00 / ND ND ND +++ / / / 0.00 tomentosa Tiges ND / + 0.00 Launeae arborescens Asteriscus Partie aérienne Feuilles ND ND / / ND ND / / graveolens Tiges ND / ND / Citrullus colocynthis Feuilles et tiges ND / ND / +++ ± ± ± ND ND ++ + + + + ND ND ND ++ +++ ND ND ND ND ± + ND ND ND ND ND + ± ± ND ND / / / / 0.00 0.00 / / / / / 0.00 0.34 0.62 / / ± 0.00 0.19 0.45 0.69 / / 0.00 0.88 0.95 0.00 0.00 / / / 0.00 0.00 0.00 ND / ND + + / 0.00 0.00 ND ND ND / / / Asteriscus graveolens Fredolia aretioides Citrullus colocynthis Calotropis procera Pergularia tomentosa Acacia raddiana Citrullus colocynthis Méthanol Nerium oleander Dichlorométhane Acacia raddiana Les écorces Launeae arborescens Partie aérienne Racines Partie aérienne Limoniastrum feei Racines Acétate d’éthyle Asteriscus Feuilles graveolens Fredolia aretioides Citrullus colocynthis Nerium oleander Tiges Racines Feuilles et tiges Fruits Feuilles Tiges ND: Non détecté; +: Présence, (±, +, ++, et +++ sont liés à l'intensité et la surface du spot). 113 L'absence des tanins catéchiques est remarquable dans plusieurs parties des plantes sauf chez les feuilles et tiges de Citrullus colocynthis, les feuilles et les tiges de Pergularia tomentosa, mais avec des concentrations et/ou une réactivité différentes (selon l'intensité de couleur et la surface du spot). Les feuilles de Pergularia tomentosa présentent une concentration et/ou une réactivité forte pour les tanins catéchiques. Les tanins galliques sont présents dans quelques dépôts dans les extraits méthanoliques, contrairement aux extraits par l'acétate d’éthyle où leur présence est plus fréquente avec des Rf différents. Les feuilles de Nerium oleander, les écorces d’Acacia raddiana et les racines de Fredolia aretioides montrent une présence et/ou une réactivité forte des tanins galliques. 3.3. Caractérisation des coumarines Le test est positif pour les anthrones, les furanocoumarines et/ou pyranocoumarines dans la plupart des parties des plantes (23 sur 31 extraits, 74.19 %). La présence de ces composés est remarquable surtout dans les points de dépôt des extraits (Tableau 16). Les Rf des spots des coumarines sont dans l’intervalle [0.00-0.98] dans le système de solvant: acétate d’éthyle/heptane (75/25). Pour les extraits par l’hexane, plusieurs extraits qui ont présenté un résultat positif pour les coumarines ont des Rf très proches pour ces spots; qui sont les extraits des feuilles d'Acacia raddiana (Rf = 0.98), de la partie aérienne de Fredolia aretioides (Rf = 0.96), des feuilles et tiges de Citrullus colocynthis (Rf = 0.95), et des feuilles d’Asteriscus graveolens (Rf = 0.94). Six sur 7 extraits héxaniques (85.71 %), 10 sur 12 extraits par l’acétate d’éthyle (83.33 %), 3 sur 4 extraits par dichlorométhane (75.00 %), et 5 sur 8 extraits méthanoliques (62.50 %), ont montré la présence des coumarines. Des résultats positifs ont été observés pour: Acacia raddiana (3 sur 5) représenté par les extraits d’écorces (par acétate d’éthyle) et des feuilles (par hexane, méthanol), Asteriscus graveolens (4 sur 5) représenté par les extraits des feuilles par (hexane, dichlorométhane, acétate d’éthyle) et d’écorces par acétate d’éthyle, Fredolia aretioides (1 sur 2) représenté par l’extrait de la partie aérienne par l’hexane, Citrullus colocynthis (5 sur 6) et le seul extrait de Calotropis procera. Les extraits de Pergularia tomentosa ont montré la présence des coumarines dans les tiges mais pas dans les feuilles (2 sur 3). Il en est de même les extraits méthanoliques des feuilles et extraits des tiges par acétate d’éthyle de 114 Nerium oleander. Tous les extraits de Launeae arborescens (3 sur 3) et les deux extraits par acétate d’éthyle de Limoniastrum feei ont montré un résultat positif pour les coumarines. 3.3. Caractérisation des alcaloïdes Les Rf des spots présentant un résultat positif avec le réactif de Marquis sont dans l’intervalle [0.00-0.97] dans le système de solvant: acétate d’éthyle/heptane (75/25). Certains spots de différents extraits ont le même Rf et donnent la même couleur (Tableau 17). Sur les 123 spots colorés pour tous les extraits, 42 sont colorés en marron (34.15 %), 23 en vert (18.70 %), 22 en jaune (17.89 %), 20 en violet (16.26 %), 5 en rouge brique ou rose (4.06 %), et 3 en beige ou orange (2.44 %). La couleur rose est représentée seulement par les extraits méthanoliques (Rf: 0.00, 0.31) et d’acétate d’éthyle (Rf: 0.00, 0.20, 0.38) des écorces d’Acacia raddiana. Touts les spots colorés en vert ont des Rf supérieurs à 0.70 sauf pour l’extrait méthanolique de Nerium oleander (feuilles) (Rf = 0.11). Les douze extraits par l’acétate d’éthyle représentent 60 spots colorés. Les extraits méthanoliques (8 extraits) montrent 29 spots colorés. Les extraits par dichlorométhane (4 extraits) représentent 14 spots colorés. Les sept extraits hexaniques représentent 20 spots colorés. 3.5. Caractérisation des saponosides La caractérisation des saponosides a été réalisée par le calcul de l’indice de mousse (IM) pour les extraits aqueux des plantes. L’ensemble a donné 17 extraits, deux parties pour toutes les plantes sauf Calotropis procera avec une seule partie. L’évaluation est basée sur trois intervalles: IM < 100 qui signifie une présence non détectée, 50 < IM < 100 qui signifie une présence non confirmée, IM > 100 qui signifie une présence confirmée. La plupart des extraits (12 sur 17) ont montré une présence non détectée pour les saponosides. Trois extraits sur 17: Acacia raddiana (écorces), Limoniastrum feei (partie aérienne) et Asteriscus graveolens (feuilles), ont une présence non confirmée pour les saponosides. Seulement les deux extraits de Fredolia aretioides 2 sur 17 ont montré une présence confirmée des saponosides (Tableau 18). 115 Tableau 16: Caractérisation des coumarines sur les chromatogrammes des extraits des plantes dans le système de solvant: acétate d’éthyle/heptane (75/25). Solvant Au Plantes Parties UV 365 nm Rf D'extraction visible Hexane Acacia raddiana Asteriscus graveolens Fredolia aretioides Citrullus colocynthis Calotropis procera Pergularia tomentosa Méthanol Acacia raddiana Citrullus colocynthis Nerium oleander Dichlorométhane Pergularia tomentosa Launeae arborescens Asteriscus graveolens Feuilles Les écorces Feuilles Partie aérienne Feuilles et tiges Feuilles Tiges Feuilles Les écorces Feuilles et tiges Fruits Feuilles Tiges Feuilles Tiges Partie aérienne Feuilles Tiges Citrullus colocynthis Feuilles et tiges Acacia raddiana Les écorces Partie aérienne Racines Partie aérienne Limoniastrum feei Racines Feuilles Asteriscus graveolens Tiges Racines Fredolia aretioides Feuilles et tiges Citrullus colocynthis Fruits Feuilles Nerium oleander Tiges Acétate d’éthyle Launeae arborescens ND: Non détecté; +: Présence. 116 + 0.98 ND ND / 0.94 0.96 0.95 0.00 0.00 0.00 ND / 0.00 0.00 ND / 0.00 / 0.00 0.00 0.00 ND / 0.00 0.62 0.17 0.38 0.00 0.00 ND 0.95 0.00 0.00 0.00 ND / 0.00 / 0.00 / ND + + + + + + ND + + ND + ND + + + ND + + + + + + + + + + ND + ND + ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND Méthanol Hexane Tableau 17: Caractérisation des alcaloïdes sur les chromatogrammes des extraits de plantes dans le système de solvant: acétate d’éthyle/heptane (75/25). Solvant Plantes Parties Nombre Rf Couleur D'extraction de spots 0.44 Marron Feuilles 3 0.64 Violet 0.82 Vert Acacia raddiana 0.55 Jaune 0.68 Violet Les écorces 4 0.76 Marron 0.91 Violet 0.68 Marron 3 Asteriscus graveolens Feuilles 0.76 Jaune 0.88 Vert 0.62 Marron clair Partie aérienne 2 Fredolia aretioides 0.76 Vert 0.59 Marron 2 Citrullus colocynthis Feuilles et tiges 0.76 Vert 0.15 Jaune clair 0.68 Marron clair Feuilles 4 Calotropis procera 0.79 Vert 0.94 Marron 0.70 Beige 2 Pergularia tomentosa Tiges 0.88 Beige 0.00 Jaune Feuilles 3 0.83 Jaune clair 0.94 Vert Acacia raddiana 0.00 Rose 0.31 Rose clair Les écorces 4 0.63 Jaune 0.83 Violet clair 0.00 Jaune Feuilles et tiges 3 0.80 Jaune Citrullus colocynthis 0.95 Vert 0.00 Beige Fruits 2 0.97 Marron 117 Acétate d’éthyle Dichlorométhane Méthanol Tableau 17: Caractérisation des alcaloïdes sur les chromatogrammes des extraits de plantes dans le système de solvant: acétate d’éthyle/heptane (75/25) (suite). Solvant Plantes Parties Nombre Rf Couleur d'extraction de spots 0.00 Marron foncé 0.11 Vert 0.26 Jaune Feuilles 7 0.46 Jaune 0.57 Jaune Nerium oleander 0.80 Violet 0.94 Vert 0.00 Jaune 0.31 Jaune Tiges 4 0.80 Marron 0.94 Orange 0.00 Marron Feuilles 3 0.83 Jaune 0.94 Vert Pergularia tomentosa 0.00 Marron Tiges 3 0.80 Jaune 0.97 Orange 0.00 Marron 3 Launeae arborescens Partie aérienne 0.20 Marron clair 0.79 Vert 0.00 Vert clair Feuilles 3 0.73 Marron 0.88 Vert Asteriscus graveolens 0.00 Marron clair 0.32 Vert clair Tiges 4 0.68 Violet 0.82 Vert clair 0.00 Marron 0.29 Marron 4 Citrullus colocynthis Feuilles et tiges 0.82 Vert 0.94 Rouge brique 0.00 Rose 0.20 Rose clair 0.38 Rose clair Les écorces 6 Acacia raddiana 0.55 Jaune 0.70 Violet 0.85 Vert 118 Acétate d’éthyle Tableau 17: Caractérisation des alcaloïdes sur les chromatogrammes des extraits de plantes dans le système de solvant: acétate d’éthyle/heptane (75/25) (suite). Solvant Plantes Parties Nombre Rf Couleur d'extraction de spots 0.00 Marron 0.23 Violet Partie aérienne 4 0.79 Violet 0.91 Vert Launeae arborescens 0.00 Marron 0.26 Marron clair Racines 4 0.76 Violet clair 0.94 Marron 0.00 Marron 0.26 Violet clair Partie aérienne 5 0.73 Violet 0.88 Marron clair Limoniastrum feei 0.97 Marron 0.00 Marron 0.52 Marron clair Racines 4 0.68 Violet foncé 0.88 Marron foncé 0.00 Marron 0.29 Marron clair 0.50 Jaune Feuilles 7 0.62 Violet clair 0.79 Violet 0.94 Vert Asteriscus graveolens 0.99 Marron 0.00 Marron 0.14 Jaune Tiges 5 0.26 Violet clair 0.73 Violet 0.91 Vert 0.00 Marron 0.26 Marron clair Racines 5 Fredolia aretioides 0.59 Marron 0.76 Violet 0.94 Marron 119 Acétate d’éthyle Tableau 17: Caractérisation des alcaloïdes sur les chromatogrammes des extraits de plantes dans le système de solvant: acétate d’éthyle/heptane (75/25) (suite). Solvant Plantes Parties Nombre Rf Aspects d'extraction de spots 0.00 Marron 0.26 Marron 0.62 Marron clair Feuilles et tiges 6 0.73 Marron 0.85 Vert clair Citrullus colocynthis 0.94 Vert 0.00 Rouge brique 0.44 Jaune Fruits 4 0.67 Jaune 0.88 Rouge brique 0.00 Marron 0.23 Violet clair 0.55 Marron clair Feuilles 6 0.76 Violet 0.88 Vert Nerium oleander 0.97 Orange 0.00 Rouge brique 0.26 Jaune Tiges 4 0.76 Jaune 0.94 Rouge brique 4. Bioautographie Parmi les 31 extraits (17 extraits de plantes médicinales et 14 extraits de plantes toxiques) qui ont été choisis pour le criblage phytochimique et bioautographie, seulement 7 extraits (22.58 %) ont montré au moins une zone d’inhibition (Tableau 19). Tenant compte des solvants d’extraction, l’acétate d’éthyle présente le meilleur effet (3 extraits sur 7 présentant un effet positif). Asteriscus graveolens est la plante qui présente le plus grand nombre d’extrait montrant un effet positif (3 extraits). Du point de vue diamètre des zones d’inhibition Citrullus colocynthis et Asteriscus graveolens détiennent les premières places (7.75 ± 1.06 mm et 7.00 ± 1.41 mm, respectivement). Les feuilles sont les plus représentatives par rapport aux autres parties montrant un effet positif. La moitié des zones d’inhibition (4 sur 8 zones d’inhibition) ont un Rf égale à zéro (point de dépôt de l’extrait). 