thèse - Université Paul Sabatier

THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Immunologie
Présentée et soutenue par Florence NICOT
Le 13 juillet 2010
Titre :
VARIABILITE GENETIQUE DU VIRUS DE L’HEPATITE C ET PERSISTANCE VIRALE
JURY
Madame le Professeur Françoise STOLL-KELLER (Rapporteur)
Monsieur le Professeur Gilles DUVERLIE (Rapporteur)
Madame le Docteur Anne-Marie ROQUE-AFONSO (Examinateur)
Monsieur le Professeur Christophe PASQUIER (Co-directeur de thèse)
Monsieur le Professeur Jacques IZOPET (Directeur de thèse)
Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologie
Unité de recherche : INSERM U563 Equipe C. Davrinche/ J.Izopet
Directeur(s) de Thèse : Pr Jacques IZOPET et Pr Christophe PASQUIER
Rapporteurs : Pr STOLL-KELLER et Pr DUVERLIE
A l’issue de ce travail, je voudrais adresser ma profonde reconnaissance
Au jury
Mme le Professeur STOLL-KELLER
Professeur des Universités- Praticien Hospitalier
Laboratoire de Virologie, Strasbourg
Je vous remercie d’avoir accepté la charge d’être rapporteur de mon travail de thèse et de
me faire bénéficier de votre expertise dans le domaine du HCV.
Mr le Professeur Gilles DUVERLIE
Professeur des Universités- Praticien Hospitalier
Laboratoire de Virologie, Amiens
Doyen de la faculté de Pharmacie d’Amiens
Je vous remercie de me faire l’honneur de juger mon travail en tant que rapporteur, et de me
faire partager votre connaissance de la physiopathologie de l’infection HCV.
Mme le Docteur Anne-Marie ROQUE-AFONSO
Maître de conférence des Universités- Praticien Hospitalier
Laboratoire de Microbiologie, Villejuif
Vous avez accepté de participer à mon jury de thèse. Soyez assuré de mes sincères
remerciements.
Mr le Professeur Christophe PASQUIER
Professeur des Universités- Praticien Hospitalier
Laboratoire de Virologie, Toulouse
Tu m’as fait l’honneur de co-diriger cette thèse.
Je te remercie pour l’aide précieuse que tu m’as apportée tout au long de cette thèse. Tu
m’accompagnes et me guides depuis mon arrivée au laboratoire. Trouve ici le témoignage
de ma profonde reconnaissance.
Mr le Professeur Jacques IZOPET
Professeur des Universités- Praticien Hospitalier
Laboratoire de Virologie, Toulouse
Tu m’as fait l’honneur de diriger cette thèse.
Ton dynamisme et ton enthousiasme ont été moteurs pour moi. Ton perfectionnisme m’a
amené à atteindre le meilleur de moi-même. Merci pour tes encouragements, ta confiance et
ce que tu m’as apporté professionnellement.
A Florence, merci pour ton aide précieuse et nos échanges de tous les jours,
A Karine, avec qui j’ai eu plaisir de découvrir les subtilités des statistiques,
A Stéphanie, pour nos soirées en « tête à tête » au labo,
A tous les biologistes, merci pour votre bonne humeur et nos petits moments de folie.
Mention spéciale aux filles du bureau.
A Martine, merci d’avoir guidé mes premiers pas techniques au laboratoire avec la patience
et la gentillesse qui te caractérisent et pour le travail réalisé à tes côtés.
A toute l’équipe du laboratoire de Virologie.
A mes parents, ma sœur merci pour vos encouragements et votre soutien,
A toute ma famille,
A tous mes amis.
TABLE DES MATIERES
INTRODUCTION
5
I- LE VIRUS DE L’HEPATITE C (HCV)
7
A- Du génome aux protéines virales
B- Le cycle viral
II- PHYSIOPATHOLOGIE DE L’INFECTION
7
12
17
A- Histoire naturelle chez les patients infectés par HCV seul
17
B- HCV et coinfection par HIV
20
C- Infection par HCV chez les patients hémodialysés et transplantés rénaux 21
D- Tropisme hépatique et cibles extra-hépatiques
III- VARIABILITE GENETIQUE DU HCV
24
26
A- Variabilité inter-individus : les génotypes et sous-types du HCV
26
B- Variabilité intra-individus : les quasi-espèces
32
C- Les virus recombinants
33
D- Implications cliniques et épidémiologiques de la variabilité génétique
34
i. Au niveau des génotypes et des sous-types
ii. Au niveau des quasi-espèces
34
38
IV- PRISE EN CHARGE THERAPEUTIQUE DES
INFECTIONS PAR HCV
A- Molécules antivirales actuellement utilisées
i. Les interférons : mécanisme d’action et pharmacocinétique
ii. La ribavirine : mécanisme d’action et pharmacocinétique
40
40
40
46
2
B- Facteurs influençant la réponse au traitement
i. Facteurs viraux
ii. Facteurs de l’hôte
iii. Facteurs pharmacologiques
C- Algorithme de traitement des patients infectés par HCV
i. Détermination et surveillance de la charge virale
ii. Optimisation du traitement
iii. Prise en charge thérapeutique des patients coinfectés HCV-HIV
iv. Traitement des patients hémodialysés et transplantés rénaux
D- Mécanismes d’échappement viral au traitement
i. Amélioration des traitements actuellement disponibles
ii. Futurs traitements
V- PERSISTANCE OCCULTE DU HCV
A- Définition de l’infection occulte à HCV
i. Les différents types d’hépatite C occulte
ii. Diagnostic de l’infection occulte à HCV
50
50
51
53
55
56
57
65
67
69
73
73
79
79
79
81
B- Caractéristiques cliniques de l’infection occulte
82
C- Réplication et infectiosité du virus C dans l’infection occulte
84
D- Groupes de patients à risque d’infection occulte
84
E- Immunobiologie de l’infection occulte à HCV
85
i. Réponse immune humorale anti-HCV
ii. Réponse immune cellulaire anti-HCV
85
86
F- Traitement de l’infection occulte
87
OBJECTIFS
89
RESULTATS
91
PARTIE I : VARIABLITE GENETIQUE ET EPIDEMIOLOGIE DES
GENOTYPES 2 ET 4
Publication n°1 : J Gen Virol, 2005
Publication n°2 : J Med Virol, 2007
Publication n° 3: J Clin Microbiol, soumis
3
PARTIE II : FACTEURS ASSOCIES A LA REPONSE AU TRAITEMENT
CHEZ DES PATIENTS DIFFICILES A TRAITER
Publication n°4 : J Med Virol, 2008
Publication n°5 : J Med Virol, soumis
PARTIE III : INFECTION OCCULTE A HCV : L’ERADICATION DU HCV
EXISTE-T-ELLE ?
Publication n°6 : Tranplant International, 2010
DISCUSSION
103
BIBLIOGRAPHIE
119
4
INTRODUCTION
L’infection par le virus de l’hépatite C (HCV) est une des principales causes
d’hépatite chronique, de cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire. Le
génome du virus a été caractérisé pour la première fois en 1989 à partir du sérum
d’un sujet présentant une hépatite chronique post-transfusionnelle non-A non-B
(Choo, 1989). C’est un ARN simple brin de polarité positive codant pour un seul
cadre de lecture (ORF). L'agent causal des hépatites non-A non-B, ainsi identifié, a
été nommé HCV. A cette époque, la visualisation de la particule virale et la culture du
virus in vitro n’étaient pas réalisables. En 20 ans, les progrès scientifiques ont permis
la mise au point d’un système de culture cellulaire efficace pour le HCV. Cette
découverte a ouvert une nouvelle ère dans la recherche sur le HCV permettant ainsi
d’accélérer la compréhension des mécanismes d’entrée et du cycle réplicatif du HCV
dans les cellules hépatocytaires, et de cribler des nouvelles molécules à visée
thérapeutique.
Cependant, les options thérapeutiques restent à ce jour limitées et il n’y a pas
de vaccin disponible. Le traitement actuel consiste en une bithérapie par interféron-α
pégylé et ribavirine. Ce traitement difficilement toléré permet l’élimination du virus
dans 50% des cas. Une meilleure connaissance des facteurs influençant le
traitement, des interactions virus-hôte, et du cycle réplicatif du virus sont nécessaires
afin de développer des thérapeutiques plus efficaces et mieux tolérées. Différentes
molécules sont en cours de développement et permettront probablement
d’augmenter le taux de succès thérapeutique des patients chroniquement infectés.
Six génotypes différents subdivisés en plus de 70 sous-types ont été décrits
pour le HCV. Cette variabilité est impliquée dans la réponse au traitement. Elle est
aussi l’un des principaux freins à la mise au point d’un vaccin. Dans ce contexte, il
est important de connaître les différentes souches circulantes, et d’identifier leurs
prévalences respectives. Pour cette raison, nous avons étudié dans un premier
temps la variabilité et l’épidémiologie des souches HCV de génotypes 2 et 4 qui
étaient mal connues. L’impact du sous-type viral du HCV sur la réponse n’a pas été
étudié et pourrait, comme le génotype, influencer la réponse au traitement. Les
paramètres pharmacologiques pourraient également être impliqués dans les
réponses au traitement très éclectiques observées dans les populations où
5
l’éradication virale est plus difficile. Nous avons donc dans un deuxième temps
évalué l’influence de ces facteurs sur la réponse virale au traitement. Enfin, la
description récente d’infections occultes à HCV chez des patients non virémiques
remet en question la notion d’éradication du HCV. Nous avons donc recherché ce
type d’infection chez des patients immunodéprimés anciennement infectés par le
HCV.
6
I- LE VIRUS DE L’HEPATITE C (HCV)
A- Du génome aux protéines virales
Ce petit virus enveloppé, de 55 à 65 nm de diamètre (Kaito, 1994; Shimizu,
1996), est classé dans le genre Hepacivirus au sein de la famille des Flaviviridae.
Cette famille rassemble les Flavivirus (virus de la fièvre jaune, de la dengue et de
l’encéphalite à tique), les Pestivirus animaux et les GB virus A, B et C classés dans
aucun genre. Le HCV est le seul représentant du genre Hepacivirus. Son génome à
ARN est composé d’une partie 5’ non codante (5’NC), comportant le site d’entrée
interne dans le ribosome (IRES : internal ribosomal entry site), d’un cadre de lecture
ouverte codant les protéines structurales et non structurales, et d’une partie 3’ non
codante (3’NC). L’enveloppe du virus est dérivée de la bicouche lipidique cellulaire
de l’hôte et contient les protéines d’enveloppe E1 et E2. La nucléocapside renferme
la protéine de capside et l’ARN génomique.
Le HCV circule sous diverses formes chez les personnes infectées. Il peut être
associé à des lipoprotéines de faible densité (LDL) et de très faible densité (VLDL),
circuler sous forme de virions liés à des immunoglobulines ou sous forme libre
(Hijikata, 1993; Kanto, 1994; Agnello, 1999). Ceci peut expliquer les différentes
densités de particules virales observées sur gradient de sucrose. L’infectiosité
maximale est observée pour une densité de 1,10 g/mL. Plus récemment, la
circulation du HCV sous forme de lipo-viro-particules (LVP) a été décrite avec des
densités variant de 1,06 à 1,55 g/mL selon la composition des LVP (Andre, 2002).
Ce sont des particules sphériques riches en triglycérides, Apo B ou Apo E contenant
la capside virale et l’ARN à l’intérieur, et les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 à
leur surface (Diaz, 2006).
Le génome du HCV est une molécule d’ARN simple brin positif de 9.6 kb, qui
après l’entrée du virion dans la cellule est reconnu comme un ARN messager et
traduit par la machinerie cellulaire de l’hôte pour former une polyprotéine précurseur
d’environ 3 000 acides aminés (AA) (Penin, 2004b). La polyprotéine subit l’action
d’enzymes cellulaires et virales au niveau de la membrane du réticulum
endoplasmique (RE) pour donner naissance à 10 protéines virales : (1) les protéines
structurales à savoir la protéine de capside ou protéine C, les protéines d’enveloppe
7
E1 et E2, p7 et (2) les protéines non structurales NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A et
NS5B (Figure 1) (Moradpour, 2007). Un système de numérotation de la séquence
nucléotidique et en AA a été proposé sur la base de la séquence du génome complet
de l’isolat H77 (numéro d’accession : AF0099606) (Kuiken, 2006).
La région 5’NC est très conservée au sein des différents génotypes. L’IRES
couvre une région d’environ 340 nucléotides (nt) qui comprend la majeure partie de
5’NC et 24 à 40 nt de la région codant la protéine C (Tsukiyama-Kohara, 1992;
Reynolds, 1995). L’IRES est indispensable à la transcription coiffe-indépendante de
l’ARN viral. La région 5’NC, dans les conditions physiologiques, prend une structure
tertiaire complexe constituée de 4 domaines. Les domaines II, III et IV sont
indispensables à l’activité IRES (Fraser, 2007). Le domaine III permet la liaison à la
sous-unité 40S du ribosome et à eIF2 (facteur d’initiation de la transcription
eucaryote). Le domaine IV contient le codon d’initiation. La relation structure-activité
de l’IRES est très étroite. Des mutations dans les domaines II ou IV ont peu d’impact
sur l’activité de l’IRES, en revanche, des mutations dans le domaine III telles que la
G266A ou la G268U peuvent diminuer son activité (Barria, 2009). La traduction de
l’ARN conduit à la synthèse de la polyprotéine virale. In vitro, il a été montré qu’un
microARN (miRNA) spécifiquement retrouvé dans le foie, le miR-122, avait la
capacité d’augmenter la réplication virale en se fixant sur l’IRES (Jopling, 2005). In
vivo, la quantité de miR-122 intrahépatique et la concentration d’ARN HCV
plasmatique n’étaient pas corrélées mais les patients non répondeurs à un traitement
anti-HCV avaient une plus faible abondance de miR-122 dans les cellules
hépatocytaires (Sarasin-Filipowicz, 2009).
8
Cadre de lecture : 9379-9431 nucléotides (≈ 3011 codons)
IRES
Région structurale
Région non structurale
3’NC
5’NC
Traduction
Polyprotéine
C
E1
E2
p7
NS2
NS3
NS4B
NS5A
NS5B
NS4A
Maturation post traductionnelle
1
192
C
384
E1
747
E2
p7
810
NS2
1027
1658 1712
NS3
NS4B
1973
2421
NS5A
3011
NS5B
NS4A
Encapsidation
du génome
Glycoprotéines
Canal
ionique
Cystéine
protéase
Sérine protéase
RNA hélicase
Arrangement Phosphoprotéine
complexe
membranaire
ARN polymérase
ARN dépendante
Site de clivage signal peptide peptidase
Cofacteur sérine
protéase
Site de clivage peptidase signal
Site de clivage NS2 protéase
Figure 1 : Organisation génomique du HCV
Site de clivage NS3-NS4A protéase
9
Les protéines virales du HCV ont été décrites dans plusieurs revues
(Moradpour, 2007; Murray, 2008) :
- La première protéine structurale codée par le génome du HCV est la
protéine de capside ou protéine C constituant la nucléocapside virale. La protéine
C mâture du HCV s’associe aux gouttelettes lipidiques et induit une accumulation
lipidique intracellulaire (Ait-Goughoulte, 2006 ; Boulant, 2006 ; Jhaveri, 2009). Elle
joue un rôle essentiel dans l’assemblage et la libération des virus infectieux et
intervient également au moment du désassemblage des particules virales lors de
l’entrée dans la cellule (Penin, 2004b; Miyanari, 2007; Shavinskaya, 2007).
- La protéine F (frameshift) ou ARF (alternative reading frame) ou core+1
Cette protéine a une durée de vie très courte, environ 10 min (Roussel, 2003). La
détection d’anticorps et de cellules T spécifiques de la protéine F chez des patients
infectés par le HCV suggère qu’elle est exprimée pendant l’infection HCV in vivo
(Gao, 2008). Elle n’est pas essentielle à la réplication virale ou à la production de
virus infectieux (Vassilaki, 2008) mais pourrait agir comme un facteur de régulation
(Branch, 2005).
- Les protéines d’enveloppe E1 et E2 sont les constituants principaux de
l’enveloppe. (Dubuisson, 2002). Elles participent à l’entrée cellulaire du HCV en se
fixant aux récepteurs cellulaires et en induisant la fusion de l’enveloppe virale avec
les membranes cellulaires de l’hôte (Op De Beeck, 2001). La protéine E2 est la cible
préférentielle de la réponse immunitaire. Trois régions hypervariables (HVR) ont été
identifiées dans la séquence E2: la région HVR1, à la partie N-terminale est
constituée de 27 AA, la région HVR2 constituée de 9 AA et plus récemment la région
HVR3, comprise entre les régions HVR1 et HVR2, constituée de 35 AA (Troesch,
2006). Cette dernière est moins variable que les 2 autres. D’un point de vue
conformationnel, la région HVR1 est très conservée ce qui est cohérent avec le rôle
qu’elle joue en tant que cible de la réponse immune et dans l’attachement du virus à
la cellule (Penin, 2001).
- La protéine P7 est issue d’un clivage incomplet à partir de la protéine E2.
Ces fonctions sont encore mal connues. Cette protéine s’oligomérise pour former un
canal ionique d’où son assimilation aux viroporines (Griffin, 2003; Clarke, 2006; Luik,
2009). Elle semble nécessaire à l’infection mais pas à la réplication de l’ARN. Elle est
essentielle à l’assemblage des particules virales et aussi à la libération des virions
(Steinmann, 2007).
10
- La NS2-3 protéase est une autoprotéase responsable du clivage entre les
protéines non structurales NS2 et NS3. C’est un facteur essentiel du cycle réplicatif
du HCV in vitro et in vivo (Pietschmann, 2006).
- Le complexe NS3-4 : NS3 est une protéine multifonctionnelle qui possède
une activité sérine protéase et hélicase/NTPase. Le polypeptide NS4A fonctionne
comme cofacteur de la sérine protéase. Le complexe sérine protéase NS3/4A permet
le clivage des protéines non structurales qui se trouvent en aval de NS3. NS3
intervient dans de nombreuses interactions hôte-pathogène et est une cible majeure
des nouveaux anti-viraux. L’hélicase NS3 participe à la séparation des ARN double
brin ou au déroulement des structures secondaires. Récemment, NS3 a été
impliquée dans les étapes précoces de la morphogénèse des virions. Elle intervient
dans le recrutement de NS5A aux gouttelettes lipidiques et la formation de particules
virales intracellulaire. Des mutations d’adaptation peuvent chez un virus qui a perdu
cette capacité restaurer cette propriété (Ma, 2008).
- La protéine NS4B est mal connue. Elle participe à l’association des
membranes mais également à l’altération des membranes intracytoplasmiques pour
former des complexes membranaires supportant la réplication virale appelés
« complexes de réplication ». Leur formation dépend de certains résidus situés sur la
partie C-terminale de la protéine NS4B (Aligo, 2009).
- La protéine NS5A : NS5A est une phosphoprotéine fixant les ARN (Brass,
2002; Penin, 2004a). Le domaine III a récemment été identifié comme élément clé
dans l’assemblage des particules virales (Appel, 2008). La délétion de ce domaine a
pour conséquence l’arrêt de la formation de virions infectieux et l’accumulation de
protéines C à la surface des gouttelettes lipidiques. Le domaine III de NS5A est une
des régions les plus variables du génome HCV. NS5A a aussi été impliquée dans la
régulation de la réponse interféron et interagirait avec de nombreuses voies de
signalisation cellulaire.
- La protéine NS5B est une ARN polymérase ARN dépendante (RdRp) qui
joue le rôle de catalyseur au sein de la machinerie de réplication du HCV. NS5B est
capable d’initier la synthèse d’ARN de novo in vitro et il semblerait que ce soit
également le cas in vivo (Bartenschlager, 2004). Les études de cristallographie
montre une structure pouce-paume-doigts commune à la plupart des polymérases
(Bressanelli, 1999). Cette protéine est une cible majeure des nouvelles molécules
anti-HCV.
11
B- Le cycle viral
Depuis la découverte du HCV, différents modèles d’études, infections
d’hépatocytes primaires à partir de particules virales HCV dérivées du sérum de
patients, glycoprotéines E2 recombinantes, particules HCV-like, pseudoparticules
rétrovirales HCV (HCVpp) ont été développés mais aucun ne permettait l’étude du
cycle complet du HCV et la production de particules HCV infectieuses de façon
efficace (Burlone, 2009). Les virus provenant de sérums de patients se répliquaient
très faiblement sur des cultures d’hépatocytes primaires in vitro. Récemment, la mise
au point d’un système de culture cellulaire du HCV sur lignée hépatocytaire Huh-7
(HCVcc) a permis d’accélérer l’étude et la compréhension des différentes étapes du
cycle de réplication virale du HCV et en particulier les étapes de l’entrée
(Lindenbach, 2005; Wakita, 2005).
Les cellules hépatocytaires sont le site principal de réplication virale du HCV
(Figure 2). L’identification des particules virales se fixant aux cellules hôtes et des
récepteurs d’entrée a été possible dans un premier temps grâce au modèle des
pseudoparticules HCV. Les virions HCV, libres ou associés à des apolipoprotéines,
interagissent en cascade avec de nombreux récepteurs présents à la surface des
hépatocytes.
La
première
interaction
virus-hépatocytes
fait
intervenir
des
glycosaminoglycans (GAGs) et des récepteurs des lipoprotéines (LDLR). Ensuite, le
récepteur cellulaire scavenger classe B site I (SR-BI) (Scarselli, 2002) formerait avec
le récepteur cellulaire CD81 (Pileri, 1998) un complexe permettant le transfert du
HCV au niveau des jonctions serrées. Ceci permet l’interaction du virus avec des
protéines de jonctions serrées : claudin-1 (CLDN1) (Evans, 2007) et occludines
(OCLN) (Liu, 2009). Ces dernières facilitent l’internalisation du HCV par endocytose
des récepteurs de surface liés aux particules HCV, via une voie clathrine
dépendante. Dans les endosomes, le faible pH déclenche la fusion de l’enveloppe
virale avec les membranes endosomales et la libération de l’ARN génomique dans le
cytoplasme. La transcription des brins d’ARN de polarité positive peut alors débuter
avec la synthèse d’un brin d’ARN complémentaire de polarité négative qui sert de
matrice pour la production des brins d’ARN de polarité positive.
La découverte des nouveaux systèmes de cultures cellulaires du HCV a
permis d’étudier les étapes tardives du cycle réplicatif telles que l’assemblage des
12
particules et la libération des virions. L’assemblage des particules virales à l’interface
du RE et des organelles de stockage des matières grasses appelées « gouttelettes
lipidiques » est déclenchée par l’association des protéines du core aux lipides
(Miyanari, 2007). La colocalisation du complexe de réplication avec les protéines
d’enveloppe du HCV facilite la production des virus infectieux. Ils sont ensuite libérés
dans la lumière du RE et relargués à l’extérieur de la cellule par la voie de sécrétion
des VLDL (Huang, 2007). Il a récemment été montré in vitro que le HCV pouvait être
transmis de cellules à cellules et que cela nécessitait la présence des récepteurs
cellulaires CD81 et CLDN1 (Timpe, 2008).
Figure 2 : Cycle réplicatif du HCV (adapté d’après Boonstra et al, 2009)
13
Les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 impliquées dans l’entrée cellulaire
s’assemblent pour former un hétérodimère. La glycoprotéine E2 joue un rôle majeur
dans l’interaction avec les récepteurs SR-BI et CD81. Trois régions (AA 480 à 493,
AA 528 à 535 et AA 544-551) sont impliquées dans l’interaction E2/CD81 (Flint,
1999; Clayton, 2002) et plus récemment, des résidus spécifiques et conservés au
sein des différents génotypes ont été décrits (W420, Y527, W529, G530 et D535)
(Owsianka, 2006). La région HVR1 de E2 participe à l’interaction E2/SR-BI (Scarselli,
2002). Cette région très variable, participe à l’échappement viral face à la réponse
immunitaire de l’hôte. Le rôle de la protéine E1 reste peu connu. Elle serait impliquée
dans le processus de fusion des membranes (Lavillette, 2007).
Les récepteurs et/ou co-récepteurs cellulaires principaux sont CD81, SR-BI,
Claudin-1 et les occludines :
- CD81 est une protéine membranaire de la famille des tétraspanines qui est
exprimée de manière ubiquitaire. Les études récemment publiées montrent qu’elle
interviendrait dans l’entrée du HCV après l’étape de fixation des particules virales à
la membrane cellulaire. En effet, les anticorps dirigés contre CD81 inhibent l’infection
HCV après l’étape d’attachement (Flint, 2006; Koutsoudakis, 2006). La susceptibilité
des cellules à l’infection par HCV est liée non seulement au niveau d’expression de
CD81 mais aussi à la proportion de CD81 à la surface cellulaire (Laguno, 2007).
EWI-2wint, un partenaire cellulaire de CD81 exprimé à la surface cellulaire, bloque
efficacement l’entrée du virus dans les cellules en inhibant l’interaction virus-CD81
(Rocha-Perugini, 2008). L’absence de cet inhibiteur naturel de CD81 sur les cellules
hépatocytaires pourrait expliquer l’entrée du virus dans les hépatocytes et
l’hépatotropisme du HCV. CD81 joue également un rôle essentiel dans l’infectiosité
en activant les Rho GTPases ce qui provoque le remodelage des filaments d’actine
et la relocalisation du complexe E2/CD81 au niveau des aires de contact cellulescellules où se trouvent CLDN1 et les occludines. CD81 active la cascade de
signalisation Raf/MEK/ERK, impliquée dans les étapes post-entrée du virus et
possiblement dans la réplication (Brazzoli, 2008). Le rôle de CD81 dans les
mécanismes de réplication du HCV vient d’être démontré (Zhang, 2010). Les cellules
qui expriment le plus le récepteur cellulaire CD81 sont celles qui ont la réplication
virale la plus efficace.
14
- SR-BI est une glycoprotéine exprimée principalement dans le foie et dans les
tissus synthétisant les stéroides. C’est le récepteur de nombreux ligands, notamment
des lipoprotéines (lipoprotéines de haute densité, de faible densité et de très faible
densité, respectivement HDL, LDL, VLDL) (Rhainds, 2004). SR-BI se lie au HCV par
la partie HVR1 de la glycoprotéine E2. Comme CD81, ce récepteur cellulaire
interviendrait après l’attachement du virus à la cellule (Zeisel, 2007). Le ligand
majeur de SR-BI, le HDL, faciliterait l’entrée cellulaire des HCVpp ou HCVcc, sans
interaction directe connue entre le HDL et les particules virales HCV (Voisset, 2005;
Dreux, 2006). Récemment, l’activité antivirale de l’interféron a été liée à une
diminution du niveau d’expression de SR-BI réduisant ainsi l’attachement et l’entrée
des virus dans les hépatocytes (Murao, 2008).
- CLDN-1 est une nouvelle protéine de la famille des claudines impliquée dans
l’entrée du HCV (Evans, 2007). Elle est exprimée dans tous les tissus épithéliaux
mais est prédominante dans le foie, formant les réseaux de jonctions serrées.
L’expression de ce récepteur dans des lignées non hépatocytaires les rend
susceptibles à l’infection par HCVpp. Ce récepteur interviendrait après les récepteurs
cellulaires SR-BI et CD81. Les premières étapes de fixation des particules virales
ciblent des récepteurs cellulaires qui activent des voies de signalisation cellulaires
permettant ainsi le transfert du virus au niveau des jonctions serrées. La distribution
de CLDN-1 au niveau des jonctions serrées est corrélée à la permissivité à l’infection
HCV. L’infection par HCV de lignées cellulaires hépatocytaires Huh-7 diminue
l’expression de CLDN-1, prévenant ainsi les sur-infections (Liu, 2009).
Les CLDN-6 et 9 pourraient également participer à l’entrée du HCV (Zheng,
2007). Elles sont exprimées dans le foie mais également sur les cellules
mononucléées du sang périphérique, qui est un site possible de réplication virale.
Ces 3 récepteurs, CLDN-1, CLDN-6 et CLDN-9 possèdent une région très
conservée, la boucle extracellulaire EL1, qui semble impliquée dans l’entrée du HCV
(Evans, 2007).
- les occludines ont été dernièrement impliquées dans l’entrée du HCV (Liu,
2009). Composant des jonctions serrées, elles sont proches des claudines d’un point
de vue tridimensionnel. Elles interagiraient avec la glycoprotéine E2. Les occludines
humaines rendent les cellules murines infectables par HCVpp (Ploss, 2009).
L’infection par HCV peut altérer la localisation et l’expression des protéines
CLDN-1 et occludines induisant une diminution des jonctions serrées au niveau des
15
hépatocytes infectés (Benedicto, 2008). Les jonctions serrées étant des éléments
essentiels au maintien de la polarité des hépatocytes et à leurs fonctions, altérer leur
expression peut donc aboutir à divers symptômes tels que les désordres
cholestatiques.
16
II- PHYSIOPATHOLOGIE DE L’INFECTION
A- Histoire naturelle chez les patients infectés par HCV seul
Lors d’une infection aiguë par le virus HCV, seul 20 à 30% des patients
présentent des signes cliniques, le plus souvent peu spécifiques (fatigue, nausées,
douleurs de l’hypocondre droit suivies ou non de l’apparition d’urines foncées et d’un
ictère). Le diagnostic d’infection HCV aiguë est confirmé par la détection d’ARN HCV
dans le plasma avec une séroconversion objectivée des anticorps anti-HCV (Figure
3A). En moyenne, environ 26% des patients élimineront spontanément le virus, le
plus souvent dans les 3 mois suivant les signes cliniques (Villano, 1999 ; Gerlach,
2003; Corey, 2006; Micallef, 2006; Santantonio, 2006). Les hépatites aigues C
fulminantes sont rares et observées chez moins de 1% des patients.
Environ 70% des personnes infectées vont évoluer vers une infection
chronique (présence d’ARN HCV détectable dans le sang plus de 6 mois) (Figure
3B). (i) Parmi ces patients, 7 à 53% ont une activité normale des alanines
aminotransférases (ALAT) (Mathurin, 1998; Persico, 2000; Alter 2005). Ceci serait
essentiellement lié à une faible réponse immunitaire de l’hôte vis-à-vis de l’infection
virale. Les lésions hépatiques, dans ce cas, sont le plus souvent modérées et
significativement moins importantes que chez les patients avec une activité des
ALAT élevée. Ces patients n’ont habituellement aucun symptôme, mais environ 90%
d’entre eux présentent des lésions d’hépatites chroniques sur biopsie hépatique
(Esteban, 1991; Marcellin, 1997). (ii) La forme d’infection chronique la plus fréquente,
appelée modérée ou sévère, se traduit par une activité des ALAT élevée. Elle est le
plus souvent asymptomatique mais peu s’accompagner d’une asthénie et dans
certains cas de manifestations extra-hépatiques telles qu’une cryoglobulinémie, une
néphropathie, une pathologie thyroïdienne…(Zignego, 2007). Cette forme d’hépatite
chronique progresse plus rapidement chez les patients de plus de 40 ans, les
hommes, et les patients consommants de l’alcool.
17
A/
- - - - + + + +
1000 - + + + + + + -
+ + + + +
- - - - -
+ Ac anti-HCV
- ARN VHC
ALAT (U/L)
800
600
Symptômes
400
200
0
0 2 4 6 8 10 12 24 1 2 3 4 5 6
Semaines
Années
Temps après exposition
B/
1000
- - - + +
+
+
+
+ +
+ +
+
+
+ + +
+ + +
+ +
+ +
+ Ac anti-HCV
+ ARN VHC
ALAT (U/L)
800
600
Symptômes
400
200
0
0
2
4 6 8 10 12 24 1
Semaines
2
3 4 5
Années
6
Temps après exposition
Figure 3 : Cinétique des marqueurs de l’infection HCV aiguë (A) et chronique (B).
18
Parmi les patients infectés chroniquement, 25 % vont développer une cirrhose
(Hoofnagle 1997). Les patients infectés avant 40 ans, développeront moins
fréquemment une cirrhose comparés à des patients infectés après 40 ans, 5%
versus 20% respectivement (Hoofnagle 1997; 2004). La cirrhose peut rester
silencieuse pendant de nombreuses années. Les signes d’hypertension portale ou
d’insuffisance hépatocellulaire apparaissent tardivement. Chez une proportion non
négligeable de patients, 2% environ, la pathologie va évoluer jusqu’au carcinome
hépatocellulaire (CHC) (Kew 1998). Le taux de décompensation chez les patients qui
présentent une cirrhose est estimé à 4% et le taux de mortalité annuel chez les
patients qui décompensent à 15% dans les pays industrialisés versus 30% dans les
pays émergents.
La ponction biopsie hépatique (PBH) permet d’évaluer la gravité de l’atteinte
hépatique en déterminant le score METAVIR, associant un score de fibrose (F0 à F4)
et un score d’activité (A0 à A3). C’est le plus souvent lors de cet examen que le
stade de cirrhose est découvert. D’autres méthodes non invasives de mesure de la
fibrose sont disponibles telles que le FibroTest® (combinaison de cinq marqueurs
sanguins : alpha2-macroglobuline, haptoglobine, apolipoprotéine A1, bilirubine totale
et gamma-glutamyltranspeptidase, avec un ajustement sur le sexe et l’âge) (ImbertBismut, 2001), le Fibromètre® (combinaison de neuf marqueurs sanguins : alpha2macroglobuline, acide hyaluronique, numération plaquettaire, taux de prothrombine,
aspartate aminotransférase, alanine aminotranférase, urée, bilirubine totale et
gammaglutamyltranspeptidase, avec un ajustement sur l’âge et le sexe), le
FibroScan® (élastographie impulsionnelle ultrasonore) (Ziol, 2005) et l’Hépascore®
(combinaison
de
quatre
marqueurs
sanguins:
alpha2-macroglobuline,
acide
hyaluronique, bilirubine totale et gammaglutamyl transpeptidase, avec un ajustement
sur le sexe et l’âge). La PBH reste cependant la méthode de référence pour évaluer
le degré de fibrose et donc la progression de la maladie (Ghany, 2003).
Différents facteurs peuvent affecter l’histoire naturelle de l’infection HCV. Les
patients qui ont des valeurs normales d’ALAT évolueraient moins rapidement. La
stéatose hépatique, plus que l’obésité, semble être un facteur de progression vers la
fibrose. Cependant une étude interventionnelle suggère que la perte de poids
permettrait de ralentir la progression de la fibrose (Adinolfi, 2001; Hickman, 2002). La
résistance à l’insuline pourrait également influencer la progression de la fibrose
19
(Moucari, 2008). La coinfection par le virus de l’hépatite B (HBV) augmenterait le
risque de développer un CHC par rapport à des patients infectés seulement par l’un
des deux virus (Dore, 2002). Enfin, la prise de plus de 50 g d’alcool par jour accélère
la progression vers la cirrhose d’un facteur 3 (Wiley, 1998). La charge virale et le
génotype ne semblent pas influencer de façon significative la progression de la
fibrose (Sullivan, 2007).
Le traitement par antiviraux modifie également l’histoire naturelle de l’infection
HCV. Globalement, la proportion de patients virémiques qui initient un traitement
anti-HCV est faible, y compris dans les pays industrialisés. La réponse virologique
soutenue (RVS) est associée à une amélioration histologique des lésions hépatiques
et de la fibrose (Maylin, 2008; McHutchison, 2008) mais l’impact sur la survie est
encore mal connu.
B- HCV et coinfection par HIV
En France, 100 000 à 130 000 patients sont infectés par HIV. Environ 7 000
nouveaux cas sont diagnostiqués chaque année. En Europe et aux Etats-Unis, plus
de 30% des patients HIV+ sont coinfectés par le HCV (Sherman, 2002; Rockstroh,
2005). L’infection HCV est devenue l’une des causes majeures de morbi-mortalité
chez ces patients. En effet, depuis l’avènement des traitements antirétroviraux
hautement actifs en 1996, la survie des patients HIV s’est considérablement
améliorée mais des pathologies hépatiques terminales telles que la cirrhose, le CHC
ou la décompensation hépatique sont apparues (Bica, 2001; Pineda, 2007).
Lors d’une infection aiguë, les patients infectés par HIV éliminent moins
fréquemment le virus HCV (Thomas, 2000) et les charges virales HCV observées
sont plus élevées que chez des patients infectés par HCV seul. L’étude de sérums
prélevés chez des patients hémophiles avant et après la séroconversion HIV a
montré que les charges virales du HCV augmentaient de façon significative après
l’infection par HIV (Eyster, 1994). L’augmentation de la charge virale est plus
marquée chez les patients présentant des taux de lymphocytes T CD4+ bas. Ceci
pourrait être la conséquence d’un contrôle de la réplication moins efficace, en raison
de l’immunodépression causée par le HIV. Différentes études sur l’histoire naturelle
du HCV ont montré que la coinfection par le HIV accélérait la progression vers la
fibrose (Benhamou, 1999; Di Martino, 2001; Mohsen, 2003). Le risque de développer
20
une cirrhose chez les patients qui ont des taux de lymphocytes T CD4+ bas est
multiplié par 2 (Sanchez-Quijano, 1995; Di Martino, 2001). Une méta-analyse
réalisée sur 3 567 individus coinfectés par HIV et HCV a montré que la fibrose
hépatique augmentait d’environ 0,12 unité/an (Thein, 2008). La probabilité de
développer une cirrhose dans cette étude est de 21% après 20 ans d’infection et de
49% après 30 ans. Le risque estimé de cirrhose est globalement 2 fois plus élevé
chez les patients coinfectés HCV-HIV que chez les patients infectés par HCV seul :
RR=2,5 dans le groupe de patients non traités par antirétroviraux, RR=1,7 dans le
groupe de patients sous traitement antirétroviral. Le traitement antirétroviral peut
avoir un double effet : soit induire une progression plus lente de la fibrose grâce à la
reconstitution immunitaire sous traitement efficace (Sulkowski, 2000; Thomas 2002),
soit induire une toxicité hépatique ce qui peut augmenter le processus de
fibrogénèse (Sulkowski, 2002; Weber, 2006). Le mécanisme sous-jacent de cette
progression
accélérée
de
la
fibrose
pourrait
être
expliqué
en
partie
à
l’immunosuppression (Martinez-Sierra, 2003; Mohsen, 2003; Martin-Carbonero,
2004).
C- Infection par HCV chez les patients hémodialysés et transplantés rénaux
La prévalence de l’infection par HCV chez les patients hémodialysés (HD) est
très variable d’un pays à l’autre (4-71%) (Wreghitt 1999; Rahnavardi, 2008). Ces
dernières années, la prévalence a diminué grâce aux mesures de prévention mises
en œuvres (utilisation de gants, matériel à usage unique, mesures d’isolement en
hémodialyse) (Laporte, 2009). En France, la prévalence de l’infection par HCV en
hémodialyse serait actuellement de 7,7 %.
i. Histoire naturelle de l’infection par HCV chez les patients HD
L’histoire naturelle de l’infection HCV chez des patients HD est difficile à
évaluer. La date de contamination est rarement connue et l’infection peut évoluer
silencieusement pendant des dizaines d’années. Chez des patients HD et
virémiques, l’activité sérique des ALAT seule ne permet pas de prédire l’évolution
vers la fibrose. En effet, les patients peuvent développer des lésions hépatiques
malgré une activité sérique des ALAT normale (Furusyo, 2000; Martin, 2000). La
21
gravité de la maladie hépatique avant transplantation serait un facteur de l’évolution
de la pathologie rénale terminale post-transplantation (Mathurin, 1999). Dans ces
conditions, l’évaluation de l’atteinte hépatique est fortement recommandée avant
transplantation rénale. La fréquence de fibrose hépatique ou de cirrhose est de 5 à
32% selon les séries étudiées (Meyers, 2003). Chez ces patients, l’infection par HCV
est plutôt bénigne à modérée, et habituellement plus bénigne que chez des patients
non HD (Rampino, 1999; Cotler, 2002; Luzar, 2003). Les lésions hépatiques moins
fréquentes chez ces patients peuvent être expliquées par un statut immunitaire
altéré, une charge virale plus faible probablement due aux dialyses successives et à
la rétention des particules virales à la surface des membranes de dialyse (Fabrizi,
1998), à une libération prolongée de facteur de croissance hépatocytaire impliqué
dans la régénération du foie (Rampino, 1999), et à la production endogène
d’interféron-α suite à l’utilisation de membranes cellulosiques ou synthétiques, qui
peut réduire la virémie HCV (Badalamenti, 2003).
Plusieurs études ont cherché à évaluer la survie des patients HD infectés par
le HCV. Une étude prospective multicentrique a été réalisée au Japon chez 1470
patients HD, dont 276 étaient anticorps (Ac) anti-HCV positif (+) (Nakayama, 2000).
Après un suivi de 6 ans, la mortalité était significativement plus élevée chez des
patients anti-HCV positifs que chez les patients Ac anti-HCV (-) (23 versus 33%).
CHC (5 versus 0 %) et cirrhose (8,8 versus 0,4%) étaient des causes de décès
significativement plus fréquentes chez les patients Ac anti-HCV (+). L’étude DOPPS
(Dialysis outcomes and practice patterns study) réalisées sur 16 720 patients HD
recrutés aux Etats-Unis, en Europe et au Japon a rapporté un risque relatif de 1,17
(statistiquement significatif) associant séropositivité anti-HCV et mortalité (Goodkin,
2003). Une méta-analyse (Fabrizi, 2004) rassemblant 3 études prospectives et une
rétrospective a également conclu que la présence d’Ac anti-HCV était un facteur de
risque indépendant et significatif de mortalité chez les patients HD. Le risque relatif
déterminé dans cette étude était de 1,57. Donc, l’augmentation du risque de mortalité
chez les patients HD Ac anti-HCV (+) pourrait être partiellement liée à la pathologie
hépatique sous-jacente.
22
ii. Infection par HCV après transplantation rénale
L’infection par HCV après transplantation rénale (TR) évolue généralement de
façon bénigne, bien que des anomalies biochimiques et histologiques puissent
apparaître sur le long terme (Vosnides 1997; Morales, 1998). Entre 20 et 51% des
patients TR Ac anti-HCV (+) peuvent avoir une activité sérique des transaminases
normale, mais cela ne signifie pas une histologie normale. Seulement 10% des
patients TR Ac anti-HCV (+) et ARN HCV (+) ont une activité normale des
transaminases et une histologie normale (Haem, 1996).
Le risque de développer une pathologie hépatique après TR dépend de
plusieurs paramètres : la durée et la sévérité de l’infection HCV avant la TR,
l’histologie du foie, la coinfection par le HBV, la durée après la TR et le type de
traitement immunosuppresseur reçu (Pereira, 1997; Morales, 2000). Une métaanalyse récente a montré que le risque de mortalité lié à une cirrhose ou un CHC
était augmenté (RR de 1,79) chez des patients TR infectés par HCV par rapport à
des patients non infectés (Fabrizi, 2005).
Des biopsies hépatiques réalisées chez des patients qui avaient une élévation
chronique de l’activité sérique des ALAT ont mis en évidence une hépatite chronique
active ou une cirrhose dans 20% des cas (Vosnides 1997). La prévalence est plus
faible lorsque les biopsies sont réalisées chez tous les patients, quelque soit l’activité
sérique des ALAT. Par exemple, sur des biopsies réalisées tôt après la TR, une
hépatite chronique est présente dans 80% des cas mais le taux de cirrhose est
faible, 7% (Glicklich, 1999). Peu de données sont actuellement disponibles dans la
littérature sur l’évolution histologique de l’infection HCV après TR. Une première
étude de 36 patients TR ARN HCV (+) a classé les patients en fibroseurs et non
fibroseurs en fonction de l’évolution de la fibrose évaluée sur 2 biopsies (réalisées 45
et 81 mois après transplantation): 36% des patients ont évolué vers la fibrose (Izopet,
2000). L’évolution vers la fibrose était associée à une diversification des quasiespèces de la région HVR-1 plus lente. Une autre étude réalisée chez 51 patients TR
ARN HCV (+) suivis 6 années après la TR a permis la réalisation de biopsies
séquentielles (Kamar, 2005). Trois profils histologiques différents ont été décrits : le
degré de fibrose est resté stable chez 20 patients, il a augmenté chez 21 patients et
s’est amélioré chez 10 patients. Les facteurs associés de façon indépendante à la
régression de la fibrose étaient le niveau initial de fibrose et la grande diversification
23
des quasi-espèces virales étudiées par analyse clonale de la région HVR1. Donc
chez plus de 50% des patients TR, il n’y aurait pas d’évolution vers la fibrose.
La comparaison de l’évolution histologique de la pathologie hépatique chez
des patients HCV TR et des patients immunocompétents, montre des résultats
contradictoires. Certains décrivent une progression plus rapide de l’activité et de la
fibrose du foie chez les patients TR que chez les patients non immunodéprimés
(Zylberberg, 2002). D’autres ont rapporté une progression lente de la fibrose
hépatique chez des patients infectés par le HCV et TR par rapport à des patients
avec une fonction rénale normale (Alric, 2002). Ces différences pourraient être dues
à des protocoles d’immunosuppression post-transplantation différents.
Sur la base des connaissances actuelles, les patients infectés par HCV ont
donc un risque accru de progression de la pathologie hépatique après TR (Kidney
Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) 2008). Cependant, des études
complémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre l’histoire naturelle de
l’infection HCV chez les patients TR.
D- Tropisme hépatique et cibles extra-hépatiques
Le tropisme du HCV est principalement hépatocytaire. Le foie est le site
majeur de la réplication du HCV et contient une forte abondance d’ARN HCV
(environ 108-1011 copies par gramme de tissu) (Sugano, 1995). Chez des
chimpanzés inoculés avec un fort titre de virus HCV par voie parentérale, l’ARN HCV
est détecté dans la plupart des hépatocytes 2 jours après la contamination et sa
détection dans les hépatocytes est contemporaine de l’apparition du HCV dans le
sérum (Negro, 1992). Les études réalisées chez l’homme, par hybridation in situ
montre la présence d’ARN HCV dans 5 à 50% des hépatocytes (Pal, 2006). La
proportion d’hépatocytes présentant un brin d’ARN HCV de polarité négative
détectable semble corrélée au niveau d’élévation de l’activité des transaminases et
aux changements histologiques, plus que la simple présence d’ARN HCV. La
présence de ces brins d’ARN HCV de polarité négative est en faveur d’une
réplication du virus. L’extension des lésions hépatiques pourrait donc être lié au
nombre de cellules infectées productives, cependant ces résultats ne permettent pas
de savoir si les lésions sont causées par la réplication virale elle-même ou par la
réponse immunitaire de l’hôte contre le virus.
24
D’autres sites de réplication extra-hépatiques ont été décrits notamment au
niveau des cellules mononucléées du sang périphérique (CMSPs) (Muller, 1993;
Lerat, 1996; Lerat, 1998; Navas, 1998; Laskus, 2000; Blackard, 2005), des cellules
du système nerveux central (Morsica, 1997; Forton, 2004 ) et d’autres tissus tels que
le pancréas, la thyroïde et la rate (Laskus, 1998), ou encore le plasma séminal
(Pasquier, 2000 ; Bourlet, 2002). La présence d’ARN HCV a été mise en évidence
dans les lymphocytes et les cellules dendritiques ainsi qu’une possible réplication
virale par la présence d’ARN HCV de polarité négative (Laskus, 2000; Goutagny,
2003). Une compartimentation du HCV, dans les cellules lymphocytaires B et les
cellules dendritiques a été décrite (Ducoulombier, 2004). Les séquences HVR1
observées dans ces cellules étaient différentes de celles observées dans le plasma.
Une étude réalisée sur 109 patients a montré qu’une proportion non négligeable de
patients infectés par HCV avaient des variants très divergents dans les CMSPs, qui
n’étaient pas détectable dans le plasma et auraient été acquis lors de coinfections ou
de surinfections (Roque-Afonso, 2005). En effet, chez 9 patients les séquences
virales présentes dans les CMSPs étaient suffisamment différentes de celles du
plasma pour être assignées à un autre génotype. Le génotype 1 serait plus
fréquemment retrouvé dans les CMSPs que les génotypes 2 ou 3 (Di Liberto, 2006).
Ceci suggère que le génotype 1 pourrait être le mieux adapté aux CMSPs, comme
évoqué dans une précédente étude (Lerat, 1998). La compartimentation du HCV,
définie par analyse de la séquence IRES, pourrait influencer la réponse au traitement
(Di Liberto, 2006). Certains patients développent des réponses cellulaires T
spécifiques contre un virus de génotype différent de celui présent dans le plasma
(Sugimoto, 2005). Cette réponse immunitaire pourrait contribuer à la dynamique
virale observée dans ce contexte : les patients qui ont une compartimentation du
virus dans les CMSPs pourraient être ceux qui développent une plus forte réponse
immunitaire facilitant ainsi l’élimination du virus.
25
III- VARIABILITE GENETIQUE DU HCV
Le HCV présente une grande diversité génétique. Cette diversité résulte de
l’absence d’activité exonucléasique 5’-3’ (manque d’activité correctrice) de l’ARN
polymérase ARN dépendante (induisant des substitutions de nucléotides), mais
également du niveau élevé de réplication (1012 nouveaux virions HCV par jour)
(Neumann, 1998). La fréquence moyenne de mutation nucléotidique par site et par
an varie de 1.4x103 à 1.9x103 (Ogata, 1991). La majorité des mutations accumulées
pendant la réplication sont silencieuses ou synonymes et n’ont pas d’impact sur la
séquence en AA de la protéine virale. Les mutations non-synonymes en revanche
provoquent un changement de la séquence en AA de la protéine virale et peuvent
induire l’émergence de polymorphismes. Certaines mutations peuvent être à l’origine
de particules virales défectives ou être létales.
Le polymorphisme génétique varie d’un gène à l’autre. Des régions plus ou
moins polymorphes ont également été identifiées au sein d’un même gène (Salemi,
2002). Les protéines impliquées dans la transcription ou la réplication et les régions
qui ont des contraintes conformationelles sont les plus conservées. La région 5’NC
est l’une des régions les plus conservées du génome avec plus de 90%
d’homologies entre les séquences de différentes souches (Bukh, 1992). La région
codant la capside est également très conservée avec 81 à 88% d’homologie de
séquence entre isolats (Simmonds, 1994). La région la plus variable du génome est
celle codant pour les protéines d’enveloppe E1 et E2. Les séquences codant les
régions hypervariables HVR1, HVR2 et HVR3 de la glycoprotéine E2 peuvent varier
de 50% d’une souche à l’autre (Smith 1999; Troesch, 2006)
A- Variabilité inter-individus : les génotypes et sous-types du HCV
La classification du HCV a été réalisée par des approches de phylogénie et a
permis de classer les variants en 6 génotypes qui peuvent être subdivisés en
différents sous-types correspondant à des sous-groupes de virus plus proche au sein
d’un génotype (Figure 4) (Robertson, 1998). Un système de nomenclature
consensuel a été proposé pour la classification des génotypes et sous-types du HCV
(Simmonds, 2005). La méthode de choix pour assigner un génotype à un virus HCV
26
est l’analyse phylogénétique de la région core/E1, NS5B ou du génome complet. La
désignation d’un nouveau génotype nécessite une analyse phylogénétique de la
séquence complète du nouveau variant du HCV, montrant qu’il appartient à un
groupe distinct des autres et montrant l’absence de recombinaison. La désignation
d’un génotype sera confirmée si au moins 2 génomes complets d’infection HCV liées
épidémiologiquement sont séquencés. La désignation d’un sous-type nécessite
l’identification d’au moins 3 infections avec la détermination des séquences des
régions Core/E1 et NS5B.
Les génotypes diffèrent les uns des autres par une variabilité de séquence
nucléotidique de 31-33%, et les sous-types par une variabilité de 20-25% sur
l’ensemble du génome. Malgré la diversité de séquence du HCV, tous les génotypes
partagent la même organisation génomique linéaire, avec des gènes de taille
similaire ou identique au niveau du cadre de lecture ouverte. Ceci a permis pour
beaucoup de variants actuellement connus d’être classés provisoirement, sur la base
de l’analyse de régions partielles du génome telles que core/E1 ou NS5B (Figure 5)
(Simmonds, 1994).
La détermination du génotype est primordiale puisque les génotypes 1 et 4
sont plus résistants que les génotypes 2 ou 3 au traitement par interféron α pégylé et
ribavirine et que la durée du traitement est adaptée au génotype. Les tests de
génotypage sont basés sur l’analyse d’une portion de génome amplifié. Le plus
souvent c’est la région 5’NC, ciblée par la plupart des tests de détection ou
quantification de l’ARN HCV, qui est utilisée pour déterminer le génotype. Bien que
cette région soit hautement conservée, un certain nombre de polymorphismes
permettent de déterminer le génotype. La technique de référence pour le génotypage
HCV est néanmoins basée sur une amplification suivie du séquençage et de
l’analyse phylogénétique de régions codantes. La région NS5B a l’intérêt d’être
représentative du génome complet. En effet, la topologie des arbres réalisés avec
des séquences de génomes complets ou de la région NS5B sont identiques (Hraber,
2006). Cependant, compte tenu des contraintes techniques et du coût d’une telle
approche, des techniques alternatives ont été développées. Les différentes
méthodes utilisées pour déterminer le génotype viral sont : le typage sérologique
(mise en évidence d’anticorps spécifiques d’un génotype dirigé contre certaines
protéines virales) et le typage génomique (caractérisation du polymorphisme d’un
fragment du génome viral par une approche moléculaire).
27
Les tests de typage sérologique permettent de différencier les 6 génotypes
mais ne permettent pas de discriminer les sous-types. C’est un test ELISA basé sur
la détection d’anticorps dirigés contre la protéine NS4A et/ou core du HCV. Il est
notamment utilisé pour déterminer le génotype de patients qui ne sont plus
virémiques.
Figure 4 : Arbre phylogénétique des souches virales HCV construit à partir de
génomes complets du HCV disponibles en 2010.
28
1a
1b
1c
1d
1e
1f
1g
1h
1i
1j
1k
1l
1m
2a
2b
2c
2d
2e
2f
2g
2h
2i
2j
2k
2l
2m
2n
2o
2p
2q
2r
3a
3b
3c
3d
3e
3f
3g
3h
3b
3i
3k
4a
4b
4c
4d
4e
4f
4g
4h
4k
4l
4m
4n
4o
4p
4q
4r
4s
4t
5a
6a
6b
6c
6d
6e
6f
6g
6h
6i
6j
6k
6l
6m
6n
6o
6p
6q
6r
6s
6t
6u
6w
Core/E1/E2/P7/NS2/NS3/NS4a/NS4b/NS5a/NS5b
Figure 5 : Liste des génotypes et sous-types confirmés ou provisoires, et région(s)
séquencée(s). (Source : HCV Sequence Database, http://hcv.lanl.gov/content/index).
29
Le typage génomique est la méthode la plus courante pour déterminer le
génotype. Les techniques utilisées ne sont pas toutes équivalentes, certaines
notamment sont plus discriminantes que d’autres pour déterminer les sous-types
(Tableau 1). Les plus utilisées actuellement sont :
- la technique d’hybridation inverse ou LiPA (line Probe Assay) qui s’appuie
sur l’analyse du polymorphisme de la région 5’NC dans la première version et sur
l’analyse des régions 5’NC et core dans la version 2 (Verbeeck, 2008).
- le séquençage direct suivi d’une analyse phylogénétique : plusieurs
régions du génome viral ont été étudiées en vue de caractériser les souches du
HCV. Les séquences obtenues sont comparées à des séquences de référence
répertoriées dans des banques de données telles que Los Alamos HCV (Kuiken,
2005), euHCV database (Combet, 2007) ou GenBank. La construction d’arbres
phylogénétiques incluant les séquences de référence permet de déterminer le
génotype voire même le sous-type, selon les régions amplifiées. La région 5’NC est
extrêmement conservée et ne permet pas de discriminer tous les sous-types.
L’analyse d’un fragment de la région NS5B semble être la meilleure approche pour
déterminer à la fois le génotype et le sous-type de façon pertinente (Sandres-Saune,
2003; Murphy, 2007). Il existe aussi une technique de séquençage semi-automatisé
basée sur l’amplification et le séquençage de 222 bp de la région 5’NC. La séquence
obtenue est ensuite automatiquement comparée à des séquences de références
(Halfon, 2001). Plus récemment, une méthode de séquençage d’un fragment de la
région core avec interprétation automatique du génotype et du sous-type a été
développée permettant la détermination du sous-type dans 96% des cas (Ross,
2008b).
- les techniques de PCR en temps réel utilisant des sondes spécifiques de
génotype ou de sous-type ciblant soit la région 5’NC soit la région NS5B (Martro,
2008 ; Nakatani, 2010). L’analyse est limitée aux génotypes 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3, 4,
5 et 6.
- les techniques sur puces à ADN basées sur l’analyse la région 5’NC (Park,
2009; Mao, 2010). Elles permettent de discriminer les sous-types 1a, 1b et d’identifier
les différents génotypes.
30
Tableau 1 : Comparaison des performances des méthodes de génotypage.
Test
Région HCV
Identification Génotypes
Identification Sous-types
LiPA
5’NC (v1)
1-6 (problème d’identification des 6)
Peu discriminant (notamment pour 1, 2, 4 et 6)
5’NC+core (v2)
1-6 (meilleure discrimination des 6)
Discrimine 1a/1b (peu discriminant pour 2 et 4)
NS5B ou core/E1
1-6
Bonne discrimination des sous-types
5’NC
1-6 (problème d’identification des 6)
Peu discriminant (notamment pour 1, 2, 4 et 6)
PCR temps réel
5’NC et/ou NS5B
1-6
Peu discriminant (1a, 1b, 2a, 2b, 2c uniquement)
Puce ADN
5’NC
1-6
Peu discriminant (1a, 1b discriminés)
Séquençage
31
B- Variabilité intra-individus : les quasi-espèces
Le HCV, comme de nombreux virus à ARN, circule chez l’hôte sous forme
d’une quasi-espèce virale, c’est-à-dire d’un mélange complexe et en équilibre
instable de variants génétiquement distincts mais apparentés (Martell, 1992;
Domingo, 2007). En effet, la présence simultanée de variants viraux permet la
sélection rapide et continue des variants les mieux adaptés à l’environnement dans
lequel le virus se réplique. La capacité d’adaptation des quasi-espèces virales aux
modifications de l’environnement joue un rôle important dans la physiopathologie de
l’infection, aussi bien dans les mécanismes de persistance virale que dans la
résistance
aux
traitements
antiviraux
ou
la
récidive
de
l’infection
après
transplantation hépatique.
A un instant donné de l’infection, la quasi-espèce virale d’un patient infecté est
en équilibre. Cependant, les quasi-espèces évoluent en permanence pour s’adapter
à l’environnement au sein duquel le virus se réplique et ce, sous l’influence de
pressions sélectives telles que la réponse immunitaire, les protéines cellulaires de
l’hôte ou le traitement anti-viral. L‘évolution virale se fait en 2 étapes :
- La première est l’introduction continue de mutations dans le génome viral
due au manque d’activité correctrice de la RdRp induisant des erreurs réplicatives.
- La seconde étape est la sélection au cours de laquelle les génomes mutés
sont sélectionnés par pression de sélection naturelle ou imposée.
L’accumulation des mutations au cours de la réplication est répartie sur toute
la longueur du génome. Certaines régions du génome subissent de plus fortes
pressions de sélection. C’est le cas de la région HVR-1 de la glycoprotéine E2, cible
des Ac anti-HCV. La forte pression de sélection immunitaire sur cette région est
responsable de sa variabilité au cours de l’infection chronique et sous traitement
antiviral (Chambers, 2005). Cependant, son rôle dans l’attachement aux récepteurs
cellulaires d’entrée impose également la conservation de la conformation
tridimensionnelle et de certains résidus basiques (Penin, 2001; Callens, 2005).
32
C- Les virus recombinants
La recombinaison génétique constitue un phénomène rarement observé pour
le HCV. La mise en évidence de génomes recombinants du HCV est assez difficile
car il nécessite le séquençage de 2 régions différentes. Or les méthodes de
génotypage sont basées sur l’analyse d’une seule région du génome HCV. Un
génome recombinant est confirmé grâce au séquençage du génome complet et à
des analyses clonales qui permettent d’éliminer la présence éventuelle d’une
infection mixte. Différents travaux ont montré l’existence de souches recombinantes.
Le premier virus recombinant décrit a été une souche 2k/1b découverte en Russie
(Kalinina, 2002). Les autres virus recombinants caractérisés ont été une souche
2i/6p au Vietnam (Noppornpanth, 2006), une souche 2b/1b aux Philippines
(Kageyama, 2006), une souche 2/5 chez un patient de la région Midi-Pyrénées
(Legrand-Abravanel, 2007) et dernièrement une souche 2b/6w (Lee, 2010). Chez
des chimpanzés inoculés simultanément avec des sous-types 1a, 1b, 2a, et 3a, des
recombinaisons entre les différents génomes ont été observées après analyse
clonale (Gao, 2007). Des infections mixtes étant possibles chez l’homme, des
phénomènes de recombinaison peuvent donc être envisagés. La souche 2k/1b
semble avoir diffusé en Europe chez les patients toxicomanes (Moreau, 2006), en
Russie et en Ouzbékistan (Kurbanov, 2008a). La sensibilité de cette souche à un
traitement par interféron α pégylé et ribavirine a été étudiée chez des souris
humanisées avec des hépatocytes humains et infectées par une souche 2k/1b. Cette
souche présentait une bonne sensibilité au traitement (Kurbanov, 2008b). C’est
actuellement la seule étude ayant évalué la sensibilité d’un virus recombinant HCV à
un traitement par interféron.
Les recombinants décrits sont le plus souvent intergénotypiques cependant
quelques virus intragénotypiques ont été identifiés : un 1a/1b chez un patient
péruvien (Colina, 2004) et un 1a/1c en analysant 89 génomes complets disponibles
dans la banque de données Genbank (Cristina, 2006). Plus récemment, un virus
mosaïque 1a/1c (AY651061) a été décrit (Ross, 2008a). Ce virus a une organisation
génomique complexe avec 5 points de cassure potentiels de la région core à NS3.
Des « échanges » de morceaux de génome entre virus sont donc possibles.
Une localisation préférentielle des points de recombinaison au niveau NS2NS3 semble exister in vivo et in vitro (Lindenbach, 2005; Pietschmann, 2006 ; Yi,
33
2007). Des chimères HCV construites avec un point de cassure à la jonction p7-NS2
ne produisaient pas de particules infectieuses dans le surnageant de culture
cellulaire, malgré la réplication du génome (Yi, 2007). Le point de recombinaison des
souches 2i/6p, 2b/1b, 2/5 et 2b/6w est localisé à la jonction de NS2 et NS3. Le point
de recombinaison de la souche 2k/1b est situé au niveau de NS2. Pour les
recombinants intragénotypiques, le point de cassure semble préférentiellement
localisé au niveau des gènes E1-E2. Deux mécanismes de recombinaison ont été
décrits pour les virus à ARN : (i) un mécanisme de choix de copie correspondant à
un changement de matrice lors de la réplication, dépendant de la processivité de
l’enzyme et (ii) un mécanisme de recombinaison non réplicatif qui implique la ligation
simple de 2 fragments d’ARN. Pour le premier mécanisme, plusieurs facteurs
peuvent expliquer l’arrêt et le décrochage de la polymérase lors de l’élongation : un
défaut de continuité de la matrice, la présence de séquences spécifiques ou de
motifs structuraux, une erreur d’incorporation d’un nucléotide ou une interaction du
génome avec une protéine qui ne participe pas à la réplication (Figlerowicz, 2003).
D- Implications cliniques et épidémiologiques de la variabilité génétique
i. Au niveau des génotypes et des sous-types
 Distribution géographique
Les génotypes et sous-types ont une distribution géographique mondiale
variable (Figure 6) (Zein 2000). Les génotypes 1a, 1b, 2 et 3 sont répartis dans le
monde entier.
Les études épidémiologiques et d’évolution moléculaire ont montré que la
dissémination des génotypes et sous-types coïncidait avec des pratiques défaillantes
en
matière
d’administration
parentérale
(Frank,
2000;
Tanaka,
2004).
La
dissémination dans le monde, au 20ème siècle, a débuté avec l’administration de
produits sanguins infectés, l’injection intraveineuse de drogues et la pratique de
gestes invasifs contaminants (Pybus, 2001; Mizokami, 2006). Au début des années
90, les génotypes 1, 2 et 3 étaient les plus représentés chez les donneurs de sang et
les patients infectés en Europe (McOmish, 1994). En France, les génotypes 1b et 2
sont retrouvés plus fréquemment chez des patients transfusés et ont plus de 50 ans
34
alors que les génotypes 1a ou 3a sont généralement retrouvés chez des patients qui
ont une histoire de toxicomanie intraveineuse et ont moins de 50 ans (MartinotPeignoux, 1999). Le génotype HCV majoritaire est le 1, puis le génotype 3a, puis le
génotype 2. Parmi les patients infectés par un génotype 1, 26-30% sont infectés par
un sous-type 1b et 19-33% par un sous-type 1a (Tamalet, 2003; Payan, 2005 ). A
eux deux, ils représentent près de 60% des infections en Europe de l’Ouest et
infectent la majorité des patients atteints d’infection HCV aux Etats-Unis. En France,
la répartition des génotypes peut varier d’une région à l’autre. La région Auvergne
concentre un nombre important de patients infectés par un génotype 5 (Henquell,
2004; Verbeeck, 2006 ). Les génotypes 2 ou 4 semblent plus fréquemment retrouvés
dans les régions du sud ou la région parisienne, régions sujettes à une plus large
immigration. Le génotype 6 est très peu représenté.
1b, 1a, 2, 3
1b, 1a, 3, 2, 4
1a, 1b, 2, 3
4
3, 6, 1a, 1b
1, 2, 4
4, 1b, 1a
1a, 3, 1b, 2
5
3, 1a, 1b
Figure 6 : Distribution géographique mondiale des souches de HCV en 2010. La taille
des génotypes est représentative de leur proportion respective.
35
L’analyse des relations phylogénétiques permet de comprendre l’émergence
et la diversification des différents génotypes au fil des siècles. Les différents
génotypes auraient émergés il y a 500 à 2 000 ans (Smith, 1997). La divergence des
génotypes en sous-types remonterait à 300 ans. Les virus de génotype 1, 2 et 4 sont
endémiques en Afrique et les virus de génotype 3 et 6 en Asie (Mellor, 1995 ;
Simmonds 2001). Le HCV de génotype 5 est dominant en Afrique du Sud, qui
pourrait être la région endémique (Ohno, 1994; Prabdial-Sing, 2008). Les souches
dites « endémiques » reflètent une transmission à bas bruit mais sur le long terme et
sont supposées être la source des souches épidémiques.
Plus précisément, le génotype 2 du HCV est endémique dans les pays
d’Afrique de l’Ouest et d’Afrique centrale (Guinée-Bissau, Bénin, Burkina Faso,
Ghana) et présente une diversité extrêmement importante (Ruggieri, 1996; Jeannel,
1998; Candotti, 2003; Markov, 2009). Il a également été retrouvé en Martinique avec
une diversité importante suggérant une introduction assez ancienne (Martial, 2004).
Les génotypes 2a et 2b sont assez communs en Amérique du Nord, au Japon et en
Europe tandis que le sous-type 2c est très présent en Italie (Ansaldi, 2005). Le
génotype 4 du HCV émerge depuis une dizaine d’années dans les pays européens
principalement par toxicomanie avec une prédominance des sous-types 4a et 4d
(Morice, 2001; Tamalet, 2003; van Asten, 2004). En Espagne les sous-types 4c et 4d
sont prédominants (Fernandez-Arcas, 2006), et en Italie le sous-type 4d est
majoritaire (Argentini, 2000). Dans ce pays, la prévalence du génotype 4 serait plus
importante en Sicile. Ce génotype est endémique en Afrique Centrale, et plus
particulièrement au Cameroun (Ndjomou, 2003; Njouom, 2003; Njouom, 2009 ). Il
existe une grande diversité des virus de génotypes 4, circulant simultanément dans
des régions bien définies. Le génotype 4 du HCV a également une forte prévalence
au Moyen-Orient, en particulier en Egypte (Angelico, 1997; Ray, 2000) où le soustype prédominant est 4a.
 Réponse au traitement anti-HCV
L’une des conséquences majeures de la diversité génétique du HCV est une
réponse au traitement variable en fonction du génotype (Poynard, 1998; Manns,
2001; Fried, 2002; Hadziyannis, 2004b). Les patients infectés par un virus de
génotype 2 ou 3 répondent à une bithérapie interféron α pégylé et ribavirine dans
36
environ 80% des cas. En revanche, ceux infectés par un génotype 1 répondent dans
seulement 40-50 % des cas. Les études concernant le taux de RVS des patients
infectés par un virus de génotype 4 montrent des résultats assez contradictoires : les
premières études ont observé un taux de réponse d’environ 40% assez proche de
celui des génotypes 1 (Alfaleh, 2004), alors que d’autres études ont montré un taux
de réponse plus élevé 50-79% (Diago, 2004; Kamal, 2005; Legrand-Abravanel,
2005; Trapero-Marugan, 2007 ; Kamal 2009). Le génotype 4 du HCV aurait donc une
sensibilité au traitement intermédiaire entre les virus de génotype 1 et ceux de
génotype 2/3. Les patients infectés par génotype 3 répondraient moins bien au
traitement que les patients infectés par un génotype 2 (79% versus 83%) (Zeuzem,
2004). Les patients infectés par un génotype 5, sur la base d’études rétrospectives,
répondent dans 56% à 83% (Legrand-Abravanel, 2004; Delwaide, 2005; Bonny,
2006). Enfin, les études récentes réalisées sur le génotype 6 montrent une sensibilité
du virus au traitement antiviral chez 50 à 80% des patients (Fung, 2008; Nguyen,
2008), similaire à celle des patients infectés par un virus de génotype 2 ou 3. A ce
jour, il n’existe pas de données sur l’impact du sous-type du HCV sur la réponse
virale au traitement. Ceci s’explique par le fait que les méthodes de détermination du
génotype les plus utilisées sont basées sur l’analyse de la région 5’NC, ne
permettant pas de discriminer de façon efficace les sous-types.
Une étude récente a montré que le taux de réponse au traitement pouvait être
le reflet de l’évolution du virus pour s’adapter au système immunitaire (Pang, 2009).
L’étude phylogénétique réalisée avec tous les génomes complets disponibles
(n=345) a abouti à la construction d’un arbre qui montre l’âge relatif des génotypes.
La réponse au traitement observée dans des essais cliniques prospectifs a été reliée
à cet arbre et a montré une corrélation entre le taux de réponse au traitement et l’âge
des génotypes respectifs (Figure 7). Le génotype 2 du HCV serait le génotype le
plus ancien, les génotypes 1 et 4 du HCV seraient les génotypes les plus jeunes et
les génotypes 3, 5 et 6 du HCV seraient intermédiaires. Cette étude a également
montré que les protéines E2 et NS5A pourraient être des déterminants clés de la
réponse virale génotype spécifique. La divergence des génotypes du HCV aurait été
fortement orientée d’une part par la pression de sélection du système immunitaire et
d’autre part par l’acquisition de facteurs viraux, capables d’inhiber la réponse
immunitaire et jouant un rôle dans la capacité à répondre à un traitement par
interféron.
37
Le génotype du HCV reste à ce jour le principal facteur prédictif de réponse
mais des facteurs de l’hôte pourraient avoir la même importance, comme le montre
les données récentes sur l’IL-28 pour les virus de génotype 1 (Ge, 2009; Suppiah,
2009; Tanaka, 2009).
Figure 7 : Evolution des génotypes HCV et leur corrélation avec la réponse au
traitement observée dans des études cliniques (adapté de Pang et al., 2009).
ii. Au niveau des quasi-espèces
La complexité des quasi-espèces peut avoir des conséquences sur l’histoire
naturelle de l’infection HCV et sur la réponse au traitement antiviral.
Le renouvellement dynamique de variants capables d’échapper au système
immunitaire est probablement un mécanisme important de la persistance virale. Lors
d’une infection HCV aiguë, les patients infectés par une quasi-espèce virale qui
évolue peu en terme de diversité génétique, élimineront généralement le virus. A
l’inverse, les patients qui ont une quasi-espèce évoluant rapidement développeront
plus facilement une infection chronique (Farci, 2000). Ceci pourrait s’expliquer par la
pression de sélection du système immunitaire de l’hôte qui influence le niveau de
diversité des quasi-espèces dans le but d’éliminer le virus.
Différentes études ont cherché à corréler la complexité des quasi-espèces
avec le degré de lésions hépatiques (Hayashi, 1997; Cabot, 2001; Farci, 2006). Les
38
observations rapportées sont assez contradictoires, cependant, une étude récente
suggère que l’homogénéité des quasi-espèces serait associée à une évolution
péjorative de l’histologie hépatique chez des patients immunocompétents infectés
par des virus de génotype 1 (Sullivan, 2007). Une étude réalisée chez des patients
TR avaient montré précédemment que la diversification des quasi-espèces de la
région HVR1 entre la transplantation et la PBH post-transplantation était un facteur
indépendamment associé à la régression de la fibrose (Kamar, 2005).
Le traitement antiviral de référence du HCV comprend de l’interféron et de la
ribavirine. L’interféron exerce une pression de sélection sur les quasi-espèces du
HCV (Enomoto, 1994) et l’hétérogénéité génétique du HCV jouerait un rôle dans la
réponse au traitement. En effet, les quasi-espèces pourraient être un des facteurs
prédictifs de la RVS (Salmeron, 2008). Dans cette étude, réalisée chez des patients
infectés par un virus de génotype 1, les facteurs prédictifs de la réponse au
traitement sont un âge < 40 ans, une charge virale < 600 000 UI/mL et une faible
variabilité de la quasi-espèce virale avant traitement (objectivée < 5 bandes par
technique SSCP). La variabilité de certaines régions du génome a été impliquée
dans des mécanismes de résistance à l’interféron. C’est le cas par exemple des
régions ISDR (interferon sensitivity determining region) et PKRBD (PKR binding
domain) dans le domaine NS5A (Pascu, 2004; Munoz de Rueda, 2008).
L’impact de la variabilité du HCV sur la génération d’anticorps spécifiques antiHCV et sur le contrôle de la virémie est important. Ceci doit être pris en compte dans
la conception de vaccins prophylactiques ou thérapeutiques. La région HVR1 a une
variabilité épitopique due à la sélection de virus mutants par la réponse immunitaire
humorale. Cette sélection a lieu rapidement après la primo-infection (Farci, 2000).
Ces virus « mutés » peuvent induire une faible expression des peptides de CMH, ou
une faible fixation des épitopes aux CMH de classe I et induire une faible réponse
des lymphocytes T cytotoxiques (Erickson, 2001; Kimura, 2005). La réponse
immunitaire est ainsi en partie neutralisée.
39
IV- PRISE EN CHARGE THERAPEUTIQUE DES INFECTIONS PAR
HCV
Depuis la découverte du HCV en 1989 et l’introduction de la monothérapie par
interféron alpha (IFNα) au début des années 1990, des progrès considérables ont
été réalisés dans la prise en charge thérapeutique des infections par le HCV, qu’elles
soient chroniques ou aiguës. Le traitement standard actuel de l’infection chronique
repose sur la combinaison de l’interféron alpha pégylé (pegIFNα) et de la ribavirine
(RBV) (Anonymous 2002). Le principal objectif du traitement est l’éradication virale.
Les algorithmes de traitement actuels permettent d’atteindre une RVS (virémie HCV
plasmatique indétectable plus de 6 mois) chez 80% des patients infectés par un virus
de génotype 2 ou 3, après un traitement de 24 semaines. Malheureusement, les
patients infectés par un virus de génotype 1 atteignent une RVS dans 40-50% des
cas après 48 semaines de traitement (Manns, 2001 ; Fried, 2002; Hadziyannis,
2004b). Le suivi dans patients plusieurs années après la guérison ont montré que la
RVS était synonyme d’élimination définitive du virus et de guérison (Maylin, 2008;
George, 2009).
A- Molécules antivirales actuellement utilisées
i. Les interférons : mécanisme d’action et pharmacocinétique
Cette famille de protéines autocrines et paracrines stimule des réseaux intra et
intercellulaires qui régulent la résistance aux infections virales, active la réponse
immunitaire innée ou adaptative et module la survie et la mort des cellules normales
et tumorales.
Trois classes d’IFN ont été identifiées, désignées type I à III, et classées en
fonction du récepteur par lequel ces protéines signalaient: les interférons de type I
regroupent entre autres les IFN α, IFN β, IFN ω, IFN ε/τ, IFN κ, les IFN de type II ont
un seul représentant, l’IFN γ, et les IFN de type III, récemment décrits, regroupent 3
IFN λ (de 1 à 3). Ces derniers auraient comme les IFN de type I des propriétés
antivirales et pourraient être les ancêtres des IFN de type I (Levraud, 2007). Ils
utilisent des récepteurs différents mais les mêmes voies de signalisation.
40
Les IFNα sont produits principalement par les leucocytes (monocytes et
macrophages) suite à une infection virale. Chez l’homme, il existe plus d’une
vingtaine de sous-espèce d’IFNα. Les sous-espèces α-2a et α-2b sont utilisées en
thérapeutique. Les gènes codant pour les IFNs sont activés et transcrits selon des
mécanismes complexes.
Lors d’une infection par le HCV, la première ligne de défense mise en jeu par
l’hôte pour combattre l’infection est la réponse innée et en particulier la production
d’IFN de type I. Elle est induite par 2 voies principales :
1- l’ARN viral est reconnu par des senseurs cytoplasmiques tels que RIG-I
(retinoic acid inducible gene-I) ou MDA-5 (melanoma differentiation antigen 5) qui
vont ensuite se lier à l’IPS-1 (IFN-β promoter stimulator-1) ce qui va permettrent
l’activation de l’IRF-3 (transcription factors interferon regulatory factor-3) et de NF-κB
(nuclear factor κB). Ces facteurs de transcription seront transloqués dans le noyau et
induiront la production d’IFN-β (Johnson, 2006) ;
2- la voie de signalisation par les TLR (Toll Like Receptors). Les TLR 3, 7 et 8
sont impliqués dans les mécanismes de défense de l’hôte contre les infections
virales. La reconnaissance d’ARN double brin (ARN db) par TLR 3 induit le
recrutement de la protéine adaptatrice TRIF (TIR domain containing adaptatorinducing IFN-β) puis active les facteurs de transcriptions IRF3 et NF-κB qui induisent
la transcription des gènes de l’IFN-β. TLR 7 et 8 sont exprimés dans le compartiment
endosomal. Ils reconnaissent des ARN simple brin et recrute la protéine adaptatrice
MyD88 (myeloid differentiation factor factor 88), active les facteurs de transcription
IRF7 et NF-κB. Ces derniers activent la production de cytokines pro-inflammatoires
et d’IFN de type I (Akira, 2006).
Les voies de signalisation des IFN sont ensuite activées, induisant la
production de différentes molécules antivirales. Ces cytokines interagissent avec des
récepteurs membranaires pour exercer leurs effets sur les cellules cibles. Toutes les
lignées cellulaires, à l’exception des érythrocytes mâtures, expriment à leur surface
des récepteurs aux IFN de type I ou II (IFNAR I ou II). Les récepteurs fonctionnels
sont constitués de plusieurs sous-unités protéiques distinctes comportant un
domaine transmembranaire. La fixation du ligand à son récepteur induit une
dimérisation de ce dernier et une cascade de signaux intracellulaires très similaires
pour les IFN de types I et III (Figure 8) (Sadler, 2008). L’initiation de cette cascade
commence par l’activation des protéines de la famille des Janus kinases (Jaks) qui
41
sont associées aux domaines intracytoplasmiques des récepteurs à l’IFN. Ces Jaks
induisent la phosphorylation des protéines STATs. Les STATs phosphorylées
forment un complexe multimérique avec la protéine IFN regulator factor 9 (IRF9), qui
est transloqué dans le noyau et se lie à une séquence d’ADN appelée IFN-stimulated
response element (ISRE), située dans le promoteur des gènes inductibles par les
IFNs ou ISG (gènes inductibles par l’IFN) (Stark, 1998). Ainsi, un grand nombre de
protéines antivirales peuvent être induites sous le contrôle des IFN.
 Les effecteurs de la réponse antivirale médiée par l’IFNα
Les propriétés biologiques des IFN sont pléiotropes et mettent en jeux
l’expression de nombreux gènes cellulaires et la synthèse de protéines de novo.
L’effet antiviral des IFN est médié principalement par les protéines cidessous (Sadler, 2008).

La famille des 2’5’ oligoadénylate synthases (2’5’ OAS) représente un
groupe d’enzymes présentes à l’état basal dans de nombreuses cellules, et
activées par la voie IFN. Elles polymérisent les molécules d’adénosine
triphosphate (ATP) en 2’5’ oligoadénylates (3 à 5 unités) qui activent
l’endoribonucléase L (RNase L). La RNase L activée est responsable du
clivage des ARN viraux simple brin et inhibe ainsi la synthèse protéique. Ce
système inhibe la réplication de nombreux virus et peut également modifier la
croissance cellulaire. Le système 2’5’OAS/RNase L contribuerait également à
l’activité antivirale de l’IFN en induisant l’apoptose des cellules infectées
(Castelli, 1998).

la protéine kinase dépendante des ARN bicaténaires (PKR) est une sérine
thréonine kinase qui affecte de nombreux processus cellulaires et inhibe la
réplication virale. En position N-terminale, elle présente un site de liaison des
ARNdb et en position C-terminale un domaine catalytique (Meurs, 1990).
Présente à l’état inactif dans les cellules, elle est activée entre autre par les
ARN db entre autre. Le site catalytique ainsi démasqué peut phosphoryler de
nombreuses protéines. En phosphorylant la sous-unité α d’eIF2, elle empêche
la traduction des protéines et le recyclage des facteurs d’initiation de la
traduction (Clemens, 1997). Ainsi, la synthèse des protéines cellulaires et
virales devrait être bloquée. En revanche, les dernières données montrent que
42
la synthèse des protéines virales ne serait pas inhibée. En effet, l’IRES HCV
serait insensible à la phosphorylation d’eIF2, ce qui n’empêcherait pas la
traduction des ARN (Esteban 2009; Garaigorta, 2009). La PKR participe aussi
à l’élimination des virus en médiant l’apoptose par différents mécanismes
(Lee, 1997; Fujimoto, 1998).
IFN de type I
IFN de type III
Membrane
cytoplasmique
Cytoplasme
Noyau
IMMUNITE ANTIVIRALE
Figure 8 : Voies de signalisation des IFN de type I et III (d’après Sadler, 2008)

une isoforme des adénosines déaminases spécifiques des ARNdb (ADAR)
est un autre facteur de l’activité antivirale des IFN. Cette enzyme reconnaît les
ARN db et les déroule en convertissant systématiquement les adénosines en
inosines. De nombreux ARN viraux ayant un ARN db comme intermédiaire de
43
réplication, ce processus s’avère mutagène et les mutations décrites au sein
des génomes sont compatibles avec une telle activité.

les protéines Mx (Mx A et B chez l’homme), appartiennent à la superfamille
des GTPases de haut poids moléculaire. Lors d’une infection virale, la
protéine humaine MxA s’accumule dans le cytoplasme de la cellule et exerce
son activité antivirale sur un large spectre de virus à ARN. Les mécanismes
d’action de cette protéine sont encore mal connus mais elle pourrait agir par
interaction directe avec certaines nucléocapsides virales (Haller, 2002). En
séquestrant ou redistribuant ces nucléocapsides au sein de la cellule, celles-ci
ne sont plus disponibles pour générer de nouveaux virions.