120 Tableau 18: Caractérisation des saponosides par l’indice de mousse (IM). Plante Partie Indice de mousse Saponosides Acacia raddiana Launeae arborescens Limoniastrum feei Asteriscus graveolens Fredolia aretioides Citrullus colocynthis Nerium oleander Pergularia tomentosa Calotropis procera Feuilles <50 ND Ecorces 50<IM<100 ± Partie aérienne <50 ND Racines <50 ND Partie aérienne 50<IM<100 ± Racines <50 ND Feuilles 50<IM<100 ± Tiges <50 ND Partie aérienne >100 + Racines >100 + Feuilles et tiges <50 ND Fruits <50 ND Feuilles <50 ND Tiges <50 ND Feuilles <50 ND Tiges <50 ND Tiges <50 ND ND: Non détecté; +: Présence confirmée; ±: Présence non confirmée. 5. Corrélation entre résultats de bioautographie et résultats du criblage phytochimique D’après le tableau 19, on remarque que les extraits montrant un effet antifongique (sur Foa) représentent pour certains extraits une corrélation entre les résultats de la bioautographie (Rf des zones d’inhibition) et le criblage phytochimique. Pour l’extrait d’Asteriscus graveolens (feuilles) par l’acétate d’éthyle, la 1ère zone d’inhibition avec (Rf = 0,00) montre un résultat positif pour les flavonoïdes, tanins, coumarines et alcaloïdes; par contre la 2ème (Rf = 0,85) n’a révélé que la présence des alcaloïdes. L’extrait dichlorométhanique de Citrullus colocynthis (fruits) provoquant l’inhibition à la zone (Rf = 0,00), indique la présence des coumarines et alcaloïdes. Cinq zones sur 8 (zones montrant l’inhibition du Foa) ont révélé la présence des alcaloïdes. 121 Tableau 19: Corrélation entre bioautographie et criblage phytochimique des extraits bioactifs sur Foa. Bioautographie Espèce Partie Solvant Feuilles Acétate d’éthyle Asteriscus graveolens Criblage phytochimique ∅ (mm) Rf Flavonoïdes Tanins Coumarines Alcaloïdes 5.50±2.12 0.00±0.00 + + + + 4.75±0.35 0.85±0.04 ND ND ND + Citrullus colocynthis Fruits Acétate d’éthyle 7.75±1.06 0.82±0.08 ND ND ND + Tiges Acétate d’éthyle 7.00±1.41 0.50±0.10 ND ND ND ND Feuilles Méthanol 3.50±0.71 0.82±0.06 ND ND ND + Feuilles et Tiges Dichlorométhane 3.23±0.35 0.00±0.00 ND ND + + Partie aérienne Hexane 6.00±1.41 0.00±0.00 ND ND ND ND Feuilles Hexane 3.00±0.00 0.00±0.00 ND ND ND ND Asteriscus graveolens Pergularia tomentosa Citrullus colocynthis Fredolia aretioides Asteriscus graveolens ND: Non détecté pour le même Rf de bioautographie; ∅: Diamètre des zones d’inhibition en millimètre. 122 6. Analyse du produit CCF1 par spectroscopie IR Le spectre d’absorption IR du produit isolé CCF1 (Figure 14 et Tableau 20), fait ressortir les informations suivantes: - La fréquence de vibration vers 3431 cm-1 correspond à la bande d’absorption de liaison OH. - L’existence d’une chaîne aliphatique (vibration de valence: CH, CH2, CH3) en raison d’une absorption intense située à 2852 cm-1, 2923 cm-1, 2962 cm-1. - La bande d’absorption vers 1743 cm-1 correspondant à la présence d’un groupement C=O (ester). - La présence d’un groupement carbonyle α,β insaturé est confirmée par l’absorption vers 1661 cm-1. - La présence d’une bande caractéristique (C=C α,β insaturé) à 1601 cm-1. - Le spectre IR montre une bande d’absorbance vers 1459 cm-1 correspondant aux vibrations de déformation (-CH-, -CH2-, -CH3). - Les bandes d’absorption vers 1301, 1263, 1164 cm-1 sont liées aux vibrations de valence d’un C-O α,β insaturé. - Les bandes d’absorption vers 1022, 1093 cm-1 correspondent aux liaisons (C-O) aliphatiques. - Les bandes d’absorption vers 804 et 962 cm-1 caractérisent des vibrations de déformation en dehors des plans de type (C=C-C, C=C-O-, C-C=O). - La bande d’absorption à 718 cm-1 caractérise une vibration de déformation en dehors des plans de type (C=C-H). 7. Analyse du produit CCF1 par spectroscopie UV-Visible D’après les résultats d’analyse du produit CCF1 par l’ultraviolet (Tableau 21), trois principales informations peuvent être tirées: - λ ∈ [204-253]: correspond aux transitions π → π* de C=C. - λ ∈ [256-269]: correspond aux transitions π → π* de C=O. - λ ∈ [270-288]: correspond aux transitions n → π* de C=O. 123 Tableau 20: Bandes d’absorption IR du produit CCF1 Fréquence (cm-1) Interprétation 3431,87 ν OH 2962,06 ν CH3 2923,82 ν CH2 2852,81 ν CH3 1743,85 ν C=O (ester) 1661,91 ν C=O (α,β insaturé) 1601,82 ν C=C 1459,79 δ CH3, δ CH2, δ CH 1377,85 δ OH 1301,37 ν C-O (α,β insaturé) 1263,13 ν C-O (α,β insaturé) 1164,80 ν C-O (α,β insaturé) 1093,78 ν C-O (aliphatique) 1022,76 ν C-O (aliphatique) 804,25-962,67 γ C=C-C, γ C=C-O, γ C-C=O 718,84 γ C=C-H 124 4000 3500 3000 25 20 15 2000 2500 Wavenumbers (cm-1) Figure 14: Spectre infrarouge du produit CCF1. 125 1500 716,84 35 1000 804,25 1022,76 1301,37 1459,79 962,67 55 1093,78 1164,80 1263,13 30 1377,85 1743,85 2923,82 2852,81 2962,06 50 1601,82 40 3431,87 45 1661,91 %Transmittance 70 65 60 10 5 500 8. Effet sur l’activité cellulasique du Foa Les extraits bioactifs sur le Foa testés par la bioautographie directe ont été évalués pour leurs effets sur l’activité cellulasique. On a développé une technique en se basant sur le principe de la bioautographie et sur des travaux récents réalisés sur les cellulases (Kasana et al., 2008; Eveleigh et al., 2009; Abu-Bakar et al., 2010). Comme il ressort du Tableau 21, un effet sur l’activité cellulasique du Foa a été noté pour Citrullus colocynthis (fruits), Asteriscus graveolens (tiges), Pergularia tomentosa (feuilles), et Fredolia aretioides (partie aérienne). Par contre, les feuilles d’Asteriscus graveolens (extraites par l’acétate d’éthyle et par l’hexane) ainsi que les feuilles et tiges de Citrullus colocynthis n’ont montré aucun effet détectable sur l’activité cellulasique. Le nombre maximal de spots est de deux, représenté par les fruits de Citrullus colocynthis, les feuilles de Pergularia tomentosa, et la partie aérienne de Fredolia aretioides. Les rapports frontaux des spots se situent dans l’intervalle [0,00-0,88] dans le système de solvant acétate d’éthyle/heptane (75/25). Le diamètre des zones d’inhibition est compris entre 1 et 3 mm. Tableau 21 : Effet des extraits bioactifs sur l’activité cellulasique du Foa. Zones d’inhibition Espèce Partie Solvant Rf ∅ (mm) ∅ (mm) Asteriscus Feuilles AE graveolens Citrullus Fruits AE 2 0,00 3 colocynthis Asteriscus Tiges AE 3 0,00 graveolens Pergularia Feuilles Méthanol 2 0,11 1,5 tomentosa Feuilles et Citrullus DCM Tiges colocynthis Partie Fredolia Hexane 1 0,14 1 aérienne aretioides Asteriscus Feuilles Hexane graveolens Rf 0,08 0,06 0,88 - AE: Acétate d’éthyle; DCM: Dichlorométhane; ∅: Diamètre des zones d’inhibition en millimètre; Rf: Rapports frontaux des zones d’inhibition. 126 9. Criblage phytochimique des extraits de rachis des cultivars de palmier dattier 9.1. Caractérisation des flavonoïdes Des résultats positifs ont été enregistrés pour la plupart des extraits (au moins un spot) avec AlCl3. Les spots présentant un résultat positif ont des Rf dans l’intervalle [0.000.94] dans les systèmes de solvant cités dans le Tableau 22. Parmi les 70 spots, 28 sont représentés par les extraits dichlorométhaniques, 24 par les extraits d’acétate d’éthyle, 10 par les extraits méthanolique, et 8 par les extraits hexaniques. Par ailleurs, tous ces cultivars testés présentent des nombres de spots proches: 10 pour Tiwraghine, 9 pour Taquerbucht, Ghares, Baydh-Djaje et Rotbi, et 8 pour Feggus, Bent-Cherk et Kseiba. En outre, ces cultivars ont des spots avec des Rf très proches (Tableau 22). 9.2. Caractérisation des tanins Les différents cultivars contiennent principalement des tanins galliques, les tanins catéchiques n’ont été détectés que dans 5 spots correspondant à des extraits par l’acétate d’éthyle. Les spots avec résultat positif ont des Rf dans l’intervalle [0.00-0.91] dans les systèmes de solvant cités dans le Tableau 22. Le nombre de spots présentant un test positif décroit avec la polarité des solvants d’extraction utilisés: 17 pour les extraits méthanoliques, 14 pour les extraits par acétate d’éthyle, 8 pour les extraits dichlorométhaniques et aucun pour les extraits hexaniques. Seulement cinq cultivars ont présenté un spot positif aux tanins catéchiques (Feggus, Ghares, Kseiba, Baydh-djaje, Rotbi) (Tableau 23). 9.3. Caractérisation des coumarines Des résultats positifs (aux furanocoumarines, pyranocoumarines et/ou anthrones) ont été notés pour les extraits d’acétate d’éthyle (15 spots), les extraits hexaniques (14), les extraits dichlorométhaniques (8) et les extraits méthanoliques (6) (Tableau 24). 