L’ISG15 (protéine de 15kDa stimulée par l’IFN) est l’une des protéines les plus
fortement induite par l’IFN. Ses fonctions antivirales n’ont été évoquées que
très récemment. C’est une protéine homologue de l’ubiquitine (Loeb, 1992).
Avec l’aide d’autres enzymes ubiquitin like, dont l’expression est aussi induite
par l’IFN, l’ISG15 se conjugue à différentes protéines cellulaires. Ce
phénomène appelé ISGylation, est régulé de façon réversible par des
protéases telles que l’USP18 ou l’UBP43. Parmi les cibles potentielles de
l’ISG15, on compte les protéines des voies IFN telles que Jak1, STAT1, RIG1, MxA, PKR, RNase L (Zhao, 2005). Bien que les conséquences de cette
conjugaison soient mal connues, il a été suggéré qu’elle pourrait prévenir la
dégradation des protéines. L’activité antivirale de l’ISG15 a été montré pour
différents virus et récemment, il a été montré que l’ISG15 module l’activité de
l’IFNα dans l’infection HCV (Chua, 2009). L’inhibition de la traduction de
l’ISG15 par des siRNA, puis le traitement par IFNα de lignées cellulaires Huh7 induit une sensibilité accrue de ces cellules à l’IFNα.
 Activité immunomodulatrice
En plus d’une inhibition directe de la réplication du HCV par les ISG, les IFN
induisent également la réponse immunitaire adaptative et acquise (Borden, 2007).
Les cellules dendritiques (DC) infectées sont les premières à transmettre des
signaux de la présence de pathogènes, notamment les cellules dendritiques
plasmacytoïdes (pDC) circulantes, en libérant des IFN de type I. Les DC activées par
l’intermédiaire du CMH de classe II (CMH II) vont présenter les peptides
44
antigéniques aux lymphocytes T CD4+. L’expression des protéines de CMH II est
induite uniquement par l’IFNγ. Les cellules infectées qui présentent les peptides
antigéniques avec le CMH I sont reconnues et éliminées par les lymphocytes T
CD8+. L’expression des molécules de CMH I est induite par les IFN de type I et
l’IFNγ.
Les IFNs permettent aussi l’accumulation des leucocytes au site d’invasion
des pathogènes en induisant l’expression de protéines d’adhésion et la production de
cytokines chimiotactiques qui participent au recrutement de ceux-ci.
Enfin, l’IFNγ active les propriétés effectrices cytotoxiques des cellules de
l’immunité innée et adaptative : les cellules natural killer (NK), les cellules
dendritiques, les macrophages et les cellules T.
 Pharmacologie des IFNs
Les IFNs standard ou pégylés sont administrés par voie sous-cutanée.
Les IFNs standards, IFNα-2a ou IFNα-2b ont une concentration maximale
(Cmax) sérique 6 à 12 heures après l’injection et une demi-vie d’élimination de 7-9h.
L’IFNα est quasiment indétectable 24h après son administration. Etant administré 3
fois par semaine, il en résulte une fluctuation importante des concentrations sériques
d’IFN médicamenteux entre 2 injections, et donc des périodes où le virus n’est plus
soumis à l’effet de l’IFN (Luxon, 2002).
Deux formes pégylées d’IFN ont été développées pour pallier à l’élimination
rapide de l’IFNα standard. Le pegIFNα-2b est l’association d’IFNα-2b avec des
chaînes linéaires de polyéthylène glycol (PEG) de 12 kd. La Cmax est obtenue 15 à
44 h après l’injection, sa demi-vie d’élimination est de 40 h et 30% est éliminée par
voie rénale (Glue, 2000). Le pegIFNα-2b est administré une fois par semaine à la
posologie de 1,5 µg/kg/semaine. Le pegIFNα-2a est l’association d’IFNα-2a avec des
chaînes ramifiées de PEG de 40 kd. La Cmax est obtenue 72 à 96 heures après
l’injection. La biodisponibilité de cette molécule est de 84 %, sa demi-vie
d’élimination est de 60 à 80 h (Bruno, 2004). Le pegIFNα-2a est administré une fois
par semaine à la posologie de 180 µg/injection. Après 6 à 8 semaines de traitement
hebdomadaire, le niveau des concentrations sériques est multiplié par un facteur 2
ou 3. Après 8 semaines, il n’y a pas d’accumulation supplémentaire. A l’équilibre, le
rapport des concentrations au pic sur les concentrations résiduelles est de 1,5 à 2.
45
ii. La ribavirine : mécanisme d’action et pharmacocinétique
La RBV reste à ce jour une molécule assez énigmatique quant à son mode
d’action. En dépit de son large spectre d’action, l’autorisation de mise sur le marché
de la RBV reste limitée au traitement de l’infection par HCV. Découverte en 1972, cet
analogue nucléosidique de la guanosine a rapidement montré son efficacité sur un
large spectre de virus (rhinovirus, virus respiratoire syncitial, virus de la rougeole,
virus des fièvres hémorragiques…), mais son mécanisme d’action reste encore mal
connu.
Dans l’état actuel des connaissances, les mécanismes d’action, directs ou
indirects, proposés pour la RBV sont les suivant (Figure 9) (Dixit, 2006; Hofmann,
2008).
1/ la RBV agirait en inhibant l’activité de coiffage des ARN. En tant
qu’analogue nucléosidique, elle a la capacité d’interagir avec les enzymes de
coiffage soit en les inhibant directement, soit en s’incorporant à la coiffe.
2/ elle peut inhiber l’ARN polymérase virale. La RBV (analogue
monophosphate) doit être triphosphorylée pour être active. Son métabolite triphosphate (RTP) entrerait en compétition avec les pools cellulaires de guanosine
triphosphate (GTP) et d’adénosine triphosphate (ATP) (Cannon, 2009).
3/ La RBV augmenterait la fréquence des mutations via l’incorporation de
celle-ci dans les génomes nouvellement synthétisés. Elle est capable de se lier
indifféremment à la cytidine et à l’uridine et induit ainsi un défaut dans l’appariement
des bases. Cette stratégie est nommée mutagénèse létale : la population virale
accumule un taux de mutation supérieur au seuil de variabilité acceptable, au-delà
duquel les mutations additionnelles se révèlent délétères. Ce mécanisme a été décrit
in vitro pour la RBV chez le poliovirus, le HCV, les virus Hanta et West Nile (Crotty,
2000; Graci, 2006; Brochot, 2007). Cuevas et al. a étudié l’effet mutagène de la RBV
in vivo, en estimant le taux de mutations sur la base de l’analyse des mutations non
synonymes. Il a montré une augmentation du taux de mutations d’un facteur 3 et un
changement du spectre de mutations sur les prélèvements de patients traités 6 à 12
mois (Cuevas, 2009).
46
4/ La RBV induit une réduction du pool intracellulaire de GTP via l’inhibition
compétitive de l’inosine monophosphate déshydrogénase (IMPDH). L’IMPDH est
responsable de la conversion d’inosine monophosphate en xanthine monophosphate
qui sera ensuite aminée en guanosine monophosphate, précurseur pour la synthèse
d’ARN et d’ADN.
5/ la RBV présenterait un effet immunomodulateur. Elle favoriserait la
réponse immunitaire T cellulaire de type Th1 antivirale (induction de cytokines : IL12, puis d’IL-2, IFN-γ et TNF-α), au dépend de la réponse des lymphocytes
auxiliaires de type Th2 (diminution de l’IL-4, IL-5 et IL-10) associée au
développement de maladies chroniques au cours de l’infection HCV (Tam, 1999).
Une étude a montré in vitro que des concentrations de RBV de 2 à 5 µM induisait
une prolifération cellulaire T associé à une diminution de l’IL-10 (Rigopoulou, 2007).
En revanche, à des concentrations supérieures à 20 µM, la RBV supprimerait la
prolifération cellulaire T.
6/ Récemment, Feld et al. (Feld, 2007) a montré à l’aide de biopuces que la
RBV pouvait influencer la réponse de l’hôte. Chez des patients qui initient une
bithérapie par pegIFNα et RBV, un prétraitement de 72h par RBV augmente
l’expression des ISG dans le foie et diminue l’expression des gènes impliqués dans
l’inhibition de l’IFN par rapport à des patients non pré-traités. Ceci est plus
particulièrement observé chez des patients qui sont répondeurs virologiques rapides,
et montre que la RBV peut améliorer l’issue d’un traitement en augmentant
l’expression des cytokines induites par l’IFN lors de la phase précoce de déclin de la
charge virale (Feld, 2010).
47





Extinction virale
Diversité des quasiespèces naturelles
Diversité des quasiespèces sous RBV

Augmentation de
l’expression des ISG
Figure 9 : Mécanismes d’action décrits pour la RBV (d’après Jeulin et al., 2009)
 Pharmacologie de la RBV
La RBV est administrée par voie orale. Elle est absorbée rapidement, avec
une Cmax obtenue 1 à 6 h après l’administration. La biodisponibilité est de 45 à 65%
et est augmentée lors de repas riche en graisse. La RBV ne se lie pas aux protéines
plasmatiques et est transportée dans les cellules grâce à des transporteurs de
nucléosides présents sur la plupart des cellules. Sa demi-vie d’élimination est de 70
h après l’administration d’une dose unique et en fin de traitement, elle est de 300 h
environ ce qui traduit une accumulation dans le sang total et probablement une
élimination lente à partir des compartiments extracellulaires (Tsubota, 2003). Lors du
traitement d’une hépatite C chronique, l’état d’équilibre des concentrations sanguines
de RBV est obtenu entre 4 et 8 semaines (Tsubota, 2003). A l’état d’équilibre, la
48
concentration maximale observée peut être 2 à 3 fois plus élevée que la
concentration résiduelle (Breilh, 2009).
La RBV est métabolisée par deux voies : (1) par phosphorylation réversible,
uniquement dans les cellules nucléées, (2) par dégradation impliquant une
déribosylation et une hydrolyse de la fonction amide pour donner un métabolite
carboxyacide triazolé (Dixit, 2006). Dans les érythrocytes, qui sont des cellules
anucléées, sans système de déphosphorylation, la forme ribavirine triphosphate
s’accumule et provoque l’hémolyse de ces cellules, cause de l’anémie fréquemment
observée chez les patients traités par RBV. La RBV et ses métabolites sont ensuite
éliminés par voie rénale. Dans la plupart des études, les doses de RBV sont
adaptées au poids. Pourtant, plusieurs études suggèrent que les doses de RBV
pourraient être adaptées à la fonction rénale, en particulier, chez les patients ayant
une fonction rénale altérée (Bruchfeld, 2002; Kamar, 2004).
 Cinétique de décroissance virale
La RBV n’a pas montré d’activité anti-HCV propre lorsqu’elle était donnée en
monothérapie bien qu'une légère diminution de la charge virale (0.5 log) ait été
observée (Di Bisceglie, 1992; Zoulim, 1998 ). Son utilisation seule n’est donc pas
recommandée. Son association à l’IFNα dans un premier temps puis au pegIFNα, a
permis d’augmenter de façon significative les chances de succès du traitement antiHCV avec une RVS pouvant aller jusqu’à 80%. Depuis l’introduction du pegIFNα
dans l’arsenal thérapeutique, les études cliniques se sont concentrées sur la
combinaison pegIFNα et RBV.
Les modèles mathématiques et analyses statistiques ont révélé que la
décroissance de l’ARN HCV en réponse à un traitement à base d’interféron pouvait
être bi ou triphasique. La première phase (1 à 2 jours) représente la diminution de
production virale et l’élimination des virions libres (de 1 à 2 log chez les patients
infectés par un génotype 1 et jusqu’à 3 ou 4 log chez les patients infectés par un
génotype 2). La deuxième phase, représentée par une baisse beaucoup plus lente
de la charge virale correspond à l’élimination des cellules infectées. Lors de la
première phase, la RBV évite le rebond de charge virale qui peut être observé entre
2 injections d’IFN, mais elle influence principalement la deuxième phase de déclin de
la charge virale HCV. Elle réduirait l’infectiosité du HCV chez les patients infectés et
49
ceci de manière dose-dépendante (Dixit, 2004). Un modèle triphasique a été
proposé, dans lequel la deuxième phase de décroissance observée pourrait être la
conséquence de l’homéostasie du foie, au cours de laquelle la perte de cellules
infectées est compensée par la prolifération d’hépatocytes (Dahari, 2007b).
L’effet de la RBV dépend de l’efficacité de l’IFN à bloquer la production virale.
Si l’efficacité de l’IFN est élevée, comme dans le traitement des génotypes 2 ou 3, la
RBV a peu d’effet puisque la production virale est efficacement bloquée. Au
contraire, lorsque l’effet de l’IFN est faible, la RBV décroît de façon significative
l’infectiosité des virus et accélère la seconde phase de décroissance (Dixit, 2004;
Perelson, 2005).
B- Facteurs influençant la réponse au traitement
Le taux de réponse au traitement par pegIFNα et RBV étant très variable d’un
patient à l’autre et d’un virus à l’autre, les facteurs influençant la réponse au
traitement ont été recherché. Des facteurs viraux, de l’hôte ou pharmacologiques ont
été identifiés.
i. Facteurs viraux
Parmi les facteurs viraux prédictifs de réponse, le génotype est le facteur
présentant la meilleure valeur prédictive de réponse au traitement. Une infection par
un virus de génotype 2 ou 3 est de meilleur pronostic qu’une infection par un virus de
génotype 1 ou 4 (Manns, 2001; Fried, 2002).
Un autre facteur viral important est la concentration d’ARN HCV plasmatique
pré-thérapeutique. Une charge virale faible, c’est-à-dire pour la plupart des études,
inférieure à 800 000 UI/mL est prédictive d’une meilleure réponse au traitement par
pegIFNα et RBV (Zeuzem, 2006; Berg, 2008; Lee, 2008). Cependant des seuils plus
bas à 600 000 ou 400 000 UI/mL ont été proposés dans des études plus récentes
(Zeuzem, 2009).
La cinétique de décroissance de la charge virale est également un facteur
important et est utilisé dans la prise en charge des patients. Les patients qui ont une
charge virale indétectable dans le plasma 4 semaines après le début du traitement
réponse virologique rapide (RVR) ont une RVS dans plus de 80% des cas (Davis
50
2006). Chez les patients coinfectés par HIV, la RVR a une valeur prédictive positive
pour la RVS de 69% chez les patients infectés par un virus de génotype 1 et de 83%
chez les patients infectés par un virus de génotype 2 ou 3 (Martin-Carbonero, 2008).
La réponse virologique précoce (RVP), définie par une baisse de la charge virale
HCV à la semaine 12 de plus de 2 log UI/mL, a une valeur prédictive positive pour la
RVS de 65-72% chez des patients infectés par un virus de génotype 1 (2002; Davis,
2003; Craxi 2004). Les patients qui n’ont pas de RVP n’ont aucune chance de guérir
puisque la valeur prédictive négative pour la RVS est de 98-100%.
ii. Facteurs de l’hôte
Les principaux facteurs de l’hôte impliqués dans une moins bonne réponse
sont un âge plus élevé (Chen, 2009), un indice de masse corporelle élevé (Bressler,
2003), une origine asiatique ou afro-américaine, une fibrose hépatique à un stade
avancé.
D’autres facteurs ont été identifiés plus récemment. Chez les patients inclus
dans la cohorte Virahep-C, il a été observé que l’index HOMA (homeostasis model
assessment of insuline sensitivity) qui mesure la résistance à l’insuline était associé
de manière indépendante à la RVS (Conjeevaram, 2007). Ceci a également été
retrouvé dans une étude réalisée chez 300 patients Taiwanais traités par pegIFNα et
RBV, en particulier chez les patients difficiles à traiter (Dai, 2009) et dans différentes
études réalisées chez des patients caucasiens (Romero-Gomez, 2005; Poustchi,
2008). Un mécanisme par lequel la résistance à l’insuline et l’obésité pourrait
contribuer à la non réponse est l’augmentation de la régulation de SOCS3 (Walsh,
2006). En effet, SOCS3 bloque la voie de signalisation de l’IFN et peut exacerber la
résistance à l’insuline en augmentant la dégradation des récepteurs de l’insuline.
L’origine ethnique pourrait être l’un des facteurs influençant le plus la réponse
au traitement. Trois études comparant l’effet du pegIFNα et de la RBV chez des
américains d’origine africaine et des américains d’origine caucasienne, infectés par
un virus génotype 1 ont montré que les patients d’origine africaine répondaient moins
fréquemment au traitement (19-28%) que les patients d’origine caucasienne (3952%) (Muir, 2004; Conjeevaram, 2006; Howell, 2008). Le taux de RVR était inférieur
à celui observé chez des patients d’origine caucasienne (10 versus 22%).
51
Un
facteur
génétique
essentiel
a
été
récemment
identifié.
Des
polymorphismes génétiques situés sur le chromosome 19, à proximité du gène
codant pour l’interleukine 28B encore appelé interféron lambda 3 (IFN-λ3) ont été
identifiés comme facteurs influençant la réponse au traitement pour les virus de
génotype 1. Le premier SNP (single nucléotide polymorphism) retrouvé, le
rs12979860, a été associé à une réponse au traitement anti-HCV deux fois plus
fréquente chez les patients porteurs du génotype CC, qu’ils soient d’origine
caucasienne ou afro-américaine (Ge, 2009). Les patients homozygotes CC pour ce
polymorphisme éliminaient également plus fréquemment le virus lors d’une infection
aigue (Thomas, 2009). La fréquence de cet allèle est très variable d’une population à
l’autre, avec une fréquence faible chez les individus d’origine africaine (<40%), une
fréquence moyenne chez les individus d’origine caucasienne (50-70%), une
fréquence très élevée chez les individus d’origine asiatique (80-100%). Ceci pourrait
donc expliquer les disparités de réponse au traitement observées selon les origines
ethniques. D’autres polymorphismes proches du gène de l’IL28B, seraient également
associés à la non réponse au traitement par pegIFNα et RBV, en particulier le SNP
rs8099917 (Suppiah, 2009; Tanaka, 2009). L’allèle minoritaire de ce dernier serait
associé à la progression vers la chronicité de l’infection HCV et à l’échec du
traitement en particulier chez les patients infectés par un génotype 1 ou 4 (Rauch,
2010). Ces 2 SNPs sont probablement en déséquilibre de liaison avec des mutations
situées dans le gène codant l’IL-28B, qui influenceraient son expression. L’IFN-λ3 est
une cytokine induite par les infections virales qui possède une activité antivirale. La
production de cette cytokine peut être une alternative aux IFN de type I dans
l’immunité antivirale (O'Brien 2009). A la différence de l’IFNα qui induit l’expression
des ISG selon une cinétique rapide mais transitoire, l’IFN-λ3 induit une augmentation
continue de ces gènes (Marcello, 2006).
Plusieurs équipes ont étudié la relation entre la non réponse à un traitement et
l’expression des gènes induits par l’interféron dans le foie (Chen, 2005; Feld, 2007;
Sarasin-Filipowicz, 2008). Ces trois études ont décrits que les ISG étaient
surexprimés avant le début du traitement, chez les patients non répondeurs. Après
traitement, le niveau d’expression de ces gènes était similaire chez les patients
répondeurs et non répondeurs. C’est donc la différence d’expression des ISG dans le
foie, avant et après traitement, qui est associée à la réponse au traitement et non le
niveau d’expression des ISG après traitement.
52
iii. Facteurs pharmacologiques
Depuis quelques années, les résultats de différentes études montrent que les
concentrations plasmatiques de pegIFNα et de RBV pourraient influencer la réponse
au traitement et qu’il pourrait être utile de les doser. Les molécules candidates à des
mesures de concentrations plasmatiques doivent remplir plusieurs critères :
-
leur pharmacocinétique doit être bien connue
-
leurs concentrations plasmatiques doivent présenter une variabilité
interpatient importante et une variabilité intrapatient faible
-
les concentrations plasmatiques doivent être corrélées à l’efficacité
thérapeutique et aux effets secondaires éventuels
-
la cible thérapeutique doit être étroite
Les concentrations plasmatiques de RBV ont une variabilité interindividuelle
élevée et une variabilité intraindividuelle faible (25-30%) (Larrat, 2003). La plupart
des études réalisées ont montré un lien entre les concentrations plasmatiques de
RBV et la réponse thérapeutique ou les effets secondaires. Cette molécule est donc
un candidat potentiel pour des adaptations de posologie en fonction des
concentrations plasmatiques.
La plupart des études qui ont investigué un lien entre les concentrations
plasmatiques de RBV et la RVS ont trouvé une association. Une première étude
réalisées chez des patients monoinfectés HCV a montré un taux de RVS de 49%
lorsque les concentrations de RBV étaient entre 3,5-4 mg/L et de 62,5% lorsque les
concentrations étaient supérieures à 4 mg/L (Jen, 2000). Les concentrations
plasmatiques de RBV à S12 et S24 étaient plus élevées chez les patients
répondeurs que les non répondeurs (Larrat, 2003). Un taux de RVS de 100% a été
observé chez des patients infectés par un virus de génotype 1b avec des
concentrations de RBV de 2,5-3 mg/L à S4 ou > 3 mg/L à S8 (Tsubota, 2003). Des
résultats similaires ont été obtenus par Arase et al. (Arase, 2005): des concentrations
de RBV comprises entre 3 et 3,5 mg/L étaient prédictives d’une réponse plus
fréquente. Une étude prospective a évalué sur 10 patients infectés par un virus de
génotype 1 l’efficacité et la tolérance de fortes doses de RBV ajustées pour atteindre
une concentration plasmatique ≥ 3,66 mg/L (Lindahl, 2005). Neuf des 10 patients ont
53
eu une RVS malgré la survenue d’anémie plus fréquente et plus grave. Chez les
patients coinfectés par HIV, Rendon et al. a montré qu’une concentration de RBV à
S4 supérieure à 2,7 mg/L était prédictive de la RVP avec une sensibilité de 70% et
une spécificité de 49% (Rendon, 2005).
Les concentrations de RBV ont également été associées à la chute du taux
d’hémoglobine, fréquemment observée chez les patients traités. Le nadir
d’hémoglobine est inversement corrélé aux concentrations de RBV (Jen, 2000). Le
taux d’hémoglobine diminue progressivement après le début du traitement et atteint
un plateau à la semaine 4. Les concentrations sériques de RBV observées aux jours
7, 14 et 28 étaient corrélées avec le nadir d’hémoglobine et la chute la plus
importante du niveau d’hémoglobine (Saito, 2006). Dans une autre étude, la chute du
taux d’hémoglobine a été inversement corrélée aux concentrations de RBV
mesurées à S8 (Arase, 2005). Les patients avec des concentrations > 3,5 mg/L
interrompaient plus souvent le traitement que les patients avec des concentrations <
3,5 mg/L due à l’anémie. Des concentrations de RBV > 4 mg/L ont été associées à
un niveau d’hémoglobine < 8,5 g/dL (Maeda, 2004). Dans cette étude, la clairance
totale de la RBV étant associée à la clairance de la créatinine, les auteurs ont donc
proposé d’ajuster les doses de RBV à la fonction rénale. Chez les patients coinfectés
HCV-HIV, les concentrations de RBV induisant une anémie étaient plutôt comprises
entre 2,3 mg/L et 2,8 mg/L (Rendon, 2005; Aguilar Marucco, 2008). La plupart de ces
données ont été obtenues sur de petits effectifs et peu de données sont disponibles
pour les patients coinfectés par HIV.
En ce qui concerne les concentrations plasmatiques d’IFNα les données
disponibles sont encore plus rares. Une étude a montré que les patients
hémodialysés avaient un taux de réponse au traitement par IFNα (42% à 64%)
supérieur à des patients avec une fonction rénale normale (Izopet, 1997). Ceci a été
expliqué par des AUC d’IFNα-2b plus élevées chez les patients dialysés (936
pg.h/mL versus 485 pg.h/mL) (Rostaing, 1998; Chatelut, 1999). Chez les patients
hémodialysés, la clairance de l’IFNα seraient donc plus lente. Il a également été
montré que les patients répondeurs à S12 avaient des concentrations d’IFNα
supérieures aux patients non répondeurs (Boulestin, 2003). L’ensemble de ces
données est en faveur d’une influence des concentrations plasmatiques d’IFNα sur la
réponse virale au traitement. Cependant il n’existe aucune donnée sur le pegIFNα.
54
C- Algorithme de traitement des patients infectés par HCV
Le traitement des HCV aiguës permet de réduire le risque de passage à la
chronicité (Alberti, 2002). Si l’ARN HCV plasmatique n’est pas éliminé spontanément
dans les 3 mois qui suivent le début de l’infection, un traitement doit être proposé. Un
traitement précoce, 6 à 12 semaines après le début de l’infection, par pegIFNα est
recommandé pendant une durée de 6 mois. Il permet d’éliminer le virus dans 76 à
94% des cas (Santantonio, 2005; McGovern, 2009). La difficulté reste le dépistage
de ces infections aiguës à un stade suffisamment précoce pour pouvoir instaurer le
traitement.
Les recommandations actuelles pour le traitement des patients chroniquement
infectés par HCV sont résumés Figure 10. Brièvement, les patients infectés par un
virus de génotype 2 ou 3 répondent mieux au traitement que les patients infectés par
un virus de génotype 1 ou 4. Les taux de RVS sont similaires, qu’ils soient traités 24
ou 48 semaines ; donc pour les patients infectés par un virus de génotype 2 ou 3, 24
semaines de traitement suffisent. Pour les patients infectés par un virus génotype 1,
la durée de traitement par pegIFNα et RBV appropriée est de 48 semaines
(Hadziyannis, 2004b). Si les doses de pegIFNα à administrer sont bien définies, 180
µg/jour pour le pegIFNα-2a et 1,5µg/kg/jour pour le pegIFNα-2b, les doses de RBV
diffèrent en fonction du génotype. Des doses de RBV de 800 mg/jour suffisent chez
les patients infectés par un virus de génotype 2 ou 3 alors que chez les patients
infectés par un virus de génotype 1 ou 4, des doses de 800 à 1 200 mg/jour en
fonction du poids sont nécessaires (Hadziyannis, 2004b; Snoeck, 2006 ; Shiffman,
2007; Lee, 2008). Les données actuellement disponibles pour les patients infectés
par un génotype 5 ou 6 sont assez limitées, c’est pourquoi, il est actuellement
recommandé de traiter ces patients 48 semaines avec 1 000-1 200 mg/j de RBV.
55
Génotype 1 (et 4, 5 ou 6)

Détermination de la charge virale de départ

Initiation d’un traitement de 48 semaines (S48) par pegIFNα+ RBV
(adaptée au poids)

Détermination de la réponse virologique à S12 (RVP)
o Si la charge virale HCV a diminuée de ≥ 2 log par rapport à celle
de départ, continuer le traitement jusqu’à S48, à condition que la
charge virale mesurée à S24 soit indétectable
o Si la charge virale a diminuée de < 2 log, arrêt du traitement
Génotype 2 ou 3

Initier un traitement de 24 semaines par pegIFNα+ RBV (800 mg/jour)

Il n’y a pas de recommandations pour mesurer la charge virale à S12,
étant donné que le taux de réponse est élevé (80%)
Figure 10: Recommandations actuelles pour le traitement des hépatites C chroniques,
d’après Zeuzem, J Viral Hepatitis, 2009.
i. Détermination et surveillance de la charge virale
La décision de continuer ou d’arrêter le traitement est basée sur le niveau de
la charge virale au cours du traitement. Il est donc nécessaire d’avoir des mesures
de charges virales précises et sensibles. Il est également indispensable de prendre
en compte la fluctuation naturelle de charge virale au cours de l’infection HCV ainsi
que la variabilité inter et intra-essai. Les tests commerciaux actuellement disponibles
ont des gammes de quantification très variables (Tableau 2). Malgré l’introduction
des unités internationales par mL (UI/mL), des différences peuvent être observées
lorsqu’un patient n’est pas suivi par la même technique (Shiffman, 2003; Halfon,
2006; Sarrazin, 2006). La variabilité intra-essai est d’environ 0,2 log. La variabilité la
plus importante est observée entre les techniques de bDNA ou Abbott real-time PCR
et CAP/CTM qui montrent une différence d’environ 0,5-0,7 log. Des modifications de
charges virales HCV inférieures à 0,5 log sont considérées comme non significatives
cliniquement.
56
Tableau 2 : Limites de détection et gamme de quantification des techniques de
détection et quantification de l’ARN HCV
Tests
Limite de détection Gamme de quantification linéaire UI/mL
UI/mL
Borne inférieure
Borne supérieure
Essais qualitatifs
Versant
5-10
NA
NA
50
NA
NA
PCR temps réel Abbot
10
12
100 000 000
PCR temps réel Cobas TaqMan
10
43
69 000 000
Cobas Amplicor Monitor v2.0
600
600
500 000
ARN HCV versant 3.0
615
615
7 700 000
Cobas Amplicor v2.0
Essais quantitatifs
NA = non applicable
ii. Optimisation du traitement
Des données récentes suggèrent que la durée de traitement pourrait être
raccourcie ou rallongée en fonction de la charge virale de départ et de la charge
virale HCV à la semaine 4 (S4) et 12 (S12) (Zeuzem, 2009). Il est clairement
souhaitable que le traitement anti-HCV soit le plus cours possible (sans
compromettre l’efficacité du traitement) afin de minimiser au maximum les effets
secondaires et de réduire les coûts. Un traitement « à la carte » pourrait être une
solution (Van den Eynde, 2009). Des nouveaux algorithmes de traitement pourraient
donc être proposés, pour les patients infectés par un virus de génotype 1, 2, 3 ou 4.
 Chez les patients infectés par un virus de génotype 1
Actuellement, il est recommandé d’arrêter le traitement chez les patients qui
ont une baisse de la charge virale < 2 log (19 à 29% des patients) à S12. En effet, le
taux de RVS chez ces patients est proche de 0% (Davis, 2003; Ferenci, 2005). Si le
patient a une baisse de la charge virale ≥ 2 log, le traitement est poursuivi jusqu’à la
48ème semaine. Cependant, si le patient a toujours un ARN HCV détectable dans le
57
plasma à S24, les chances de succès thérapeutique sont quasiment nulles (valeur
prédictive négative de 98-100%) (Manns, 2001; Berg, 2003; Davis, 2003) et l’arrêt du
traitement doit être envisagé. Le taux de rechute (ARN HCV indétectable à S48 et
détectable 6 mois après l’arrêt du traitement) chez les patients infectés par un
génotype 1 est de l’ordre de 18-19%, quelque soit le type d’IFN utilisé (Manns, 2001;
Fried, 2002). Le traitement pourrait être individualisé en fonction de la cinétique de la
charge virale (Figure 11).

Réduction de la durée de traitement ?
Le traitement de 48 semaines actuellement recommandé peut être surestimé
dans certain cas, par exemple pour les patients qui ont une charge virale HCV
indétectable à S4. Un essai prospectif réalisé sur 265 patients infectés par un virus
de génotype 1, avec une faible charge virale à l’inclusion (<600 000 UI/mL) et une
RVR, a montré que la RVS suite à un traitement par pegIFNα-2b et RBV pendant 24
semaines était de 90% (Zeuzem, 2006). Environ un quart des patients infectés par
un virus de génotype 1 traités par pegIFNα et RBV ont une RVR (Jensen, 2006).
Parmi ces patients 89% ont eu une RVS après 24 semaines de traitement, alors que
les patients qui n’ont pas de RVR ont eu une RVS dans seulement 19% des cas. Les
patients qui ont une charge virale HCV supérieure à 600-800 000 UI/mL,
cirrhotiques, co-infectés par HIV ou immunodéprimés ne peuvent pas bénéficier d’un
traitement plus court. Seuls les patients qui ont une RVR (charge virale indétectable
par une technique sensible de PCR < 50 UI/mL) peuvent bénéficier d’un traitement
plus court. La probabilité que la charge virale soit indétectable à S4 et détectable à
S12 est peu probable.

Allongement de la durée de traitement : chez quels patients ?
Au contraire, les patients qui ont une réponse virologique moins rapide (ARN
HCV détectable à S12 et indétectable à S24) peuvent avoir besoin d’un traitement
plus long de 72 semaines (Berg, 2006; Pearlman, 2007; Sanchez-Tapias, 2007). Une
étude a randomisé des patients traités par pegIFNα-2a (180 µg/jour) et RBV (800
mg/jour) soit dans un bras 48 semaines, soit dans un bras 72 semaines et comparé
les taux de RVS et de rechute (Berg, 2006). Aucune différence n’a été observée
58
entre les 2 durées de traitement. Par contre, cette étude a montré que l’identification
des patients avec ou sans RVP pouvait orienter le choix de la durée de traitement de
façon individuelle. En effet, les patients ARN HCV (+) à S12 et traités 72 semaines
avaient un taux de RVS plus élevé que les patients traités seulement 48 semaines
(29% versus 17%, p=0,04). Une autre étude a randomisé des patients qui n’avaient
pas de RVR dans un bras 48 semaines ou un bras 72 semaines de traitement par
pegIFNα-2a (180 µg/jour) et RBV (800 mg/jour) (Sanchez-Tapias, 2007). Le taux de
RVS était plus élevé chez les patients traités 72 semaines (44% versus 28%,
p=0,003 pour les patients infectés par un virus de génotype 1). Les patients sans
RVR mais avec une charge virale indétectable à S12 qui ont bénéficié d’un
traitement de 72 semaines répondaient plus fréquemment au traitement que les
patients traités 48 semaines seulement (77% versus 31%) (Sanchez-Tapias, 2007).
Une autre étude a évalué l’impact d’un traitement par pegIFNα-2b et RBV ajusté au
poids d’une durée de 72 semaines versus 48 semaines, chez des patients qui
avaient un chute de la charge virale de plus de 2 log à S12 sans être indétectable et
une charge virale indétectable à S24 (Pearlman, 2007). Le taux de RVS était de 39%
chez les patients traités 72 semaines versus 18% chez les patients traités 48
semaines. L’ensemble de ces données suggérent qu’un allongement de la durée de
traitement à 72 semaines chez les patients qui répondent lentement (20% des
patients infectés par un génotype 1) est nécessaire (Berg, 2006).
59
Charge virale (CV) pré-thérapeutique
Tester RVR à S4
RVR et une CV préthérapeutique basse,
traiter 24 semaines
Pas de RVR, prévoir un
traitement de 48 semaines
Tester RVP à S12
ARN HCV
indétectable, traiter
48 semaines
Chute ARN HCV > 2
log UI/mL, traiter 72
semaines
Chute ARN HCV < 2
log UI/mL, arrêt du
traitement
Tester réponse en fin
de traitement à S24
Tester RVS à S48
ARN HCV
indétectable à S24,
traiter 72 semaines
ARN HCV détectable
à S24, arrêt du
traitement
Tester réponse en fin
de traitement à S48
Tester RVS à S72
Tester réponse en fin
de traitement à S72
Tester RVS à S96
Figure 11 : Algorithme pour individualiser le traitement chez les patients infectés par
un virus de génotype 1 (RVR : réponse virologique rapide, RVP : réponse virologique
précoce, RVS : réponse virologique soutenue). D’après Zeuzem et al., 2009.
60
 Chez les patients infectés par un virus de génotype 2 ou 3
L’individualisation du traitement peut également être envisagée chez des
patients infectés par un virus de génotype 2 ou 3. De nombreuses études ont évalué
une durée de traitement plus court chez ces patients (Berg, 2008). Plusieurs ont
montré, sur de petits effectifs que le taux de RVS était comparable après un
traitement de 16 ou 24 semaines (Mangia, 2005; von Wagner, 2005; Andriulli, 2006).
Cependant dans l’étude multicentrique internationale randomisée ACCELERATE, où
des doses plus faibles de RBV ont été utilisées (800 mg/jour), le taux global de RVS
était plus faible chez les patients traités 16 semaines que 24 semaines, bien que la
différence ne soit significative que chez les patients infectés par un virus de génotype
2 (Shiffman, 2007). Chez les patients qui avaient eu une RVR, la RVS était
significativement plus élevée chez ceux traités 24 semaines par rapport à ceux
traités 16 semaines (85% versus 79%, p<0,001). Le traitement plus court était
associé à un risque de rechute plus élevé.
Les virus de génotypes 2 et 3 ne répondent pas de la même façon au
traitement. En effet, le taux de RVS est plus faible chez les patients sans RVR
infectés par un génotype 3 que chez les patients infectés par un génotype 2, et
également chez les patients qui ont une durée de traitement plus courte avec une
RVR (Mangia, 2005; Shiffman, 2007; Dalgard, 2008). Des études complémentaires
sont nécessaires pour savoir si la durée de traitement doit ou pas être raccourcie
chez les patients infectés par un virus de génotype 3.
La charge virale pré-thérapeutique a également son importance puisque les
patients avec une concentration d’ARN HCV plasmatique faible et une charge virale
indétectable à S4 ont un taux de RVS aussi élevé après 16 semaines de traitement
qu’après 24 semaines de traitement (82-100% et 81-100% respectivement). Une
étude a suggéré que les patients avec une activité des ALAT normale en préthérapeutique faisaient plus souvent des rechutes après un traitement cours (14%
après 12-14 semaines de traitement versus 2% après 24 semaines) (Andriulli, 2006).
Le taux de RVS peut également être optimisé en réduisant le taux de rechute.
Les patients qui ont une charge virale HCV pré-thérapeutique élevée ont un taux de
RVS inférieur et un taux de rechute plus élevé que les patients avec une charge
virale faible après 24 semaines de traitement (Zeuzem, 2004; von Wagner, 2005;
Shiffman, 2007). Si les patients sont traités 48 semaines avec des doses de RBV
61
plus élevées, le taux de rechute observé est plus faible (Willems, 2007). Les patients
infectés par un génotype 3 répondant moins bien au traitement que les patients
infectés par un génotype 2, un traitement plus long, avec des doses de RBV plus
élevées pourrait leur être proposé. Les données actuelles sont basées sur des
études rétrospectives et nécessitent d’être confirmées par des études prospectives,
mais une individualisation de traitement peut être proposée chez ces patients
(Figure 12).
Charge virale (CV) préthérapeutique
Tester RVR à S4
RVR et une CV préthérapeutique basse,
traiter 16 semaines
Pas de RVR ou charge
virale préthérapeutique
élevée, prévoir un
traitement de 24 semaines
Tester réponse en fin
de traitement, à S16
Tester réponse en fin
de traitement, à S24
Tester RVS, à S40
Tester RVS, à S48
Figure 12 : Algorithme pour individualiser le traitement des patients infectés par un
virus de génotype 2 ou 3 (RVR : réponse virologique rapide, RVP : réponse
virologique précoce, RVS : réponse virologique soutenue). D’après Zeuzem et al.,
2009.
 Chez les patients infectés par un virus de génotype 4, 5 ou 6
Les virus de génotypes 4, 5 et 6 représentent environ 20% des infections HCV
dans le monde. Ce sont les génotypes les moins répandus dans les pays
industrialisés et ils ont une distribution géographique assez restreinte. Ceci explique
en grande partie qu’il y ait moins de données disponibles sur le traitement de ces
génotypes ou sur des effectifs plus faibles. L’optimisation de la durée de traitement
est essentielle chez les patients infectés par ces génotypes pour s’assurer que le
62
taux de RVS est optimal sans exposer les patients à une durée de traitement qui
pourrait avoir des conséquences défavorables en terme de tolérance.

Patients infectés par un virus de génotype 4
Les patients infectés par un virus de génotype 4 étaient considérés comme
des patients aussi difficiles à traiter que les patients infectés par un virus de
génotype 1. En effet, les premières études montraient une RVS de 5-25% après un
traitement par IFNα seul, et de 25-42% en associant IFNα et RBV. Les études
réalisées avec un traitement associant pegIFNα et RBV ont montré un taux de RVS
de 50 à 70%, intermédiaire entre les génotypes 1 et les génotypes 2 et 3 (Antaki,
2009).
L’optimisation de la durée de traitement a été évaluée dans 3 essais
prospectifs. Dans une première étude, les patients ont reçu un traitement par
pegIFNα-2b et RBV pendant 24, 36 ou 48 semaines (Kamal, 2005). Le taux global de
RVS était significativement plus élevé chez les patients traités 36 ou 48 semaines
que chez les patients traités 24 semaines (66% et 69% versus 29%, p=0,001). Chez
les patients qui avaient un charge virale pré-thérapeutique > 2 millions de copies/mL,
le taux de RVS était plus élevé chez les patients traités 48 semaines (65%) que 36
semaines (35%). Dans une autre étude, les patients ont reçu soit un traitement par
pegIFNα-2b et RBV pendant 24 semaines soit par IFNα-2b et RBV pendant 48
semaines avec une induction de 24 semaines par amantadine (El-Zayadi, 2005). Les
taux de RVS observés dans les 2 bras n’étaient pas différents (49% versus 55%).
Enfin, une étude plus récente a évalué une durée de traitement plus courte en
fonction des concentrations d’ARN HCV à S4 et S12 (Kamal, 2007). Les patients
avec une charge virale indétectable à S4 et S12, traités 24 ou 36 semaines avaient
un taux de RVS élevé avec moins d’effets secondaires et une meilleure observance
au traitement. La valeur prédictive positive de la RVR et de la RVP pour réponse
virale au long terme était de 88% et 83% respectivement. Ces résultats ont été
confirmés par une autre étude (Ferenci, 2008).
Le taux de réponse des génotypes 4 est variable en fonction des origines
ethniques. En effet, les Egyptiens répondraient mieux au traitement (55-63%) que les
Européens (40-51%) qui eux-mêmes répondraient mieux au traitement que les
63
Africains (32-39%) (Roulot, 2007; Moucari, 2009). Ceci pourrait également être pris
en compte dans l’individualisation du traitement.