127 DCM / Chloroforme (20 / 20) ml Acétate d'éthyle/Méthanol Acétone/Acide acétique Acétate d'éthyle/Méthanol (20 / 20) ml (10 / 30) ml (35 / 5) ml Méthanol Hexane Acétate d'éthyle Dichlorométhane (DCM) Tableau 22: Caractérisation des flavonoïdes dans les extraits des rachis de palmier dattier. Solvant d'extraction Eluants Cultivars Rf Tiwraghine 0.00 0.39 0.59 0.94 0.00 Taquerbucht 0.35 0.57 0.92 0.00 Feggus 0.35 0.94 / 0.00 Ghares 0.36 0.57 0.94 0.00 Bent Cherk 0.36 0.59 0.92 0.00 Kseiba 0.39 0.94 / 0.00 / Baydh Djaje 0.37 0.93 0.00 / Rotbi 0.24 0.94 0.00 / Tiwraghine 0.64 0.91 0.00 / Taquerbucht 0.77 0.90 0.00 / Feggus 0.75 0.91 0.00 / Ghares 0.69 0.92 0.00 / Bent Cherk 0.80 0.91 0.00 / Kseiba 0.72 0.91 0.00 / Baydh Djaje 0.76 0.89 0.00 / Rotbi 0.71 0.89 / / / Tiwraghine 0.72 / / / Taquerbucht 0.77 / / / Feggus 0.77 / / / Ghares 0.72 / / / Bent Cherk 0.77 / / / Kseiba 0.77 / / / Baydh Djaje 0.82 / / / Rotbi 0.80 / / Tiwraghine 0.22 0.86 / / / Taquerbucht 0.09 / / / Feggus 0.86 / / / Ghares 0.87 / / / Bent Cherk / / / / Kseiba 0.11 / / Baydh Djaje 0.06 0.22 / / Rotbi 0.09 0.85 Rf: Rapports frontaux des spots positifs aux flavonoïdes. 128 Tableau 23: Caractérisation des tanins dans les extraits des rachis de palmier dattier Tanins galliques Solvant d'extraction Cultivars Taquerbucht NST 1 1 RF / P/A ND RF / 0.00 P/A / / / ND / Feggus 1 0.00 / / ND / Ghares 1 0.00 / / ND / Bent Cherk 1 0.00 / / ND / Kseiba 1 0.00 / / ND / Baydh Djaje 1 0.00 / / ND / Rotbi 1 0.00 / / ND / Tiwraghine ND / / / ND / Taquerbucht 0.00 / 0.18 / 0.79 / ND / Feggus 3 ND 1 0.90 Ghares ND / / / 1 0.87 Bent Cherk 2 0.03 0.87 1 0.83 / ND 1 / Kseiba / / 0.88 Baydh Djaje 2 0.05 0.69 / 1 0.79 Rotbi 0.03 / / / / 1 Tiwraghine 1 ND / ND 0.65 / Taquerbucht ND / / / ND / Feggus ND / / / ND / Ghares ND / / / ND / Bent Cherk ND / / / ND / Kseiba ND / / / ND / Baydh Djaje ND / / / ND / Rotbi ND / / / ND / Tiwraghine 2 0.00 0.79 / ND / Taquerbucht 1 0.91 / / ND / Feggus 2 0.00 0.92 / ND / Ghares 3 0.65 0.75 0.90 ND / Bent Cherk 3 0.00 0.65 ND / Kseiba 2 0.77 0.91 0.90 / ND / Baydh Djaje Rotbi 2 2 0.06 0.05 0.90 0.90 / ND / / ND / Hexane Acétate d'éthyle Dichlorométhane Tiwraghine Méthanol Tanins catéchiques RF 0.00 NST: Nombre de spots présentant un résultat positif aux tannins; ND: Non détecté. 129 Méthanol Hexane Acétate d'éthyle Dichlorométhane Tableau 24: Caractérisation des coumarines dans les extraits des rachis de palmier dattier (dans le système de solvant présenté dans le Tableau 22). Solvant d’éxtraction Cultivars Rf SPC Tiwraghine 0.00 / / / / / Taquerbucht 0.00 / / / / / Feggus 0.00 / / / / / Ghares 0.00 / / / / / Bent Cherk 0.00 / / / / / Kseiba 0.00 / / / / / Baydh Djaje 0.00 / / / / / Rotbi 0.00 / / / / / Tiwraghine 0.00 0.67 / / / / Taquerbucht 0.00 / / / / / Feggus 0.00 0.80 / / / / Ghares 0.00 0.79 / / / / Bent Cherk 0.00 0.91 / / / / Kseiba 0.00 0.76 / / / / Baydh Djaje 0.00 0.91 / / / / Rotbi 0.00 0.74 / / / / Tiwraghine 0.65 / / / / / Taquerbucht 0.65 / / / / / Feggus 0.62 0.69 0.91 / / / Ghares 0.72 0.92 / / / / Bent Cherk / / / / / / Kseiba 0.75 / / / / / Baydh Djaje 0.64 0.79 0.85 0.92 / / Rotbi 0.76 0.85 0.94 / / / Tiwraghine 0.86 / / / / / Taquerbucht 0.00 / / / / / Feggus 0.86 / / / / / Ghares 0.86 / / / / / Bent Cherk / / / / / / Kseiba 0.89 / / / / / Baydh Djaje / / / / / / Rotbi 0.87 / / / / / SPC: Spots positifs pour furanocoumarines, pyranocoumarines et/ou anthrones. Tous les cultivars ont présenté des tests positifs, avec un nombre de spots de 3 à 7. Trois spots pour Bent-Cherk, 4 pour Taquerbucht, 5 pour Tiwraghine et Kseiba, 6 pour Ghares, 7 pour Feggus, Baydh-Djaje et Rotbi. Les Rf des spots se situent dans l’intervalle [0.00-0.94] dans les systèmes de solvant cités dans le Tableau 22. 130 Tableau 25: Caractérisation des alcaloïdes dans les extraits des rachis de palmier dattier (dans le système de solvant présenté dans le Tableau 22). Dichlorométhane Acétate d'éthyle Hexane Méthanol Tiwraghine Taquerbucht Feggus Ghares Bent Cherk Kseiba Baydh Djaje Rotbi Tiwraghine Taquerbucht Feggus Ghares Bent Cherk Kseiba Baydh Djaje Rotbi Tiwraghine Taquerbucht Feggus Ghares Bent Cherk Kseiba Baydh Djaje Rotbi Tiwraghine Taquerbucht Feggus Ghares Bent Cherk Kseiba Baydh Djaje Rotbi MF MF MF MF MF MF MF MF J J GC GC GC GC M GC M BL M V V V V VF J J J J J V V JV 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.25 0.31 0.44 0.53 0.50 0.53 0.19 0.66 0.57 0.80 0.51 0.66 0.80 0.77 0.68 0.43 0.83 0.83 0.80 0.75 0.75 0.94 0.97 0.94 G G G G G G VF G GC GC GF VC B J GC GC / BL V / / / / / V V V V V / / / 0.14 0.13 0.17 0.17 0.18 0.17 0.14 0.14 0.37 0.41 0.75 0.62 0.62 0.66 0.56 0.90 / 0.95 0.68 / / / / / 0.97 0.97 0.94 0.94 0.94 / / / / / / / / / G B JC V GF GF GF GF VC JV / / / / / / / / / / / / / / / / RF / / / / / / 0.18 0.20 0.47 0.47 0.87 0.81 0.78 0.78 0.62 0.94 / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / / GF GF JV GF GF GF GF / / / / / / / / / / / / / / / / / RF / / / / / / / / 0.71 0.66 0.96 0.91 0.90 0.97 0.81 / / / / / / / / / / / / / / / / / couleur RF couleur RF Couleur Cultivars couleur Solvant d'extraction Couleur Alcaloïdes / / / / / / / / / M / / JV / / / / / / / / / / / / / / / / / / / RF / / / / / / / / / 0.75 / / 0.97 / / / / / / / / / / / / / / / / / / / J: Jaune ; JC: Jaune claire ; GC: Gris claire ; GF: Gris foncé ; MF: Marron foncé ; M: Marron; JV: Jaune verdâtre ; V: Vert ; VF: Vert foncé ; B: Beige; BL: Bleu. 9.4. Caractérisation des alcaloïdes L’apparition de spots colorés réagissant au réactif de Marquis est remarquée pour tous les extraits. Les tests positifs sont représentés majoritairement par les extraits d’acétate d’éthyle (33 sur 74), suivis par les extraits dichlorométhaniques et 131 méthanoliques. Les Rf des spots colorés sont dans l’intervalle [0.00-0.97] dans les systèmes de solvant cités dans le Tableau 22. Par ailleurs, on note généralement de fortes similitudes chez les différents cultivars extraits avec les mêmes solvants: mêmes couleurs et mêmes Rf des spots (Tableau 25). 9.5. Caractérisation des saponosides L’évaluation des indices de mousse a montré une absence de saponosides chez tous les cultivars utilisés dans cette étude. 10. Bioautographie des extraits de rachis des cultivars de palmier dattier L’effet antifongique est présenté seulement par les extraits dichlorométhanique (6 extraits), et les extraits par acétate d’éthyle (2 extraits). Les diamètres des zones d’inhibition (mm) se situent dans l’intervalle [3.00-6.50]. Les extraits les plus importants sont l’extrait dichlorométhanique de Bent-Cherk (6.50 ± 1.41 mm) et l’extrait d’acétate d’éthyle de Rotbi (6.00 ± 1.41 mm) (Tableau 26). Tableau 26 : Effet antifongique sur Fusarium oxysporum f. sp. albedinis des extraits de rachis de cultivars de palmier dattier (400 µg) par bioautographie directe (dans le système de solvant présenté dans le Tableau 22). Cultivar Solvant d’extraction Rf ∅ (mm) Taquerbucht Dichlorométhane 4.00±1.41 0.00±0.00 Feggous Dichlorométhane 3.50±0.71 0.78±0.07 6.50±1.41 0.00±0.00 Bent-Cherk Dichlorométhane 3.50±0.71 0.84±0.03 Kseiba Dichlorométhane 3.00±0.00 0.86±0.01 Acétate d’éthyle 5.50±0.71 0.72±0.02 Baidh Ldjaj Dichlorométhane 5.50±3.45 0.62±0.34 Acétate d’éthyle 6.00±1.41 0.83±0.07 Rotbi Dichlorométhane 4.00±1.41 0.78±0.11 ∅ (mm): Diamètre de la zone d’inhibition en millimètre; Rf: Rapport frontal. 132 DISCUSSION 133 CHAPITRE III: DISCUSSION Dans cette étude, nous avons évalué l'effet des extraits de neuf plantes médicinales et/ou toxiques sur l'agent causal du Bayoud «Fusarium oxysporum f. sp. albedinis» (Foa), un microbe pathogène tellurique du palmier dattier « Phoenix dactylifera L. ». Les plantes ont été choisies sur la base de la connaissance traditionnelle et des travaux de recherches réalisées notamment par Laboratoire de Phytochimie et Synthèse Organique (LPSO) (Université de Bechar, Algérie), Laboratoire de Biochimie Végétale et Substances Naturelles (Université d’Oran, Algérie). Ce travail s’inscrit donc dans la continuité des études entreprises par ces deux laboratoires sur les plantes médicinales et/ou toxiques du Sud-Ouest Algérien et qui visent à déterminer le potentiel biologique de ces plantes parallèlement à la caractérisation de leurs profils chimiques (Cheriti, 2000; Cheriti et al., 2004, 2005; Belboukhari et Cheriti, 2006; Belboukhari et al., 2007; Boulenouar et al., 2008; Belboukhari et Cheriti, 2009; Boulenouar et al., 2009). Nous avons étudié l'effet direct des extraits de plantes sur le champignon par la technique de diffusion en agar; l'effet de ces extraits sur la virulence du Foa (sur le tissu de tubercule de pomme de terre). Les extraits montrant une inhibition du Foa ou diminuant la VR au-dessous de 50 % ont subit des analyses par bioautographie et criblage phytochimique pour les flavonoïdes, tanins, coumarines, alcaloïdes et saponosides. En outre, les extraits des rachis de huit cultivars de palmier dattier ont subit un criblage phytochimique et analyse par bioautographie directe sur le Foa. 1. Plantes médicinales 1.1. Efficacité d’extraction Le rendement d'extraction est significativement affecté par le solvant et la partie de plante utilisée mais pas par l'espèce de plante (p < 0,05). Quant aux solvants, ceci est principalement lié à leur polarité et donc à leur aptitude à dissoudre les substances présentes dans ces plantes. Le méthanol étant le plus important concernant le rendement d'extraction, autrement dit, les plantes utilisées contiennent plus de substances qui se dissolvent de préférence par le méthanol. De même, les substances contenues dans les différentes parties de plante varient en nature et en quantité ; car les branches ont donné les meilleurs rendements d'extraction, la partie aérienne contient plus de substances que les racines, en utilisant le même solvant. 