Patients infectés par un virus de génotype 5
Pour les patients infectés par un virus de génotype 5, aucune étude
prospective n’a été réalisée pour déterminer le taux de succès à un traitement antiHCV. Seules 4 études rétrospectives avec des petits effectifs, ont rapporté le taux de
RVS. Un taux de RVS de 54% a été observé chez des patients traités par IFNα (17
patients, RVS 47%) ou pegIFNα (9 patients, 67%) (Antaki, 2008). Les chances de
succès étaient identiques, que les patients soient traités 24 ou 48 semaines. Une
autre étude a rapporté un taux de RVS de 60% quelque soit le type de traitement
(IFNα ou pegIFNα) (Bonny, 2006). Le taux de succès thérapeutique était comparable
entre les patients infectés par un virus de génotype 5 et ceux infectés par un virus de
génotype 2 ou 3 (63%), mais plus élevé que chez des patients infectés par un virus
de génotype 1 (37%). Des taux de RVS plus élevés ont été rapportés dans d’autres
études: 83% chez 7 patients traités pour l’une (Delwaide, 2005), 67% chez 12
patients traités pour l’autre (Legrand-Abravanel, 2004).

Patients infectés par un virus de génotype 6
Il existe assez peu de données sur le traitement des patients infectés par un
virus de génotype 6. Une RVS de 62,5% a été rapportée chez des patients traités
par IFNα et RBV pendant 48 semaines (Hui, 2003). Dans cette même étude, les
patients infectés par un génotype 1 avaient un taux de RVS de 29%. Après 52
semaines de bithérapie par IFNα et RBV, une RVS de 82,5% a été observée chez
les patients infectés par un virus de génotype 6 versus 62% chez les patients
infectés par un virus de génotype 1 (Dev, 2002). La thérapie d’induction, réalisée
avec des doses d’IFNα plus élevées pendant les 8 premières semaines, peut
expliquer les taux de RVS plus élevés observés dans cette étude. Une étude
prospective récente, a montré que le taux de RVS observé après 48 semaines de
traitement par pegIFNα ou IFNα et RBV était de 86% (Fung, 2008). Une étude
comparant 3 schémas thérapeutiques, IFNα et RBV pendant 24 semaines, pegIFNα
et RBV pendant 24 semaines ou 48 semaines, a montré un taux de RVS de 52%,
64
39% et 75% respectivement (Nguyen, 2008). Un traitement de 48 semaines par
pegIFN et RBV semble donc le plus approprié chez ces patients. Avec ce schéma, ils
répondent donc aussi bien que des patients infectés par un virus de génotype 2 ou 3.
iii. Prise en charge thérapeutique des patients coinfectés HCV-HIV
L’hépatite C étant l’une des principales causes de morbi-mortalité chez les
patients coinfectés par HIV, son éradication est devenue un enjeu majeur chez ces
patients. Cependant, la prise en charge est encore insuffisante et le traitement de
l’infection HIV est souvent prioritaire. Chez les patients non immunodéprimés, chez
lesquels le traitement antirétroviral peut être différé, le traitement de l’hépatite C est
privilégié afin d’éviter les interactions médicamenteuses et de limiter la toxicité
hépatique des antirétroviraux. Lors de la mise en route d’un traitement anti-HCV,
l’objectif principal est l’éradication du HCV, toutefois la régression de la fibrose et la
prévention des complications de la cirrhose peuvent devenir des objectifs du
traitement. La prise en charge thérapeutique de l’infection HCV chez ces patients est
principalement basée sur les résultats de 4 essais thérapeutiques (Tableau 3)
(Carrat, 2004; Chung, 2004; Laguno, 2004; Torriani, 2004). Le traitement
actuellement recommandé chez ces patients est une bithérapie par pegIFNα et RBV
pendant 48 semaines quelque soit le génotype. Le taux de succès thérapeutique est
cependant beaucoup plus faible chez les patients coinfectés HCV-HIV que chez les
monoinfectés HCV.
Plus récemment, il a été montré que la RVR avait une valeur prédictive
positive pour la RVS de 97% et qu’une baisse de la charge virale de moins de 2 log à
S12 avait une valeur prédictive négative de 99%. Une concentration d’ARN HCV
plasmatique supérieure à 460 000 IU/ml à S4 ou un ARN HCV supérieure à 39 000
UI/ml à S12 sont également des facteurs négatifs de réponse au traitement chez les
patients coinfectés par HIV (Payan, 2007).
Chez des patients immunodéprimés, la réponse au traitement par pegIFNα et
RBV est de 26% chez les patients ayant des taux de lymphocytes CD4+ < 250/mm3
et de 32% chez les patients ayant un taux de CD4+ > 250/mm3 (p=NS) (Mira, 2009).
65
Tableau 3: Taux de réponse virologique soutenue (RVS) dans 4 essais menés chez
des patients co-infectés HCV/HIV traités par bithérapie pegIFNα et RBV pendant 48
semaines.
RVS
Nom de l’essai
PEG-IFNα2a
Schéma thérapeutique
RVS
génotypes génotypes
1/4
2/3
+
RBV
pegIFNα-2a 180 µg/sem + RBV 800 mg/j
29 %
63 %
APRICOT
IFNα-2a 3MUI x 3/ sem + RBV 800 mg/j
7%
20 %
pegIFNα-2a 180 µg/sem + RBV 600-1000 mg/j
14 %
73 %
IFNα-2a 3MUI x 3/ sem + RBV 600-1000 mg/j
6%
33 %
pegIFNα-2b 1,5 µg/kg/sem + RBV 800 mg/j
17 %
44 %
IFNα-2b 3MUI x 3/ sem + RBV 800 mg/j
6%
43 %
pegIFNα-2b 1,5 µg/kg/sem + RBV 1000-1200
38 %
47 %
7%
53 %
(n=860)
ACTG
(n=133)
PEG-IFNα2b
RBV
+
RIBAVIC
(n=412)
mg/j
Laguno et al
IFNα-2b 3MUI x 3/ sem + RBV 1000-1200 mg/j
(n=95)
Dans cette population, les patients qui ont une activité sérique des ALAT
normale ont plus de chances de répondre à une bithérapie par pegIFNα et RBV que
des patients qui ont une activité sérique des ALAT anormale (50% versus 29%
respectivement) (Maida, 2010). Dans cette étude, une activité des ALAT normale
était un facteur associé de manière indépendante à la réponse au traitement. Le
traitement anti-HCV chez ces patients ne doit donc pas être négligé.
Des progrès sont nécessaires dans la prise en charge de l’infection HCV chez
les patients coinfectés par HIV, pour que le taux de succès thérapeutique dans cette
population égale celui observé chez les patients infectés par HCV seul.
66
iv. Traitement des patients hémodialysés et transplantés rénaux
La stratégie thérapeutique de l’infection HCV chez les patients TR est publiée
dans les recommandations cliniques internationales KDIGO (Kidney Disease:
Improving Global Outcomes (KDIGO) 2008). Le traitement de l’infection HCV par
IFNα après transplantation rénale a été lié à une augmentation des risques de
dysfonctionnement ou de rejet du greffon. (Rostaing, 1995 ; Carbognin, 2006;
Kamar, 2006; 2008; Weclawiack, 2008). De ce fait, son utilisation après
transplantation rénale est fortement déconseillée sauf chez des patients où le
bénéfice du traitement est supérieur au risque de perte du greffon. Récemment, il a
été montré qu’un traitement par IFNα après une transplantation rénale pouvait être
envisagé avec peu d’effet néfaste sur le greffon, s’il était instauré plusieurs années
après la transplantation (Pageaux, 2009). L’IFNα est à ce jour le seul traitement
disponible puisque la RBV ou l’amantadine n’ont pas d’influence sur la virémie ou
l’histologie du foie (Kamar, 2006).
Actuellement, la meilleure stratégie thérapeutique pour ces patients est de
traiter l’infection HCV avant la transplantation au stade de dialyse (Rostaing, 1998;
Morales,
2000;
Campistol,
2002;
Cruzado,
2003;
Kamar,
2003;
2008).
L’administration de RBV n’est pas recommandée car la clairance rénale diminuée
provoque une accumulation de RBV et donc une hémolyse importante chez les
patients en insuffisance rénale terminale. Un schéma thérapeutique pour la prise en
charge de l’infection HCV chez les patients hémodialysés candidats à une TR est
disponible (Dominguez-Gil, 2009). En résumé, le traitement de choix par IFNα doit
être proposé aux patients qui ont une hépatite virale active et une hépatite chronique
prouvée par biopsie hépatique. Il peut également être proposé aux patients qui ont
une hépatite chronique sans atteinte hépatique. Le contrôle de l’infection HCV avant
la transplantation présente de nombreux avantages :
- il permet de prévenir la progression de l’atteinte hépatique (Kamar, 2006),
les pathologies liées à l’infection HCV telles que les glomérulonéphrites (Cruzado,
2003) et le diabète post-transplantation
- les patients traités avant la transplantation rénale ont plus de chance de
répondre au traitement anti-HCV (2008). Il a été montré que si le HCV est éliminé
sous dialyse, le taux de rechute après transplantation rénale est très rare, malgré les
traitements immunosuppresseurs post-transplantation (Kamar, 2003). Ce traitement
67
chez des patients HD est plus efficace que des patients non urémiques, en raison
d’une clairance de l’IFNα moins rapide chez ces patients (Rostaing, 1998).
Les recommandations sont donc un traitement par IFNα à 3 millions d’unités 3
fois par semaine, 48 semaines pour les patients infectés par un virus de génotype 1
ou 4, et 24 semaines pour les patients infectés par un virus de génotype 2 ou 3. Une
charge virale HCV doit être réalisée 12 semaines après le début du traitement pour
évaluer la RVP et décider de la poursuite du traitement pendant 24 ou 48 semaines.
La RVP est un bon facteur prédictif de la RVS lors d’un traitement par IFNα chez ces
patients. Le taux de RVS est d’environ 40% (Russo, 2003; Weclawiack, 2008).
Les patients infectés par HCV qui ne peuvent pas bénéficier d’un traitement,
doivent être placés sur la liste de transplantation car leur espérance de vie est
meilleure que celle des patients qui restent sous dialyse (Pereira, 1998; Abbott,
2004; Bloom, 2005).
La meilleure stratégie de traitement anti-HCV avant la transplantation reste à
définir (Berenguer 2008). La longue expérience de traitement par IFNα pourrait
maintenant laisser place à de nouvelles thérapies si on considère les données
récemment publiées sur le traitement des patients dialysés par pegIFNα associé ou
non à la RBV. Un traitement par pegIFNα (135 µg/semaines) serait plus efficace et
mieux toléré qu’un traitement par IFN (3 millions d’unités 3 fois par semaine) chez les
patients dialysés (48% versus 20%, p=0,07) (Liu, 2008). Dans l’analyse multivariée,
le traitement par pegIFNα était un facteur indépendamment prédictif de RVS. La
combinaison de pegIFNα (135 µg/semaine) et de RBV à des doses faibles (200
mg/jour, ajustées en fonction des concentrations plasmatiques de RBV) a donné des
résultats très prometteurs : 15/16 patients infectés par un virus de génotype 1 et
19/19 patients infectés par un virus d’un autre génotype ont complètement éliminé le
virus (Rendina, 2007). Cependant la tolérance a été un problème majeur, puisque
74% des patients ont développé une anémie due à la RBV. Malgré ces résultats très
intéressants, l’expérience acquise avec les traitements par IFNα standard et la
meilleure tolérance de celui-ci en font toujours le traitement de choix de l’hépatite C
chez les patients hémodialysés (2008).
68
D- Mécanismes d’échappement viral au traitement
Les mécanismes de résistance mis en place par le virus pour contourner les
effets antiviraux de l’IFNα et de la RBV sont nombreux, et ont été identifiés grâce à
des études in vitro sur des systèmes réplicons et in vivo, par analyse de la variabilité
génétique (par des approches de clonage et de séquençage) des protéines
(Wohnsland, 2007 ; Sklan, 2009). La protéine C, la protéine d’enveloppe E2, la
sérine protéase NS3/4A et la protéine NS5A sont les principales impliquées dans les
mécanismes de résistance (Figure 13).

La protéine C du HCV induit l’expression des protéines SOCS-3
(suppressor of cytokine signaling 3) et SOCS-1 in vitro, qui
antagonisent l’action de l’IFNα en bloquant la voie Jak/Stat (Bode,
2003; Vlotides, 2004 ). Elle réduirait également le nombre de pDC et
leur capacité à produire de l’IFNα (Dolganiuc, 2006).
69
Figure 13 : Stratégies d’évasion du virus HCV face au système immunitaire.
IF N‐α
IF N‐α
HCV
IF N‐β
IF N‐α
IF N‐β
Hépatocyte
IFNAR1
T Y K ‐2
IF N‐α
IFNAR2
J AK
Endosome
↑ SOCS1/3
HCV
Structures
génomiques
Core HCV
TLR
P
P
RIG-I ou Mda5
IP S ‐1
T R IF
P
NS3/4A
HCV
IR F ‐3
IR F ‐3
NS3/4A
HCV
P
NF-κB
IR F ‐9
NS5A HCV
HCV E2
NF-κB
Noyau
2’5’ OAS, PKR et
autres protéines (ISG)
IFN-β
IFN-α
ISRE
70

Pour la protéine E2, l’étude de la région de fixation à CD81, HVR2, n’a
pas montré d’association entre les variations d’AA observées dans
cette région et la réponse au traitement par IFNα (Hofmann, 2003).
L’étude des quasi-espèces virales de la région HVR1 a montré qu’une
hétérogénéité faible avant traitement et qu’un changement des quasiespèces tôt lors du traitement étaient associés à un taux de RVS plus
élevé (Abbate, 2004; Chambers, 2005). Cependant le rôle de cette
région dans la réponse au traitement est un sujet assez controversé car
d’autres équipes n’ont pas trouvé de lien direct entre la variabilité
génétique de cette région et la réponse au traitement (Sandres, 2000).
La protéine E2 du HCV induirait une résistance à l’IFNα par inhibition
de la PKR (Taylor, 2001). Une séquence de 12 AA dans la partie Cterminale présente une homologie avec les sites d’autophosphorylation
du domaine régulateur de PKR et de son substrat naturel eIF-2α. Cette
région est appelée PKR-eIF-2α phosphorylation homology domain
(PePHD). L’interaction entre PePHD et PKR serait impliquée dans la
résistance des génotypes 1a et 1b à l’IFNα. Les souches de sous-types
1a ou 1b, les plus résistantes à l’IFNα, ont plus d’homologie de
séquence avec les sites de phosphorylations de PKR que les souches
de génotypes 2 ou 3, suggérant que cette portion de génome pourrait
expliquer la différence de réponse au traitement observée entre ces
génotypes. Cependant, aucun polymorphisme n’a été spécifiquement
associé à la réponse au traitement pour les virus génotypes 1, 2 ou 3,
(Sarrazin, 2000; Boulestin, 2002; Watanabe, 2003; Gaudy, 2005). Une
étude récente a cependant montré sur 60 patients infectés par un
génotype 1b ou 1a, traités par pegIFNα et RBV que la présence de plus
de 4 mutations dans le domaine PePHD était prédictive d’une meilleure
RVS (Munoz de Rueda, 2008).

La protéine NS3/NS4A est impliquée dans plusieurs mécanismes
inhibant la réponse antivirale. Elle diminue la phosphorylation et la
translocation de l’IRF3 et empêche l’activation du facteur de
transcription NF-κB, et donc la production d’IFN de type I (Foy, 2003).
Cette protéine joue également un rôle dans l’évasion face au système
immunitaire en perturbant la voie de signalisation RIG-I en inactivant la
71
protéine adaptatrice Cardif (Foy, 2005; Meylan, 2005 ). Elle bloque
l’expression des gènes de défense en clivant le TLR3 (Li, 2005). Enfin,
elle perturbe la phosphorylation de la protéine Stat-1 impliquée dans la
voie de signalisation IFN inhibant ainsi l’activité antivirale de l’IFN
(Helbig, 2008).

La protéine NS5A est également impliquée dans la résistance à l’IFNα
par différents mécanismes. Elle inhibe la PKR et cette inhibition serait
génotype dépendant ce qui pourrait expliquer en partie les différences
de réponse observées entre les différents génotypes. Des études
réalisées au Japon ont montré que les mutations retrouvées dans une
région de 40 AA, dénommée ISDR pour IFNα sensitivity determining
region, joueraient un rôle dans la RVS des patients infectés par un
génotype 1b (Enomoto, 1996) et plus récemment chez des patients
chinois (Shen, 2007). Les patients infectés par un génotype 1b, qui ont
plus de 4 mutations dans cette région, répondent plus souvent au
traitement par IFNα (Pascu, 2004). Cependant les résultats rapportés
en Europe et aux Etats-Unis concernant la corrélation entre les
mutations décrites dans l’ISDR et la réponse à l’IFN sont assez
discordants (Khorsi, 1997; Zeuzem, 1997 ; Duverlie, 1998; Murphy,
2002). L’ISDR est nécessaire à la fixation de NS5A à la PKR, mais elle
n’est pas suffisante. Cette interaction nécessite également une région
de 26 AA, dénommée PKRBD pour PKR binding domain. Récemment,
la présence de mutations dans E2-PePHD, NS5A-PKRBD, NS5AISDR, et NS5A-V3 associées à la réponse au traitement a été
recherchée chez 60 patients caucasiens infectés par un virus de
génotype 1 (Munoz de Rueda, 2008). Seule la présence de plus de 4
mutations dans le domaine NS5A-PKRBD a été liée à une meilleure
réponse au traitement par pegIFNα et RBV. Une autre étude réalisée
chez 45 patients infectés par un génotype 1b a montré que la présence
de 6 mutations ou plus dans la région variable 3 de NS5A (NS5A-V3) et
sa région flanquante était un seuil optimal pour prédire la RVS. Cette
région (AA 2334-2379) est appelée région déterminant la résistance à
l’IFN et la RBV ou IFN/RBV resistance-determining region (IRRDR) (ElShamy, 2008). L’expression de NS5A induit également la production
72
d’IL-8 qui inhibe l’activité de l’IFNα. In vivo, il a été observé que des
patients non répondeurs avaient des taux sanguins d’IL-8 plus élevés
que les patients répondeurs (Polyak, 2001; Mihm, 2004).
E- Nouvelles perspectives thérapeutiques
i. Amélioration des traitements actuellement disponibles
Des améliorations ont été réalisées en terme de biodisponibilité, de
pharmacocinétique et de tolérance des IFN médicamenteux. L’albuféron alpha est
une forme fusionnée de l’IFNα-2b avec l’albumine sérique humaine. Il a une forte
activité antivirale, et est bien toléré grâce à une demi-vie plus longue que les IFN
standards ou pégylés permettant 1 injection toutes les 2 semaines (Chemmanur,
2006). L’albuféron est en essai de phase III.
Un interféron de type III, l’IL29 ou IFN-λ1, en essai de phase I, a montré une
activité antivirale contre les virus de génotype 1, avec des effets secondaires
moindres que ceux observés avec l’IFNα (Muir, 2009).
Un analogue de la RBV, la viramidine a été développé pour améliorer le profil
de tolérance et éviter l’effet secondaire majeur de la RBV, l’anémie. Cette nouvelle
molécule se concentre dans les hépatocytes et a été associée à un risque réduit
d’anémie hémolytique (Gish, 2007). Cependant les études de phase III ont montré
que la viramidine à dose fixe était moins efficace que la RBV (Benhamou, 2009;
Marcellin, 2010).
ii. Futurs traitements
L’efficacité modérée de la bithérapie par pegIFNα et RBV, seul traitement
actuellement disponible, rend la mise à disposition de nouvelles molécules de plus
en plus urgente. La découverte et le développement de celles-ci sont depuis peu
facilités par les nouvelles méthodes de culture et les modèles animaux disponibles
(Boonstra, 2009). De nombreuses molécules sont en cours de développement
(Webster, 2009). Les plus avancées sont les inhibiteurs sélectifs du HCV
73
comprenant les inhibiteurs de la polymérase et de la protéase, communément
appelés STAT-C pour Specifically Targeted Antiviral Therapy for HCV.
 Les inhibiteurs de protéases
Deux classes ont été développées, celle des molécules peptidomimétiques et
celle des molécules non peptidiques.
La molécule la plus avancée actuellement, le telaprevir (VX-950) est un
inhibiteur réversible, sélectif et spécifique de la protéase NS3/4a (Reesink, 2006).
Dans les études cliniques préliminaires, elle était bien tolérée avec une efficacité
antivirale substantielle. Cependant certains patients traités par monothérapie de
telaprevir ont connu un échec virologique lié à la sélection de mutants de résistance.
La combinaison de celle-ci avec l’IFNα-2a a montré une efficacité plus importante et
une trithérapie avec la RBV augmente encore le taux de réponse au traitement
(Forestier, 2007; Lawitz, 2008). L’association du telaprevir à l’IFN et la RBV permet
de prévenir le développement de résistances. Les essais de phase II, PROVE 1 et
PROVE 2, ont évalué l’efficacité et la tolérance d’une trithérapie associant pegIFNα2a, RBV et telaprevir chez des patients infectés par un virus de génotype 1 naïfs de
traitement (Hezode, 2009; McHutchison, 2009). Dans les 2 études, les patients inclus
dans les bras avec telaprevir étaient significativement plus souvent répondeurs
virologiques à S4 et S12. Le taux de RVS était significativement plus élevé chez les
patients des bras avec telaprevir (60-69%) que chez les patients du bras contrôle
(41-46%). Chez des patients non répondeurs a un précédent traitement, le
retraitement par telaprevir associé au pegIFNα et à la RBV permettait d’obtenir une
RVS chez 51-53% des patients versus 14% dans le groupe contrôle de traitement
par pegIFNα et RBV (McHutchison, 2010).
Le second inhibiteur de protéase le boceprevir (SCH503034) est un inhibiteur
peptidomimétique. L’efficacité de cette molécule a été montrée en association avec
le pegIFNα et la RBV chez des patients infectés par un virus de génotype 1 non
répondeurs à un précèdent traitement par IFNα et RBV (Sarrazin, 2007).
Un autre inhibiteur de la famille des ketoamides, le narlaprevir, associé à la
RBV et au pegIFN induirait une baisse de la charge virale rapide chez les patients
infectés par un génotype 1 (Sarrazin, 2010).
74
Le TMC435 est un inhibiteur macrocyclique de la protéase. Les résultats de
l’étude de phase I montrent une diminution de la charge virale d’environ 3,5 log à 3
jours et une bonne tolérance (Reesink, 2009).
D’autres inhibiteurs de protéases sont en cours de développement dans des
essais de phase I ou II (R7271, ITMN191, MK7009, BI201335, SCH900518, BMS650032, PHX1766) (Sarrazin, 2010).
 Les inhibiteurs de polymérases
Deux classes structurales distinctes d’inhibiteurs de polymérase avec des
modes d’action différents ont été rapportées : (1) les analogues nucléosidiques qui
ciblent le site actif de la polymérase de manière compétitive et ont un large spectre
d’action, (2) les inhibiteurs non nucléosidiques qui agissent soit par interaction direct
avec le site actif soit par fixation au site allostérique empêchant ainsi le processus
d’initiation. Cette deuxième classe est plus spécifique (Huang, 2006).
 De nombreux analogues nucléosidiques ont été identifiés comme
inhibiteurs de la RdRp et bloquent la réplication HCV dans les systèmes
réplicons (Sarisky 2004). Le premier développé, la valopicitabine (prodrogue
de la 2’-méthylcytidine) a été stoppé en raison d’effets gastro-intestinaux
sévères (Zeuzem, 2008). Le deuxième analogue nucléosidique développé a été
le R1626. Cette molécule a montré une forte activité antivirale dans un essai de
phase I réalisé chez des patients infectés par un génotype 1 (Roberts, 2008).
Dans l’étude de phase II, une indétectabilité de la charge virale à S4 était
obtenue chez 74% des patients sous R1626 cependant les effets secondaires
sévères (lymphopénie et maladies infectieuses) ont conduit à l’arrêt du
développement de la molécule (Pockros, 2008). Le R7128, prodrogue de PSI6130, est un analogue de la cytidine. La baisse de la charge virale, obtenue à
S4 chez des patients naïfs de traitement infectés par un virus de génotype 1, et
l’absence
d’effets
secondaires
additionnels
sont
des
résultats
très
encourageants. Ce sera probablement la première molécule de cette classe à
entrer dans un essai de phase III.
 Des analogues non nucléosidiques de la polymérase virale ont
également été décrits. Au moins 4 sites allostériques de fixation des molécules
ont été identifiés pour inhiber la polymérase NS5B :
75
o les inhibiteurs non nucléosidiques (INN) du site benzimidazole
au niveau du pouce ou INN-site 1 : BILB1941, BI207127 et MK3281. Ces molécules ont montré une activité antivirale faible à
modérée dans des essais de phase I chez des patients infectés
par un virus de génotype 1 (ou 3 pour la molécule MK-3281)
(Erhardt, 2009; Sarrazin, 2010). Le développement du BILB1941
a été arrêté.
o Les INN du site thiophene au niveau du pouce ou INN-site 2 : le
filibuvir, VHC-759, VHC-916 et VHC-222. Le filibuvir a montré
une activité antivirale moyenne dans une étude de phase I chez
des patients infectés par un virus de génotype 1. Des essais de
trithérapie avec pegIFNα-2a et RBV sont en cours. Les autres
molécules pour l’instant n’ont été évaluées qu’en monothérapie.
o Les INN du site benzothiadiazine au niveau de la paume ou INNsite 3 : les représentants actuellement les plus avancés sont le
ANA598 et ABT333 qui ont montré une activité antivirale en
monothérapie et en association avec le pegIFN et la RBV sur les
patients infectés par un génotype 1 dans des essais de phase II.
o Les INN du site des benzofuranes au niveau de la paume ou
INN-site 4 : les études de monothérapie réalisées avec la
molécule HCV-796 ont montré une bonne tolérance et une
réduction de la charge virale HCV après 14 jours de
monothérapie in vitro et in vivo (chez des souris humanisées)
(Kneteman, 2009). Son développement a été arrêté en raison
d’augmentations des enzymes hépatiques. Le GS-9190 est
actuellement en développement pour le traitement de patients
infectés par un virus de génotype 1. Son activité en
monothérapie est faible, des essais de phase IIb en combinaison
avec l’IFNα et la RBV sont en cours.
L’une des craintes majeures pour ces nouvelles molécules (antipolymérases
et antiprotéases) est l’émergence de mutations de résistances, comme cela a déjà
été observé pour les molécules utilisées dans le domaine du HIV. Des études in vitro
ont permis de caractériser les mutations de résistance développées contre ces
76
molécules. La caractérisation de ces mutations chez des patients en échec est moins
évidente. Pour les inhibiteurs de protéases, les mutations pouvant être sélectionnées
sont la V36A/M, la T54A/V, la R155K/Q/T, l’A156T/S ou la D168V/A. Les mutations
les plus souvent sélectionnées sont celles en position 156 et 155 pour le telaprevir et
celle en position 156 pour le boceprevir. Pour les inhibiteurs de polymérases, les
mutations sélectionnées peuvent être la S282T (2’-C-méthylnucléosides), la S96T
(4’-C-méthylnucléosides), pour les analogues nucléosidiques et pour les non
nucléosidiques les plus fréquentes sont la C316Y, M423T et L419M (Soriano, 2009 ;
Sarrazin, 2010).
 Autres approches thérapeutiques :
L’immunomodulation de la voie des IFN a été un champ d’investigation
pour développer de nouvelles molécules. Des agonistes des TLR comme le
resiquimod (agoniste de TLR7 et 8) (Pockros, 2007) et le CPG10101 (agoniste de
TLR9) (McHutchison, 2007) ont été développées. Ces molécules exerçaient une
activité antivirale en stimulant les voies d’IFN endogènes. Cependant les effets
secondaires pour l’agoniste de TLR7 et le manque d’efficacité pour l’agoniste de
TLR9, ont conduit à l’arrêt de leur développement (Zeuzem, 2008). Deux nouvelles
molécules sont en essais de phase I : IMO2125 (agoniste de TLR9) et ANA773
(agoniste de TLR7).
La cyclosporine A, molécule utilisée en transplantation d’organe pour ses
propriétés immunosuppressives, diminue la réplication du HCV par un mécanisme
bloquant spécifiquement les cyclophilines B (Watashi, 2005). Ces dernières
interviennent dans la liaison de la protéine NS5B à l’ARN viral et jouent ainsi le rôle
de protéines régulatrices de la réplication du HCV. Des inhibiteurs de la
cyclophiline B sans effet immunosuppresseur, tels que la molécule DEBIO-025
(alisporivir), sont en cours de développement. Administré en association avec l’IFN, il
induit une réduction de la charge virale de plus de 4 log (Coelmont, 2009). Il est
actuellement testé en phase IIb. D’autres molécules NIM811 et SCY-635 sont en
cours d’évaluation.
77
Les ARN interférents pourraient être une option thérapeutique (Watanabe,
2007). Ces ARN reconnaissent une séquence d’ARN spécifique formant avec celle-ci
un ARN db. Dans les cellules de mammifères, l’introduction d’ARN db active la voie
des IFNs et induit une dégradation non spécifique des ARN, l’inhibition de la
traduction des ARN et la mort cellulaire. L’utilisation de siRNA pour small interfering
RNA (petits ARN db), ciblant soit le génome du HCV soit des voies cellulaires
impliquées dans l’infection HCV, pourrait être une stratégie antivirale intéressante
(Khaliq, 2010). Un siRNA, le BLT-HCV, ciblant 3 régions différentes du HCV est en
cours d’évaluation dans des essais cliniques.
Les micro-ARN (miRNA) représentent une classe de petites molécules d’ARN
non codant capable de reconnaître les transcripts d’ARN viral et d’altérer l’expression
des gènes viraux. Des hauts niveaux du miRNA mR-122 ont été associés à une
réponse au traitement par IFNα et RBV favorable (Sarasin-Filipowicz, 2009). Ils
pourraient donc devenir une nouvelle stratégie thérapeutique.
Des inhibiteurs de l’α-glucosidase sont en développement. Cette enzyme
joue un rôle critique dans la maturation virale en initiant le processus de Nglycosylation des protéines d’enveloppe. Le celgosivir est en essai de phase II
(Durantel, 2007).
Les facteurs de l’hôte peuvent également être des cibles thérapeutiques. Les
thiazolides représentent une classe d’inhibiteurs ciblant spécifiquement une voie
impliquée dans la réponse immunitaire antivirale. Un représentant de cette classe, le
nitazoxanide, module la réponse antivirale médiée par la voie PKR, en activant cette
dernière. Dans les essais de phase II réalisés chez des patients infectés par un
génotype 4, le nitazoxanide en association avec pegIFN et RBV a montré un taux de
RVS de 80% (Keeffe, 2009).
78
V- PERSISTANCE OCCULTE DU HCV
La résolution clinique d’une hépatite C, soit spontanée soit après un traitement
est synonyme d’éradication virale. Cependant, ces six dernières années, différents
travaux ont rapporté la persistance du virus HCV à de faibles niveaux dans le
plasma, les CMSPs et le foie de certains patients.
A- Définition de l’infection occulte à HCV
i. Les différents types d’hépatite C occulte
 Hépatite C occulte « cryptogénique »
En 2004, une nouvelle forme d’hépatite C dite occulte, a été décrite chez des
patients qui présentaient des troubles hépatiques d’étiologie inconnue et n’avaient ni
Ac anti-HCV ni ARN HCV détectables avec les techniques usuelles (Castillo, 2004).
Toute autre cause connue de pathologie hépatique (virus, maladie autoimmune,
alcool, médicaments hépatotoxique, désordres métaboliques) avait été écartée chez
ces patients. L’utilisation de techniques de PCR très sensibles a permis de mettre en
évidence la présence d’ARN HCV dans le foie chez 57 % d’entre eux. Ceci fut la
première description d’hépatite C dite occulte. L’ARN HCV a par la suite été retrouvé
dans les CMSPs de 70% de ces patients (Tableau 4).
De manière plus surprenante, la présence d’hépatite C occulte a récemment
été décrite chez des patients qui n’avaient aucune atteinte hépatique, ni Ac anti-HCV
ni ARN HCV détectables (De Marco, 2009). Les 276 patients inclus dans cette étude
provenaient 3 cohortes différentes : patients présentant un lymphome non
hodgkinien, un cancer de la vessie, ou suivi dans une cohorte évaluant l’existence
d’un lien entre le cancer et la nutrition. L’ARN HCV a été détecté dans les CMSPs de
9 d’entre eux évoquant une hépatite C occulte.
79
 Hépatite C occulte « secondaire »
L’hépatite C occulte a également été décrite dans 2 autres situations cliniques:
chez des patients Ac anti-HCV (+)/ARN HCV (-) ayant des fonctions hépatiques
normales (Tableau 4) qui ont éliminé le virus soit spontanément après une hépatite
C aiguë (Radkowski, 2005b; Carreno, 2006) soit après traitement antiviral efficace
d’une hépatite C chronique (Pham, 2004; Radkowski, 2005a; Castillo, 2006).
Tableau 4 : Profils définissant une infection occulte à HCV (adapté de la revue de
Pham et al., 2010)
Infection occulte à HCV
Infection occulte à HCV
«cryptogénique»
« secondaire »
Plasma*
-
-
Plasma**
+/-
+/-
CMSP
+/-
+/-
+
+/-
-
+
oui/non
non
Description
Détection de l’ARN HCV
PBH
Ac anti-HCV
Enzymes hépatiques élevées
Au moins 1
marqueur
positif
* PCR de routine (50-500 UI/mL) ** PCR très sensible (≤3 UI/mL)
Ces infections occultes à HCV remettent en cause la notion d’éradication du
HCV et pourraient avoir des implications cliniques non négligeables et être la cause
de réactivations virales HCV éventuelles. Pourtant, il semble que ce ne soit pas le
cas puisque les données de la littérature montrent que le taux de rechute chez les
patients en succès thérapeutique est extrêmement faible, 2-3% (Welker, 2009). De
plus des études réalisées sur des cohortes de patients plus importantes, montrent
une absence de détection du HCV dans les CMSPs et le foie de patients guéris
malgré l’utilisation de techniques très sensibles (Bernardin, 2008; Halfon, 2008;
Maylin, 2008; Maylin, 2009 ).
80
ii. Diagnostic de l’infection occulte à HCV
La méthode de référence permettant de diagnostiquer une infection HCV
occulte est la détection d’ARN HCV dans les cellules hépatocytaires (Castillo, 2004).
Cependant, les PBH ne sont pas toujours disponibles et l’arrivée de méthodes non
invasives d’évaluation de la fibrose fait qu’elles le seront de moins en moins.
L’alternative proposée est la détection de l’ARN HCV dans les CMSPs
(Carreno, 2004). Globalement, le génome HCV est détecté dans les CMSPs chez
50% des patients qui ont une hépatite C occulte.
Le virus est également présent dans le plasma mais en quantité insuffisante
pour être détecté par les techniques de biologie moléculaire classiquement utilisées.
En effet, les charges virales observées sont comprises entre 60 et 160 copies/mL
(Bartolome, 2007) et nécessitent l’utilisation de techniques de biologie moléculaire
sensibilisées.
Les équipes qui ont décrit des hépatites C occultes (Tableau 5) ont utilisé les
méthodes suivantes pour augmenter la sensibilité de la détection de l’ARN HCV
(Pham, 2010) :
1- des techniques de biologie moléculaire basées sur l’amplification de la
région 5’NC du HCV par RT-PCR nichée suivi d’une hybridation d’acides nucléiques
(Southern-Blot), avec une sensibilité ≤ 3 UI/mL.
2- la stimulation ex vivo des CMSPs par des mitogènes (phytohémaglutinine
et l’interleukine-2). Ceci augmente de façon significative la réplication du HCV et
donc la détection du génome viral dans des cellules apparemment non infectées par
le HCV (Pham, 2004; Pham, 2005 ; Pham, 2008). L’ARN HCV est détectable dans
les CMSPs non stimulées chez environ 30% des patients guéris d’une hépatite C. Ce
pourcentage augmenterait jusqu’à 75% si la même analyse est réalisée sur des
cellules stimulées en culture.
3- des prises d’essai non conventionnelles de plasma (1-4 mL) ou de CMSPs
(5 x 105, 1 x 106 ou 4 x 106 cellules) sont utilisées (Radkowski, 2005a; Bartolome,
2007; Castillo, 2009b). La détection des hépatites C occultes pourrait ainsi être
augmentée de 10-15%.
81
4- la répétition des tests sur les échantillons successifs de plasma et de
CMSPs, permettrait d’augmenter la fréquence de détection des hépatites C occultes
jusqu’à 100%. En effet, la détection permanente de l’ARN HCV dans le plasma et les
CMSPs est observée dans une minorité de cas (Pham, 2004; Radkowski, 2005a;
Pham, 2008).
La mise en œuvre de ces techniques de manière systématique est
difficilement envisageable en pratique clinique courante mais semble nécessaire
pour détecter ce type d’infection.
B- Caractéristiques cliniques de l’infection occulte
A ce jour, seule une étude a été réalisée pour étudier les caractéristiques
cliniques de l’infection HCV occulte (Pardo, 2007). Elle a comparé des patients avec
une hépatite C occulte « cryptogénique » (n=68) et des patients chroniquement
infectés par le HCV (n=69). Les deux groupes ont été appariés sur l’âge, le sexe,
l’indice de masse corporelle et la durée estimée d’anomalie des enzymes
hépatiques. Les patients avec une hépatite C occulte avaient des taux de cholestérol
et de triglycérides significativement plus élevés que les patients avec une hépatite C
chronique mais une activité sérique des ALAT et gamma glutamyl transpeptidases
(γ-GT) plus faible. Concernant l’histologie hépatique, le nombre de patients avec une
activité nécro-inflammatoire et une fibrose (score F1 ou plus) était plus élevé chez
les patients chroniquement infectés que chez les patients avec une hépatite C
occulte (96% versus 31% et 75% versus 15%, respectivement). La proportion de
patients avec une cirrhose ou une stéatose hépatique était comparable dans les
deux groupes. Le pourcentage d’hépatocytes infectés par le HCV était plus faible
chez les patients avec une hépatite C occulte (5,3%) que chez les patients avec une
hépatite C chronique (10,1%).
L’infection occulte induirait donc moins de lésions hépatiques qu’une infection
chronique. Ceci pourrait s’expliquer par le plus faible niveau de réplication.
82
Tableau 5 : Fréquence de détection du génome HCV dans les différents compartiments étudiés dans les études ayant décrits des
infections occultes à HCV
Etudes
Nombre
patients
Population
(ARN HCV -)
Détection ARN HCV (Techniques sensibilisées)
Génotype HCV
Ac anti HCV
Cytolyse
hépatique
Foie
CMSPs
Plasma
(Castillo, 2004)*
100
-
Oui
57/100 (57%)
40/57 (70%)
NT
1b
(Bartolome, 2007)*
106
-
Oui
106/106 (100%)
69/106 (65%)
62/106 (58%)
1b
(Barril, 2008)*
109
-
Oui
NT
49/109 (45%)
NT
1b
(De Marco, 2009)
276
-
Non
NT
9/276 (3,2%)
NT
1a, 1b, 2a
(Pham, 2004)*†
16
+
Non
NT
13/16 (81%)
15/17 (88%)
1a, 1b, 2a
(Radkowski, 2005a)*†
17
+
Non
3/11 (27%)
9/17 (53%)
4/17 (24%)
1a, 1b, 2a, 3a
(Radkowski, 2005b)*†
11
+
Non
NT
7/11 (64%)
6/11 (54%)
1a, 1b
(Carreno, 2006)*
12
+
Non
10/12 (83%)
6/12 (50%)
NT
1b
(Castillo, 2006)
20
+
Non
19/20 (95%)
13/20 (65%)
NT
1b, 2, 3
(Gallegos-Orozco, 2008)†
25
+
Non
NT
5/25 (20%)
0/25 (0%)
1, 2
* Southern-blot, † Stimulation des CMSPs par des mitogènes,
NT : non testé, CMSPs (cellules mononucléées du sang périphérique)
83
C- Réplication et infectiosité du virus dans l’infection occulte
La détection de brins d’ARN HCV antigénomiques dans les CMSPs ou les
cellules hépatocytaires chez plus de 50% des patients qui ont une hépatite C occulte
suggère l’existence d’une réplication virale (Pham, 2004 ; Castillo, 2005; Radkowski,
2005a ; Radkowski, 2005b; Carreno, 2006; Castillo, 2006). Le virus détecté dans le
plasma de patients avec une hépatite C occulte « cryptogénique » a été retrouvé au
sein des particules de densité 1,03 à 1,04 et 1,08 à 1,19 g/mL (Bartolome, 2007).
Ces densités correspondent à celles de particules virales observées dans l’infection
chronique à HCV, suggérant la présence de virus HCV complets.
L‘infectiosité in vitro du HCV persistant après une RVS n’a été étudié que très
récemment (MacParland, 2009). L’infection HCV de novo de cellules T humaines a
été utilisée pour déterminer si des traces de virus HCV, provenant du plasma ou du
surnageant de CMSPs cultivées d’individus avec une RVS, pouvaient conduire à une
réplication productive du HCV in vitro (MacParland, 2006). Le virus résiduel de 3
patients était capable d’infecter des cellules T de novo et de se propager à des
cellules non infectées (MacParland, 2009). L’ARN HCV détecté dans le plasma lors
d’une infection occulte serait donc potentiellement infectieux. Ceci paraît étonnant en
l’absence de certains récepteurs (SR-BI, CLDN-1 et occludines) sur les CMSPs,
impliqués dans l’entrée du HCV. De plus, une étude a montré que des virus produits
en culture, HCVcc, n’étaient pas capable de se répliquer dans des CMSPs quel que
soit le type cellulaire (Marukian, 2008).
L’infection occulte pourrait donc faciliter la réactivation clinique d’une infection
HCV, en particulier dans des situations où le système immunitaire est altéré par des
comorbidités ou des traitements immunosuppresseurs.
D- Groupes de patients à risque d’infection occulte
La prévalence de l’infection HCV occulte semble non négligeable. Elle pourrait
être un problème majeur dans les unités d’hémodialyse. En présence d’une élévation
de l’activité sérique des enzymes hépatiques et d’un ARN HCV positif dans le sang,
des mesures de prévention sont mises en œuvre dans ces services pour éviter toute
transmission
nosocomiale.
Une
étude
récente
réalisée
sur
109
patients
84
hémodialysés avec des enzymes hépatiques anormales a montré la présence
d’hépatites C occultes « cryptogéniques » en détectant l’ARN HCV génomique dans
les CMSPs de 45% d’entre eux (Barril, 2008). La transmission du HCV au sein
d’unités d’hémodialyses prenant en charge des patients avec une infection occulte
pourrait donc exister. Dans ce cas, des mesures de préventions adaptées seraient à
envisager.
Dans une étude, la transmission interfamiliale a également été évoquée dans
des familles où un patient est infecté par une hépatite C occulte « cryptogénique »
(Castillo, 2009a). Chez 102 membres de familles d’un cas index d’hépatite C occulte
et 118 membres de familles d’un cas index d’hépatite C chronique, des Ac anti-HCV
ont été détectés respectivement chez 10 (9.8%) et 4 (3.4%) d’entre eux. Ces 14
patients n’avaient pas de facteur de risque identifié, 4 avaient une activité sérique
des enzymes hépatiques supérieure à la normale et 9 un ARN HCV détectable dans
le plasma par technique sensibilisée. L’analyse phylogénétique de la région core du
HCV chez 6 familles (5 avec une infection occulte et 1 avec une hépatite C
chronique) a montré que les souches des patients index et des cas d’une même
famille étaient regroupés au sein d’un même cluster. Les patients issus d’une famille
avec un cas d’hépatite C occulte étaient tous infectés par un génotype 1b. Le risque
de contamination chez les personnes vivant aux côtés de patients avec une hépatite
C occulte pourrait être comparable à celui observé chez des proches de patients
infectés chroniquement.
E- Immunobiologie de l’infection occulte à HCV
i. Réponse immune humorale anti-HCV
Lors d’une infection par le HCV, des Ac anti-HCV spécifiques développés
contre les protéines structurales et non structurales apparaissent tardivement après
l’infection et dans certains cas peuvent ne jamais apparaître. Dans ces conditions, le
virus peut facilement échapper au contrôle de la réponse immunitaire humorale.
Chez des patients chroniquement infectés, le titre d’Ac anti-HCV spécifique diminue
rapidement chez les patients guéris suite à un traitement par IFNα (Toyoda, 2005;
Maylin, 2009) et peut même complètement disparaître une dizaine d’années après
85
l’élimination du virus (Takaki, 2000). Une séroréversion spontanée a été observée
chez 2 personnes immunocompétentes (Kondili, 2002) et chez 1 patient
polytransfusé (Lefrere, 2004). Ces patients pourraient donc faire partie des patients
qui ont une infection occulte à HCV « cryptogénique ».
Pour les hépatites C occultes, un test immunoenzymatique ciblant un antigène
de la protéine de capside a permis de mettre en évidence la présence d’IgG antiHCV.
Ce
test
détecte
les
anticorps
dirigés
contre
la
séquence
PKPQRKTKRNTNRRP correspondant aux AA 5 à 19 de la protéine C qui est un
épitope immunodominant. Chez 145 patients Ac anti-HCV (-) avec une hépatite C
occulte, 45 ont été testés Ac anti-HCV (+) avec ce test sérologique (Quiroga, 2009).
Chez des patients chroniquement infectés, ces anticorps sont détectés dans 98,6%
des cas.
ii. Réponse immune cellulaire anti-HCV
Contrairement aux Ac anti-HCV spécifiques, la réponse immunitaire cellulaire
reste détectable des dizaines d’années après la guérison d’une hépatite C aiguë ou
chronique (Takaki, 2000; Semmo, 2005). Des cellules T CD8+ effectrices HCV
spécifiques ont été détectées dans le sang des membres d’une famille non infectés
par le HCV mais exposés de façon continue à un sujet chroniquement infecté
(Scognamiglio, 1999). Ceci suggère la mise en place d’une mémoire immunitaire
suite à une infection subclinique. Le maintien d’une réponse immunitaire T spécifique
pourrait être la conséquence de la persistance du virus HCV à faible niveau sans
réplication apparente. En l’absence d’une réponse humorale efficace, qui peut ne
pas être induite malgré une réponse immunitaire T CD4+ HCV spécifique, la réponse
T spécifique peut suffire à contrôler l’infection par HCV (Post, 2004).
La réponse immunitaire pourrait expliquer l’atteinte hépatique plus modérée
observée chez les patients avec une infection occulte à HCV. Les réponses
immunitaires
cellulaires
de
50
patients
avec
une
hépatite
C
occulte
« cryptogénique », 141 patients avec une hépatite C chronique et 21 patients avec
une pathologie hépatique cryptogénique ont été comparées (Quiroga, 2004). Au
total, 52% des patients avec une infection HCV occulte avait une réponse
proliférative T CD4+ HCV spécifique. Cette réponse était significativement plus
86
fréquente chez ces patients que celle observée chez les patients chroniquement
infectés (26%). Les cellules T HCV spécifiques proliféraient plutôt en réponse aux
protéines NS3 et NS4 et produisaient de l’interféron gamma. Ils avaient également
plus de cellules T CD8+ HCV spécifiques que les patients avec une infection HCV
chronique. La réponse immunitaire cellulaire pourrait être plus efficace chez les
patients avec une infection HCV occulte que chez les patients chroniquement
infectés mais peut-être pas assez efficace pour éradiquer le virus. La même équipe a
montré que les réponses immunitaires prolifératives T CD4+ et CD8+ HCV
spécifiques étaient observées plus souvent chez les patients qui avaient guéris
spontanément que ceux chroniquement infectés guéris après traitement (Quiroga,
2006).
Les CMSPs (en particulier les T CD4+, T CD8+, B, monocytes et les cellules
dendritiques) peuvent être infectées par le HCV lors d’une infection HCV chronique
(Ducoulombier, 2004). Les mêmes populations cellulaires sont infectées dans les
infections HCV occultes (Pham, 2008). Cependant des profils d’expression
cytokiniques différents ont été observés selon le type d’infection (Pham, 2009). En
effet, la transcription de l’IFN-α, IFN-γ et du TNF-α est plus élevée et celle de l’IL-10
est moins élevée dans les CMSPs de patients avec une infection occulte que de
patients chroniquement infectés. L’impact de l’infection de ces cellules sur leurs
fonctions immunitaires est mal connu.
F- Traitement de l’infection occulte
Un traitement par RBV et pegIFNα pendant 24 semaines a été évalué chez 10
patients avec une hépatite C occulte « cryptogénique », ARN HCV (+) dans le foie et
les CMSPs (Pardo, 2006). Tous avaient un bilan hépatique perturbé. A la fin du
traitement, 8 patients avaient normalisé leurs enzymes hépatiques et 8 avaient un
ARN HCV indétectable dans les CMSPs. Vingt-quatre semaines après l’arrêt du
traitement, 6 patients avaient encore des enzymes hépatiques normales et 7 un ARN
HCV indétectable dans les CMSPs. Une deuxième biopsie hépatique a été réalisée
chez 5 patients. L’ARN HCV a été retrouvé dans les cellules hépatiques des 5
patients. La concentration d’ARN HCV était significativement plus faible dans les
cellules hépatocytaires après traitement qu’avant traitement, et le nombre
d’hépatocytes infectés également (2.2% versus 3.5%). Chez 3 de ces patients,
87
l’activité nécroinflammatoire et le score de fibrose avaient diminué. Le traitement des
hépatites C occultes pourrait donc avoir un intérêt pour améliorer l’histologie
hépatique.
88
OBJECTIFS
La diversité de réponse au traitement anti-HCV et la persistance ou non du
virus dans l’organisme sont la conséquence de mécanismes complexes et
multifactoriels. Chacun des partenaires impliqués dans la réponse au traitement (le
virus, l’hôte et les molécules antivirales) peut contribuer au succès ou à l’échec
thérapeutique. Mieux caractériser les acteurs de cette résistance au traitement
permettra d’optimiser les traitements actuels et futurs, et d’améliorer la prise en
charge des patients.
L’arrivée imminente de nouvelles molécules ciblant directement le virus, nous
a incités à étudier de manière détaillée la variabilité génétique des génotypes 2 et 4,
assez mal connue en France et à l’échelle mondiale. Le polymorphisme du HCV au
sein de chacun des génotypes pourrait influencer la réponse au traitement. Chez les
patients présentant un mauvais pronostic, coinfectés par HIV ou porteurs d’un
génotype 1 ou 4, nous avons ensuite étudié les facteurs influençant la réponse virale
à un traitement par pegIFNα et RBV. Enfin, la description récente d’un nouveau type
d’infection, l’hépatite C occulte, a ouvert le débat de la persistance éventuelle du
virus après élimination spontanée ou après traitement. Ceci nous a conduit à
rechercher la présence d’une infection occulte chez des patients immunodéprimés
anciennement infectés par le HCV.
Dans un premier temps, mon travail a consisté à mieux caractériser la
variabilité génétique du HCV et l’épidémiologie des souches HCV de génotypes 4
(publication n°1 ; Nicot, JGV, 2005) et 2 (publication n°2 ; Thomas, JMV, 2007)
pour lesquelles peu de données étaient disponibles en France. Les analyses
phylogénétiques des régions NS5B et E2 et les données épidémiologiques
recueillies ont permis de répondre à ces questions. Nous avons ensuite développé
un système fondé sur l’analyse de la région NS5B permettant d’identifier un grand
nombre de sous-types du HCV sur biopuce (publication n°3 ; Gruyadunov,
soumis ; brevet international WO2009/022939).
Par la suite, je me suis intéressée aux facteurs impliqués dans la réponse au
traitement anti-HCV. Dans une première étude, réalisée chez des patients coinfectés
89
HCV-HIV, nous avons évalué l’impact des paramètres pharmacologiques sur la
réponse au traitement par pegIFNα et RBV (publication n°4 ; Nicot, JMV, 2008).
Dans une seconde étude, nous avons étudié chez des patients infectés uniquement
par des virus de génotypes 1 ou 4, l’influence de la variabilité génétique au niveau du
sous-type et des facteurs pharmacologiques sur la réponse au traitement
(publication n°5 ; Nicot, soumis).
Enfin, la guérison spontanée ou après un traitement ayant été remise en
question par plusieurs équipes avec la notion d’infection HCV occulte, nous avons
voulu étudier chez des patients immunodéprimés transplantés rénaux, anciennement
infectés par le HCV, la présence éventuelle d’une réactivation virale. Le génome
HCV a été recherché dans le sang et les cellules mononucléées du sang
périphérique (CMSP) par des techniques dont la sensibilité était similaire à celles
utilisées dans les travaux ayant conduit au concept d’infection occulte (publication
n°6 ; Nicot, TI, 2009).
90
RESULTATS
PARTIE I :
VARIABLITE GENETIQUE ET EPIDEMIOLOGIE DES GENOTYPES 2 ET 4
Publication n°1 :
Heterogeneity of hepatitis C virus genotype 4 strains circulating in
south-western France
Journal of General Virology 2005, vol.86, p.107-114
Le HCV de génotype 4 est retrouvé de manière endémique en Afrique
Centrale, au Moyen-Orient et en Egypte. Ces 10 dernières années, l’émergence du
HCV de génotype 4 a été observée en Europe et en France (dans la région
Parisienne). Cependant son épidémiologie et sa diversité en France étaient assez
mal connues car les études ont été faites sur de petits effectifs et les tests de
génotypages ont été réalisés en majorité par analyse de la région 5’NC, peu
discriminante pour les sous-types. Notre objectif a été d’étudier la diversité et
l’épidémiologie des souches HCV de génotype 4 présentes dans la région MidiPyrénées.
Entre 2000 et 2003, toutes les souches de patients infectés par HCV
génotypées par analyse phylogénétique de la région NS5B ont été répertoriées
(n=2239). Les virus de génotype 4 représentaient 7,4% (n=166) des souches des
patients infectés par HCV alors que ceux de génotype 1 représentaient 58,1%, ceux
de génotype 2 13,1%, ceux le génotype 3 20%, ceux de génotype 5 1,3% et ceux de
génotype 6 0,1%. Les souches de génotype 4 ont été caractérisées par des analyses
phylogénétiques réalisées sur 391 nucléotides de la région NS5B afin de déterminer
le sous-type. Un fragment de 212 paires de bases, situé dans la région E2, a
91
également été séquencé sur 90 souches. En effet, cette région est suffisamment
variable pour pouvoir également déterminer les sous-types.
Onze sous-types différents ont été identifiés : 4a, 4c, 4d, 4f, 4h, 4i, 4k, 4o, 4p,
4r, 4t. Quelques souches (1,5%), n’ont pas été classées au sein d’un sous-type
connu. Les sous-types les plus représentés étaient les sous-types 4a (44%) et 4d
(34%). Les analyses phylogénétiques réalisées sur les régions NS5B et E2 étaient
concordantes, montrant que la région E2 discriminait aussi bien les sous-types que
la région NS5B. Les distances génétiques dans la région E2 (0,361 ± 0,03
substitutions par site) étaient plus élevées que dans la région NS5B (0,129 ± 0,03
substitutions par site), montrant une plus grande variabilité génétique de la région E2
par rapport à la région NS5B.
Les données épidémiologiques de 140 patients ont été collectées et
analysées afin d’étudier le mode de diffusion des différents sous-types. Parmi eux,
30% étaient coinfectés par le HIV. Deux groupes de patients ont été identifiés : le
premier composé de patients contaminés par toxicomanie, et le deuxième composé
de patients non contaminés par toxicomanie. Le premier groupe (n=83) rassemblait
des patients d’origine française et presque exclusivement infectés par un sous-type
4a ou 4d (99% des souches). Le deuxième groupe était constitué de 57 patients non
toxicomanes infectés par une grande diversité de sous-types. Onze sous-types ainsi
que des souches de sous-type non déterminé étaient représentés dans ce groupe.
Celui-ci a été subdivisé en 2 sous-groupes selon l’origine des patients : d’une part
des patients contaminés en France et d’autre part des patients contaminés en
Afrique ou Moyen-Orient. Les patients d’origine française étaient infectés
essentiellement par les sous-types 4a et 4d, les patients d’origine africaine étaient
infectés majoritairement par des sous-types 4f, 4k, 4r et 4 non sous-typés, et ceux
originaires du Moyen-Orient par le sous-type 4a. Les distances génétiques des
souches de patients d’origine française étaient plus faibles que les distances
génétiques des souches de patients d’origine africaine ou du Moyen-Orient
suggérant une introduction plus récente du HCV en France.
Notre étude a donc montré l’importante variabilité génétique du HCV de
génotype 4 dans la région Midi-Pyrénées par l’analyse phylogénétique de 2 régions
discriminantes pour les sous-types. Nous avons également mis en évidence que la
diffusion de ce génotype en France se faisait principalement par toxicomanie.
92
Journal of General Virology (2005), 86, 107–114
DOI 10.1099/vir.0.80409-0
Heterogeneity of hepatitis C virus genotype 4
strains circulating in south-western France
Florence Nicot,1 Florence Legrand-Abravanel,1 Karine Sandres-Saune,1
Anne Boulestin,1 Martine Dubois,1 Laurent Alric,2 Jean-Pierre Vinel,3
Christophe Pasquier1 and Jacques Izopet1
Service de Virologie1, Service de Médecine Interne2 and Service de Gastro-entérologie3,
Hôpital Purpan, EA2046-IFR30, CHU Toulouse, 31059 Toulouse Cedex, France
Correspondence
Jacques Izopet
[email protected]
Received 30 June 2004
Accepted 17 September 2004
Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of liver disease. Knowledge of HCV variability
is crucial for clinical and epidemiological analysis. HCV genotype 4 (HCV-4) has become
increasingly prevalent in European countries, including France, in recent years. The present
study investigates the heterogeneity of HCV-4 in south-western France by phylogenetic analysis
of NS5B sequences from 166 patients. The E2 region of 90 strains was also analysed. Genotype
4 accounts for 7?4 % of HCV infections in this area. Analysis of the NS5B region revealed 12
subtypes and the NS5B and E2 phylogeny data were congruent, except for one strain.
The epidemiological data indicated two main groups of patients. One included intravenous
drug users (IVDUs) of French origin, who were infected by homogeneous strains of subtypes
4a or 4d. The second group comprised non-IVDU patients who were infected with heterogeneous
strains. This group was subdivided into patients of French origin, who were infected with eight
subtypes, and patients from non-European countries (Central Africa or the Middle East), who
were mainly infected with 4f, 4k, 4r and other subtypes; they showed the greatest genetic
heterogeneity. This study of a large cohort of patients shows the great diversity of HCV-4
strains, and that these subtypes have spread differently.
INTRODUCTION
More than 170 million people throughout the world are
infected with hepatitis C virus (HCV). Persistence of the
virus in the liver leads to chronic hepatitis in 70 % of
infected patients, which can progress to cirrhosis and liver
cancer (Poynard et al., 2003; WHO, 1997).
This single-stranded RNA virus is genetically extremely
heterogeneous because of its rapid replication and the poor
fidelity of its RNA-dependent RNA polymerase, encoded
by the NS5B region. Studies on the taxonomy of HCV
based upon phylogenetic analyses of nucleotide sequences
indicate that there are six HCV genotypes (1–6) (Robertson
et al., 1998; Simmonds, 1999), each of which may have
various subtypes. The virus population in an individual is
defined as quasispecies (Martell et al., 1992). Several
methods are used for genotyping, based on analysis of
portions of the genome (59NC, NS5B, core, E1). Phylogenetic analysis of the NS5B region is commonly used for
subtyping (Salemi & Vandamme, 2002), but little is known
of the suitability of the E2 region (Sandres et al., 2000).
The GenBank/EMBL/DDBJ accession numbers for the NS5B
sequences reported in this paper are AY743050–AY743215 and
those for the E2 sequences are AY742960–AY743049.
0008-0409 G 2005 SGM
Printed in Great Britain
Knowledge of HCV variability is crucial for clinical and
epidemiological analyses. Prediction of sustained virological
response and choice of treatment duration depend on
genotype (Poynard et al., 2003; Zein, 2000). Subtyping has
yet to be shown to be relevant to treatment, but this
information could be useful in epidemiological investigations (Pybus et al., 2001). Genotypes differ in both their
geographical distribution and mode of transmission (Pybus
et al., 2001). HCV strains 1, 2, 3 and 4 are encountered
worldwide, whereas genotypes 5 and 6 are restricted to
well-defined areas. Genotypes 1a and 3a mainly infect
patients who have been infected via intravenous drug use
(IVDU), whereas genotypes 1b and 2 infect patients who
have received contaminated blood transfusions. Several
recent studies carried out in Europe have indicated changes
in genotype distribution and have underlined the increasing prevalence of HCV genotype 4 (HCV-4) (Matera et al.,
2002; Sánchez-Quijano et al., 1997; Schröter et al., 2002;
van Asten et al., 2004). This genotype is endemic to Central
Africa (Ndjomou et al., 2003; Xu et al., 1994) and the
Middle East (Chamberlain et al., 1997), including Egypt
(Angelico et al., 1997; Ray et al., 2000), but is spreading
into European countries, mainly among intravenous drug
users (IVDUs) (van Asten et al., 2004). Previous studies on
small groups of patients in north and south-east France
107
F. Nicot and others
found an increased occurrence of HCV-4 (Morice et al.,
2001; Tamalet et al., 2003).
We have now investigated the variation in HCV-4 strains
in a large cohort of patients in the Midi-Pyrénées area of
south-west France. The NS5B region of the HCV-4 strains
was characterized by phylogenetic analysis and a second
region of the genome, E2, was also investigated in a subset
of these strains. Epidemiological data were used to determine the spread of the different subtypes.
METHODS
Patients. HCV strains in 2239 patients infected with HCV living in
the Midi-Pyrénées area, France, were examined between March 2000
and May 2003. They were genotyped by sequencing the NS5B region
and subjected to phylogenetic analysis (Sandres-Sauné et al., 2003)
in the virology laboratory of Toulouse University Hospital. In total,
166 subjects were infected with genotype 4. The E2 region of the
virus was also characterized in a subset of 90 patients. Data on
patient age, gender, risk factors for HCV acquisition and virus load
were collected.
HCV RNA quantification. HCV RNA in sera was measured by
quantitative RT-PCR [Cobas Monitor HCV 2.0 (Roche Diagnostics)]
according to the manufacturer’s instructions. The detection limit
was 600 IU ml21.
Sequencing and phylogenetic analysis of HCV NS5B. HCV
RNA was extracted from 140 ml serum by using the QIAamp viral
RNA method (Qiagen). Aliquots (10 ml) of extracted RNA were
amplified by RT-PCR using a Qiagen one-step RT-PCR kit. The mix
contained 3?5 mM MgCl2, 10 U ribonuclease inhibitor (Invitrogen),
2 U uracil–DNA glycosylase (Roche) and 200 nM primers Pr3 and
Pr2 (Sandres-Sauné et al., 2003). A 391 bp segment was amplified. A
hemi-nested PCR was performed for 19?9 % of HCV RNA samples,
because amplification was insufficient after the first round of PCR.
The first step was carried out with primers Pr3 and Pr4 and the
second step with Pr3 and Pr5 (Sandres-Sauné et al., 2003). The
segment obtained was 382 bp. HCV PCR products were analysed by
electrophoresis through 2 % agarose gel and ethidium bromide
staining.
HCV PCR products were then purified on columns (QIAquick PCR
purification kit) and sequenced with the PCR primers that were used
for amplification. Cycle sequencing was done by using fluorescent
dye-terminator technology (BigDye Terminator V3.1; Applera) with
AmpliTaq DNA polymerase and an ABI PRISM 3100 sequencer
(Applera). Sequence chromographs were analysed by using SEQUENCE
ANALYSIS and SEQUENCE NAVIGATOR software.
Phylogenetic analyses compared the NS5B sequences with 264 reference sequences in GenBank, including 27 NS5B regions from complete
Table 1. Reference sequences used in the NS5B tree
Abbreviations: AR, Argentina; BE, Belgium; BU, Burundi; CA,
Canada; CAR, Central African region; CG, Congo; CM, Cameroon;
EG, Egypt; FR, France; GB, Gabon; MQ, Martinique.
GenBank
accession no.
AF271808
AF308573
AJ291269
AJ291274