134 1.2. Effet antifongique Ce travail repose sur l’hypothèse que la résistance de certains cultivars de palmier dattier par rapport à d’autres est due principalement à leur équipement en composés phénoliques. Daayf et al. (2003) avaient précédemment signalé que la synthèse de composés phénoliques est induite dans le cal de palmier dattier (Phoenix dactylifera L.) par le Fusarium oxysporum f. sp. albedinis, ces composés étant identifiés principalement en tant que dérivés d'acides hydroxycinnamiques. Dans le même contexte, les recherches réalisées au niveau du Laboratoire de Phytochimie et Synthèse Organique (LPSO) (Cheriti et al., 2005; Belboukhari et al., 2007) avaient montré que les plantes choisies sont riches en métabolites secondaires biologiquement actifs. Tenant compte du nombre d'extraits ayant montré un effet sur Foa et des meilleures valeurs de zones d'inhibition, les extraits obtenus par l'acétate d'éthyle ont présenté les effets les plus importants. Il est bien connu que l'acétate d'éthyle permet une bonne extraction des composés phénoliques; ainsi l'effet observé peut être lié à la présence de ces composés dans les extraits testés. Parmi tous les tests réalisés (n = 160) seulement une petite partie a montré des effets notables (faible: 10.62 %, moyen : 2.50 %), ce qui signifie que Foa est résistant à la majorité de ces extraits de plantes et/ou aux quantités utilisées (200, 400, 800 et 1600 µg). Des différences très claires ont été trouvées pour les effets de la quantité d'extrait par disque (200, 400, 800 ou 1600 µg) et donc avec la quantité des substances actives présentes dans l'extrait, reflétant un effet antifongique accru. 1.3. Test de virulence Herrmann et al. (1996) ont démontré la virulence relative de certaines espèces de Fusarium et des formes spéciales Fusarium oxysporum sur le tissu de tubercule de pomme de terre mais sans tester la forme spéciale albedinis. Ces chercheurs avaient employé le Fusarium sambucinum BBA 62397 comme référence (100 %) qui causent 2.6 g de cellules nécrotiques. Comparé à nos résultats, le Foa représente une virulence relativement importante (0.066 g de tissu nécrotique) soit une virulence relative (VR) égale à 2.54 %. En comparant la VR du Foa avec les 36 souches étudiées par Herrmann et al. (1996), 6 ont une VR inférieure à 2.54 %; trois sur quatre formes spéciales de Fusarium oxysporum ont une VR inférieure à 2.54 %. 135 Comme présenté par Amraoui et al. (2005), l'effet nécrotique du Foa sur le tissu de tubercule de pomme de terre est dû principalement de la production d'enniatine, mycotoxine non spécifique à l'hôte et l’une des responsables de la phytotoxicité du Foa (Herrmann et al., 1996). L'effet des extraits sur la VR du Foa est probablement du à l’altération de la synthèse et/ou l'action de l'enniatine sur les cellules. Le meilleur effet dépressif sur la VR est représenté par les extraits de dichlorométhane. Ils pourraient agir sur la production d'enniatine ou affecter son mode d'action. L'augmentation de la VR audessus de 100 % reflète la cytotoxicité, tel est le cas des extraits hexaniques; peut être expliquée par la toxicité élevée des extraits et/ou de l'effet des extraits sur l'enniatine par Foa (augmentant l'effet et/ou la production de l'enniatine). Comme l’ont démontré Bosch et Mirocha (1992) et Bacon et al. (1996), la virulence de l'espèce de Fusarium est due à la production de l'acide fusarique, et à d'autres mycotoxines. Le Fusarium oxysporum f. sp. albedinis produit plusieurs toxines dont l’acide 3-phenyl lactique, acide fusarique, acide succinique et leurs dérivés, marasmins et toxines peptidiques (El Hadrami et al., 2005). Ces mycotoxines jouent un rôle majeur dans la pathogénicité et la virulence de Foa, en tant que déterminants primaires quand ils agissent dans le déclenchement de l'infection et le développement des symptômes. Ils sont des causes déterminantes secondaires quand ils modifient seulement l'intensité du symptôme. L'effet possible des extraits de plantes utilisés dans cette étude principalement d'acétate d'éthyle est d'agir sur un ou plusieurs de ces mycotoxines en modifiant leur métabolisme ou leurs effets. Dans une étude phytochimique réalisée sur Launeae arborescens. Belboukhari et Cheriti (2006) ont démontré que cette plante est riche en métabolites secondaires: tanins, saponines, flavonoïdes, terpènes et cardinolides. Le bon effet des extraits de Launeae arborescens sur la VR de Foa est probablement dû, au moins, à l’un de ces composés. Comparant les résultats obtenus à partir de la technique de diffusion en agar et du test de virulence, nous avons constaté que le dichlorométhane n'a eu aucun effet pour le premier test mais a présenté le meilleur effet pour le second. Cette controverse est probablement due à l'action des extraits de dichlorométhane sur les substances non vitales pour le Foa (jouent un rôle dans la toxicité de Foa) qui ne reflètent aucun effet sur la culture du Foa mais diminue la virulence. Amraoui et al. (2005) ont prouvé qu'une 136 fraction de Foa purifiée des extraits organiques ne pouvait pas induire la nécrose des tissus de pomme de terre, ce qui indique qu'elle ne contient pas des quantités importantes d'enniatines. Par ailleurs, une solution d'acide fusarique et d'enniatines sécrétées par plusieurs espèces de Fusarium, a été examinée à différentes concentrations et n'état pas capable d'induire les symptômes sur les feuilles isolées. Ainsi, il existerait une complémentarité nécessaire pour réaliser l'infection. 2. Plantes toxiques 2.1. L'efficacité d'extraction Le rendement d'extraction est affecté significativement par le type de solvant utilisé (p < 0.05). L'effet des solvants est lié principalement à leur polarité et donc à leur capacité d'extraire les substances Le méthanol set le solvant qui donne le rendement d'extraction le plus élevé en d’autres termes, les plantes utilisées contiennent plus de substances extractibles par le méthanol. La comparaison de l'efficacité d'extraction de 10 solvants différents (hexane, éther diisopropylique, éther diéthylique, dichlorure de méthylène, acétate éthylique, tétrahydrofurane, acétone, éthanol, méthanol et eau) en utilisant les feuilles de Combretum woodi a montré que la meilleure efficacité d'extraction était par les solvants de polarité intermédiaire comparé aux solvants polaires et non polaires reflétant que cette partie de plante contient plus de substances avec une polarité intermédiaire (Eloff et al., 2005). La différence avec nos résultats est probablement liée à la différence entre les espèces utilisées (différence dans les substances contenues dans ces plantes). Shi et al. (2003) ont signalé que les solvants polaires extraient les substances polaires (polyphénols); donc, les plantes utilisées dans cette étude contiennent des substances très polaires probablement parmi elles les polyphénols. 2.2. Effet antifongique Parmi les 128 tests réalisés, aucun na montré un effet d'inhibition fort et seulement 10.16 % ont présenté un effet modéré. Ces résultats reflètent une certaine résistance du Foa aux extraits de plantes liée à l’espèce de plante, aux solvants utilisés, aux parties utilisées et/ou aux quantités utilisées. Dans ce contexte, EL-Hassni et al. (2007) ont signalé que les stratégies de combat contre le Foa sont très restreintes ou quasi-indisponibles reflétant sa haute résistance. 137 Sur la base des expériences montrant l'effet détectable, les extraits obtenus par le méthanol, l'hexane et l'acétate d'éthyle étaient les plus efficaces, par ordre décroissant. Le méthanol étant plus polaire que l'acétate d'éthyle et l'hexane, l'effet principal des extraits méthanoliques est principalement dû aux substances polaires. Dans le cas des extraits actifs, des différences claires ont été notées traduisant un effet sur Foa proportionnel de la quantité d'extrait déposée par disque (200, 400, 800 ou 1600 µg). On peut conclure de la présente partie que ces plantes contiennent plus d'une substance avec un effet antifongique contre Foa. Par ailleurs beaucoup d'études ont montré que ces plantes contiennent de nombreux métabolites secondaires importants douées de propriétés pharmacologiques (Habs et al., 1984 ; Al-Dit et al., 1988 ; Abiola et al., 1993 ; Bégum et al., 1997 ; Maatooq et al., 1997 ; Hamdy et al., 1999 ; Abdel-Hassan et al., 2000 ; Abbassi et al., 2004 ; Hamed et al., 2006 ; Sawaya et al., 2006 ; Al-Farwachi, 2007 ; Hassan et al., 2007; Yoshikawa et al., 2007). Elles doivent être employées avec prudence en raison de leur toxicité qui est liée à la nature chimique, la dose, la partie de plante, cible(s). Dans beaucoup de cas, les marges entre les doses mortelles et sub-létales sont très basses (ex. les glycosides cardiaques…). Pour ces raisons, cette richesse doit être appréciée par les recherches pour obtenir les substances importantes et pour déterminer les doses appropriées. 2.3. Test de virulence L'absence de la corrélation entre le diamètre de la zone d'inhibition et la VR peut être liée à la différence entre les substances responsables de l'effet antifongique avec les substances responsables de l'effet d'anti-virulence. La différence peut être due à la nature chimique et/ou au mécanisme d'action. La virulence relative (VR) de Foa est la combinaison entre l'effet d'extraits de plantes et de l'effet de la virulence du Foa. Quant pour VR égale à (100 %), ce pourrait être le résultat des effets égaux et réversibles des deux facteurs (Foa, Extraits). La variabilité de l'effet antifongique des différentes parties d’une même plante est probablement lié à la différence dans les constituants présents dans ces parties. Ainsi, on a 138 observé le meilleur effet sur la VR du Foa avec les extraits des feuilles et tiges de Citrullus colocynthis alors que les extraits des fruits ont provoqué une augmentation de la VR. Les feuilles et tiges pourraient contenir des substances avec un effet bénéfique sur la virulence du Foa, tandis que les fruits pourraient contenir des substances toxiques sur le tissu de tubercule de pomme de terre. Maatooq et al. (1997) ont démontré la présence des flavonoïdes chez Citrullus colocynthis, mais les flavonoïdes présents dans les fruits sont différents de ceux de la partie aérienne. Les flavonoïdes sont connus pour avoir des effets antimicrobiens; ainsi l'effet antifongique des extraits de Citrullus colocynthis pourrait être lié aux flavonoïdes et la différence entre l'effet des parties végétales