AJ291278
AY257442
L29602
L29605
AJ291251
AJ291290
AY257467
AJ291286
AY257439
AJ291249
L29613
L36437
AJ291294
L44597
AY434157
AY548714
AF271815
AY434108
AJ291285
AY265429
AJ291282
AJ291293
AY265425
AY265430
Strain
name
Country
of origin
Subtype
4020
AR45
FrSSD83
FrSSD89
FrSSD97
Mart22
GB116
GB215
FrSSD37
FrSSD164
Mart50
FrSSD159
Mart19
FrSSD35
GB438
CAR4_1205
FrSSD174
b14
QC142
EG037
2153
QC59
FrSSD158
A07321152C
FrSSD120
FrSSD173
A02240258C
A13020210C
EG
AR
FR
EG
FR
MQ
GB
GB
FR
FR
MQ
GB
MQ
CG
GB
CAR
BU
BE
CA
EG
EG
CA
CM
CM
CA
FR
CM
CM
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4c
4c
4d
4d
4d
4f
4f
4h
4h
4i
4k
4k
4n
4n
4o
4o
4p
4p
4r
4r
4t
4t
genomes, to determine genotypes. The NS5B regions of the HCV
genomes of the 166 patients infected with genotype 4 were then
sequenced to determine subtypes by comparing them with reference
sequences of genotype 4. Primers were removed from sequences
(360 bp) before analysis. Nucleotide sequences were aligned with
CLUSTAL_X 1.83 software (Thompson et al., 1997). The evolutionary
distances between NS5B sequences were calculated with MEGA 2.1
(Kumar et al., 2001) with the Kimura two-parameter model. The mean
pairwise distance is the mean of all genetic distances calculated on
pairwise sequences. Phylogenetic trees were created by the neighbourjoining (NJ) method with the approach implemented in MEGA: firstly,
Table 2. PCR primers for E2 amplification
Name
KS1
KS2
KS3
KS4
Primer set
Polarity
Sequence
Positions*
External
Antisense
Sense
Antisense
Sense
59-CAGGACTGCAATTGCTCAATCTA-39
59-TTGCAGTTTAAGGCAGTCC-39
59-CACTGGGGAGTCCTGGCGGG-39
59-ATGTGCCAGCTGCCATTGGT-39
1612–1630
1245–1266
1587–1606
1395–1414
Nested
*Positions according to HCV-J (genotype 1b).
108
Journal of General Virology 86
Heterogeneity of HCV-4
Table 3. HCV-4 strains with country of origin and subtypes
Abbreviations: CAR, Central Africa region; CF, Central African Republic; CG, Congo; CM, Cameroon; EG, Egypt; FR, France; GB, Gabon;
RW, Rwanda; SA, Saudi Arabia; SY, Syria; ZA, Zaire.
Strain
G4MP149
G4MP156
G4MP073
G4MP140
G4MP141
G4MP142
G4MP143
G4MP144
G4MP145
G4MP147
G4MP151
G4MP162
G4MP157
G4MP077
G4MP160
G4MP165
G4MP159
G4MP166
G4MP164
G4MP152
G4MP155
G4MP139
G4MP146
G4MP150
G4MP154
G4MP153
G4MP074
G4MP002
G4MP028
G4MP031
G4MP003
G4MP001
G4MP004
G4MP005
G4MP006
G4MP007
G4MP008
G4MP009
G4MP010
G4MP011
G4MP012
G4MP013
G4MP014
G4MP015
G4MP016
G4MP017
G4MP018
G4MP019
G4MP020
G4MP021
Country
of origin
Subtype
Strain
Country
of origin
Subtype
Strain
Country
of origin
Subtype
CAR
CAR
CAR
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CF
CG
CG
GB
GB
RW
RW
ZA
ZA
SA
EG
EG
SY
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
4k
4k
4r
4f
4f
4f
4f
4f
4f
4i
4k
4o
4p
4r
4t
4t
4U
4U
4U
4k
4k
4f
4h
4k
4k
4k
4r
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
G4MP029
G4MP030
G4MP032
G4MP033
G4MP034
G4MP035
G4MP036
G4MP037
G4MP038
G4MP039
G4MP040
G4MP041
G4MP042
G4MP043
G4MP044
G4MP045
G4MP046
G4MP047
G4MP048
G4MP049
G4MP050
G4MP051
G4MP052
G4MP053
G4MP054
G4MP055
G4MP056
G4MP057
G4MP058
G4MP059
G4MP060
G4MP061
G4MP062
G4MP063
G4MP064
G4MP065
G4MP066
G4MP067
G4MP068
G4MP069
G4MP070
G4MP071
G4MP079
G4MP080
G4MP081
G4MP082
G4MP083
G4MP084
G4MP085
G4MP086
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4a
4c
4c
4d
4d
4d
4d
4d
4d
G4MP093
G4MP094
G4MP095
G4MP096
G4MP097
G4MP098
G4MP099
G4MP100
G4MP101
G4MP102
G4MP103
G4MP104
G4MP105
G4MP106
G4MP107
G4MP108
G4MP109
G4MP110
G4MP111
G4MP112
G4MP113
G4MP114
G4MP115
G4MP116
G4MP117
G4MP118
G4MP119
G4MP120
G4MP121
G4MP122
G4MP123
G4MP124
G4MP125
G4MP126
G4MP127
G4MP128
G4MP129
G4MP130
G4MP131
G4MP132
G4MP133
G4MP134
G4MP135
G4MP136
G4MP137
G4MP138
G4MP148
G4MP161
G4MP163
G4MP072
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
FR
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4d
4k
4n
4o
4r
http://vir.sgmjournals.org
109
F. Nicot and others
Table 3. cont.
Strain
G4MP022
G4MP023
G4MP024
G4MP025
G4MP026
G4MP027
Country
of origin
Subtype
Strain
Country
of origin
Subtype
Strain
Country
of origin
Subtype
FR
FR
FR
FR
FR
FR
4a
4a
4a
4a
4a
4a
G4MP087
G4MP088
G4MP089
G4MP090
G4MP091
G4MP092
FR
FR
FR
FR
FR
FR
4d
4d
4d
4d
4d
4d
G4MP075
G4MP076
G4MP078
G4MP158
FR
FR
FR
FR
4r
4r
4r
4t
with reference sequences to determine the subtype of each strain
and, secondly, only with strains of patients. The reproducibility of
the branching pattern was determined by bootstrap analysis (1000
replicates). Subtypes were determined when bootstrap values (BVs)
were >70 %. Values of >70 % of 1000 replicates are considered as
supporting the grouping as, in general, a BV of 70 % corresponds to a
confidence value of 95 % (Hillis & Bull, 1993; Robertson et al., 1998).
Phylogenetic trees were drawn by using the TreeView 1.66 program.
Genotype 4 reference sequences used in this study were taken from
the database http://hcv.lanl.gov/content/hcv-db/ and classified by
subtype (Table 1).
Sequencing and phylogenetic analysis of HCV E2. HCV RNA
was extracted from 140 ml serum by using the QIAamp viral RNA
method (Qiagen) and aliquots (10 ml) were amplified by RT-PCR
using a QIAgen one-step RT-PCR kit. The mix contained 2?5 mM
MgCl2, 10 U ribonuclease inhibitor (Invitrogen) and 300 nM primers
[external sense, KS2, and external antisense, KS1 (Table 2)]. The
thermal profile was: 30 min reverse transcription at 50 uC, 15 min
denaturation at 95 uC, 50 cycles of 94 uC for 30 s, 55 uC for 30 s and
72 uC for 30 s, followed by 10 min at 72 uC. A 394 bp segment of
the E2 gene was amplified. Nested RT-PCR was carried out on 2 ml
of the first PCR products if amplification was insufficient, with
2?5 U AmpliTaq DNA polymerase (Applera) and 300 nM primers
[nested sense, KS4, and nested antisense, KS3 (Table 1)]. The nested
PCR thermal profile was: 95 uC for 7 min, 30 cycles at 95 uC for
30 s, 55 uC for 30 s and 72 uC for 30 s and a final elongation at
72 uC for 10 min. A 212 bp segment of the E2 region was amplified.
Phylogenetic analysis was done as above for the NS5B region. The
sequence of the E2 gene was analysed by using 174 bp fragments. The
single subtype 4a reference (GenBank no. Y11604) in the database
http://hcv.lanl.gov/content/hcv-db/ was used (Simmonds, 1995).
Statistical analysis. Continuous variables were analysed by Student’s
unpaired t-test. Categorical variables were tested by the x2 test. P
values of <0?05 were considered to be significant.
RESULTS
Phylogenetic analysis of the NS5B region
Genotype 4 accounted for 7?4 % (n=166) of the strains
from patients infected with HCV in the Midi-Pyrénées
area, whilst genotype 1 accounted for 58?1 %, genotype 2
for 13?1 %, genotype 3 for 20 %, genotype 5 for 1?3 % and
genotype 6 for 0?1 %.
The sequences of genotype 4 were of two main subtypes:
44 % were of subtype 4a and 34 % were of subtype 4d
110
(Table 3). The other sequences were of subtypes 4k (5 %),
4f (4 %), 4r (4 %), 4t (1?5 %), 4c (1 %), 4h (1 %), 4i (1 %),
4n (1 %), 4o (1 %) and 4p (1 %). The subtype was not
determined in 1?5 % of cases; these sequences were called
4U. The distribution of strains is illustrated by the NS5B
tree (Fig. 1). The mean pairwise distance of the NS5B
sequences was 0?1289±0?0109 substitutions per site (range,
0?0031–0?3028). Clade 4a was made up of a homogeneous
group of sequences and divergent sequences (G4MP003,
G4MP006, G4MP028). Strains classified as subtype 4a
formed a cluster with strains of subtype 4c. Clade 4c had
a high BV that allowed strains in clade 4a to be differentiated from those in clade 4c. Clades 4d, 4f, 4h, 4i, 4k,
4n, 4o, 4p, 4r and 4t were well-defined clades, supported by
BVs of >70 %. The three 4U sequences were distributed
throughout the tree.
Phylogenetic analysis of the E2 region
The E2 gene was also analysed in a subset of 90 strains.
Because subtypes 4a and 4d were most prevalent, 31 strains
of subtype 4a and 29 strains of subtype 4d were selected
randomly. They were analysed together with all strains of
the other subtypes that were amplifiable (six of subtype 4r,
two of 4c, four of 4f, eight of 4k, two of 4o, three of 4t and
two of 4U, and one each of subtypes 4h, 4i and 4p).
The resulting phylogenetic tree (Fig. 2) showed a mean
pairwise distance for E2 sequences of 0?3605±0?0327
substitutions per site (range, 0?0066–0?7071), which was
greater than that of the NS5B sequences (P<0?001). Seven
clades (A–G) were identified. Clade A had a moderate BV
(59 %). All but one clade A sequence was of subtype 4a in
the NS5B region. One strain (G4MP132) had been subtyped as 4d in the NS5B region. Clade E was composed of
strains that were 4k in the NS5B region, clade B had 4c
strains, clade C had 4d strains, clade D had 4f strains, clade
F contained 4r strains and clade G contained 4t strains
(Table 4). Several E2 sequences were dispersed throughout
the tree, including two sequences that formed NS5B clade
4o, one belonging to NS5B clade 4h, one to NS5B clade 4i,
one to NS5B clade 4p and two undetermined sequences (4U).
Epidemiological characteristics
Demographic data were collected for each patient
infected with HCV-4 (63 women, 103 men; mean age,
Journal of General Virology 86
Heterogeneity of HCV-4
Fig. 1. Phylogenetic analysis of the NS5B gene of HCV genomes from the Midi-Pyrénées area. BVs for 1000 replicates are
indicated below branches. Subtypes were determined when sequences that we studied and reference sequences clustered
together with a BV of >70 %.
http://vir.sgmjournals.org
111
F. Nicot and others
infected with subtype 4a (45 %) and 4d (45 %) strains; a few
patients were infected with subtype 4f, 4k, 4n and 4r strains.
The epidemiological data for 140 patients revealed two
main groups. The first was composed of patients who were
infected via IVDU (n=83). Their mean age was 40 years.
All but one were infected with subtypes 4a (55 %) or 4d
(44 %) and all but one were of French origin. Only one
IVDU patient was infected with a subtype 4o strain
(G4MP162). Thirty-six patients were also infected with
HIV (43?4 %); they were infected with subtypes 4a or 4d
in similar proportions. The mean pairwise distances of
the NS5B sequences for this group was 0?1070±0?0720
substitutions per site.
The second group was a population of non-IVDUs (n=57).
They had acquired their HCV infection by transfusion,
nosocomial, interfamilial or undetermined routes. This
population was divided into two subgroups: patients of
French origin and patients from non-European countries.
The French patients (n=28; mean age, 41 years) were
infected with eight subtypes [4a (46 %), 4r (4 %), 4c (7 %),
4d (32 %), 4k (4 %), 4o (4 %), 4p (4 %) or 4t (4 %)]; 25 %
of them were also infected with HIV. Patients from nonEuropean countries (n=29; mean age, 45 years) were older
than the IVDUs (P<0?02). They included patients from
Central African countries and four from the Middle East
(G4MP002, G4MP003, G4MP028 and G4MP031; Table 3).
Patients from Africa were infected with very varied subtypes
[4f (28 %), 4k (28 %), 4r (12 %), 4U (12 %) and by 4h, 4i,
4o, 4p and 4t], whereas patients from the Middle East were
all infected with subtype 4a. No patient was infected with
strains of subtypes 4c or 4d. Only three (9 %) non-European
patients were also infected with HIV. Patients infected with
4U strains were from Cameroon (G4MP159 and G4MP166)
and the Central African Republic (G4MP164).
Mean pairwise distances for the non-European patients
(0?1643±0?0450 substitutions per site) were greater than
those for the French non-IVDUs (0?1340±0?072 substitutions per site) and the IVDUs (0?1070±0?0720 substitutions per site) (Fig. 3).
DISCUSSION
Fig. 2. NJ tree for the E2 gene corresponding to HCV-4
genomes and the 4a reference sequence (GenBank accession
no. Y11604). BVs for 1000 replicates are indicated below
branches. Clades were determined when sequences clustered
with a BV of >70 %.
41?1±8?6 years). The mean serum HCV load was 5?5±0?4
log RNA copies ml21, without any significant difference
between subtypes. Of these, 51 (17 women and 34 men,
30 %) were also infected with human immunodeficiency
virus (HIV). Patients with both HIV and HCV were mainly
112
This is the first study of a large cohort of patients to
investigate the genetic diversity of HCV-4 in Europe. We
find that genotype 4 is relatively widespread (7?4 %) in
south-west France, with a total of 12 subtypes (4a, 4c, 4d,
4f, 4h, 4i, 4k, 4n, 4o, 4p, 4r and 4t) identified by phylogenetic analysis of the NS5B region. Analysis of the E2 region
gave results that were congruent with those for the NS5B
region. Finally, links between the epidemiological data and
variations in genotype 4 reveal three populations infected
with HCV-4, each with different subtypes, risk factors and
subject origins (France, Africa or the Middle East).
Analysis of the phylogenetic relationships of the HCV-4
sequences in the NS5B and E2 regions indicate that this
Journal of General Virology 86
Heterogeneity of HCV-4
Table 4. HCV typing obtained by analysis of the NS5B and E2 sequence
Classification
based on NS5B
4a
4c
4d
4f
4k
4r
4t
No. patients
Classification (clade) based on E2
A
B
C
D
E
F
G
31
2
1
28
4
8
6
32
2
28
4
8
genotype is very heterogeneous. Mean pairwise distances
of the E2 sequences were greater than those of the NS5B
sequences, indicating that the E2 region of HCV-4 is more
variable than the NS5B region, which is in line with several
studies on other HCV genotypes (Duffy et al., 2002; Martell
et al., 1992; McAllister et al., 1998). The topologies of the
NS5B and E2 trees are congruent: sequences of one subtype were grouped in the same clades in both NS5B and E2
trees, except for three sequences, and BVs were similar. The
discordance between the phylogenetic analyses of the two
regions for strain G4MP132 is probably due to this patient
having a mixed infection or a recombinant virus (Colina
et al., 2004; Kalinina et al., 2002). The same holds for strains
G4MP162 and G4MP163, which form clade 4o in the
NS5B tree, but are dispersed in the E2 tree. Despite the lack
Fig. 3. Mean pairwise distances (±SD) of NS5B sequences
from HCV-4-infected patients living in the Midi-Pyrénées area,
according to the epidemiological data.
http://vir.sgmjournals.org
6
3
3
No.
patients
31
2
29
4
8
6
3
83
of reference sequences for the E2 region, our data show that
the E2 region discriminates well between subtypes.
HCV-4 is less common (7?4 %) in south-west France than
in the Paris area (10?5 %) (Morice et al., 2001) or around
Marseille (10?7 %) (Tamalet et al., 2003). Nevertheless, it
is above the national average in 1999 (4?5 %) (MartinotPeignoux et al., 1999). This may well be due to the greater
numbers of immigrants in the Paris and Marseille areas.
The distribution of genotype 4 subtypes in south-west
France shows great genetic diversity and the predominance
of two subtypes, 4a and 4d. We identified two epidemiological profiles. Patients infected via IVDU were all infected
with subtype 4a or 4d and were of French origin. Previous
studies conducted in France have described IVDU as the
main risk factor for patients infected with 4a and 4d
(Martial et al., 2004; Morice et al., 2001). Those IVDU
patients who were also infected with HIV were infected
with subtypes 4a and 4d in similar proportions. Our data
do not agree with those of a study conducted in other
European countries (van Asten et al., 2004), where IVDUs
co-infected with both HCV-4 and HIV were mainly infected
with subtype 4a. This may well be because there were few
genotype 4 strains (n=12) in the study by van Asten et al.
(2004). This indicates that these strains have spread only
recently in France. The second epidemiological profile on
non-IVDU patients identified two subgroups of different
geographical origins: French patients and patients from
Africa or the Middle East. All of the patients in this group
infected with HCV-4a were from the Middle East. Patients
from Africa were infected with strains 4f, 4k, 4h, 4i, 4o, 4p,
4r, 4t or 4U. These results are in agreement with those of a
study conducted in Seine-Saint-Denis (Morice et al., 2001).
Strains infecting non-IVDUs were more heterogeneous
than those of IVDUs. Non-European, non-IVDU patients
had the most heterogeneous sequences. The presence of so
many divergent and co-existing lineages of genotype 4
indicates that this genotype has been in Central African
countries for a long time. Non-European patients were
probably infected in their home countries, but we have no
data on dates of infection or immigration.
113
F. Nicot and others
This study of a large cohort of infected patients shows the
wide diversity of HCV-4 subtypes in the Midi-Pyrénées area,
with the presence of 12 subtypes. French patients infected
via IVDU are most likely to be infected with homogeneous
subtypes 4a or 4d, whereas non-IVDU patients are infected
with 11 different subtypes, with the subtypes of patients
from African countries being 4f, 4k, 4h, 4i, 4o, 4p, 4r, 4t and
4U. IVDU is the main route of HCV-4 propagation in
France.
Morice, Y., Roulot, D., Grando, V. & 8 other authors (2001).
Phylogenetic analyses confirm the high prevalence of hepatitis C
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Journal of General Virology 86
Publication n°2 :
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Journal of Medical Virology 2007, vol.79, p.26-34
Le HCV de génotype 2 est endémique dans les pays d’Afrique de l’Ouest et
d’Afrique centrale. La diversité génétique et les caractéristiques épidémiologiques du
HCV de génotype 2 en Europe et en France sont peu connues pour des raisons
identiques à celles évoquées dans l’étude des virus de génotype 4. L’objectif de
notre étude a donc était de décrire la diversité et l’épidémiologie des virus de
génotype 2 circulant dans la région Midi-Pyrénées.
Entre 2000 et 2004, les souches de patients infectés par HCV et génotypées
par séquençage de la région NS5B ont été répertoriées (n= 3 058). Les virus de
génotype 2 représentait 11,3% (n=344) des souches des patients infectés par le
HCV alors que ceux de génotype 1 représentaient 58,8%, ceux de génotype 3
19,4%, ceux de génotype 4 8,9%, ceux de génotype 5 1,3% et ceux de génotype 6
0,2%. Les souches de génotype 2 ont été caractérisées par des analyses
phylogénétiques réalisées sur 391 nucléotides de la région NS5B afin de déterminer
le sous-type. Un sous-type a été assigné à 84,3% des souches. Huit sous-types
différents ont été caractérisés : 2i (24,7%), 2k (22,4%), 2c (17,4%), 2a (10,8%), 2b
(4,7%), 2l (2,9%), 2j (0,9%) et 2d (0,6%).
Les données épidémiologiques de 145 patients ont été collectées. Ces
patients étaient représentatifs des 344 patients infectés par un HCV de génotype 2,
avec une répartition similaire des sous-types : 2i (25,5%), 2k (24,8%), 2c (15,2%), 2a
(12,4%), 2b (5,5%), 2l (2,8%) et 2j (1,4%). Chez ces 145 patients, la diversité
génétique des souches a également été caractérisée par analyse phylogénétique
d’environ 260 paires de bases dans la région E2. L’arbre phylogénétique obtenu à
partir des séquences de la région E2 a montré une répartition des souches similaire
93
à celle obtenue par analyse des séquences NS5B : en effet, chaque souche était
retrouvée dans des clusters rassemblant les mêmes souches dans les 2 régions.
Les distances génétiques dans la région E2 (0,396 ± 0,029 substitutions par
site) étaient plus élevées que dans la région NS5B (0,163± 0,013 substitutions par
site), montrant une plus grande variabilité génétique de la région E2 par rapport à la
région NS5B. L’analyse des distances génétiques au sein de chaque sous-type nous
a permis de montrer que le sous-type 2a, qui avait les plus faibles distances
génétiques, était le sous-type le plus homogène.
L’analyse des données épidémiologiques a montré que le mode de
contamination prédominant chez les patients infectés par un génotype 2 était la
transfusion sanguine quel que soit le sous-type. Par contre, nous avons mis en
évidence une relation entre la contamination par toxicomanie intraveineuse et le fait
d’être infecté par un génotype 2a : près de 50% des patients infectés par un soustype 2a l’ont été par toxicomanie. Globalement, les patients infectés par un sous-type
2a étaient plus jeunes que les patients infectés par un autre sous-type (48 versus
56,5 ans, p<0,01).
Notre étude a donc montré l’importante variabilité génétique du génotype 2
dans notre région par l’analyse phylogénétique de 2 régions discriminantes pour les
sous-types. Nous avons également mis en évidence la particularité du sous-type 2a :
il rassemble des souches plus homogènes, et la diffusion de ce sous-type se fait en
grande partie par toxicomanie contrairement aux autres sous-types qui ont
principalement diffusés par transfusion, suggérant une introduction récente de ce
sous-type.
94
Heterogeneity of HCV Genotype 2
27
subtypes 4a and 4d are spreading via intravenous drug
users, while other subtypes are found in patients from
different geographical origins and are very heterogeneous [Morice et al., 2001; Nicot et al., 2005]. Lastly, a
prospective study of patients in Central France showed
that 14.2% of the local population are carriers of HCV
genotype 5 [Henquell et al., 2004].
Many studies have described the distribution of HCV
strains in Europe [Martinot-Peignoux et al., 1999;
Tamalet et al., 2003; Ansaldi et al., 2005], and genotype
2 HCV (HCV-2) are widespread in Africa [Ruggieri et al.,
1996; Jeannel et al., 1998; Candotti et al., 2003] and in
Martinique [Martial et al., 2004]. But little has been
published, to our knowledge, on the genetic diversity
and epidemiological characteristics of the HCV-2 strains
in Europe. Discrimination between subtypes is also
easier now using new tools such as the sequencing of
fragments of the HCV genome followed by phylogenetic
analysis than it was with the widely used Line Probe
Assay (LiPA) based on reverse hybridization.
The distribution and the diversity of HCV genotype 2
(HCV-2) strains were examined in a large cohort of
patients in the Midi-Pyrenées area of France. Genotyping was performed by sequencing the NS5B region. The
subtypes identified by phylogenetic analysis of the
NS5B region were compared with phylogenetic analysis
of the E2 region sequences. Epidemiological data for
infected patients were collected to study the spread of
the different subtypes.
[Sandres-Saune et al., 2003]. NS5B nucleotide sequences were aligned with CLUSTAL_X 1.83 software
[Thompson et al., 1997] and phylogenetic trees were
created by the neighbor-joining (NJ) method. The reproducibility of the branching pattern was tested by
bootstrap analysis (1,000 replicates). Bootstrap values
(BV) >70% are considered as supporting the grouping as
a BV of 70% corresponds to a confidence value of 95%
[Hillis and Bull, 1993; Robertson et al., 1998]. The
Treeview 1.66 program was used to draw the phylogenetic trees.
Phylogenetic analyses were initially performed with
the 344 NS5B sequences (group 1) from patients and 329
available genotype 2 reference sequences from the Los
Alamos HCV database (http://hcv.lanl.gov/content/hcvdb/index). These 329 reference sequences included
13 subtypes (2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 2j, 2k, 2l,
2m), and strains not typeable. One hundred ten of these
329 strains were from African origin. A second phylogenetic analysis was carried out with 145 NS5B sequences
(group 2) from epidemiologically documented patients
and 22 NS5B reference sequences (selected from the
329 reference sequences in the Los Alamos database).
The molecular evolution of the NS5B sequences was
analyzed using MEGA version 3.0 [Kumar et al., 2004]
with the Kimura two-parameter model. This enabled us
to calculate the mean pairwise distance, which represents the mean of all the genetic distances (substitutions
per site) calculated on pairwise sequences.
METHODS
Sequencing and Phylogenetic Analysis of HCV E2
Patients
HCV RNA was extracted from 140 ml serum using
the Qiamp viral RNA method (Qiagen, Courtaboeuf,
France). Aliquots (10 ml) of extracted RNA were
amplified by RT-PCR using the QIAgen one step RTPCR kit (Qiagen) as described previously [Sandres et al.,
2000]. The mix contained 2.5 mM MgCl2, 10 U of
ribonuclease inhibitor (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 U of
uracil DNA glycosylase (Roche), and 300 nM of primers
KS3 and KS4 (Table I). The segment obtained was 314bp long. The first round of PCR was insufficient to
amplify the E2 region of virus from 5.5% of patients, so a
nested PCR was performed. The first step was carried
out with primers E2-S1-G6, KS4, and the second step
with E2-S2-G6 and E2-AS-G6 (Table I). A 303-bp
segment was amplified, purified, and sequenced.
The E2 region of virus from patients whose epidemiological data was available (145 patients) was amplified,
and phylogenetic analysis was done as for the NS5B
region. The E2 region reference sequences were
removed from eight complete genomes of genotype 2
available in the Los Alamos HCV database http://
hcv.lanl.gov/content/hcv-db/index).
The genotype of HCV infecting 3,058 patients was
determined in the Virology Laboratory, Toulouse University Hospital between March 2000 and November
2004. All anti-HCV patients were enrolled just before
starting interferon and ribavirin therapy for chronic
HCV infection. A total of 344 patients were infected with
genotype 2 and the NS5B sequences were submitted to
the phylogenetic analysis. Full demographic and epidemiological data for 145 of these 344 patients (subgroup),
who were followed-up in the Departments of Gastroenterology, Internal Medicine, and Infectious Diseases
of Toulouse University Hospital, were collected; these
were age, gender, risk factors for HCV acquisition,
METAVIR score, and HCV viral loads.
HCV RNA Quantitation
The HCV RNA in sera was measured by the quantitative reverse transcription polymerase chain reaction
(RT-PCR) CobasTM MonitorTM HCV 2.0 (Roche Diagnostics, Meylan, France) according to the manufacturer’s
instructions. The limit of detection was 600 IU/ml.
Reference Sequences
Sequencing and Phylogenetic
Analysis of HCV NS5B
HCV RNA extraction, RT-PCR, and sequencing of the
NS5B region were carried out as previously described
The reference sequences used for the NS5B phylogenetic tree were: 2a: MRS 44 (AF 516031); AY 597254 (AY
597254); MD2a-1 (AF 238481); MD2a-2 (AF 238482),
JFH-1 (AB047639), HC-J6CH (AF177036). 2b: AY
J. Med. Virol. DOI 10.1002/jmv
28
Thomas et al.
TABLE I. PCR Primers for E2 Amplification of HCV Genotype 2
Name
Primer set
KS3
KS4
E2-S1-G2
E2-AS-G6
E2-S2-G6
Polarity
External
External
External
Nested
Nested
Sense
Antisense
Sense
Antisense
Sense
Sequence
0
Position
0
5 -GCTTGGGATATGATGATGAACTGGTC-3
50 -TTGATGTGCCAGCTGCCATTGGTGT-30
50 -GCCARCTYCCGTTGGTGTT-30
50 -ATGGCDTGGGAYATGATGATGAAYTGG-30
50 -TGGGACATGATGATGAATTGGT-30
1,295–1,320a
1,584–1,608a
1,293–1,319b
1,584–1,602b
1,299–1,320b
Positions defined by the following:
a
HCV-D504109 (2c).
b
HCV-AB031663 (2k).
597255 (AY 597255); JPUT971017 (AB 030907); HC-J8
(D10988), MD2b-1 (AF238486). 2c: CH 610 (L38367);
Mart 25 (AY257445); BEBE 1 (D 50409). 2i: P6-Don (AF
515968); HN 4 (L 48499); FR 13 (L 48492). 2j: QC 203
(AY 894529). 2k: VAT 96 (AB 031663); Mart 40 (AY
257458). 2l: Mart 10 (AY257430), 19 (L 48491). 2: G886
(AY236384).
The reference sequences used for the E2 tree were: 2a:
HC-J6CH (AF177036), JFH-1 (AB047639), MD2a-1 (AF
238481). 2b: HC-J8 (D10988), MD2b-1 (AF238486),
JPUT971017 (AB 030907). 2c: BEBE 1 (D 50409). 2k:
VAT 96 (AB 031663).
Statistical Analysis
Continuous variables were tested with Student’s
unpaired t-test or the Mann–Whitney test when there
were fewer than 30 patients, and with ANOVA or
Student’s paired t-test for comparisons of paired NS5b
and E2 distances. Categorical variables were tested by
the w2 test. P values of <0.05 were considered to be
significant.
Sequences Submitted to Genbank
NS5B sequences appear under accession numbers
DQ220812–DQ220956. E2 sequences appear under
accession numbers DQ220957–DQ221099.
RESULTS
Phylogenetic Analysis of NS5B
Of the 3,058 patients examined, 11.3% were infected
with genotype 2, 58.8% with genotype 1, 19.4% with
genotype 3, 8.9% with genotype 4, 1.3% with genotype 5,
and 0.2% with genotype 6.
Phylogenetic analysis of 344 NS5B sequences from
patients infected with HCV-2 (study group) and
329 HCV-2 sequences from the Los Alamos HCV
database allowed the identification of a subtype for
84.3% of the strains. Subtypes could be determined
when studied sequences and reference sequences clustered together with a high BV (>70%). Sequences for
which the subtype could not be identified were named 2u
(15.7%). Eight subtypes were determined (Table II). The
two main subtypes were 2i (24.7%) and 2k (22.4%). The
other subtypes were 2c (17.4%), 2a (10.8%), 2b (4.7%), 2l
(2.9%), 2j (0.9%), and 2d (0.6%). The mean pairwise
distance of the 344 NS5B sequences was 0.161 0.012
substitutions per site (range, 0.003–0.420) with significant differences between subtypes (P < 0.001). The
mean distances calculated for each subtype are shown in
Table II. Among subtypes with more than three strains,
subtype 2a is the most homogeneous subtype as it has
the shortest mean pairwise distance (0.043 0.005, P <
0.001). The mode of infection and ethnic origin
were available for 145 patients (subgroup) of these
344 patients. The subgroup patients were infected with
seven subtypes: 2i (25.5%), 2k (24.8%), 2c (15.2%),
2a (12.4%), 2b (5.5%), 2l (2.8%), and 2j (1.4%). The mean
pairwise distance of the 145 NS5B sequences was
0.163 0.013 substitutions per site (range, 0.008–
0.367) with significant differences between subtypes
(P < 0.001). Again, subtype 2a has the shortest mean
pairwise distance (0.043 0.005, P < 0.001). The distribution of sequences and the mean pairwise distances
TABLE II. Distribution of Patients in Each Subtype and Mean Pairwise Distance for Each
Clade by Analysis of the NS5B Region
Study group (N ¼ 344 patients)
Subtype
2a
2b
2c
2d
2i
2j
2k
2l
2u
Subgroup (N ¼ 145 patients)
n (%)
Mean pairwise distance SE
(substitutions per site)
n (%)
Mean pairwise distance SE
(substitutions per site)
37 (10.8)
16 (4.7)
60 (17.4)
2 (0.6)
85 (24.7)
3 (0.9)
77 (22.4)
10 (2.9)
54 (15.7)
0.043 0.005
0.059 0.007
0.059 0.006
0.024 0.008
0.075 0.007
0.038 0.008
0.075 0.007
0.071 0.008
0.167 0.012
18 (12.4)
8 (5.5)
22 (15.2)
0 (0)
37 (25.5)
2 (1.4)
36 (24.8)
4 (2.8)
18 (12.4)
0.043 0.005
0.066 0.008
0.064 0.007
NA
0.077 0.008
0.046 0.011
0.079 0.008
0.081 0.011
0.187 0.014
NA, not applicable.
J. Med. Virol. DOI 10.1002/jmv
Heterogeneity of HCV Genotype 2
29
Fig. 1. Phylogenetic tree of the NS5B sequences from 145 genotype 2 HCV strains and 22 reference
sequences. Percentage bootstrap values are indicated on branches and have been calculated for 1,000
replicates. The black font is used for determined strains and the gray font for strains whose subtype cannot
be determined (i.e., 2u). The gray background is used for identification of patients contaminated by
intravenous drug use.
J. Med. Virol. DOI 10.1002/jmv
30
Thomas et al.
calculated for each clade were not significantly different
for both the 145 and 344 patient samples. The distribution of the 145 strains is illustrated in the NS5B tree
(Fig. 1). All clades were well defined, with BV > 70%,
except for the 2k subtype. Most of the 2u strains were
distributed throughout the tree. All but four of them
formed clusters made of two or three sequences with
BV > 95% and may correspond to potential new subtypes.
Phylogenetic Analysis of E2 Region
The E2 gene of the 145 group 2 strains was also
analyzed (Fig. 2). There was insufficient material to
examine 1 strain, and another E2 was not amplifiable.
Subtypes were determined for four clades: 2a, 2b, 2c, and
2k, with BV over 70% (Table III). Clade 2a includes all
strains subtyped as 2a in the NS5B analysis, as for clade
2b, 2c, and 2k. Clade A1 includes all strains subtyped as
2i in the NS5B analysis; clade A2 includes strains
subtyped as 2j; and clade A3, strains subtyped as 2l.
Subtypes were not determined with the E2 analysis
because no reference sequences were available for these
particular subtypes. Untypeable strains 2u in the NS5B
region remained untypeable in the E2 region. The 2u
sequences that formed clusters in the NS5B tree are
included in clusters with BV > 70% in the E2 tree
(G2MP011 and G2MP020; G2MP027 and G2MP077;
G2MP006 and G2MP016; G2MP001, G2MP025, and
G2MP005; G2MP013, G2MP012, and G2MP018). Thus,
the phylogenetic tree of the E2 region confirmed the
topology of the phylogenetic tree of the NS5B region. The
mean pairwise distance for E2 sequences was 0.396 0.029 substitutions per site (range: 0.069–0.727), which
was greater than the mean pairwise distance of the
NS5B sequences (0.163 0.013, P < 0.001)). As shown
for NS5B sequences, subtype 2a was the most homogeneous subtype (0.156 0.015, P < 0.001).
Epidemiological Data
The main epidemiological characteristics of the
145 patients are summarized in Table IV. All patients
were adults. Patients (60%) were women and the mean
age was 55.5 14.6 (SD) years (range: 22–82) with
variations between subtypes. Patients infected with
subtype 2a were significantly younger (48 years) than
those infected with other subtypes (56.5 years, P < 0.01).
The mean serum viral load before treatment was 5.8 log
RNA copies per ml without any significant differences
between subtypes. Metavir score were available for only
74 patients. Forty-two percent of patients have a fibrosis
score <F2 and 68% F2. One hundred twenty-eight
patients (88.3%) from the subgroup were of Caucasian
origin. The others were mainly of North African origin.
Blood transfusion was a major route of infection for all
subtypes. But a significant relationship was found
between infection with subtype 2a and contamination
due to intravenous drug use (P < 0.001).
J. Med. Virol. DOI 10.1002/jmv
DISCUSSION
This is the first study focusing on the genetic diversity
and epidemiological characteristics of genotype 2 HCV
strains in Europe. Previous studies have been conducted
in West Africa [Ruggieri et al., 1996; Jeannel et al., 1998;
Candotti et al., 2003], where genotype 2 is predominant,
and in Martinique [Martial et al., 2004].
Genotype 2 represents 11.3% of our particular population. This is close to the global frequency of genotype 2
in France described by Martinot-Peignoux et al. [1999]
(10.4%) and more recently by Payan et al. [2005] (9%).
The mean age of HCV-2-infected patients was 55.5 years
(range: 22–82) and is congruent with the results of
Tamalet et al. [2003] showing that HCV-2-infected
patients are older than 46 years.
Eight different subtypes were found, in the MidiPyrénées population, by phylogenetic analysis of the
NS5B region of 344 sequences from patients and 329
reference sequences. Subtypes were determined when
the virus and reference sequences clustered together
with a BV of >70%, which was the case for 2b, 2c, 2d, 2i,
2j, and 2l. The BV for clusters 2a and 2k were lower but
sequences matched and formed a separated cluster with
reference sequences. The determination of subtype
based only on limited genome fragments rather than
the complete genome may lead to an unclear taxonomy.
In addition, the increasing number and diversity of
sequences submitted to the HCV database could make it
difficult to discriminate between clades; this could explain partially the low BVs for 2a, and 2k subtypes in the
344 sequences phylogenetic analysis.
The 145 patients of the subgroup were selected provided the demographic and epidemiological data were
available. The 145 strains presented the same distribution of sequences and the same mean pairwise
distances calculated for each clade than the 344 strains
indicating that the subgroup is representative of the
344 group, in term of genetic diversity. Moreover, the
mean age and the sex ratio are not statistically different
between the 344 group and the subgroup of 145 (data not
shown) which limits the influence of a possible selection
bias. A phylogenetic tree was prepared with the
subgroup of 145 patients and all the BVs values were
above 70% except for the 2k subtype.
Phylogenetic analysis of E2 region was carried out to
strengthen the results of the NS5B region and identify
potential recombinant genomes. The topologies of the
NS5B and E2 trees were congruent for 100% of strains.
This indicates that the E2 region discriminates well
between subtypes, as observed for HCV genotype 4
[Nicot et al., 2005]. Cluster 2k is supported by a significant BV of 74% in the E2 tree and matched with
complete genome 2k confirming that these strains
belong to subtype 2k. Some of untypeable 2u sequences
formed clusters of two or three sequences, but they
matched no available reference. These 2u clusters
formed in the NS5B tree contained the same sequences
as the clusters formed in the E2 tree. These clusters
may become new subtypes or recombinant strains but
Heterogeneity of HCV Genotype 2
31
Fig. 2. Phylogenetic tree of the E2 gene sequence from 143 patients and 8 reference sequences.
Percentage bootstrap values are indicated on branches and were calculated for 1,000 replicates. The
black font is used for determined strains and the gray font for strains whose subtype cannot be determined
(i.e., 2u).
J. Med. Virol. DOI 10.1002/jmv
32
Thomas et al.
TABLE III. HCV Typing Obtained by Analysis of the NS5B and E2 Sequences
Classification based on E2
Classification
based on NS5B
2a
2b
2c
2i
2j
2k
2l
2u
No. Patients
2a
2b
2c
A1
A2
2k
A3
Non
typeable
No. of
patients
18
18
18
8
22
37
2
35
3
18
143
18
8
22
37
2
35
3
18
8
22
37
2
35
3
A1, A2, and A3 clusters include sequences whose subtypes cannot be determined based on E2 sequences.
sequencing complete genome is needed to confirm it.
Although intergenotypic and intratypic recombination
in HCV has been reported in recent years [Kalinina
et al., 2002; Colina et al., 2004], results from this study,
based on NS5B and E2 region analyses, did not allow the
identification of potential recombinant virus.
The presence of eight subtypes with a significant proportion of undetermined subtypes indicates the great
diversity of genotype 2 in Europe. This has been also
reported in a small group of French blood donors
[Cantaloube et al., 2005]. As expected, the E2 region is
more diverse genetically than the NS5B region. However, the mean distances of both regions were greater
than those of genotype 4 HCV strains from patients
selected in the same geographic area, that is, Southwest
France, underlining the great diversity of genotype
2 HCV strains. This is in favor of an old introduction of
HCV-2 in contrast to HCV-4 that is spreading recently
via intravenous drug users in this area [Nicot et al.,
2005]. The genetic heterogeneity of the HCV-2 genotype
in West Africa has been described as a consequence
of long-term endemicity [Jeannel et al., 1998]. African
HCV strains were analyzed together with HCV-2 reference sequences, but most of these did not match the
reference strains so that they could not be assigned to a
subtype. It was concluded that this genetic variability is
due to HCV-2 being endemic in West Africa for a long
time, and that this led to the emergence of multiple
subtypes. The reference strains used in this study were
mostly from industrialized countries (mainly Japan and
Europe), and this could explain why the sequences did
not match the African sequences. The NS5B diversity of
the 344 Midi Pyrénées sequences was analyzed with
110 African sequences available in the Los Alamos HCV
database. Calculation of mean pairwise distances
for each group gave similar results (data not shown),
showing that the Midi Pyrénées strains are as heterogeneous as the African strains. However, calculation of
mean pairwise distances of Ghanaian sequences identified by Candotti et al. [2003] show a greater heterogeneity than HCV sequences identified in Midi Pyrénées
(data not shown). It could be postulated that HCV from a
TABLE IV. Epidemiological Characteristics of Patients Infected With HCV genotype 2
HCV subtype
Characteristics
2a
2b
Men/women
10/8
4/4
Mean viral load (SD) (log10 RNA copies/ml) 5.7*(0.5) 6.0 (0.4)
Metavir score
<F2
5
1
F2
4
1
Unknown
9
6
Mode of contamination
IV drug use
7**
3
Blood transfusion
2
2
5
0
Parenteral exposurea
4
3
Unknownb
Caucasian origin
100%
87%
2c
2i
2j
2k
2l
2u
9/13
5.8 (0.3)
13/24
5.8 (0.5)
1/1
6.0 (0.4)
13/23
5.7 (0.5)
1/3
5.8 (0.7)
7/11
5.9 (0.5)
5
5
12
9
15
13
1
2
1
6
12
18
2
2
6
10
0
8
6
8
91%
0
15
8
14
83%
0
1
0
1
100%
0
15
8
13
92%
0
3
0
1
100%
1
5
5
7
83%
Sex ratio (men/women), age, and mean viral load are data from the 344 patients. Mode of infection and origins were data collected for the
145 patients.
*P < 0.01.
**P < 0.001.
a
Parenteral exposure includes tattooing, piercing, acupuncture, surgery, dialysis, professional and domestic contamination.
b
Unknown includes patients not documented and patients for whom a risk factor was not identified.
J. Med. Virol. DOI 10.1002/jmv
Heterogeneity of HCV Genotype 2
single ancestor has evolved differently and independently in Africa and in Europe because of different
genetic factors and transmission route, explaining the
genetic diversity of HCV-2 in these two areas.
A finding of this study is a specific epidemiological
pattern for the 2a subtype, since 70% of intravenous
drug users harboring genotype 2 were infected with
the 2a subtype. Patients infected with HCV-2a were
younger than patients infected with other subtypes.
Data on genetic distances indicate the 2a strains are
more homogeneous than the other strains which supports the transmission between intravenous drug users
of the related strains. The marked homogeneity and the
small number of intravenous drug users strains indicate
that the 2a subtype has spread recently via intravenous
drug users. Previous studies did not mention the presence of genotype 2 in this particular population [van
Asten et al., 2004; Pybus et al., 2005], which had always
been associated with subtype 1a, 3a, and more recently
4a and 4d [Morice et al., 2001; Nicot et al., 2005].
This study of a large cohort of patients shows the
great genetic diversity of HCV-2 subtypes in the Midi
Pyrénées area of Southwest France. Blood transfusion is
the major route of infection for most of the subtypes and
affects older patients. This corresponds to past infections due to the systematic testing of blood-derived
products since 1990. By contrast, subtype 2a is very
homogeneous and is spreading via intravenous drug
users.
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Publication n°3 :
Method for identification of HCV genotype and subtype using
biological microchip
Journal of Clinical Microbiology, soumis
La détermination du génotype et du sous-type par séquençage de la région
NS5B est la méthode de référence actuelle. Cependant elle nécessite une
instrumentation coûteuse et la réalisation d’analyses phylogénétiques. Cette
technique présente donc un accès limité à certains laboratoires. L’objectif de ce
travail était de mettre au point une technique permettant l’identification des
génotypes et une bonne discrimination des sous-types, par analyse de la région
NS5B sur puce à ADN, plus simple à mettre en œuvre que le séquençage direct et
plus rapide. Ce travail a été réalisé en collaboration avec l’institut Engelhardt de
biologie moléculaire à Moscou, qui a mis au point la technologie des biopuces
(Rubina, 2004; Mikhailovich, 2008). Nous avons apporté notre connaissance de la
diversité génétique du HCV pour le développement et la validation de ces biopuces
HCV.
La technique de génotypage sur puce ADN est basée sur l’analyse d’un
fragment de NS5B identique à celui amplifié pour le séquençage direct. Le fragment
amplifié après RT-PCR subit une deuxième amplification asymétrique (grâce à
l’excès de l’une des deux amorces) permettant l’incorporation de dUTP marqués et la
génération de produits principalement simple brin (quelques produits doubles brins
sont également présents). Les produits de cette deuxième amplification sont ensuite
hybridés sur une puce. La puce contient 120 oligonucléotides, chacun immobilisé
dans une gouttelette de gel. Chaque oligonucléotide est spécifique d’un génotype ou
d’un sous-type (les sondes immobilisées sur la puce permettent de différencier les 6
génotypes et 36 sous-types : 1a-1e, 2a, 2b, 2c, 2d, 2i, 2j, 2k, 2l, 2m, 3a, 3b, 3k, 4a,
4c, 4d, 4f, 4h, 4i, 4k, 4n, 4o, 4p, 4r, 4t, 5a, 6a, 6b, 6d, 6g, 6h, 6k). Plusieurs
oligonucléotides peuvent être spécifiques d’un même génotype et/ou sous-type (les
sondes ont été dessinées sur 4 portions différentes de la région amplifiée). Les
95
signaux des sondes qui hybrident les produits de PCR sont ensuite lus par détection
de la fluorescence et les images enregistrées sont analysées par un logiciel, qui
interprète automatiquement le génotype et/ou le sous-type de la séquence.
Afin de valider cet outil, les produits de RT-PCR de tous les génotypes
réalisés par séquençage direct de la région NS5B au laboratoire ont été conservés
entre mars 2007 et août 2008, et inclus successivement dans l’étude. L’amplification
asymétrique puis l’hybridation sur puce a été réalisée sur 345 échantillons
successifs, représentatifs de la distribution des génotypes et sous-types dans la
région. Le génotype (G1-G6) a été correctement identifié sur les 345 échantillons
(100%) et le sous-type sur 334/335 échantillons (99.7%). Les sous-types testés
étaient les suivants : 1a, 1b, 1e, 2a, 2b, 2c, 2i, 2k, 3a, 4a, 4c, 4d, 4f, 4k, 4p, 5a.
Ce travail a permis de mettre au point une technique d’analyse sur puce ADN,
permettant d’identifier les génotypes et les sous-types du HCV par analyse de la
région NS5B, région suffisamment variable pour discriminer correctement les
différents sous-types existants. Elle permet d’identifier les génotypes et sous-types
les plus représentatifs en France et notamment le 1a du 1b, le 4a du 4d. Cette
technique aussi fiable que le séquençage NS5B a l’avantage d’être largement
accessible.
96
Hepatitis C virus genotyping using an oligonucleotide microarray based on the NS5B
sequence
Running title: HCV genotyping with a biochip
Dimitry Gryadunov1*, Florence Nicot2, Martine Dubois2, Vladimir Mikhailovich1, Alexander
Zasedatelev1 and Jacques Izopet2
1
Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia
2
CHU de Toulouse, Hôpital Purpan, Laboratoire de Virologie, Toulouse F-31300, France
*Corresponding author. Mailing addresses:
Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, 32 Vavilova
St., Moscow, 119991, GSP-1; Russia
Phone No. 7 (499) 135 9846. Fax No. 7 (499) 135 1405. E-mail: [email protected]
1
Abstract
The genotype of the hepatitis C virus (HCV) is essential for determining treatment duration in
clinical practice and for epidemiological and clinical studies. Currently, few genotyping assays