est probablement liée à des différences de nature qualitative et/ou quantitative entre ces flavonoïdes ou à la présence d'un autre groupe de substances. Herrmann et al. (1996) ont démontré la virulence relative de certaines souches de Fusarium et formes spéciales de Fusarium oxysporum sur le tissu de tubercule de pomme de terre mais cette étude n'a pas testé la forme spéciale Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. Comparé à nos résultats, le Foa présente une virulence relativement importante (0.066 g de tissu nécrosé) qui représente une virulence relative égale à 2.54 %. Parmi les 36 souches étudiées par ces auteurs, 6 ont eu une virulence relative inférieure à 2.54 % et trois sur quatre formes spéciales de Fusarium oxysporum ont une virulence relative inférieure à 2.54 %. Comme présenté par Amraoui et al. (2005), l'effet nécrotique de Foa sur le tissu de tubercule de pomme de terre est dû principalement à la production d'enniatine qui est une mycotoxine non spécifique à l'hôte mais l’une des responsables de la phytotoxicité du Foa (Herrmann et al., 1996). L'effet des extraits sur la VR du Foa pourrait être médiaté par effet sur la synthèse et/ou l'action de l'enniatine sur les cellules. Le meilleur effet sur la VR est représenté par les extraits méthanoliques et dichlorométhaniques de Citrullus colocynthis (feuilles et tiges) dont les constituants pourraient agir sur la production d'enniatine ou contrecarrer son mode d'action. L'augmentation du VR au-dessus de 100 % reflète la cytotoxicité qui peut être expliquée par une toxicité directe sur les cellules et/ou par l'augmentation de l'effet d'enniatine via l’augmentation de sa production et/ou la stimulation de son action. 139 Comme l’ont démontré Bosch et Mirocha (1992) et Bacon et al. (1996), la virulence de l'espèce de Fusarium est due à la production de l'acide fusarique, et à d'autres mycotoxines. Fusarium oxysporum f. sp. albedinis produit plusieurs toxines (El Hadrami et a., 2005). Ces mycotoxines jouent un rôle majeur dans la pathogénicité et la virulence de Foa. L'effet possible des extraits actifs des plantes utilisées dans cette étude est d'agir sur un ou plusieurs de ces mycotoxines en modifiant leur métabolisme et/ou leurs effets. Couplant l'effet des extraits de plantes sur la croissance et la virulence de Foa, Citrullus colocynthis a montré une plus grande efficacité que les autres plantes. Ceci pourrait être attribué aux différences dans la composition chimique, l'affinité à la cible biologique, et/ou d'autres facteurs. Beaucoup d'études ont étudié cette plante pour sa richesse en métabolites biologiquement actifs (Habs et al., 1984 ; Maatooq et al., 1997 ; Abdel-Hassan et al., 2000 ; Sawaya et al., 2006). Comparant les résultats obtenus à partir de la technique de diffusion en agar et le test de virulence, on a constaté que le dichlorométhane n'a eu aucun effet pour le premier test mais a eu un bon effet dans quelques tests de virulence. Cette différence est probablement due à l'action des extraits de dichlorométhane sur les substances non vitales pour le Foa (mais qui jouent un rôle dans sa toxicité) qui ne reflètent aucun effet sur la culture mais diminue la virulence. Il a été démontré par Amraoui et al. (2005) qu'une fraction de Foa purifiée à partir des extraits organiques de Foa ne pouvait pas induire la nécrose des tissus de pomme de terre, ce qui indique qu'elle ne contient pas des quantités importantes d'enniatines. Par ailleurs, une solution d'acide fusarique et d'enniatines sécrétés par plusieurs espèces de Fusarium, a été examinée à différentes concentrations et n'était pas capables d'induire les symptômes sur les feuilles isolées (Amraoui et al., 2005). Ainsi, il semblerait qu’il existe un genre de complémentarité pour réaliser l'infection. 3. Criblage phytochimique Malgré que certaines techniques de criblage phytochimique ne soient pas spécifiques pour les composés recherchés, elles sont au moins utiles pour nous orienter vers la présence ou l’absence éventuelle de ces composés dans les limites de détection propres à chaque technique. Pour cela, on considère judicieux d’utiliser ces techniques au préalable en vue de mettre au point d’autres analyses plus précises et plus appropriées à moindre coût et en temps réduit. Par exemple, il existe plusieurs méthodes pour estimer la 140 teneur totale en composés phénoliques dans un tissu végétal, mais il est important de prendre en considération qu’aucune de ces méthodes n’est capable de détecter tous les composés phénoliques (Vermerris et Nicholson, 2006). Quatre solvants ont été utilisés dans cette étude (méthanol, acétate d’éthyle, dichlorométhane et hexane). A cause de la différence de polarité entre ces solvants, il en résulte des différences d’ordre quantitatif (exemple, rendement d’extraction) et d’ordre qualitatif (exemple, effet antifongique) entre les différents extraits. Le criblage phytochimique a montré la présence d’alcaloïdes, de tanins, de flavonoïdes, et de coumarines chez toutes les plantes mais la présence des saponosides n’est confirmée que chez Fredolia aretioides malgré que d’autres études (Diwan et al., 2000; Belboukhari et Cheriti, 2006; Yoshikawa et al., 2007; Belboukhari et Cheriti, 2009) ont montré la présence des saponosides chez certaines de ces plantes. La différence est visiblement liée à la technique utilisée (indice de mousse) qui a une limite de détection élevée par rapport à d’autres analyses. Les flavonoïdes et tanins ont été détectés principalement dans les extraits d’acétate d’éthyle et de méthanol. Cela concorde avec le fait que ces deux solvants sont souvent utilisés pour leur bonne capacité d’extraction des polyphénols (Baydar et al., 2003; Goli et al., 2005; Nayab et al., 2006). Selon Magdalena et Anna (2008), l’acétate d’éthyle et méthanol sont parmi les solvants utilisés pour extraire les acides phénoliques. Selon leurs structures, certains flavonoïdes sont solubles dans les solvants polaires (eau, méthanol,…), d’autres sont solubles dans des solvants de faible polarité (acétate d’éthyle, chloroforme, …) (Marica et al., 2008). Pengelly (2004) a signalé que les tanins sont largement présents dans l’écorce des arbres, feuilles, tiges et fruits. Dans notre cas, parmi les plantes qui ont montré une richesse en tanins (tanins galliques) figure l’Acacia raddiana (écorces). Ce résultat est en accord avec celui de (Malan et Roux, 1975) travaillant sur plusieurs espèces du genre. Contrairement aux flavonoïdes et aux tanins, les coumarines ont montré une présence dans les extraits pour tous les solvants. Ce résultat est expliqué par le fait que les coumarines ont des structures chimiques différentes et donc diverses propriétés allant de 141 l’hydrophilie à l’hydrophobie, d’où leur extraction par des solvants de polarités différentes (Monika et Miroslaw, 2008). Les alcaloïdes sont les plus diversifiés par rapport aux autres classes de métabolites secondaires (Magdalena et Anna, 2008). Cela reflète la diversité des couleurs et des spots présentés par les extraits révélés pour les alcaloïdes. L’existence de certains spots de différents extraits ayant les mêmes Rf et les mêmes couleurs, pourrait être expliquée par leur identité structurale. 4. Bioautographie Certains extraits ont montré un effet antifongique par la méthode des disques mais n’ont pas présenté un effet par bioautographie. Ce résultat pourrait être lié à l’effet de synergie entre les composés présents dans l’extrait brut. Par contre, les extraits choisis pour leur effet sur la virulence relative (VR < 50 %) mais ayant montré une inhibition sur le chromatogramme, peut être expliqué par le phénomène d’antagonisme au niveau de l’extrait brut, et donc ce phénomène disparaît après séparation. Cowan (1999) a montré que parfois l’effet est lié au mélange de composés (synergie). La bioautographie montre différents Rf pour les zones d’inhibition, résultat lié à la présence (chez ces plantes) de composés anti-Foa avec différentes polarités. Par ailleurs, ce résultat confirme également la présence de différentes cibles chez le Foa et donc l’inhibition n’est pas forcément liée à un seul mécanisme. En outre, l’efficacité varie d’une plante à l’autre et d’une partie à l’autre (Shinde et al., 2009). La réalisation de la bioautographie nous a permis à la fois de séparer les constituants présents dans un extrait donné et d’évaluer leur effet antifongique. Pour les Rf des zones d’inhibition, plus la valeur est proche de (1.00) plus le caractère polaire diminue (lorsque la phase stationnaire est polaire, gel de silice par exemple) (Mdee et al., 2009). D’après nos résultats, les composés antifongiques présents chez ces plantes diffèrent du point de vue efficacité (diamètre de la zone d’inhibition), polarité et nature chimique. N’importe quelle partie de plante peut contenir des composés antimicrobiens (Cowan, 1999). Cette information est juste mais générale, mais des résultats différents peuvent être remarqués selon la source végétale, le protocole d’extraction et d’évaluation, et la cible (pathogène). Nos résultats ont démontré que les feuilles sont les plus 142 représentatives du point de vue effet antifongique. Concernant l’efficacité, les fruits de Citrullus colocynthis sont les plus importants. Les extraits de racines n’ont pas inhibé le Foa par bioautographie. Les extraits d’acétate d’éthyle sont les plus efficace sur le Foa, c’est probablement du à la nature des composés extraits par ce solvant et à la présence de leurs cibles chez ce champignon. L’acétate d’éthyle est connu pour son efficacité d’extraire des composés biologiquement actifs (flavonoïdes, tannins, coumarines,…) qui jouent un rôle dans la défense des plantes comme les composés phénoliques. Plusieurs études ont montré la présence des composés antifongique dans les extraits par l’acétate d’éthyle (Chang et al., 1999; Deepa et al., 2004). Tung et al. (2006) ont montré que la fraction soluble dans l’acétate d’éthyle (écorce d’Acacia confusa) est la plus riche en composés phénoliques et la plus efficace comme antioxydant. Le fait que les extraits de Citrullus colocynthis et d’Asteriscus graveolens sont les plus actifs sur le Foa, indique la présence de composés antifongiques potentiels chez ces plantes et la présence de leurs cibles chez le Foa. Des études phytochimiques ont montré la richesse de Citrullus colocynthis en composés phénoliques et en flavonoïdes (Maatooq et al., 1997; Kumar et al., 2008), bien connus pour leur action antimicrobienne (Pengelly, 2004; Marica et al., 2008). L’effet remarquable des extraits de Citrullus colocynthis est donc probablement lié aux composés phénoliques. Les flavonoïdes, par exemple, peuvent jouer un rôle d’inhibition d’enzymes du Foa. Monika et Miroslaw (2008) ont signalé que les coumarines jouent un rôle de protection chez les plantes et que certaines coumarines ont un effet antifongique. La corrélation réalisée entre le criblage phytochimique et bioautographie a montré que certaines zones d’inhibition correspondent aux quatre classes de métabolites testés sur le chromatogramme tandis que d’autres ne correspondent qu’à une seule ou à aucun de ces métabolites. Dans le premier cas, certains métabolites ont certains caractères en commun (flavonoïdes, tanins, coumarines) donc le résultat observé est lié probablement au caractère polyphénolique en général. Cowan (1999) a signalé que l’effet antimicrobien peut être présenté par différents groupes de métabolites secondaires. 