that determine the HCV subtype are available. This report describes a microarray-based
molecular technique for identifying the HCV genotype and subtype. It uses low density
hydrogel-based biochips containing genotype and subtype-specific oligonucleotides based on
the sequences of the NS5B region of the HCV genome. The biochip contains 120
oligonucleotides that identify genotypes 1-6 and 36 (1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 2a, 2b, 2c, 2d, 2i, 2j, 2k,
2l, 2m, 3a, 3b, 3k, 4a, 4c, 4d, 4f, 4h, 4i, 4k, 4n, 4o, 4p, 4r, 4t, 5a, 6a, 6b, 6d, 6g, 6h, 6k)
subtypes. The procedure included amplification of a 380-nt fragment of NS5B and its
hybridization on the biochip. Tests on 345 HCV-positive samples showed that the assay agreed
with NS5B sequencing 100% for the genotype and 99.7% for the subtype. The hybridization on
the microarray and the NS5B sequence were in 100% agreement for identifying the most
common subtypes 1а, 1b, 4а, 4d, and 3a. This approach is a promising tool for HCV
genotyping, especially for implementing the new anti-HCV drugs that require accurate
identification of clinically relevant subtypes.
2
Introduction
The hepatitis C virus (HCV) is a leading cause of chronic liver disease and increased risk of
cirrhosis and hepatocellular carcinoma (49). More than 170 million people are infected with HCV
worldwide (40). This enveloped, single stranded positive sense RNA virus is a member of the
Flaviviridae family. The RNA genome contains a single large open reading frame composed of
over 9,000 nucleotides encoding structural and non-structural proteins (5). One of these
proteins is an RNA-dependent RNA polymerase encoded by the so-called NS5b region. This
error-prone enzyme lacks proofreading activity, which makes it responsible for the great genetic
variability of HCV. Sequencing studies on HCV strains have identified 6 genotypes and more
than 70 subtypes (41, 43).
The HCV genotype is considered to be the major baseline predictor of a sustained virological
response (SVR) to antiviral therapy. Patients infected with HCV genotypes 2 and 3 are more
sensitive to combination therapy with interferon and ribavirin than those infected with genotype
1 (8, 11, 20). The available data on HCV genotype 4 suggest that its sensitivity to HCV
treatment lies somewhere between those of genotypes 1 and 2/3 (17). The sensitivity of
genotypes 5 and 6 could be similar to those of genotypes 2 or 3 (1, 9, 18). The HCV subtype
has recently been implicated as a potential predictor of SVR. One study on 597 difficult-to-treat
patients found that subtypes 1b, 4a and 4d were independently associated with SVR (16). The
virological response to new anti-HCV agents could also be influence by the HCV subtype (29,
39).
Several methods has been proposed for HCV genotyping (48), including commercially available
techniques based on real-time PCR: the HCV genotyping analyte-specific reagent [ASR] assay
(Abbott Molecular Inc., Des Plaines), IL (22), semiautomated sequencing (the TruGene HCV
5’NC genotyping kit, Bayer HealthCare, Berkeley, CA) (10), and automated reverse
hybridization (the Inno-LiPA HCV II assay, Innogenetics, Gent, Belgium) (44, 47). Most HCV
genotyping methods are based on analysis of the 5’ non-coding (NC) region of the HCV
genome because 5’NC is regularly amplified for HCV molecular diagnosis and quantifying the
viral load. However, this highly conserved region is not suitable for accurately discriminating
3
between subtypes and can lead to genotyping or subtyping errors (2, 3, 15, 37, 41). Hence,
alternative genomic regions have been proposed for genotyping HCV, including the core
fragment (33, 47) and the NS5B region (37). Sequencing and phylogenetic analysis of the
NS5B region is presently considered to be the gold standard for HCV genotyping since it
accurately identifies the subtype and can be used to establish an epidemiological picture of
circulating virus strains (26, 28, 37, 45). However, this method is expensive and timeconsuming, and therefore unsuitable for large-scale applications in routine laboratory practice
(12).
Therefore an assay was developed that involves hybridization on an oligonucleotide microarray
for identifying HCV genotypes and subtypes. It uses low density hydrogel-based microarray
(biochip) that has been successfully used in many fields of molecular diagnostics (25, 27, 35).
The microarray contains genotype and subtype-specific oligonucleotides based on the
corresponding sequences of NS5B region. This report compares this approach to accurately
identify HCV genotype and subtype with direct NS5B sequencing.
Materials and methods
Collection of serum samples, HCV RNA isolation and NS5B amplification. All the HCVpositive patients attending Toulouse University Hospital between March 2007 and August 2008
for whom genotyping was requested were included in this study. A total of 345 samples from
consecutive patients with HCV RNA concentrations of 1622 to >10 000 000 IU/mL were
included. The viral load in samples was quantified by real-time RT-PCR COBASTM
Ampliprep/COBASTM Taqman HCV test (CAP/CTM ; Roche Diagnostic, Meylan France)
according to the manufacturer’s instructions.
HCV RNA for genotyping was extracted with the Cobas AmpliPrep Total Nucleic Acid Isolation
kit (TNAI) (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) following the manufacturer’s instructions.
Briefly, RT-PCR was performed using 10 µL of extracted RNA with primers Pr2r (5’GGCGGAATTCCTGGTCATAGCCTCCGTGAA-3’)
and
Pr1f
(5’-
4
TATGAYACCCGCTGYTTTGACTC-3’) as previously described (37). PCR products were stored
frozen for both NS5B sequencing and microarray genotyping.
Sequencing and phylogenetic analysis of the NS5B region. Two microliters of RT-PCR
amplification mix were used for sequencing the NS5B region as previously described (37). The
NS5B nucleotide sequences were aligned with CLUSTAL_X 1.83 software (46) and
phylogenetic trees were created by the neighbor-joining (NJ) method. The reproducibility of the
branching pattern was tested by bootstrap analysis (100 replicates). We used the Treeview 1.66
program to draw the phylogenetic trees (30).
Phylogenetic analyses were performed with the NS5B sequences from patients and 191
reference sequences available from the Los Alamos HCV database (14). These 191 reference
sequences included genotype 1 (subtypes 1a, 1b, 1c, 1d, 1e, 1f, 1g, 1h, 1i, 1j, 1k, 1l, 1m, 1 non
typeable), genotype 2 (subtypes 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 2j, 2k, 2l, 2m, 2o, 2p, 2q, 2r, 2
non typeable), genotype 3 (subtypes 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 3h, 3i, 3k), genotype 4 (subtypes
4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k, 4l, 4m, 4n, 4o, 4p, 4q, 4r, 4t, 4 untypeable), genotype 5
(subtype 5a, 5 untypeable) and genotype 6 (subtypes 6a, 6b, 6c, 6d, 6f, 6g, 6h, 6i, 6j, 6k, 6l, 6o,
6p, 6q, 6t, 6u).
Oligonucleotide design. NS5B region nucleotide sequences were aligned using ‘Bioedit’
software (Ibis Therapeutics, Carlsbad, CA). A total of 1232 NS5B region sequences from
Genbank and the Los Alamos HCV sequence database were aligned (14) (nts 8256-8616
numbering according to (5)). This multiple alignment was used to generate unique consensus
sequences for each genotype. Genotype-specific probes were then selected from within the
corresponding consensus sequences. As the HCV genome is highly variable, several probes
were designed for each genotype wherever possible so as to increase the reliability of the
method. The sequences of the genotype-specific probes selected by this procedure were
located in different segments of the NS5B region.
Next, consensus sequences were deduced for each subtype, and segments of the NS5B region
that discriminated between the maximum number of subtypes within each genotype were
5
selected (Figure 1). The number of such segments was optimized for reliable identification of
each subtype. Finally, probes for identifying subtypes were designed based on the sequences
of the selected segments. This procedure did not exclude the possibility that individual probes
could detect simultaneously two or more subtypes in different subtype-specific segments of the
analyzed NS5B region.
The melting temperatures were calculated and the secondary structures of the designed
oligonucleotides
were
estimated
with
Oligo
analyzer
(Integrated
DNA
technologies,
http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/). The lengths of the oligonucleotides
were adjusted to maintain the range of melting temperatures within 2-3C.
Oligonucleotides for immobilization on the biochip and primers for amplification were
synthesized and purified as described earlier (36). The molecular masses of oligonucleotides
were measured with a MALDI-TOF mass spectrometer COMPACT MALDI 4 (Kratos Analytical,
Chestnut Ridge, NY) using sinapinic acid or 2-amino-5-nitropyridine as a matrix.
Microarray design. The diagnostic biochip comprised 120 immobilized oligonucleotides, four
marker cells (M) for accurate positioning (image acquisition) by the processing software, and
four elements of empty gel (0) needed to calculate the reference fluorescence intensity Iref
(background). The arrangement of oligonucleotides immobilized on the biochip is shown in
Figure 2A. The oligonucleotides labeled ‘G’ that identified the genotype of the HCV sample were
immobilized in the two top rows (all six genotypes). The probes immobilized in the lower rows
identified the HCV subtypes.
Four groups of oligonucleotides were designed to identify subtypes 1a, 1b, 1c, 1d, and 1e of
genotype 1. Three groups of probes were designed to differentiate between subtypes 2a, 2b,
2c, 2d, 2i, 2j, 2k, 2l, and 2m of genotype 2. Three more groups of oligonucleotides identified the
three subtypes of genotype 3 – 3a, 3b, and 3k. Finally, four groups of probes were included to
identify subtypes 4a, 4c, 4d, 4f, 4h, 4i, 4k, 4n, 4o, 4p, 4r, and 4t of genotype 4. Genotype 5 has
only one subtype 5a, therefore the three probes for identifying genotype 5 also identified
subtype 5a. Subtypes 6a, 6b, 6d, 6g, 6h, and 6k of genotype 6 were identified using two groups
6
of probes, each of which corresponded to a separate segment within the analyzed fragment of
NS5B region (see Fig.1).
Biochip Manufacture. The biochips were manufactured as described earlier (36), with 35-μl
hybridization chambers (Biochip-IMB, Ltd., Moscow, Russia). Each biochip contained semispherical gel elements 100 m in diameter placed 300 m apart. Quality control of large-scale
microchip production was done by measuring the quantity of immobilized oligonucleotides in
each gel element using ‘TestChip’ software provided by Biochip-IMB, Ltd.
Amplification of the NS5B fragment for genotyping on the microarray. The PCR
amplification step was performed with 1 l RT-PCR reaction mixture using the primers Pr1f and
Pr3r (5’-GCTAGTCATAGCCTCCGT-3’). The primer concentrations were: Pr1f – 10 nM, Pr3r –
100 nM.
The reaction mixture (25 l) contained 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 0.2
mM of each dATP, dCTP, dGTP and dUTP (Sileks, Russia); 0.04 mM of fluorescently labeled
dUTP ‘IMD-515-dUTP’ (Biochip-IMB, Ltd, Moscow, Russia), 5 units Taq DNA-polymerase
(Sileks). Because of the difference in the concentrations of forward and reverse primers within
each pair, the reaction yielded predominantly single stranded fluorescently labeled product.
PCR was performed as follows: 4 min at 95C; 36 cycles of 20s at 95C, 20s at 60C, and 30s
at 72C; and 5 min at 72C.
Hybridization on the biochip and registering the results. Hybridization mixtures were
prepared by adding 12 l of PCR mixtures to 23 l of 1.5M guanidine thiocyanate (GuSCN),
0.075M HEPES, pH 7.5, 7.5mM EDTA. The biochip hybridization chamber was filled with the
mixture, and the assembly was incubated for 14-16 h at 37C. The chamber was then removed,
the microarray surface washed three times (about 30 s each) with water at 37 C, and air-dried.
The fluorescent pattern of biochips was registered using a fluorescence analyzer setup and
specialized software ‘ImageWare®’ (Biochip-IMB, Ltd).
7
Interpretation of hybridization results.
Genotype identification (genotyping). First, perfect hybridization duplexes were identified
within the upper two rows containing oligonucleotides for identifying genotypes. Our statistics
(31) indicated that the fluorescent intensity of perfect duplexes should be at least 2.0 times
higher than the average background signal (Iref) with a standard deviation of 0.2. Thus, a 2.0fold intensity difference was taken as the threshold value for selecting positive signals.
The intensities of selected positive signals corresponding to perfect duplexes were compared
within each genotype-specific group. If the maximum signal Gimax in one group exceeded the
maximum signal in the other groups by more than 1.5-fold, the analyzed specimen was
considered to belong to the corresponding genotype.
If the ratio of the signals among Gimax observed within each individual group did not exceed 1.5,
the genotype of the analyzed specimen could not be accurately determined and identification of
subtype was not performed. The program stopped further processing when the signals within
each genotype-specific group were below the threshold value and could not pass the initial
selection.
Subtype identification (subtyping). The subtype-specific oligonucleotides were combined in
groups according to the selected segments of the NS5B region. Subtyping was performed
strictly after the genotype had been successful identified. It was crucial for the identification
strategy to consider only the subtype-specific oligonucleotides corresponding to specific
genotype while excluding all other signals as irrelevant.
The signals within each group of subtype-specific probes were considered positive if their
intensities were at least 2.0 times the average background signal Iref. Positive signals within
each group of subtype-specific probes that were at least 1.5-times stronger than other signals of
the same group were selected for further processing. These signals were designated Sixj (where
i is the genotype number, x the symbol of a subtype according to the HCV subtype
classification, j the number of the analyzed group of microarray elements). When two or more
elements within the same group had signals differing from one another by less than 1.5-fold,
then all such signals Sixj were selected as positive. As a result, a set of elements from various
8
groups ix1, iy1, ix2, iz2, ix3, etc. were detected whose signals were at least 1.5-times the rest of
the signals in their groups. If the number of elements homologous to one subtype in such a set,
for example, ix1 and ix3, or ix1 and ixy2, exceeded the number of elements corresponding to
other subtypes by at least one, the conclusion was that the analyzed specimen belonged to
subtype ‘x’ of genotype ‘i’.
When the elements of different groups in the set so obtained corresponded to a different
subtype, for example, ix1, iy2, iz3, or ix1, iyz3, the sets of signals corresponding to individual
subtypes were compared to each other. If the signal of an element corresponding to subtype ‘x’
in one group was 3 or more times stronger than the strongest signals from the groups
corresponding to other subtypes, the conclusion was that the analyzed specimen belonged to
subtype ‘x’. If the ratio of signals Six1/Siy2 was 3 or less, we concluded that the subtype could not
be determined. Similarly, if the probe specific for two subtypes was the strongest signal in the
group, for example, ixy1, and there were no valid signals in other groups of the elements, the
conclusion was that the subtype could not be determined. Finally, if the signals of subtypespecific groups of elements did not pass the primary signal filtration relative to Iref, the
conclusion was that the subtype of the analyzed specimen could not be determined.
Statistical analysis. The kappa coefficient was measured using Stata SE 9.2 (StataCorp LP,
College Station, TX) to evaluate the concordance between the HCV subtypes determined by
NS5B sequencing and the NS5B biochip assays. The overall proportions of HCV subtypes
determined by NS5B sequencing and the NS5B biochip assays were checked using the Chi-2
test. P values of <0.05 were considered significant.
9
Results
Determining the genotype/subtype by biochip analysis of the NS5B region. HCV
genotyping based on analysis of the NS5B region was performed by hybridization on the
biochip. The procedure consisted of three steps: (i) RT-PCR to amplify the NS5B region
fragment; (ii) asymmetric PCR to obtain fluorescently labeled predominantly single-stranded
DNA fragments; and (iii) hybridization of the labeled product on the biochip with gel elements
carrying immobilized oligonucleotides.
Figure 2B shows an example of hybridization pattern and distribution of normalized signals of
biochip elements resulting from analysis of a subtype 1b sample. As defined by the algorithm
described in Methods, only signals in G1 group containing genotype 1-specific probes were
more than 2 times the threshold with the maximum signal produced by the G1-3 element (2.68).
The signals in other groups containing genotype-specific probes were close to background (the
deviation from Iref did not exceed 0.12). The conclusion was that this HCV sample belonged to
genotype 1.
Further processing of the groups of elements containing specific probes for genotype 1
subtypes produced the following results. In group 1, the strongest signal was obtained from
element 1bd1 (4.98). In group 2 it was 1b2 (3.72), in group 4 it was 1b4 (2.46). Group 3
contained no elements with positive signals (see corresponding histogram on Fig.2B).
Consequently, this specimen was identified as subtype 1b.
Additional examples of fluorescence patterns by hybridization with different HCV samples are
shown in Fig.3 (A-I). All the genotype-specific probes hybridized with the corresponding target
genotypes without cross-reacting with the other genotypes. Analysis of some samples, for
instance 4d (see Fig. 3G), resulted in cross-hybridization with oligonucleotides specific for
subtypes of genotype 2. However, the data processing algorithm uses only the elements with
subtype-specific probes of genotype that was determined in the previous step regardless of the
signals in other biochip elements. As a result, the subtypes for most samples were identified
unambiguously.
10
Analytical sensitivity and specificity. The analytical sensitivity of this method was estimated
by assaying ten-fold serial dilutions (with seronegative plasma) of a plasma standard contained
5.2×106 IU/mL of HCV subtype 1b. Four replicates were used for each dilution. The
hybridization results obtained with the 2.0×102 UI/ml concentration of viral RNA were
unambiguous.
The specificity of the procedure was tested using 24 seronegative plasma samples. All were
identified as negative samples. With at least three replicates of each sample analyzed, the
deviations of signals of genotype- and subtype-specific elements for identical samples remained
within 20% of the average background signal (Iref). Therefore, there were no false-positive
results.
Comparison of biochip-based genotyping with NS5B sequencing. Table 1 shows the
results obtained by hybridization on the biochip and direct sequencing of NS5B segments. All
(100%) of the 345 HCV RNA-positive sera analyzed were successfully genotyped by biochip
hybridization. They included samples infected with all six HCV genotypes.
The samples included subtypes 1a, 1b, 1d, 1e, 2a, 2b, 2c, 2i, 2j, 2k, 2l, 3a, 4a, 4c, 4d, 4f, 4h,
4k, 4p, 4r, 5a and samples of undetermined subtypes of genotypes 1, 2, 4 and 6, as determined
by sequencing. The two methods were concordant for the subtypes of 329/330 samples
(99.7%), with a kappa coefficient of 0.996 (p<0.00001). One sample, identified as 2c by NS5B
sequencing was identified as 2k by NS5B biochip analysis. The NS5B sequencing method
failed to determine the subtypes in 8 samples (2.3%) and the NS5B biochip methods failed in 12
samples (3.5%) (p=0.36). Samples with an undetermined subtype by NS5B sequencing were
identified as 1a, 1b, 2k, 4h and 4r by NS5B biochip analysis. Samples with an undetermined
subtype by NS5B biochip analysis were assigned to subtypes 1d, 2a, 2j and 2l by NS5B
sequencing. The subtypes of 5 samples were not determined by either method.
11
Discussion
The gold standard for HCV genotyping remains PCR-amplification followed by sequencing of
one of the phylogenetically informative coding region of the HCV genome, such as NS5B or
core/E1, and comparison with the consensus sequences in GenBank or the Los Alamos
Hepatitis C databases (14). We have developed a novel microarray-based assay for identifying
the genotype and subtype. The new NS5B microarray assay and NS5B sequencing were in
almost complete agreement.
The assay relies on hybridization a 380-nt NS5B fragment with oligonucleotides specific for
HCV genotypes and subtypes immobilized on a biochip. The reliable identification of each
individual genotype and subtype required the design of several oligonucleotides for each of
them, in consequence of the variability of the NS5B region. The results were interpreted using
an original algorithm that included preliminary processing of the hybridization signal intensities
from the biochip elements, comparison of signals from elements within the sets of genotypespecific probes, and then from sets of subtype-specific probes.
The new method enabled us to determine all six HCV genotypes with a sensitivity of
approximately 2.0×102 IU/ml of HCV RNA. This analytical performance using biochip-based
genotyping and subtyping is comparable to that of commercially available assays (48), including
the new generation of line probe assays (47).
The new method was tested on 345 HCV-positive samples. The results were 100% concordant
for the genotype and 99.7% concordant for the subtype with the results obtained by direct
sequencing of the NS5B segment. The accuracy and reliability of the assay makes it suitable for
large-scale genotyping and subtyping projects.
Hybridization on the biochip correctly identified HCV isolates of subtypes 1a, 1b, 1e, 2a, 2b, 2c,
2i, 2k, 3a, 4a, 4c, 4d, 4f, 4k, 4p, 4r and 5a. It failed to identify subtypes 1d, 2j, 2l, and 4h. This
could be because there are fewer of these NS5B sequences in GenBank and other databases
which resulted in less accurate selection of subtype-specific probes. However, these subtypes
are very infrequent in Europe – 2.9% for 2l, 0.9% for 2j and 1% for 4h (28, 45). But the
hybridization on the microarray and NS5B sequencing were in 100% agreement for identifying
the most widespread and clinically relevant subtypes, such as 1а, 1b, 4а, 4d, and 3a. The only
12
limitation of the study is that not many samples of HCV genotype 6 were tested because this is
very rare in France.
Some recent studies have shown that HCV subtypes can predict the response to standard
treatment regimens that include pegylated interferon and ribavirin. One French multicenter study
of 597 treated patients showed that subtypes 1b, 4a and 4d were independent predictors of
SVR (16). Another study of 1532 patients infected with HCV genotype 4 showed that subtype
4a was more sensitive to anti-HCV treatment than subtype 4d (34). Moreover, the development
of new specific inhibitors of HCV enzymes whose antiviral responses and resistance profiles
may be determined by the HCV subtype may require identification of the subtype prior to
treatment (7, 19, 23). Several HCV inhibitors appear to act selectively against certain HCV
genotype 1 subtypes, both in vitro and in vivo. Differences in the activities of NS3/4A protease
inhibitors (telaprevir and boceprevir) against different subtypes have been reported. There is
evidence that the selection of resistant variants and virus breakthrough is more frequent in
patients infected with subtypes 1b than in those harboring subtype 1a (13, 24, 38). The antiviral
activities of nucleoside analogs of polymerase inhibitors are similar regardless of the HCV
subtype, while non-nucleoside inhibitors are more active against subtype 1b than against
subtype 1a (29, 39). These findings suggest that the antiviral activity of new anti-HCV agents
may also vary with the subtypes of genotypes other than 1. It is therefore essential to accurately
discriminate between subtypes in order to tailor anti-HCV treatment schedules with HCV
protease and polymerase inhibitors. There are few methods presently available other than direct
sequencing of NS5B and core/E1 segments for identifying numerous subtypes. One of the
commercially available methods, the INNO-LiPA v.2, discriminates better between subtypes 1a
and 1b than the previous version INNO-LiPA v1, but does not discriminate between subtypes
4a, 4c and 4d (4, 47). Our new method correctly identified HCV subtypes 1a and 1b in more
than 99% of samples; it also identified subtypes 4a and 4d.
All the experimental microarray-based methods for HCV genotyping use immobilized
oligonucleotides from the 5’-untranslated region of the HCV genome. They can therefore
identify only a small number of subtypes (1a, 1b, 2a/2b/2c, 3a, 3b, 6a), although their
determination of genotypes is reported to be almost 100% ((6), (21), (32)). In this work, use of
13
probes complementary to subtype-specific sequences of the NS5B region enabled to identify
more than twenty HCV subtypes in the specimens tested. Other methods, such as real-time
PCR, can identify a limited number of subtypes and genotypes (1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3, 4, 5 et 6
)((22), (42)). Only the Clip Sequencing method can, in theory, discriminate as many subtypes as
our procedure (33).
In conclusion, this new approach to analyzing the NS5B region of HCV based on hybridization
with a low-density microarray is a promising tool for rapidly, sensitively, and accurately
identifying viral genotype and subtype. It provides clinicians with the information needed for the
choice of a correct individual treatment of hepatitis C. In addition, the performance of the new
procedure and the range of identifiable genotypes and subtypes make it suitable for
epidemiological surveys.
Acknowledgements
This work was supported by the contract #02.522.11.2019 with Federal Agency of Sciences and
Innovations of Russian Federation.
We are grateful to E. Kreindlin, for manufacturing of microarrays, to S. Surzhikov, and I.
Grechishnikova for synthesis of oligonucleotides, to Dr. A. Chudinov for synthesis and selection
of the fluorescent dyes, to Dr. R. Urasov for help with the mathematical calculations and
analysis of experimental data. We are especially grateful to Dr. A. Kolchinsky (Health Front
Line, Ltd., Champaign, IL) for his assistance in preparation of this paper. The English text was
edited by Dr Owen Parkes.
14
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Figure legends
Fig. 1. Alignment of the subtype-specific consensus sequences of NS5B region. The subtypes
are indicated in the left-hand column. Residues identical to the consensus sequence of subtype
1a are indicated by dots. Numbering is from first nucleotide of H77 1a reference sequence
(GenBank Acc No NC_004102). The positions of segments of the NS5B region used for
selecting subtype-specific probes are boxed. The number of the segment corresponds to a
group number and designation of subtype-specific oligonucleotide. Slashes indicate
discontinuous sequences within the NS5B region.
Fig. 2. (A) Diagram of the biochip for hybridization. Elements with index ‘G’ contain genotypespecific probes. Four probes (G1-1 – G1-4) are used to identify genotype 1, three (G2-1 – G2-3)
for genotype 2, two (G3-1 – G3-2) for genotype 3, three (G4-1 – G4-3) for genotype 4, three
(G5-1 – G5-3) for genotype 5 and one (G6) for genotype 6. The probes for identifying subtypes
are named ixN, where ‘i’ is the genotype number, ‘x’ indicates the subtype, and N is the number
of the group corresponding to a segment of the NS5B region. (B) Fluorescence hybridization
pattern of biochip elements obtained by analyzing HCV sample of genotype 1, subtype 1b. The
group of genotype-specific probes (G2-1 – G6) and groups 1-4 of subtype-specific probes of
genotype 1 are outlined with a broken line. The histogram of normalized fluorescence signals of
row 2 elements containing genotype-specific oligonucleotides is shown above the hybridization
pattern. The histograms of normalized fluorescence signals of elements comprising groups 1-4
of subtype-specific oligonucleotides belonging to genotype 1 are outlined below the
fluorescence image. The calculated value of the mean signal of empty elements (Iref) is shown
by a solid bold line on both histograms.
Fig. 3. (A) Hybridization patterns obtained using HCV samples belonging to subtype 1a(A), 1b
(B), 2a (C), 2i (D), 3a (E), 4a (F), 4d (G), 5a (H), 6x (I). The groups of elements containing
genotype- and subtype-specific oligonucleotides corresponding to the analyzed sample are
contoured.
21
Table 1. A comparison of HCV genotyping obtained by NS5B sequencing and hybridization on the biochip.
Number of isolates with HCV genotype and subtype assigned by hybridization on biochip
NS5B
Sequenci 1 1a 1b 1 1 2 2 2 2 2i 2j 2 2l 3 4 4 4 4 4f 4
ng
d e
a b c
k
a
a c d
h
1 1
1
1
10
1a
3
88
1b
1
1d
1
1e
3
1
2
1 4
2a
5
2b
3
1
2c
7
2i
1
2j
5
2k
1
2l
8
3a
4
4
1
4a
2
1
4c
8
4d
1
4f
1
4h
4k
4p
2
4r
5a
6
2 10 89 0 1 6 4 5 3 7 0 7 0 8 3 1 1 8 1 0
Total
4
4
2
4k
4p
4r
5a
6
Tota
l
3
103
88
1
1
4
5
5
4
7
1
5
1
84
0
12
1
1
2
3
1
1
2
3
1
1
1
8
1
1
1
1
4
3
1
345
22
Figure 1
23
Figure 2
24
Figure 3
25
PARTIE II :
FACTEURS ASSOCIES A LA REPONSE AU TRAITEMENT CHEZ DES
PATIENTS DIFFICILES A TRAITER
Publication n°4 :
Serum Concentrations of Ribavirin and Pegylated Interferon and
Viral Responses in Patients Infected With HIV and HCV
Journal of Medical Virology 2008, vol.80, p.1523-1529
L’infection HCV est devenue une cause majeure de morbi-mortalité chez les
patients HIV+. Hors les patients coinfectés HCV-HIV répondent moins bien à une
bithérapie par pegIFNα et RBV que des patients monoinfectés HCV. De nombreux
facteurs peuvent influencer la réponse au traitement chez les patients mono-infectés
parmi lesquels les concentrations de RBV. Chez les patients coinfectés HCV-HIV
l’impact des facteurs pharmacologiques sur la réponse au traitement était peu
documenté. L’objectif de cette étude a été d’évaluer l’influence des concentrations de
RBV et de pegIFNα sur la réponse au traitement de patients coinfectés HCV-HIV.
Tous les patients coinfectés HCV-HIV et traités par pegIFNα et RBV (n=35) au
CHU de Toulouse entre 2001 et 2005, ont été inclus rétrospectivement dans cette
étude. Le dosage des concentrations de pegIFNα a été réalisé par un test biologique
en culture cellulaire et le dosage des concentrations de RBV par chromatographie
liquide haute performance couplée à une détection UV, sur des sérums collectés 3
mois (M3) et 6 mois (M6) après le début du traitement.
Vingt et un (60%) patients étaient infectés par un génotype 1 ou 4, 28 étaient
traités par du pegIFNα-2b, 7 par pegIFNα-2a, et 24 (67%) étaient sous traitement
antirétroviral. Une RVP a été observée chez 43% des patients et une RVS chez 37%
97
des patients (29% chez les patients infectés par un génotype 1/4 et 50% chez les
patients infectés par un génotype 2/3).
Les concentrations moyennes de pegIFNα étaient de 81 ± 116 UI/mL et 86 ±
113 UI/mL à M3 et M6. Les concentrations moyennes de RBV étaient de 2 006 ± 780
ng/mL et 2 034 ± 1 021 ng/mL à M3 et M6. Nous avons observé pour les deux
molécules une variabilité interindividuelle importante mais une faible variabilité
intraindividuelle entre M3 et M6.
La relation entre les concentrations sériques médicamenteuses mesurées à
M3 et la RVS a été étudiée. Les concentrations moyennes de pegIFNα étaient
similaires chez les patients répondeurs et les patients non répondeurs. Au global, les
concentrations de RBV tendaient (p=0,08) à être plus élevées chez les patients
répondeurs (2 322 ± 926 ng/mL) que chez les patients non répondeurs (1 833 ± 646
ng/mL). Chez les patients infectés par un génotype 2/3, les concentrations de RBV
étaient similaires chez les répondeurs et les non répondeurs (p=0,89). En revanche,
les concentrations de RBV chez les patients infectés par un génotype 1/4 étaient
significativement plus élevées chez les répondeurs (2 672 ng/mL) que chez les non
répondeurs (1 758 ng/mL) (p<0,05). Un seuil de concentration de RBV à M3 prédictif
de la réponse virologique a été déterminé par analyse de courbes ROC. Un seuil à
2 300 ng/mL a été défini comme prédictif de la RVS avec une sensibilité de 67% et
une spécificité de 86%.
Cette étude est la première à avoir évalué à la fois l’influence des
concentrations de RBV et de pegIFNα sur la réponse au traitement chez des patients
coinfectés HCV-HIV. Nous avons mis en évidence que les concentrations sériques
de RBV pouvaient être un facteur important pour améliorer la réponse au traitement
chez les patients infectés par un génotype 1/4 et que des concentrations inférieures
à 2 300 ng/mL étaient prédictives d’une non réponse dans 86% des cas.
98
Journal of Medical Virology 80:1523–1529 (2008)
Serum Concentrations of Ribavirin and Pegylated
Interferon and Viral Responses in Patients Infected
With HIV and HCV
Florence Nicot,1,2 Florence Legrand-Abravanel,1,2 Thierry Lafont,3 Martine Dubois,1,2
Karine Sauné,1,2,4 Christophe Pasquier,1,2,4 Etienne Chatelut,2,4 and Jacques Izopet1,2,4*
1
INSERM, U.563, Toulouse, France
CHU Toulouse, Institut Fe´de´ratif de Biologie de Purpan, Laboratoire de Virologie, Toulouse, France
3
EA3035, Institut Claudius-Regaud, Toulouse, France
4
Universite´ Toulouse III Paul-Sabatier, Faculte´s de Me´decine et de Pharmacie, Toulouse, France
2
The hepatitis C virus (HCV) infects a substantial
proportion of patients infected with human
immunodeficiency virus (HIV). Patients infected
with both HCV and HIV respond poorly to antiHCV treatment with pegylated interferon alpha
and ribavirin. But few data are available on the
influence of ribavirin and interferon concentrations on treatment outcome for these patients.
This study investigated the relationship between
the serum pegylated interferon and ribavirin
concentrations 3 and 6 months after treatment
initiation, and treatment outcome in 35 HCV-HIV
coinfected patients. The pegylated interferon and
ribavirin concentrations at months 3 and 6 were
similar. The pegylated interferon concentrations
at 3 months in responders and nonresponders
were similar. However, responders tended to have
higher ribavirin concentrations (2,322 ng/ml)
than nonresponders (1,833 ng/ml; P ¼ 0.08). Responders infected with HCV genotype 1 or 4 had
higher ribavirin concentrations (2,672 ng/ml)
than did similarly infected nonresponders (1,758
ng/ml; P ¼ 0.04). ROC curve analysis showed that
a ribavirin concentration of 2,300 ng/ml was the
best threshold for predicting a nonresponse (ROC
area ¼ 0.80 0.12). Thus ribavirin concentrations
influence treatment outcome in HIV patients
infected with HCV genotype 1 or 4. Monitoring
ribavirin concentrations could help adapt ribavirin concentrations and improve the sustained
virological response. J. Med. Virol. 80:1523–
1529, 2008. ß 2008 Wiley-Liss, Inc.
KEY WORDS: HCV-HIV coinfection; peginterferon; RBV; HCV treatment
INTRODUCTION
A substantial proportion of patients infected with
human immunodeficiency virus (HIV) are also infected
ß 2008 WILEY-LISS, INC.
with hepatitis C virus (HCV) [Sherman et al., 2002;
Rockstroh et al., 2005; Strader, 2005]. The prevalence of
HCV-HIV coinfection depends on the risk of the patient
acquiring HIV. HCV currently causes morbidity and
mortality in HIV-infected patients and they progress
to end-stage liver disease faster than patients infected
by HCV alone [Benhamou et al., 1999; Thomas, 2002;
Martin-Carbonero et al., 2004]. Treating HCV in HIV
infected patients is therefore a priority. The current
recommended treatment for chronic HCV infection in
patients infected with HCV alone is a combination of
oral ribavirin and subcutaneous pegylated interferon
a-2a or a-2b. A sustained virological response is obtained
in more than half of treated patients, depending on
the HCV genotype: 30–40% of patients infected with
genotype 1 or 4 and 80% of patients infected with
genotype 2 or 3 [Manns et al., 2001; Fried et al., 2002;
Hadziyannis et al., 2004; Zeuzem et al., 2004; LegrandAbravanel et al., 2005]. Although the same treatment
is recommended for HCV-HIV infected patients, the
response rates for these patients are worse: 17–29% for
genotype 1 or 4 and 44–62% for genotype 2 or 3 [Carrat
et al., 2004; Chung et al., 2004; Laguno et al., 2004;
Torriani et al., 2004], except in one study conducted with
higher ribavirin doses [Nunez et al., 2007].
Numerous parameters can influence the long-term
outcome of anti-HCV treatment, including genetic
variations in the HCV genome, virus load, infections
with HIV or HBV, and various host factors [Pawlotsky,
2003; Zeuzem, 2004]. The ribavirin concentrations have
been identified recently as a factor influencing the
*Correspondence to: Jacques Izopet, INSERM, U.563, IFR30,
Université de Toulouse et Laboratoire de Virologie, Institut
Fédératif de Biologie de Purpan, 330, Avenue de Grande-Bretagne
TSA 40031, 31059 Toulouse, Cedex 9, France.
E-mail: [email protected]
Accepted 3 April 2008
DOI 10.1002/jmv.21227
Published online in Wiley InterScience
(www.interscience.wiley.com)
1524
Nicot et al.
response to anti-HCV treatment in patients infected
with HCV alone. Jen et al. [2000] first demonstrated that
higher ribavirin concentrations at week 4 are associated
with a better response. Larrat et al. [2003] demonstrated that ribavirin concentrations at weeks 12 and
24 are also higher in responders than in nonresponders
and described great variations in the ribavirin concentration between individuals. Several ribavirin concentration thresholds (from 2,000 to 3,000 ng/ml) have been
proposed for predicting a high sustained virological
response rate [Tsubota et al., 2003; Arase et al., 2005].
But little is known about the influence of the plasma
ribavirin concentration on the long-term outcome of
treatment in HCV-HIV coinfected patients. The influence of plasma ribavirin concentrations on the early
virological response has been reported [Rendon et al.,
2005], but its influence on the sustained virological
response has been explored in only one study, measuring early ribavirin levels [Dahari et al., 2007]. The better
response of hemodialysis patients treated with standard
interferon than of patients with normal renal function
[Izopet et al., 1997] was explained by the lower clearance
and a greater area under the plasma curve (AUC) of
interferon in these patients [Rostaing et al., 1998;
Chatelut et al., 1999]. This suggests that the interferon
concentration influences the virological response. Boulestin et al. [2003] also demonstrated that the interferon
AUC tended to be greater in early responders than in
early nonresponders. However, there have been few
studies on the influence of the circulating pegylated
interferon concentrations on the virological response of
HCV infected patients until the recent development of
bioassays [Boulestin et al., 2004; Francois et al., 2005].
Since few data are available on the pharmacological
parameters and sustained virological response to antiHCV treatment in HCV-HIV coinfected patients, the
present study determined the serum pegylated interferon and ribavirin concentrations 3 and 6 months after
initiating treatment in HCV-HIV coinfected patients.
The influence of pegylated interferon and ribavirin
concentrations on the sustained virological response
and the usefulness of monitoring these drugs for predicting sustained virological response in these patients
were assessed.
MATERIALS AND METHODS
Population Studied
All HCV-HIV coinfected individuals whose HCV
infection was treated with pegylated interferon and
ribavirin at the Toulouse University Hospital between
2001 and 2005 were retrospectively included in the
study. They were treated for chronic hepatitis C with
pegylated interferon a-2b (n ¼ 28) or a-2a (n ¼ 7) plus
ribavirin (600–1,200 mg daily according to body weight)
for 48 weeks. The drug concentrations were measured
on stored frozen sera from blood samples taken 3 and
6 months after treatment initiation and collected before
the next doses of pegylated interferon and ribavirin.
Samples were processed in the 2 hr following blood
J. Med. Virol. DOI 10.1002/jmv
sampling and were kept frozen at 808C. Patients
achieved an early virological response when they had an
undetectable virus load after three months of treatment.
Patients were responders if they achieved a sustained
virological response, defined as an undetectable HCV
virus load 6 months after treatment withdrawal, and
were nonresponders if their HCV virus load was
detectable at this time.
HCV-RNA Detection
Serum HCV-RNA was detected with a commercial kit
(Amplicor 2.0 HCV kit, Roche Diagnostics, Meylan,
France) according to the manufacturer’s instructions.
The limit of detection was 50 IU/ml.
HCV-RNA Quantification
Serum HCV-RNA was measured by quantitative RTPCR (Cobas Monitor HCV 2.0, Roche Diagnostics)
according to the manufacturer’s instructions. The limit
of detection was 600 IU/ml.
HIV-RNA Quantitation
Serum HIV-RNA was measured by quantitative
RT-PCR (Cobas Monitor HIV 1.5, Roche Diagnostics)
according to the manufacturer’s instructions. The limit
of detection was 50 copies/ml.
HCV Genotyping
Genotypes and subtypes were determined by sequencing a 401-bp fragment within the NS5b region of the
HCV genome followed by phylogenetic analysis with
reference strains from the Los Alamos HCV database
(http://hcv.lanl.gov/content/hcv-db/index) [Sandres-Saune
et al., 2003].
Determination of Serum Pegylated
Interferon Concentrations
The residual pegylated interferon concentrations in
serum samples taken at months 3 and 6 were measured
with a bioassay as reported previously [Boulestin
et al., 2004]. The assay evaluates the reduction in the
cytopathic effect on MDBK cells in culture of the
vesicular stomatitis virus by the pegylated interferon
in serum samples. The method is linear from 0 to
500 IU/ml.
Determination of Serum
Ribavirin Concentrations
Residual serum ribavirin concentrations were determined 3 and 6 months after treatment initiation by a
slightly modified high-performance liquid chromatography (HPLC) method [Svensson et al., 2000; Kamar
et al., 2004]. Serum samples were prepared by adding
500 ml of the specimen to 500 ml 0.5 M ammonium
hydroxide and 100 ml 50 mg/ml 3-methylcytidine (3-MC;
internal standard). The diluted samples were loaded
Ribavirin Concentrations in Treated HCV-HIV Patients
onto phenyl boronic acid Bond Elute 100 mg/PK
cartridges (Varian SA) that had been treated with 1 ml
methanol, 1 ml 0.1 M phosphoric acid, and 1 ml 0.5 M
ammonium hydroxide. The cartridges were washed
twice with distilled water and ribavirin and 3-MC was
eluted with 500 ml 0.1 M phosphoric acid. An aliquot
(100 ml) of the eluate was injected onto a Bischoff
NucléosilR C18 7 mm (250 mm by 4.6 mm) column with a
mobile phase consisted of ammonium dihydrogenphosphate buffer (10 mmol/L), pH ¼ 2.5 at a flow rate of 1 ml/
min. Peaks were detected at a wavelength of 215 nm.
The method was linear from 250 to 6,000 ng/ml. The
average within-run and between-run precision was
better than 15% for control samples of high and medium
concentrations, and better than 20% for low concentrations.
Statistical Analysis
Continuous variables were tested with the Mann–
Whitney test or with Student’s paired or unpaired t-test.
Categorical variables were tested by the Chi-squared
test. A ROC curve analysis was performed to determine
the ribavirin threshold. P values of <0.05 were considered significant.
RESULTS
Patient Characteristics
Thirty-five patients infected with HCV and HIV and
treated with pegylated interferon and ribavirin were
retrospectively included. Their anti-HCV treatment is
summarized in Table I. The HCV genotype distribution
was 1 (n ¼ 15), 2 (n ¼ 2), 3 (n ¼ 12), and 4 (n ¼ 6).
Information on liver histology, based on the METAVIR
score after liver biopsy, was available for 25 patients.
A total of 24 patients were on antiretroviral therapy at
the time HCV therapy was initiated (Table I) and 13 had
an undetectable HIV virus load. An early virological
response was obtained in 43% of patients; it was 38% in
patients infected with HCV genotype 1 or 4 and 50% in
patients infected with HCV genotype 2 or 3 (P ¼ 0.48). A
TABLE I. Anti-HCV (n ¼ 35) and Anti-HIV (n ¼ 24)
Treatment
Patients, n (%)
Anti-HCV therapy
Pegylated interferon a-2a
Pegylated interferon a-2b
Ribavirin
600 mg
800 mg
1000 mg
1200 mg
Antiretroviral therapy
Zidovudine
Abacavir
Stavudine
Didanosine
Lamivudine
Tenofovir
7 (20)
28 (80)
3 (9)
19 (54)
10 (28)
3 (9)
12 (34)
5 (14)
5 (14)
6 (17)
21 (60)
4 (12)
1525
sustained virological response was obtained in 37% of
patients; in 29% of patients infected by HCV genotype 1
or 4, and in 50% of patients infected by HCV genotype 2
or 3 (P ¼ 0.19). The dose of pegylated interferon had to be
reduced for four patients (two responders and two
nonresponders). The dose of ribavirin had to be reduced
for six patients (two responders and four nonresponders). No patient was given growth factors. The baseline
characteristics of responders and nonresponders are
summarized in Table II. The parameters influencing
the treatment outcome — sex, mean age, weight, mean
CD4þ cell count, fibrosis score, and HCV virus load —
were similar in responders and nonresponders.
Pegylated Interferon and Ribavirin
Serum Concentrations
The mean serum pegylated interferon concentration
was 81 116 IU/ml (range: 0–500) at month 3 and
86 113 IU/ml (range: 0–375) at month 6 (Fig. 1a).
Although the concentration varied greatly from one
individual to another, the pegylated interferon concentrations at months 3 and 6 in any given individual were
not significantly different (Student’s paired t-test,
P ¼ 0.60).
The mean ribavirin concentration was 2,006 780 ng/
ml (range: 717–3,814) at month 3 and 2,034 1,021 ng/
ml (range: 293–4,694) at month 6 (Fig. 1b). As for
pegylated interferon, the concentration varied widely
between individuals but not within a given patient at 3
and 6 months (Student’s paired t-test, P ¼ 0.60).
HCV Virological Response and Serum
Concentrations of Pegylated
Interferon and Ribavirin
The mean pegylated interferon concentrations