143 5. Analyse spectroscopique du produit CCF1 Les résultats d’analyses chromatographiques et spectroscopiques (CCM, UV, IR) montrent que le composé isolé CCF1 n’appartient pas à la classe des polyphénols, les Rf dans les mêmes conditions d’analyse des flavonoïdes, tanins et coumarines ne correspondent pas au Rf du produit isolé. L’analyse spectroscopique par UV ne présente aucune bonde d’absorption au delà de 300nm qui caractérise les flavonoïdes en générale. Le spectre d’analyse IR présente une bande d’absorption faible vers 3400cm-1 qui indique l’absence des glycosides (faible présence des groupements OH), par contre, des bandes très intenses vers 2900cm-1 correspondent aux liaisons CH (présence importante). L’absence des bandes de vibration de valence vers 1500cm-1 confirme l’absence des CH aromatiques qui caractérisent les polyphénols. Le spectre IR présente aussi deux bandes caractéristiques au carbonyle, l’un correspond à un ester et l’autre à un carbonyle α,β insaturé. Selon les travaux sur la phytochimie de Citrullus colocynthis (Lavie et al., 1964; Gamlath et al., 1988, Sturm et Stuppner, 2000; Sturm et al., 2009), cette plante contient une quantité considérable de terpènes et surtout les triterpènes (cucurbitacines,…) connus pour leurs effets biologiques (antimicrobiens, anticacereux,…) (Miro, 1995; Cowan, 1999; Chen et al., 2005). Cette classe de substances naturelles présente des difficultés techniques pour la séparation et la purification, pour cela, on l’obtient avec des rendements faibles (Sturm et al., 2009). Donc le produit isolé appartient probablement à la classe des triterpènes et par comparaison avec les donnés spectroscopiques de la littérature (Lavie et al., 1964; Chen et al., 2003; Chen et al., 2005; Nayab et al., 2006), le produit CCF1 peut avoir la structure chimique de α-élatérine (cucurbitacine E) (Figure 15). Figure 15: Structure de Cucurbitacine E 144 6. Effet sur l’activité cellulasique du Foa Le choix de l’activité cellulasique parmi les systèmes acellulaires est lié à sa grande implication dans la pathogénicité, principalement dans le cas des champignons telluriques. Selon Agrios (2005), les enzymes cellulolytiques facilitent la pénétration et la diffusion du microbe pathogène dans l'hôte et causent l'effondrement et la désintégration de la structure cellulaire, facilitant de ce fait au microbe pathogène à provoquer la maladie. Ultérieurement, les enzymes cellulolytiques peuvent participer indirectement au développement de la maladie en libérant des chaînes de cellulose, des sucres solubles qui servent comme nourriture pour le microbe pathogène et, dans les maladies vasculaires, par la libération de grandes molécules de cellulose dans les voies conductrices, qui perturbent le mouvement normal de l'eau. Pour cela, un effet inhibant l’activité cellulasique agit d’une manière directe sur la pathogénicité du Foa. La mesure de l’activité cellulasique est complexe, mais parfois des méthodes simples et reproductibles peuvent prédire l’action enzymatique sous certaines conditions (Eveleigh et al., 2009). La technique utilisée dans cette étude est semi-quantitative donnant des informations sur la présence d’une inhibition et son degré par le diamètre, ainsi que la zone contenant la (les) molécules responsable(s) de cette inhibition par le Rf de la zone. Selon le nombre de spots inhibant l’activité cellulasique du Foa, les extraits de Citrullus colocynthis (Fruits), Pergularia tomentosa (Feuilles) et Fredolia aretioides (Partie aérienne) sont les plus importants. Ces extraits contiennent des composés capables d’inhiber l’activité cellulasique du Foa, malgré les diamètres faibles. En plus de son efficacité sur la croissance du Foa, Citrullus colocynthis montre une action sur l’activité cellulasique mais avec des Rf différents. L’effet inhibant l’activité cellulasique n’est pas simple parce que l’activité est liée à trois enzymes (Endo-β-Glucanase, Exo-β-Glucanase, Cellobiase) qui agissent en synergie pour dégrader la cellulose. L’inhibition représentée par certains composés est liée principalement à l’une de ces enzymes, tenant compte du principe de la spécificité enzymatique et de la différence entre ces enzymes. Concernant la corrélation entre inhibition par bioautographie et inhibition des cellulases, il est claire qu’on milieu synthétique l’inhibition de la croissance n’est pas 145 forcement liée à l’inhibition de l’activité cellulasique. Ce phénomène est fortement lié à la nature du milieu (source de carbone) et à la différence entre le milieu synthétique et l’environnement naturel du champignon (pénétration dans la plante hôte par la dégradation des barrières) (Vidhyasekaran, 2008). 7. Criblage phytochimique et bioautographie des extraits des rachis L’utilisation des rachis des cultivars de palmier dattier comme source d’agent(s) antifongique(s) contre le Foa était basée sur deux points essentiels. Le premier, l’existence de trois types de cultivars ayant des comportements différents vis-à-vis du Foa: cultivars résistants, cultivars sensibles, et cultivars tolérants. Pour cela, on a voulu déterminer s’il y a une corrélation entre les caractères précédents et l’effet des extraits sur le Foa. En deuxième lieu, le palmier dattier est la plante hôte du Foa, et comme les autres plantes, elle a un mécanisme de défense. Donc, le palmier dattier peut avoir une ou plusieurs substances antifongiques. De plus, la présence de substance(s) antifongique(s) peut être inefficace dans la plante (concentration faible, temps d’action retardé, cible absente,…), donc l’évaluation in vitro peut être utile pour dévoiler ces substances. 7.1. Criblage phytochimique Les résultats ont montré une certaine ressemblance entre les cultivars concernant la présence ou l’absence des métabolites secondaires testés. Cela est expliqué par le fait que les rachis testés sont de la même espèce « Phoenix dactylifera », malgré les différences au niveau de certains caractères ; il existe donc toujours une certaine unicité au niveau métabolique. Par exemple, Ziouti et al. (1996) ont montré qu’il y a une différence quantitative, mais non qualitative, entre les cultivars résistants et sensibles durant la croissance, concernant la production de certaines molécules polyphénoliques. La présence de flavonoïdes dans tous les extraits montre que ces rachis contiennent des flavonoïdes de différentes polarités (Marica et al., 2008; Shinde et al., 2009). La diversité dans le nombre et couleurs de spots positifs aux alcaloïdes est liée à la richesse et diversité de cette classe de métabolites secondaires (Magdalena et Anna, 2008). 7.2. Bioautographie L’analyse bioautographique montre que lefficacité des extraits par le dichlorométhane et l’acétate d’éthyle sur Foa est liée à des composés de polarité moyenne. Certaines zones d’inhibition provoquées par des extraits de différents cultivars, avec le 146 même solvant, ont des Rf très proches. Tel est le cas des extraits des rachis par dichlorométhane de Feggus, Bent-Cherk, Kseiba et Rotbi. Il pourrait donc s’agir du même composé ou de composés apparentés chimiquement. Les différences observées concernant le diamètre de la zone d’inhibition au niveau de certains spots de même Rf sont dues à la différence de concentration du composé correspondant d’un cultivar à l’autre. Toutes les recherches consultées en ce qui concerne l’analyse phytochimique et biochimique du palmier dattier concernent principalement les polyphénols (connus pour leurs effets antifongiques) (Daayf et al., 2003), certaines enzymes (Majourhat et Baaziz, 2004; El-Hassni et al., 2005; Baaziz et al., 2006), ou la stimulation de la défense par lutte biologique (El-Hassni et al., 2007). Ces études ont ciblé le principe de la défense naturelle pour la corréler avec le problème de la sensibilité vis-à-vis du Foa pour avoir une explication du phénomène de résistance et sensibilité. D’autres études se sont chargé de résoudre ce problème en ce basant par exemple sur le mécanisme de la défense des cultivars résistants (molécules responsables, mécanisme d’action,…). On peut citer dans ce contexte, la recherche de cultivars résistants, avec des fruits de bonne qualité, par croisement dirigé (Brac de la Perrière et Benkhalifa, 1991; Djerbi, 1991). Malheureusement, en dépit des résultats prometteurs au début, les cultivars présentant les caractères voulus changent avec le temps ou ne peuvent pas résister à certaines conditions abiotiques. La résistance, la tolérance ou la sensibilité ne sont pas toujours liées à la présence d’un seul composé ou une classe de molécules. Ce sont des mécanismes complexes qui font appel à plusieurs types de molécules. Selon Ziouti et al. (1996), le point essentiel concernant la différence entre ces cultivars, c’est le temps de réponse. Ça veut dire que la différence entre ces cultivars est généralement dans le mécanisme de réponse avant la concentration ou la nature des composés impliqués. A la lumière de l’ensemble de nos résultats, nous supposons que l'effet antifongique présenté par ces extraits de plantes contre le Foa peut être dû aux métabolites secondaires, les composés phénoliques en premier lieu, présents chez ces plantes. La différence observée quant au degré de l'effet observé est proportionnelle à la nature et/ou à la quantité de(s) métabolite(s) secondaire(s) responsable(s) présent(s) chez ces plantes. 147 REFERENCES Abbassi K., Kadiri A. Z. et Ghaout S. 2004. Biological Activity of Calotropis procera (Ait. R. Br) Leaves on the Desert Locust (Schistocerca gregaria, Forsk. 1775). Zoologica Baetica, 15: 153-166. Abdel-Hassan I. A., Abdel-Barry J. A. et Mohammeda S. T. 2000. The Hypoglycaemic and Antihyperglycaemic Effect of Citrullus colocynthis Fruit Aqueous Extract in Normal and Alloxan Diabetic Rabbits. Journal of Ethnopharmacology, 71: 325-330. Abiola F. A., Alogninouwa T., El-Bahri L., Ali M., Kaboret et Fayomi B. 1993. Experimental Study of Poisoning of Goats with Pergularia tomentosa L. Revue des d’Elevage et de Médecine Vétérinaire des Pays Tropicaux, 46: 591-595. Abu-Bakar N. K., Abd-Aziz S., Hassan M. A. et Ghazali F. M. 2010. Isolation and Selection of Appropriate Cellulolytic Mixed Microbial Cultures for Cellulases Production from Oil Palm Empty Fruit Bunch. Biotechnology, 9(1): 73-78. Agrios G. N. 2005. Plant Pathology. 5th edition, Elsevier Publishing, p. 922. Al-Farwachi M. I. 2007. In vivo and in vitro Immunomodulatory Activities of Nerium oleander Aqueous Leaf Extract in Rabbits. Journal of Animal and Veterinary Advances, 6: 1047-1050. Al-Said M. S., Kadertaragan A. H. et Hifnawy M. S. 1988. Pharmacognostical and Preliminary Phytochemical Investigation of the Fruit of Pergularia tomentosa L. Pharmaceutical Biology, 26:9-16. Amraoui H., Lazrek H., Sedra M., Sampieri F., Mansuelle P., Rochat H. et Hamdaoui A. 2005. Chromatographic Characterization and Phytotoxic Activity of Fusarium oxysporum f. sp. albedinis and Saprophytic Strain Toxins. Journal of Phytopathology, 153 (4): 203208. 148 Baaziz M., Qacif N., Bendiab K. et Aouad A. 2006. Les Peroxydases des Plantes: Aspect théorique et Applications pratiques. Congrès International de Biochimie, Agadir, Maroc, 912 Mai, 17-21. Bacon C. W., Porter J. K., Norred W. P. et Leslie J. F. 1996. Production of Fusaric Acid by Fusarium species. Applied and Environmental Microbiology, 62: 4039-4043. Baydar N. G., Özkan G. et Sa diç O. 2003. Total Phenolic Contents and Antibacterial Activities of Grape (Vitis vinifera L.) Extracts. Food Control, 14(5): 335-339. Begum S., Sultana R. et Siddiqui B. S. 1997. Triterpenoids from the Leaves of Nerium oleander. Phytochemistry, 44: 329-332. Belboukhari N. et Cheriti A. 2006. Phytochemical Investigation of the Bioactive Extract from Launea arborescens. Pakistan Journal of Biological Sciences, 9 (15): 2930-2932. Belboukhari N. et Cheriti A. 2009. Analysis and Isolation of Saponins from Limoniastrum feei by LC-UV. Chemistry of Natural Compounds, 45(5): 756-758. Belboukhari N., Melekmi N., Belhadjadji Y. et Cheriti A. 2007. Chemical Composition and Antimicrobial Activity of the Saharian Medicinal Plant Acacia raddiana. Congrès International sur les Plantes Médicinales et Aromatiques (CIPMA 2007), Fès 22-24 Mars 2007, Morocco. Bosch U. et Mirocha C. J. 1992. Toxin Production by Fusarium species from Sugar Beets and Natural Occurrence of Zearalenone in Beets and Beet Fibers. Applied and Environmental Microbiology., 58: 3233-3239. Boulenouar N., Marouf A. et Cheriti A. 2008. Effect of Some Saharian Medicinal Plants Extracts on Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. 3ème Symposium international sur les plantes médicinales et aromatiques (SIPMA 3) & 1er Congrès International sur les Molécules Bioactives (CIMB 1), Oujda 29-30 Mai 2008, Morocco. 149 Boulenouar N., Marouf A. et Cheriti A. 2009. Effect of Some Poisonous Plants on Fusarium oxysporum f. sp. albedinis. Journal of Biological Sciences, 9(6): 594-600. Brac de la Perrière R. A. et Benkhelifa A. 1991. Progression de la fusariose du palmier dattier en Algérie. Sécheresse, 2(2): 119-128. Chang S. T., Wang S. Y., Wu C. L., Su Y. C. et Kuo Y. H. 1999. Antifungal Compounds in the Ethyl Acetate Soluble Fraction of the Extractives of Taiwania (Taiwania cryptomerioides Hayata) heartwood. Holzforschung, 53(5): 487-490. Chen J. C., Chiu M. H., Nie R. L., Cordell G. A. et Qiu S. X. 2005. Cucurbitacins and Cucurbitane Glycosides: Structures and Biological Activities. Natural Product Reports, 22: 386-399. Chen Y., Chiu M. H., Gu K. et Li Z. R. 2003. Cucurbitacin and Triterpenoid glycosides from Hemsleya giganthy. Chinese Chemical Letters, 14(5): 475-478. Cheriti A. 2000. Rapport CRSTA, Plantes Médicinales de la Région de Béchar, Sud-Ouest d’Algérie (Ethnopharmacological studies), Bechar, Algeria, 3-11. Cheriti A., Belboukhari N. et Hacini S. 2004. Ethnopharmacological Survey and Phytochemical Screening of Some Medicinal Plants of Algerian Sahara. Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 3: 51. Cheriti A., Belboukhari N. et Hacini S. 2005. Savoir Traditionnel et Valorisation des Plantes Médicinales du Sud-Ouest Algérien. Annales de l’Université de Béchar, 1:4. Cowan M. M. 1999. Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology Reviews, 12 (4): 564-582. Daayf F., El-Bellaj M., El-Hassni M., J’Aiti F. et El-Hadrami I. 2003. Elicitation of Soluble Phenolics in Date Palm (Phoenix dactylifera) Callus by Fusarium oxysporum f. sp. albedinis Culture Medium. Environmental and Experimental Botany, 49(1): 41-47. 150 Deepa, N., Rajendran N. N., Lata T. et Jagannathan N. S. 2004. Anti-bacterial and antifungal Activities of Ethyl Acetate Extract and the Isolated Fraction of Acanthospermum hispidum DC. Journal of Natural Remedies, 4:2. Diwan F. H., Abdel-Hassan I. A. et Mohammed S. T. 2000. Effect of Saponins on Mortality and Histopathological Changes in Mice. East Mediterranean Health Journal, 6(23): 345-351. Djerbi M. 1991. Biotechnologie du Palmier Dattier (Phoenix dactylifera L.): Voie de propagation des clones résistants au Bayoud et de haute qualité dattière. In: Les systèmes agricoles oasiens, Options méditerranéennes, série séminaires, N°04: 31-38. El-Hadrami, A., El-Idrissi-Tourane A., El-Hassni M., Daayf F. et El-Hadrami I. 2005. Toxin Based in vitro Selection and its Potential Application to Date Palm for Resistance to the Bayoud Fusarium wilt. Comptes Rendus Biologies, 328: 732-744. El-Hassni M., Verdeil J. L. et El-Hadrami I. 2005. An Hypoagressive Fusarium oxysporum Isolate Induces polypohenoloxidase Activity in the Date Palm Seedlings Allowing their Protection Against the Bayoud Disease. Plant Pathology Journal, 4(2): 96-102. El-Hassni M., El-Hadrami A., Daayf F., Chérif M., Essaid A. B., El-Hadrami I., 2007. Biological Control of Bayoud Disease in Date Palm: Selection of micro-organisms inhibiting the causal agent and inducing defence reactions. Environmental and Experimental Botany, 59: 224-234. Eloff J. N., Famakin J. O. et Katerere D. R. P. 2005. Combretum woodii (Combretaceae) Leaf Extracts have High Activity Against Gram-negative and Gram-positive Bacteria. African Journal of Biotechnology, 4: 1161-1166. Eveleigh D. E., Mandels M., Andreotti R. et Roche C. 2009. Measurement of saccharifying Cellulase. Biotechnology for Biofuels, 2: 21. Faye B. 1985. Contribution à l'Etude de la Toxicité de Calotropis procera, Effet d'une alimentation à base de Calotropis procera sur la mortalité embryonnaire et néonatale chez 151 la souris de laboratoire. Revue d’Elevage et de Médecine Vétérinaire des Pays Tropicaux, 38: 72-75. Gamlath B. Ch., Gunatilaka A. A. L., Alvi Kh. A., Atta-ur-Rahman et Balasubramaniam S. 1988. Cucurbitacins of Colocynthis vulgaris. Phytochemistry, 27(10): 3225-3229. Goli A. H., Barzegar M. et Sahari M. A. 2005. Antioxidant Activity and Total Phenolic Compounds of Pistachio (Pistachia vera) Hull Extracts. Food Chemistry, 92 (3): 521-525. Habs M., Jahn S. A. A. et Schmähl D. 1984. Carcinogenic Activity of Condensate from Coloquint Seeds (Citrullus colocynthis) After Chronic Epicutaneous Administration to Mice. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology, 108: 154-156. Hamdy I. H., Al-Rajhy D., El-Shahawi F. I. et Hashem S. M. 1999. Molluscicidal Activity of Pergularia tomentosa (L.), Methomyl and Methiocarb, Against Land Snails. International Journal of Pest Management, 45: 211-213. Hamed A. I., Plaza A., Balestrieri M. L., Mahalel U. A., Springuel I. V., Oleszek W., Pizza C. et Piacente C. 2006. Cardenolide Glycosides from Pergularia tomentosa and Their Proapoptotic Activity in Kaposi's Sarcoma Cells. Journal of Natural Product, 69: 1319– 1322. Hassan S. W., Umar R. A., Ladan M. J., Nyemike P., Wasagu R. S. U., Lawal M. et Ebbo. 2007. Nutritive Value, Phytochemical and Antifungal Properties of Pergularia tomentosa L. (Asclepiadaceae). International Journal of Pharmacology, 3: 334-340. Herrmann M., Zocher R. et Haese A. 1996. Enniatin Production by Fusarium Strains and its Effect on Potato Tuber Tissue. Applied and Environmental Microbiology, 62: 393-398. Horvath G. Y., Botz L., Kocsis B., Lemberkovics E., Szabo L. G. Y. 2004. Antimicrobial Natural Products and Antibiotics by Direct Bioautography Using Plant Pathogenic Bacteria. Acta Botanica Hungarica, 46: 153-165. 152 Kasana R. C., Salwan R., Dhar H., Dutt S. et Gulati A. 2008. A Rapid and Easy Method for the Detection of Microbial Cellulases on Agar Plates Using Gram’s Iodine. Current Microbiology, 57: 503-507. Kumar S., Kumar D., Manjisha, Saroha K., Singh N. et Vashishta B. 2008. Antioxidant and Free Radical Scavenging Potential of Citrullus colocynthis (L.) Schrad. Methanolic Fruit Extract. Acta Pharmaceutica, 58 :215–220 Lavie E., Willner D. et Merenlender Z. 1964. Constituents of Citrullus colocynthis (L.) Schrad. Phytochemistry, 3: 51-56. Maatooq G. T., El-Sharkawy S. H., Afifi M. S. et Rosazza J. P. N. 1997. C-phydroxybenzoylglycoflavones from Citrullus colocynthis, Phytochemistry, 44:187-190. Magdalena W. K. et Anna O. 2008. Sample Preparation and TLC Analysis of Phenolic Acids. In: TLC in Phytochemistry, CRC Press Taylor & Francis Group, 331-364. Majourhat K. et Baaziz M. 2004. Diversité et Caractérisation des Peroxydases Foliaires du Palmier Dattier. Congrès International de Biochimie, Marrakech, Maroc, 3-6 Mai, 153156. Malan E. et Roux D. G. 1975. Flavonoids and Tannins of Acacia species. Phytochemistry, 14(8): 1835-1841. Marica M. Š., Ivona J., Ana M. et Željan M. 2008. Application of TLC in the Isolation and Analysis of Flavonoids. In: TLC in Phytochemistry, CRC Press Taylor & Francis Group, 405-424. Mdee L. K., Masoko P. et Eloff J. N. 2009. The Activity of Extracts of Seven Common Invasie Plant Species on Fungal Phytopathogens. South African Journal of Botany, 75: 375-379. Miro M. 2006. Cucurbitacins and their Pharmacological Effects. Phytotherapy Research, 9(3): 159-168. 153 Monika W. H. et Miroslaw A. H. 2008. Application of TLC in the Isolation and Analysis of Coumarins. In: TLC in Phytochemistry, CRC Press Taylor & Francis Group, 365-404. Nayab D., Ali D., Arshad N., Malik A., Choudhary M.I. et Ahmed Z. 2006. Cucurbitacin Glucosides from Citrullus colocynthis. Natural Product Research, 20(5):409-413. Pandey N., Chandrakar A. K., Garg M. L. et Patel S. S. 2009. Calotropis procera Induced Keratitis. Indian Journal of Ophthalmology, 57: 58-60. Pengelly A. 2004. The Constituents of Medicinal Plants: An introduction to the chemistry and therapeutics of herbal medicines, 2nd Edition, Sun Flower Herbals, p.109 Sawaya W. N., Daghir N. J. et Khan P. 2006. Chemical Characterization and Edibility of the Oil Extracted From Citrullus colocynthis Seeds. Journal of Food Science, 48: 104-106. Shi J., Yu J., Pohorly J., Young J. C., Bryan M. et Wu Y. 2003. Optimization of the Extraction of Polyphenols from Grape Seed Meal by Aqueous Ethanol Solution. Food Agricultural Environment, 1:42-47. Shinde S. L., Junne S. B., Wadje S. S. et Baig M. M. V. 2009. The Diversity of Antimicrobial Compounds of Terminalia Species (Combretaceae). Pakistan Journal of Biological Sciences, 12(22): 1483-1486. Sturm S. et Stuppner H. 2000. Analysis of Cucurbitacins in Medicinal Plants by HPLC and MS. Phytochemical Analysis, 11(2): 121-127. Sturm S., Schneider P., Seger C. et Stuppner H. 2009. Analysis of Citrullus colocynthis Cucurbitacine Derivatives with HPLC-SPE-NMR. Scientia Pharmaceutica, 77: 254. Tung Y-T., Wu J-H., Kuo Y-H. et Chang S-T. 2007. Antioxidant Activities of Natural Phenolic Compounds from Acacia confusa bark. Bioresource Technology, 98(5): 11201123. 154 Vidhyasekaran P. 2008. Fungal Pathogenesis in Plant and Crops “Molecular Biology and Host Defense Mechanisms. CRC Press, Second edition, p.509. Yoshikawa M., Morikawa T., Kobayashi H., Nakamura A., Matsuhira K., Nakamura S. et Matsuda H. 2007. Bioactive Saponins and Glycosides. XXVII. Structures of New Cucurbitane-Type Triterpene Glycosides and Antiallergic Constituents from Citrullus colocynthis. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 55(3): 428-434. Ziouti A., El-Modafar C., Fleuriet A., EL-Boustani S. et Macheix J. J. 1996. Phenolic Compounds in Date Palm Cultivars Sensitive and Resistant to Fusarium oxysporum, Biologia Plantarum, 38(3): 451-457. 155 CONCLUSION & PERSPECTIVES 156 CONCLUSION & PERSPECTIVES Cette thèse s’est attachée à un thème d’une importance cruciale pour la phoeniciculture, celui de la recherche de substances naturelles actives contre l’agent causal du Bayoud ou fusariose vasculaire, causée par un champignon tellurique Fusarium oxysporum f. sp. albedinis, principale maladie du palmier dattier qui sévit dans la partie occidentale de l’aire phénicicole de l’Afrique du Nord. La propagation du Bayoud et l’absence de traitement efficace pour ce fléau nous incitent à rechercher de nouvelles substances antifongiques susceptibles d’inhiber le mécanisme de résistance du Foa. Dans ce contexte, nous avons été orienté vers l’évaluation des extraits de certaines plantes médicinales et/ou toxiques pour les utiliser comme source de substances antifongiques. A cet effet, un screening exhaustif portant sur 72 extraits a pu être effectué par la technique de diffusion par disque. Trente un extraits présentant une inhibition et/ou diminution de la virulence relative au dessous de 50 % ont subi un criblage phytochimique et une bioautographie directe. La bioautographie a été utilisée pour localiser l’activité antifongique sur le chromatogramme et étudier sa corrélation avec les données du criblage phytochimique. Les solvants les plus efficaces (extraits présentant les meilleurs effets) pour les plantes utilisées sont l’acétate d’éthyle et le méthanol; tandis que pour les rachis de cultivars de palmier dattier, les meilleurs résultats ont été obtenus avec le dichlorométhane et l’acétate d’éthyle. Les résultats ont démontré que les feuilles sont les plus représentatives du point de vue effet antifongique. Parmi les extraits testés, ceux obtenus à partir des fruits de Citrullus colocynthis et tiges d’Asteriscus graveolens par l’acétate d’éthyle sont les plus efficaces sur Foa (diamètres d’inhibition 7.75 ± 1.06 mm et 7.00 ± 1.41 mm, respectivement). Nous avons également évalué la virulence de ce pathogène sur le tissu des tubercules de pomme de terre. Une diminution de la VR jusqu’ à 30% représentée par l’ extrait avec l’ acétate d’ éthyle de la partie aérienne de Launeae arborescens. Par contre, 157 les extraits des plantes toxiques n’ ont atteint que 46% représentée par l’ extrait avec l’ acétate d’ éthyle des feuilles et tiges de Citrullus colocynthis. L'efficacité des extraits de Citrullus colocynthis indique la présence de cibles hautement sensibles chez Foa, qui peuvent être exploitées en vue de la mise au point de nouveaux traitements efficaces contre le Bayoud. Afin d’ isoler le phytoconstituant actif porteur de l’ activité antifongique, une étude guidée par test biologique a été conduite, alliant la bioautographie et la chromatographie sur colonne couplée à l’UV. Cette étude a abouti à l’isolement d’un composé pur CCF1 à partir de l’extrait des fruits de Citrullus colocynthis par acétate d’éthyle et dont la structure a été appréhendée à l’aide de techniques spectroscopiques (UV, IR) et les données de la littérature. Le produit CCF1 est probablement la Cucurbitacine E (triterpène tetracyclique). Les extraits bioactifs ont été testés sur l’activité cellulasique du Foa. L’inhibition de l’activité cellulasique du Foa n’est pas toujours liée à l’inhibition de la croissance (en milieu synthétique contenant d’autres sources de carbone), mais en milieu naturel du Foa, elle est responsable des premiers processus d’infection fongique, la pénétration. Les meilleurs effets sont représentés par l’extrait des fruits de Citrullus colocynthis et l’extrait des tiges d’Asteriscus graveolens avec l’acétate d’éthyle (∅ = 3mm). Les extraits des rachis de huit cultivars de palmier dattier (résistants, tolérants, sensibles,…) ont été analysés par criblage phytochimique et bioautographie directe sur le Foa. Parmi trente-deux extraits de rachis, huit ont montré au moins une zone d’inhibition du Foa sur le chromatogramme. Les meilleurs résultats sont représentés par l’extrait dichlorométhanique des rachis de « Bent Cherk » (6.50 ± 1.41) et l’extrait par l’acétate d’éthyle des rachis de « Rotbi » (6.00 ± 1.41). L’évaluation des extraits de rachis nous permet de suggérer que le caractère de résistance, tolérance ou de sensibilité n’est pas forcément lié à la présence ou l’absence d’une molécule spécifique. D’autre part, les résultats de criblage phytochimique et bioautographique nous permettent de conclure qu’il y a une ressemblance des profils phytochimiques entre les cultivars et que la majorité des composés bioactifs sur le Foa, semblent être des polyphénols. Par ailleurs, le caractère de résistance, tolérance ou 158 sensibilité n’apparaît pas clairement à travers les résultats du criblage phytochimique ni ceux de la bioautographie. Enfin, les extraits les plus actifs sont obtenus par acétate d’éthyle ou par le dichlorométhane ce qui indique que ces composés sont de polarité moyenne. Le mécanisme de défense naturel du palmier dattier, contre le Foa semble majoritairement lié à l’action des polyphénols. Il s’en suit que la différence entre les cultivars résistants, tolérants ou sensibles serait liée au mécanisme d’action. Au terme de cette étude, il apparaît que les plantes utilisées présentent une richesse en métabolites secondaires bioactifs offrant la potentielle alternative de les utiliser comme source d’agents antimicrobiens. La complexité de l’interaction Fusarium oxysporum f. sp. albedinis-palmier dattier nécessite de poursuivre cette étude par d’autres voies complémentaires afin de clarifier à la fois l’arsenal utilisé par le pathogène et les moyens mis en œuvre par la plante pour parer à l’attaque fongique. Dans ce contexte, plusieurs voies sont possibles. L’une d’elle serait de rechercher in vivo (tissu conducteur infecté, feuilles, sève) la présence ou non des métabolites phytotoxiques et d'établir leurs rôles dans le cycle de la maladie. Il serait également intéressant d’étudier l’effet potentialisateur des saponines sur l’activité antifongique des polyphénols (une des propriétés des saponines est qu’elles sont des agents perméabilisant membranaires : en s’associant au cholestérol des membranes, elles créent des pores à leur niveau, ce qui pourrait aider à la pénétration du principe actif dans les cellules fongiques). 159