at month 3 in responders (92 164 IU/ml) and nonresponders (75 83 IU/ml) were not significantly different (P ¼ 0.30). The mean ribavirin concentrations at
month 3 tended to be higher in responders (2,322 926 ng/ml) than in nonresponders (1,833 646 ng/ml;
P ¼ 0.08). The ribavirin concentrations in responders
infected with genotype 2 or 3 (1,972 ng/ml) were
similar to those of nonresponders with these genotypes
(1,995 ng/ml; P ¼ 0.89). But the ribavirin concentrations
in responders infected with HCV genotype 1 or 4 were
significantly higher (2,672 ng/ml, range: 1,625–3,814)
than in the corresponding nonresponders (1,758 ng/ml,
range: 717–2,807; P ¼ 0.04; Fig. 2). The ribavirin
concentrations in responders infected with HCV genotype 1 or 4 were also significantly higher at month 6
(3,062 ng/ml, range: 1,458–4,694) than in the corresponding nonresponders (1,439 ng/ml, range: 293–
2,566; P ¼ 0.01). Creatinine clearances at months 3
and 6 were similar in responders and nonresponders
infected with HCV genotype 1 or 4.
Since patients infected with genotype 1 or 4 responded
better, with high serum ribavirin concentrations, a
ribavirin threshold that predicted a good sustained
virological response was determined. The ROC curve
J. Med. Virol. DOI 10.1002/jmv
1526
Nicot et al.
TABLE II. Baseline Characteristics
All
(n ¼ 35)
Sex (female/male)
Mean age (years SD)
Weight (kg SD)
Mean CD4þ (cells/mm3)
Hemoglobin baseline (g/dl SD) (n ¼ 29)
Creatinine clearance baseline (ml/min SD) (n ¼ 26)
Fibrosis F2
HCV viral load (log IU/ml SD)
Number of genotype 1 or 4 (%)
Undetectable HIV viral load, n (%)
Antiretroviral therapy, n
10/25
41 8
63.5 9.5
444
13.9 1.5
100 29
21/25
5.8 0.28
21 (63%)
13 (37%)
24
analysis based on ribavirin concentrations at month 3
(Fig. 3) showed that a ribavirin concentration of
2,300 ng/ml was the best threshold for predicting a
sustained virological response (sensitivity ¼ 67%, specificity ¼ 86%, positive predictive value ¼ 50% and negative predictive value ¼ 70%, ROC area ¼ 0.80 0.12).
Two thirds (67%) of treated patients were responders
when the ribavirin concentration was >2,300 ng/ml,
while 86% did not respond to treatment when the
ribavirin concentration was <2,300 ng/ml.
Fig. 1. a: Serum concentrations of pegylated interferon at months 3
and 6 of treatment for each patient. b: Serum ribavirin concentrations
at months 3 and 6 of treatment for each patient. The dark lines indicate
the median values.
J. Med. Virol. DOI 10.1002/jmv
Responders
(n ¼ 13)
4/9
41 6.5
61 8.5
443
14.1 1.2
86 21
9/10
5.91 0.19
6 (46%)
4 (30%)
7
Nonresponders
(n ¼ 22)
P-value
6/16
41 9
65 10
501
13.7 1.7
108 30
12/15
5.75 0.30
15 (68%)
9 (41%)
17
0.82
0.91
0.66
0.50
0.54
0.06
0.50
0.08
0.19
0.55
0.15
DISCUSSION
It is important to identify the parameters that
influence the virological response to anti-HCV therapy
in patients infected with HCV and HIV because the
success rate is poor. Serum concentrations of pegylated
interferon and ribavirin and their influence on the
sustained virological response were investigated retrospectively, so the dose was not adapted to serum
concentrations. The serum pegylated interferon concentrations were not correlated with the virological
response, but the ribavirin concentrations were significantly higher in responders infected with HCV genotype
1 or 4 than in nonresponders.
The pegylated interferon serum concentrations varied widely between individuals. Some patients had low
or undetectable concentrations of pegylated interferon.
This might have been due to poor adherence to treatment or the presence of antibodies neutralizing pegylated interferon [van der Eijk et al., 2006]. However,
these antibodies are uncommon (11.5% of nonresponders) [Ramos et al., 2007] and could not explain all the
cases with low concentrations. It has been suggested
Fig. 2. Mean ribavirin concentrations at month 3 according to the
sustained virological response in patients infected with genotype 1 or 4.
Data are presented as box plots in which 50% of values lie within the
box. The horizontal lines drawn through the middle of the boxes
represent the median values. The top and the bottom of each box are the
10th and the 90th percentiles of all values.
Ribavirin Concentrations in Treated HCV-HIV Patients
Fig. 3. ROC curve analysis of ribavirin concentrations in patients
infected with genotype 1 or 4.
that the interferon concentration could influence treatment outcome because the interferon AUCs are greater
in hemodialysis patients than in patients with normal
renal function, and are associated with a higher
prolonged response rate [Izopet et al., 1997; Chatelut
et al., 1999]. The present study detected no influence of
the pegylated interferon concentration on treatment
outcome. This is in keeping with a recent study on
24 naı̈ve patients treated with pegylated interferon,
in which responders and nonresponders had similar
serum pegylated interferon concentrations [Talal et al.,
2006]. But this study found that the pegylated interferon concentration that decreased HCV production
by 50% (EC50) was lower in responders than in nonresponders, and that the median therapeutic quotient
(the ratio between the average pegylated interferon
concentration and EC50) was significantly greater in
responders.
The ribavirin concentrations described in the present
study are in the same range than those previously
described [Rendon et al., 2005]. The ribavirin concentrations at months 3 and 6 were similar, confirming
that the ribavirin concentrations reach a steady-state
[Tsubota et al., 2003]. The ribavirin concentrations
at months 3 and 6 were also significantly higher in
responders than in nonresponders infected with HCV
genotype 1 or 4, but not in patients infected with HCV
genotype 2 or 3. This is probably due to the low intrinsic
sensitivity to treatment of HCV genotypes 1 and 4
[Zeuzem et al., 2001; Halfon et al., 2003; Boulestin et al.,
2006]. A high ribavirin concentration is probably needed
to trigger a rapid drop in these virus genotypes. As
suggested for patients infected with HCV genotype 1
alone [Larrat et al., 2003], a high serum ribavirin
concentration could be an important factor for predicting treatment outcome in patients infected with HIV
and HCV genotype 1 or 4. The studies on HCV-HIV
coinfected patients conducted to date have only shown
that the ribavirin concentration influences the early
virological response [Rendon et al., 2005; Dahari et al.,
2007]. Dahari et al. [2007] investigated the influence of
1527
early ribavirin concentrations on the sustained virological response and found that the ribavirin concentrations increased significantly between weeks 1 and 8
in responders, but not in nonresponders. However, the
ribavirin concentrations at week 1 were not early
predictor of the response, as determined by the serum
concentration of HCV-RNA or the change in alanine
aminotransferase activity [Dahari et al., 2007]. This
could be because the serum ribavirin concentration
takes 4 weeks to reach a steady-state [Tsubota et al.,
2003]. It is thus inadvisable to measure the serum
ribavirin concentration before the first month. HIV
nucleoside analogues like zidovudine and abacavir could
influence the ribavirin concentration [Rendon et al.,
2005] or the early virological response to anti-HCV
therapy [Bani-Sadr et al., 2007]. However, the responders and nonresponders in our small population were on
similar antiretroviral regimens. There is a correlation
between the serum ribavirin concentration and the
creatinine clearance in patients with and without renal
dysfunction [Bruchfeld et al., 2002; Kamar et al., 2004;
Maeda et al., 2004]. In the present study, the creatinine
clearances measured at baseline tended to differ
between groups (P ¼ 0.06), but were not different
at months 3 and 6 (respectively, P ¼ 0.11 and P ¼ 0.66).
Hence, this parameter does not influence the higher
ribavirin concentrations found in responders infected
with genotype 1 or 4 compared to nonresponders.
The recommended ribavirin doses are based on body
weight. A recent study, found that treating HCV-HIV
coinfected patients with higher doses of ribavirin
(1,000–1,200 mg) provided an early virological response
and a sustained virological response in proportions close
to that obtained in patients infected with HCV alone
[Nunez et al., 2005, 2007]. Therefore strategies designed
to optimize doses and adherence to ribavirin might
improve the response of HCV-HIV coinfected patients to
HCV therapy. Monitoring the ribavirin concentrations
is currently advised in patients with renal impairment
[Bruchfeld et al., 2002]. Our results suggest that it
would be useful to monitor the serum ribavirin concentrations of patients infected with genotype 1 or 4. This
is supported by the wide variations in the ribavirin
concentrations between individuals [Larrat et al., 2003]
and the fact that anemia, the most frequent limiting side
effect of ribavirin, is dose-dependent and predicted by
the ribavirin concentration [Lindahl et al., 2004, 2005;
Rendon et al., 2005]. Responders infected with HCV
genotype 1 or 4 had high ribavirin concentrations
at months 3 and 6, suggesting that reaching an optimal
ribavirin concentration at month 3 helps to retain an
optimal concentration throughout the treatment. The
optimal ribavirin concentration must also take into
account the hematological toxicity. We found no relationship between the concentrations of hemoglobin and
ribavirin at months 3 or 6. The hemoglobin concentrations in responders and nonresponders were similar
(data not shown).
A ribavirin threshold of 2,300 ng/ml was appropriate
for patients infected with genotype 1 or 4. In fact, 86% of
J. Med. Virol. DOI 10.1002/jmv
1528
Nicot et al.
the patients with a concentration below this threshold
were nonresponders. Patients with ribavirin concentrations above this cut-off approached the sustained
virological response rates (67%) of patients infected with
HCV alone [Fried et al., 2002; Legrand-Abravanel et al.,
2005]. This threshold is also close the cut-off of 2,700 ng/
ml (at weeks 4 or 12) proposed for predicting the early
virological response in HCV-HIV coinfected patients
[Rendon et al., 2005]. Two ribavirin cut-offs have been
proposed for patients infected with HCV genotype 1
alone: a ribavirin concentration >2,000 ng/ml at week 4
predicted 100% sustained virological response [Tsubota
et al., 2003], while a ribavirin concentration of >3,000 ng/
ml at week 8 predicted 44% sustained virological
response in patients with a high HCV virus load [Arase
et al., 2005]. Although the ribavirin cut-offs are in the
same range, they are quite different, and most of them,
including those found in this study, are based on small
numbers of patients. Data for a larger number of
patients are needed to determine an optimal ribavirin
threshold in this difficult-to-treat population.
Recent studies on HCV-HIV coinfected patients
demonstrated the importance of a rapid virological
response at week 4, or of an early virological response
at week 12, for predicting a sustained virological
response [Laguno et al., 2007; Mira et al., 2007]. The
ribavirin dose could be modified during this period
according to the serum ribavirin concentrations to
improve the chance of obtaining a sustained virological
response. It could also be used as a parameter for
deciding whether to discontinue treatment or increase
the ribavirin concentration to improve the chance of a
sustained virological response.
In summary, the ribavirin concentration has been
identified as a factor influencing treatment outcome of
HIV-positive patients infected with HCV genotype 1 or 4
and as a strong predictor of nonresponse when the
ribavirin concentration is 2,300 ng/ml. Measurement
of ribavirin concentrations of these difficult-to-treat
patients could be used to optimize the ribavirin dose and
so increasing the probability of success. Further studies
are now needed to evaluate the use of such ribavirin
values as a therapeutic drug-monitoring tool in the
clinical setting and to determine the influence of
pegylated interferon on treatment outcome.
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Publication n°5 :
Influence of HCV genotype 1 subtypes on the virus response to Peg
Interferon Alpha-2a plus Ribavirin therapy
Journal of Medical Virology, soumis
Les patients infectés par un virus de génotype non 2/3 répondent moins bien
au traitement par pegIFNα et RBV. Les facteurs influençant la réponse au traitement
dans cette population nécessitent d’être mieux identifiés pour améliorer la prise en
charge thérapeutique. L’objectif de cette étude était d’évaluer l’impact de la variabilité
génétique au niveau du sous-type et des facteurs pharmacologiques sur la réponse
au traitement de patients infectés par un génotype 1, 4, 5 ou 6.
Les patients infectés par un génotype 1, 4 ou 5, traités par pegIFNα2a et RBV
entre juin 2005 et décembre 2007 ont été inclus dans cette étude prospective, soit
115 patients. Le génotype et le sous-type ont été déterminés par séquençage de la
région NS5B. Les concentrations sériques médicamenteuses de pegIFNα-2a et RBV
ont été mesurées à la semaine 4 (S4) et à la semaine 12 (S12). Parmi les patients
inclus, 64 étaient naïfs de traitement et 27 étaient coinfectés par HIV. Quatre-vingt
treize (81%) patients étaient infectés par un virus de génotype 1, dont 37 par un 1a
et 50 par un 1b, 20 par un virus de génotype 4 et 2 par un virus de génotype 5. Une
RVR a été observée chez 12% des patients, une RVP chez 49% des patients et une
RVS chez 48% des patients. Les patients infectés par un virus de sous-type 1a et 1b
ont eu un taux de RVS de 22,6% et 48%, respectivement. Les concentrations de
pegIFNα-2a étaient équivalentes chez les patients répondeurs et non répondeurs.
Les concentrations de RBV à S12 étaient significativement plus élevées chez les
patients qui avaient une RVP (2 424 ng/mL versus 2 162 ng/mL, p<0,05) et des
concentrations qui tendaient à être plus élevées chez les patients qui avaient une
RVS (2 538 ng/mL versus 2 296 ng/mL, p=0,08).
Les facteurs prédictifs de la réponse au traitement (RVP et RVS) ont été
recherchés par analyse statistique multivariée. Les facteurs prédictifs de la RVP
99
étaient l’absence d’un précédent traitement anti-HCV et des concentrations de RBV
> 2 200 ng/mL. Les facteurs prédictifs de la RVS étaient l’infection par un virus de
sous-type 1b, et une charge virale indétectable à S12.
Cette étude, conçue pour évaluer les paramètres influençant la réponse au
traitement de patients non 2/3 a été réalisée chez des patients infectés par des virus
de génotype 1 ou 4. Nous avons montré que des concentrations sériques de RBV >
2 200 ng/mL étaient associées à un taux de RVP plus élevé et surtout que les
patients infectés par un génotype 1b avaient plus de chance de répondre au
traitement que des patients infectés par un génotype 1a. Un résultat similaire a
également été obtenu dans le cadre d’une étude multicentrique nationale.
100
INFLUENCE OF HCV GENOTYPE 1 SUBTYPES ON THE VIRUS RESPONSE TO PEG
INTERFERON ALPHA-2a PLUS RIBAVIRIN THERAPY
Running head: HCV genotype 1 subtypes and the response to anti-HCV therapy
F. Nicot1, L. Alric2,3,4, K. Barange5, S. Métivier5, J.M. Dramard6, J.M. Combis7,B. Castan8, J.J
Meurisse9, J.L. Payen10, D.Garipuy11, H.Desmorat12, J.M Peron5, S. Thebault2, T.Morin13, C.
Renou14, P. Barel15, B. Guerin16, Y. Imbert17, S. Sire18, K. Sauné1,4,19, E. Chatelut4,20, J.
Izopet1,4,19*
From the
1
CHU Toulouse, IFB Purpan, Laboratoire de Virologie, Toulouse, F-31300, France;
2
Internal Medicine, Purpan, Toulouse University Hospital, France;
3
EA2405 UMR3 MD-UM-UPS, Université Paul Sabatier Toulouse III, France
4
Université Toulouse III Paul-Sabatier, Toulouse, F-31062 France ;
5
Gastroenterology, Purpan, Toulouse University Hospital, France;
6
Gastroenterology, Val d’Ariège Hospital, Pamiers, France;
7
Gastroenterology, Ambroise Paré Clinic, Toulouse, France ;
8
General Medicine, Auch Hospital, Auch, France;
9
Gastroenterology, Lourdes Hospital, Lourdes, France;
10
Internal Medicine, Montauban Hospital, Montauban, France;
11
Ducuing Hospital, Toulouse, France;
12
Polyclinique du Parc, Toulouse, France;
13
Gastroenterology, Bigorre Hospital, Tarbes, France;
14
Hyères Hospital, Hyères, France ;
15
Albi Hospital, Albi, France ;
16
Internal Medicine, Rodez Hospital, Rodez, France ;
17
Internal Medicine, Agen Hospital, Agen, France;
1
18
Gastroenterology, Cahors Hospital, Cahors, France;
19
INSERM, U.563, Toulouse, F-31300 France;
20
EA3035, Institut Claudius-Regaud, F-31052 Toulouse, France;
* Jacques Izopet
Laboratoire de virologie – IFB, CHU Toulouse Purpan
330, avenue de Grande-Bretagne
31059 Toulouse cedex
France
Tel: (33) 5 69 69 04 24
Fax: (33) 5 69 69 04 25
E-Mail: izopet.j@chu-toulouse.
Abstract word count: 240
Text word count: 2,327
2
ABSTRACT
Identification of new factors influencing viral response in HCV non-genotype 2/3 patients is
needed to optimize anti-HCV treatment. This multicentric prospective study evaluates the
influence of HCV variability and pharmacological parameters on the virological response to
anti-HCV treatment of these patients. Patients treated with pegylated interferon α2a
(pegIFNα-2a: 180 µg/week) and ribavirin (RBV: 800-1200 mg/day) for 48 weeks were
included. HCV subtypes were identified by sequencing the NS5B region. Serum RBV and
pegIFNα-2a concentrations were measured at weeks 4 and 12. The 115 patients (67 men;
median age=49, range [31-76]) included 64 who had never been treated and 27 co-infected
with HIV. The mean baseline HCV RNA was 6.30 ± 0.06 log IU/mL and the distribution of
HCV genotypes was G1 (n=93) with 1a (n=37) and 1b (n=50), G4 (n=20) and G5 (n=2). Most
patients (79/108; 73%) had an early virological response (EVR). Independent predictors of
EVR were naïve treatment status at inclusion (OR=2.98 [1.15; 7.72]) and RBV of > 2,200
ng/mL at week 12 (OR=3.41 [1.31; 8.90]). Thirty-eight per cent of patients (40/104) had a
sustained virological response (SVR). The only independent predictors of SVR were subtype
1b (OR=6.82 [1.7; 26.8]), and HCV RNA <15 IU/mL at week 12 (OR=25 [6.4; 97.6]).This
study of difficult-to-treat patients shows that a serum RBV of > 2,200 ng/mL is associated
with EVR and that patients infected with HCV subtype 1b have a better chance of achieving
SVR than those infected with 1a.
KEY WORDS: Hepatitis C, HCV subtype, RBV concentration
3
INTRODUCTION
The hepatitis C virus (HCV) is very variable and divided into 6 genotypes and more
than 70 subtypes [Simmonds et al., 2005; Simmonds et al., 1993]. Various factors (viral, host
and pharmacological one) can influence the overall sustained virological response (SVR)
rate to ribavirin (RBV) and pegylated interferon alpha (pegIFNα) treatment that is only 5060% [Conjeevaram et al., 2006; Conjeevaram et al., 2007; Everson et al., 2006; Fried, 2002;
Ge et al., 2009; Manns et al., 2001; Zeuzem, 2004].
Genotype is considered to be the most important factor predicting the virological
response. Patients infected with HCV genotype 1 or 4 are considered to be difficult-to-treat
patients with 40% of SVR [Fried et al., 2002; Hadziyannis et al., 2004; Manns et al., 2001;
Zeuzem, 2004]. Little is known at present about the influence of HCV subtypes on the
virological response. Most studies, including the pivotal studies, have determined the
genotype by analysing the 5’UTR region [Fried et al., 2002; Manns et al., 2001]. This makes
it difficult to accurately discriminate between HCV subtypes [Chen and Weck, 2002; Halfon et
al., 2001]. The NS5B region is considered to be the most appropriate region of the HCV
genome to use for accurately determining the HCV subtype [Cantaloube et al., 2006; Nicot et
al., 2005; Sandres-Saune et al., 2003] and for studying the virological response of different
subtypes.
There are few published data on the influence of pharmacological parameters on the
virological response or they were frequently obtained using small cohorts of patients. Most
studies have shown that a low RBV concentration is associated with a poor virological
response [Aguilar Marucco et al., 2008; Larrat et al., 2003; Lindahl et al., 2005; Maynard et
al., 2008; Nicot et al., 2008; Rendon et al., 2005] in patients infected with HCV genotypes 1
or 4 but there is some conflicting data [Crespo et al., 2007; Dahari et al., 2007; Lopez-Cortes
et al., 2008]. Likewise, there is few data on pegIFNα concentration and its influence on the
virological response [Lopez-Cortes et al., 2008; Nicot et al., 2008; Talal et al., 2006].
4
This prospective study on difficult-to-treat patients infected with HCV genotypes 1, 4
or 5 investigates the intrinsic sensitivity of HCV subtypes to pegIFNα-2a and RBV and the
influence of pharmacological parameters on the virological response (EVR and SVR).
5
PATIENTS AND METHODS
Patients
A total of 115 patients chronically infected with HCV attending the Toulouse
University Hospital and 13 General Hospitals in the Midi-Pyrénées area were enrolled in this
prospective study between June 2005 and December 2007. The inclusion criteria were: age
>18 years, HCV genotype 1, 4, 5 or 6 and treatment initiation with pegIFNα-2a and RBV.
This study was approved by the Toulouse University Hospital Ethic Committee. All the
patients provided written informed consent before participating in the study.
Treatment and monitoring
Patients were treated with 180 µg pegIFNα-2a (Pegasys®, Roche), given
subcutaneously once a week, in combination with RBV (Copegus®, Roche) adjusted for body
weight, for 48 weeks. Treatment was stopped if the plasma HCV RNA concentration at week
12 had decreased by <2 log IU/mL. All patients were seen 4, 8, 12, 24, 48 weeks after the
initial interview and 4 and 24 weeks after treatment withdrawal. Serum samples were
collected at each time, centrifuged within 2 hours and stored at -80°C. Patients with an
undetectable HCV RNA concentration at week 4 were considered to be rapid virological
responders (RVR). Patients with > 2 log decrease in plasma HCV RNA at week 12 were
considered to be early virological responders (EVR). Patients with undetectable HCV RNA
24 weeks after treatment withdrawal were considered to be sustained virological responders
(SVR).
6
Virological parameters
Plasma HCV-RNA was measured at baseline, 4, 12, 48, 52 and 72 weeks by the real-time
RT-PCR COBASTM Ampliprep/COBASTM Taqman HCV test (CAP/CTM; Roche Diagnostics,
Meylan, France), according to the manufacturer’s instructions. Plasma HIV-RNA was
measured every 3 months by the real-time RT-PCR COBASTM Ampliprep/COBASTM Taqman
HIV test (CAP/CTM; Roche Diagnostics, Meylan, France) according to the manufacturer’s
instructions. HCV genotypes and subtypes were determined by phylogenetic analysis of the
NS5b region of the HCV genome as previously described [Sandres-Saune et al., 2003].
Determination of serum pegIFNα-2a concentrations
The residual pegIFNα-2a concentrations in serum samples taken at 4 and 12 weeks were
measured with a bioassay [Boulestin et al., 2004]. The assay evaluates the capacity of the
pegIFNα-2a in serum samples to reduce the cytopathic effect of the vesicular stomatitis virus
on MDBK cells in culture. The reference solutions contained 2.8 to 180 ng/mL of pegIFNα-2a
(Roche, France).
Determination of serum RBV concentrations
Trough serum RBV concentrations were determined 4 and 12 weeks after treatment
initiation by high-performance liquid chromatography (HPLC) [Kamar et al., 2004;
Svensson et al., 2000]. Briefly, the sample extraction was performed using phenyl
boronic acid Bond Elute 100 mg/PK cartridges (Varian SA) and the analysis onto a
Bischoff NucléosilR C18 7 µm column with ultraviolet detection at a wavelength of
215 nm. The method was linear from 250 to 6,000 ng/mL. The average within-run
7
and between-run precision was better than 15 % for control samples of high and
medium concentrations, and better than 20 % for low concentrations.
Statistical analysis
Statistical analysis was performed with STATA 8.0 software (Stata corporation, Grand Forks,
ND). Continuous variables were tested with the Mann-Whitney or Wilcoxon test. Categorical
variables were tested by the Chi-squared test. Receiving operating characteristics (ROC)
curves were constructed with RBV concentrations at week 12 to determine the cut-off point
that best discriminated between virological responders and non-responders at week 12. A p
value of less than 0.05 was considered to be significant. Predictors of EVR and SVR were
evaluated by univariate and multivariate analysis. Variables with a p value of 0.10 or less
after univariate analysis were entered into a multivariate, backward, stepwise logistic
regression analysis to identify significant variables independently associated with the
virological response.
8
RESULTS
Patient characteristics, treatment response and tolerance
The baseline characteristics are summarized in Table I. Most were infected with HCV
genotype 1 (81%) and HCV genotype 4 (n=20, 17%). Twenty-seven (23%) of them were
coinfected with HIV.
Only 13/108 patients (12%) achieved RVR at week 4, while 79/108 patients (73%)
achieved EVR at week 12, including 53 (49%) who had undetectable HCV RNA. At the end
of follow-up, SVR was observed in 40/104 patients (38%), in 35/88 patients (39.8%) with
HCV-1 and 7/19 (36.8%) with HCV-4 (p=NS). SVR was observed in 7/31 (22.6%) patients
infected with HCV-1a and in 23/48 (48%) of those infected with HCV-1b (p<0.02).
Seven patients discontinued treatment before week 12 due to intolerance to treatment
(n=6), or death (n=1). Four patients with an undetectable HCV RNA viral load at week 48
were lost to follow-up after week 48. Adverse haematological events led to the initial
treatment of 32 patients (29.6%) being modified. Fourteen patients were given erythropoietin
and 7 were given neutrophil growth factors.
Serum concentrations of ribavirin
The mean serum RBV Ctrough was 1,991 ± 76 ng/mL at week 4 and it was 2,355 ± 88
ng/mL at week 12. Figure 1a shows the serum RBV concentrations at weeks 4 and 12
according to EVR and SVR. The serum RBV Ctrough concentrations at week 12 were
significantly higher in patients with EVR (2,424 ± 94 ng/mL) than in those with no EVR (2,162
± 205 ng/mL) (p<0.05). ROC curve analysis showed that the best cutoff value for
discriminating between patients with EVR and patients with no EVR was 2,200 ng/mL (area
under the curve = 0.66; 95% CI, 0.53-0.79; sensitivity of 62%, specificity of 69%). The RBV
9
serum concentration at week 12 tended to be higher in patients with SVR (2,538 ± 121
ng/mL) than in patients without SVR (2,296 ± 123 ng/mL) (p<0.08).
The RBV treatment led to a drop in circulating hemoglobin (Hb) of -3.1 mg/dL (-6.30;
3.13) between baseline and week 12; it reached a median value of 11.7 g/dL (8.2; 15.7) at
week 12. The serum RBV concentrations at week 4 (r= -0.41, p<0.001) and week 12 (r= 0.32, p<0.002) were inversely correlated with the Hb concentration at week 12 (Figure 2).
Serum concentrations of pegIFNα-2a
The mean serum pegIFNα-2a Ctrough was 92 ± 9 ng/mL at week 4 and 100 ± 11 ng/mL
at week 12. No relationship was found between the serum pegIFNα-2a concentrations at
weeks 4 and 12 and EVR or SVR (Figure 1b).
Factors predicting the virological response
One-variable analysis found that 6 factors were associated with EVR (Table II). The
factors remaining independently associated with EVR in the logistic regression analysis were
patients without previous anti-HCV therapy at inclusion and a serum RBV Ctrough > 2,200
ng/mL at week 12 (Table II).
One-variable analysis revealed 6 factors that were associated with SVR (Table III).
The factors remaining independently associated with SVR in the logistic regression model
were subtype 1b and an undetectable HCV RNA concentration at week 12 (Table III).
10
DISCUSSION
This is the first prospective study on HCV genotypes 1 or 4 that evaluates the
influence of the virus subtype and the serum concentrations of pegIFNα-2a and RBV on the
virological response. RBV concentration of > 2,200 ng/mL was identified as a factor
associated with EVR and infection by subtype 1b was a predictive factor of SVR. Unlike
clinical trials, this cohort study included patients that are representative of the population
followed by the clinicians.
Several studies reported a correlation between EVR and/or SVR and RBV Ctrough [Jen
et al., 2000; Larrat et al., 2003; Maynard et al., 2008; Rendon et al., 2005; Tsubota et al.,
2003]. A plasma RBV concentration threshold of 2,000 to 3,000 ng/mL at week 4 or 12 was
proposed to maximize the rate of response [Larrat et al., 2003; Lindahl et al., 2005; Maynard
et al., 2008; Nicot et al., 2008]. In the present study, patients with serum RBV concentration
of >2,200 ng/mL had more chance of achieving EVR. Although no association was found
between the serum RBV concentration at week 12 and SVR, this concentration tended to be
higher in responders than in non-responders as observed in a previous study conducted in
patients infected with HCV genotype 1 [Breilh et al., 2009]. The Hb concentration at week 12
was inversely correlated with the RBV concentrations which is consistent with other studies
[Arase et al., 2005; Jen et al., 2000; Loustaud-Ratti et al., 2008; Maeda et al., 2004]. Cut-off
values of 2,300 or 2,800 ng/mL were proposed for predicting haematological toxicity in
patients infected with both HIV and HCV [Aguilar Marucco et al., 2008; Rendon et al., 2005].
The optimal time for measuring the RBV concentration and the clinical RBV threshold have
yet to be determined, in order to maximize the anti-HCV response and minimize the
haematological effects.
In the present study, the serum pegIFNα-2a concentrations were not associated with
EVR or SVR. This is in keeping with the data obtained for patients infected with HCV and
HIV [Nicot et al., 2008; Talal et al., 2006]. Another study on HIV-positive patients infected
with HCV genotype 1 or 4 found that patients with a high plasma pegIFNα-2a concentration
11
throughout treatment were 3 to 4 times more likely to achieve a SVR than those with a low
plasma pegIFNα-2a concentration [Lopez-Cortes et al., 2008]. Its impact on virological
response remains to determine.
The HCV genotype is a major determinant of the response to treatment for chronic
hepatitis C. Many clinical trials have found that patients infected with genotypes 1 or 4 are
less likely to achieve SVR than others [Fried et al., 2002; Legrand-Abravanel et al., 2005;
Manns et al., 2001; Martin-Carbonero et al., 2004; Roulot et al., 2007]. Many were performed
with the first version of the INNO-LIPA HCV assay that misclassifies a significant percentage
of genotype 1a isolates as genotype 1b [Chen and Weck, 2002]. HCV subtypes in the
present study were identified by sequencing the NS5b region, which accurately discriminates
between subtypes [Cantaloube et al., 2006; Nicot et al., 2005; Sandres-Saune et al., 2003;
Thomas et al., 2007]. Those patients infected with subtype 1a had less chance of clearing
their HCV infection than patients infected with subtype 1b being in agreement with a previous
study [Legrand-Abravanel et al., 2009]. Recent data suggest that the treatment duration of
patients infected with HCV genotype 1 could be adapted according to the HCV RNA
concentrations. Evidence from several clinical trials supports the case for extending the time
to 72 weeks for patients with HCV genotype 1 and a slow virological response [Berg et al.,
2006; Pearlman et al., 2007]. Knowing the HCV subtype of patients infected with genotype 1
could also help to optimize anti-HCV treatment. Several new drugs that specifically target the
virus, including protease and polymerase inhibitors, have also focused on HCV genotype 1
infections. Studies investigating telaprevir in combination with pegIFNα and RBV found that
virologic breakthrough due to resistance emerged more frequently in patients harboring
subtype 1a [McHutchison et al., 2009; Sarrazin and Zeuzem, 2010].
Recently, independent genome wide association studies identified single nucleotide
polymorphisms near the IL28B region as associated with response to pegIFNα and RBV
treatment [Ge et al., 2009; Suppiah et al., 2009; Tanaka et al., 2009]. The association was
observed in monoinfected and HIV coinfected individuals with the strongest effects in
12
patients with HCV genotypes 1 or 4 [Rauch et al., 2010]. These combined virological,
pharmacological and host factors will be analysed in future studies.
To conclude, high RBV concentration is linked to a higher rate of EVR. An important
finding is that HCV subtype 1a responds less well to treatment than does HCV subtype 1b.
The HCV subtype could therefore be a relevant parameter to manage individual anti-HCV
therapy and to assess the efficacy of new combined treatments with drugs that specifically
target the virus.
13
ACKNOWLEDGEMENTS
We thank Thierry Lafont for technical assistance. The English text was edited by Dr Owen
Parkes. This work was supported by Roche (France). We are grateful to Natalia Kharlov for
providing assistance.
CONFLICT OF INTEREST
None.
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REFERENCES
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Figure 1: (a) Ribavirin (RBV) serum concentrations and (b) Pegylated interferon alpha-2a
(pegIFN-α2a) serum concentrations at week 4 (W4) and 12 (W12) according to early
virological response (EVR) and sustained virological response (SVR). Data are presented as
box plots in which 50% of values lie within the box. The horizontal lines drawn through the
middle of the boxes represent the median values. The top and the bottom of each box are
the 10th and the 90th percentiles of all values.
Figure 2: Relationship between the plasma RBV concentrations at weeks 4 (RBV W4) or 12
(RBV W12) and the hemoglobin concentration at week 12.
23
Table 1: Patient characteristics at inclusion
Parametera
Result
Male sex, n (%)
67 (58)
Age, years, (range)
49 (31-76)
Weight, kilograms (range)
70 (44-113)
Hemoglobin at baseline, g/dL (range)
14.6 (8.5-17.9)
Neutrophil >1,500/µL at baseline, n (%)
100 (87)
Platelet > 90,000/ µL at baseline, n (%)
103 (90)
Creatinine clearance at baseline, mL/min (range)
107 (35-138)
Fibrosis stage ≤ F2, n (%)
59 (57)
ALT > normal, n (%)
92 (80)
Risk factor for HCV, n (%)
Injection drug use
34 (30)
Nosocomial
6 (5)
Transfusion
20 (17)
Unknown
55 (48)
HCV genotype, n (%)
1a
37 (32)
1b
50 (44)
1
6 (5)
4a
9 (8)
4d
6 (5)
4
5 (4)
5
2 (2)
HCV viral load (log IU/mL)
6.27 ± 0.06
Genotype 1
6.31 ± 0.06
Genotype 4
6.13 ± 0.16
24
> 800,000 IU/mL, n (%)
87 (76)
HIV positive, n (%)
27 (23)
Patient treatment status at inclusion, n (%)
Naïve
64 (56)
Non-responder
48 (42)
Unknown
3 (3)
RBV dose, n (%)
800 mg
14 (12)
1000 mg
74 (65)
1200 mg
27 (23)
RBV weight-adjusted dose, mg/kg (range)
14.3 (9.2- 25)
Concomitant antiretroviral therapy, n
a
21 (18)
ALT, alanine aminotranferase; RBV, ribavirin
25
Table 2: Factors associated with an EVR (early virological response). Parameters with a p
value <0.10 by one-variable analysis are in bold.
Univariate analysis
Multivariate analysis
Factor a
OR (CI 95%)b
p
OR (CI 95%)
Sex (female)
1.30 [0.54;3.11]
0.55
_
Age (< 40 years old)
1.20 [0.51;0.82]
0.65
_
Weight (< 70 kg)
0.65 [0.27;1.59]
0.34
_
HCV genotype (G4)
1.48 [0.45;4.92]
0.49
_
HCV subtype (1b)
1.90 [0.72;4.99]
0.19
_
HCV-RNA (< 800 000 log IU /mL)
2.94 [1.19;7.26]
<0.02
_
Previous anti-HCV therapy (no)
2.6 [1.06;6.17]
0.03
2.98 [1.15;7.72]
Baseline ALT (elevated)
2.7 [0.97;7.92]
0.06
_
ALT at week 12 (normal)
3.13 [1.20;8.17]
0.02
_
Fibrosis score (< F3)
2.3 [0.93;5.67]
0.07
_
Baseline CrCl (< 90 mL/min)
2.13 [0.68;6.62]
0.19
_
pegIFN-α2a at week 4 (≥ 67 ng/mL)
1.02 [0.41;2.55]
0.93
_
pegIFN-α2a at week 12 (≥ 67 ng/mL)
1.06 [0.42;2.66]
0.88
_
RBV at week 4 (≥ 2,200 ng/mL)
1.11 [0.46;2.67]
0.80
_
RBV at week 12 (≥ 2,200 ng/mL)
2.6 [1.05;6.50]
<0.05
3.41 [1.31; 8.90]
a
<0.05
<0.02
ALT, alanine aminotranferase; CrCl, creatinine clearance; pegIFN-α2a, pegylated interferon
α-2a; RBV, ribavirin;
b
p
OR: odds ratio; CI: confidence interval.
26
Table 3: Factors associated with SVR (sustained virological response). Parameters with a p
value <0.10 by univariate analysis are in bold.
Univariate analysis
Multivariate analysis
Factor a
OR (CI 95%) b
p
OR (CI 95%)
Sex (female)
1.19 [0.54;2.66]
0.66
_
Age (< 40 years old)
0.82 [0.37;1.81]
0.59
_
Weight (< 70 kg)
1.10 [0.48;2.50]
0.79
_
HCV genotype (G4)
1.05 [0.37;2.99]
0.89
_
HCV subtype (1b)
3.15 [1.14;8.70]
<0.05
6.82 [1.7;26.8]
HCV-RNA (< 800 000 log IU /mL)
1.44 [0.65;3.19]
0.37
_
Previous anti-HCV therapy (no)
1.56 [0.69;3.52]
0.28
_
Baseline ALT (elevated)
1.41 [0.45;4.40]
0.52
_
ALT at week 12 (normal)
2.79 [1.14;6.86]
<0.05
_
Fibrosis score (< F3)
1.15 [0.50;2.65]
0.72
_
Baseline CrCl (< 90 mL/min)
1.17 [0.39;3.55]
0.75
_
HCV RNA at week 4 (< 15 IU/mL)
3.2 [0.96;10.66]
0.05
_
HCV RNA at week 12 (< 15 IU/mL)
13 [4.86;34.95]
<0.001
25 [6.4; 97.6]
HCV RNA drop at week 12 ( ≥2 log)
30 [3.9;234.6]
<0.001
_
pegIFN-α2a at week 4 (≥ 67 ng/mL)
1.07 [0.45;2.5]
0.85
_
pegIFN-α2a at week 12 (≥ 67 ng/mL)
1.33 [0.55;3.25]
0.50
_
RBV at week 4 (≥ 2,200 ng/mL)
0.78 [0.35;1.78]
0.54
_
RBV at week 12 (≥ 2,200 ng/mL)
2.16 [0.93;5.05]
0.07
_
a
<0.01
<0.001
ALT, alanine aminotranferase; CrCl, creatinine clearance; pegIFN-α2a, pegylated interferon
α-2a; RBV, ribavirin
b
p
OR: odds ratio; CI: confidence interval.
27
Fig.1
(a)
(b)
28
Ribavirin concentration (ng/mL)
Fig.2
7000
RBV W4
RBV W12
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
7
9
11
13
Hemoglobin at week 12 (g/dL)
29
15
PARTIE III :
INFECTION OCCULTE A HCV : L’ERADICATION DU HCV EXISTE-T-ELLE ?
Publication n°6 :
No evidence of occult hepatitis C virus (HCV) infection in serum of
HCV
antibody-positive
HCV
RNA-negative
kidney-transplant
patients
Transplant International 2009, vol 23 (6), p.594-601
La persistance d’une infection HCV à bas bruit, après élimination spontanée
ou post-thérapeutique de l’ARN HCV viral est actuellement débattue en raison de la
description d’un nouveau type d’infection : l’hépatite C occulte. Cependant ce type
d’infection est très controversé et les études de suivi à long terme montrent qu’il y a
très peu de réactivation après élimination du virus. L’objectif de cette étude a été
d’évaluer chez des patients immunodéprimés, population potentiellement plus
susceptible à une persistance de l’infection HCV à bas bruit, l’existence d’infection
occulte à HCV.
Tous les patients transplantés rénaux anciennement infectés par le HCV,
guéris (spontanément ou après traitement) et suivis dans le service de néphrologie,
dialyse et transplantation d’organe du CHU de Toulouse ont été inclus dans cette
étude. La présence d’ARN HCV a été recherchée dans le plasma et les CMSPs
stimulées ou non en culture cellulaire. Pour mettre en évidence de faibles quantités
d’ARN HCV, une technique ultrasensible d’amplification dans la région 5’NC a été
mise au point. Elle était similaire à celles utilisées dans les études ayant décrit les
infections occultes HCV, à savoir une RT-PCR nichée suivie d’une révélation par
101
southern-blot. La limite de détection de cette technique était de 2 UI/mL (environ 5
copies/mL).
Parmi les 26 patients inclus dans cette étude, 10 avaient éliminé
spontanément le virus et les 16 autres l’avaient éliminé après un traitement par IFNα
(94%). La médiane de suivi de ces patients après l’élimination du HCV était de 10,5
années (2-16 ans). Ces patients avaient globalement une activité sérique normale
des enzymes hépatiques lors du dernier suivi. Parmi eux, 22 avaient reçu un
traitement d’induction immunosuppresseur après leur transplantation rénale et tous
étaient sous immunosuppresseurs depuis.
L’ARN HCV plasmatique a été testé au moins 3 fois chez 88% des patients
avec la technique de quantification CAP/CTM (limite de détection 15 UI/mL). Aucun
des échantillons testés n’a été positif. L’ARN HCV recherché par technique
ultrasensible de RT-PCR qualitative (seuil de détection à 2UI/mL) sur le dernier
prélèvement réalisé, n’a pas permis de mettre en évidence la présence du génome
HCV dans le plasma. L’ARN HCV a également été recherché dans les CMSPs sur 2
stades pour 11 patients et 1 stade pour les 15 autres. Au total, 37 échantillons de
CMSP non activées en culture et 24 échantillons de CMSP stimulées en culture ont
été testés par RT-PCR et southern-blot. L’ARN HCV n’a été détecté dans aucun
prélèvement de CMSPs. Enfin, des PBH réalisées après l’élimination du HCV,
disponibles pour 5 patients (4 guéris spontanément et 1 guéri après traitement par
IFNα), ont été testées. L’ARN HCV n’a été retrouvé dans aucune biopsie. L’histologie
du foie étudiée sur des PBH réalisées avant et après traitement chez 4 patients a
montré que ces patients n’avaient pas d’aggravation de l’histologie hépatique et au
contraire qu’une amélioration pouvait être observée.
Les résultats de cette étude montrent l’absence de rechute HCV chez des
patients transplantés rénaux sous immunosuppresseurs, anciennement infectés par
HCV. En effet, l’ARN HCV n’a été retrouvé ni dans les biopsies hépatiques, ni dans
les cellules, ni dans le plasma. Ces résultats sont donc en faveur de l’absence de
persistance du HCV et d’une élimination définitive du virus.
102
Transplant International ISSN 0934-0874
ORIGINAL ARTICLE
No evidence of occult hepatitis C virus (HCV) infection
in serum of HCV antibody-positive HCV RNA-negative
kidney-transplant patients
Florence Nicot,1,2 Nassim Kamar,3,4,5 Bernard Mariamé,1 Lionel Rostaing,1,3,4 Christophe Pasquier1,2,3
and Jacques Izopet1,2,3
1
2
3
4
5
INSERM, U563, Toulouse, France
Department of Virology, CHU Toulouse, Purpan Hospital, Toulouse, France
Université Toulouse III Paul-Sabatier, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Toulouse, France
Department of Nephrology, Dialysis and Multiorgan Transplantation, CHU Toulouse, Rangueil Hospital, Toulouse, France
INSERM, U858, Toulouse, France
Keywords
hepatitis C virus, kidney transplantation,
occult HCV, persistence
Correspondence
Prof. Jacques Izopet, Laboratoire de Virologie,
Institut Fédératif de Biologie, CHU Toulouse,
330 avenue de Grande-Bretagne, TSA40031,
Toulouse 31059, France. Tel.: 33 5 67
69 04 24; fax: 33 5 67 69 04 25; e-mail:
[email protected]
Received: 23 September 2009
Revision requested: 26 October 2009
Accepted: 17 November 2009
Published online: 11 December 2009
doi:10.1111/j.1432-2277.2009.01025.x
Summary
Persistence of hepatitis C virus (HCV) in patients who cleared HCV is still
debated. Occult HCV infection is described as the presence of detectable HCV
RNA in liver or peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with
undetectable plasma HCV-RNA by conventional PCR assays. We have assessed
the persistence of HCV in 26 kidney-transplant patients, followed up for
10.5 years (range 2–16), after HCV elimination while on hemodialysis. If HCV
really did persist, arising out of the loss of immune control caused by institution of the regimen of immunosuppressive drugs after kidney transplantation,
HCV reactivation would have taken place. Their immunosuppression relied on
calcineurin inhibitors (100%), and/or steroids (62%), and/or antimetabolites
(94%). An induction therapy, given to 22 patients, relied on rabbit antithymocyte globulin (59%) or anti-IL2-receptor blockers (32%). All patients had
undetectable HCV RNA as ascertained by several conventional tests. At the last
follow-up, no residual HCV RNA was detected in the five liver biopsies, the 26
plasma, and in the 37 nonstimulated and 24 stimulated PBMCs tested with an
ultrasensitive RT-PCR assay (detection limit, 2 IU/ml). No biochemical or virologic relapse was seen during follow-up. The absence of HCV relapse in formerly HCV-infected immunocompromised patients suggests the complete
eradication of HCV after its elimination while on dialysis.
Introduction
The prevalence of anti-hepatitis C virus (HCV) antibodies
in patients undergoing regular dialysis is consistently
higher than in the general population, ranging from 7% to
40% [1–3]. In French hemodialysis units, it has decreased
by 7.7% during the past few years but HCV infection still
occurs and necessitates appropriate management. After
kidney transplantation, patient survival is lower in HCVpositive as compared with matched HCV-negative kidneytransplant patients [4]. Because of the relatively high rate
594
of sustained virologic response (SVR) in HCV-positive
dialysis patients treated by anti-HCV therapy, it has been
recommended to treat all kidney-transplant candidates
with a-interferon [5]. Furthermore, it has been previously
shown that, when sustained HCV RNA clearance occurs in
dialysis patients, no relapse is observed after transplantation, despite chronic immunosuppressive treatment [6].
Very recently, the presence of genomic HCV RNA in
peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) has been
found in 49 out of 109 (45%) serum HCV antibodynegative/HCV RNA-negative hemodialysis patients with
ª 2009 The Authors
Journal compilation ª 2009 European Society for Organ Transplantation 23 (2010) 594–601
Nicot et al.
abnormal liver-enzyme levels [7]. This is defined as
‘occult HCV infection’ in dialysis patients. Occult HCV
infection is a new entity described as HCV-genome RNA
that is not detected in plasma using conventional PCR
assays, but which can be detected in liver tissue, PBMCs
[8], and even plasma [9] using a highly sensitive test.
Low concentrations of HCV genomic RNA have been
detected in PBMCs, lymphocytes, macrophages, dendritic
cells, and the livers of immunocompetent patients who
are cleared of HCV either spontaneously [10,11] or after
treatment [12–14]. Thus, this could have a big impact on
the management of hemodialysis patients in dialysis units.
Kidney-transplant patients lose immune control because
of institution of the regimen of immunosuppressive
drugs. In this setting, if HCV infection really does persist
at low levels in plasma or PBMCs, we hypothesize that it
should be more easily detectable than in immunocompetent patients.
Since 2006, we have used ultrasensitive assays for HCV
RNA to systematically look for the persistence of
HCV RNA in the plasma and PBMCs of formerly
HCV-infected patients receiving immunosuppressive
therapy for kidney transplantation.
No occult HCV in kidney-transplant patients
their informed consent. The study was conducted conforming to the Declaration of Helsinki.
Isolation of PBMCs and in vitro stimulation
Peripheral blood mononuclear cells were isolated from
blood by density-gradient centrifugation (Lymphoprep,
Abcys, France). The isolated PBMCs were divided into
two parts: one was immediately frozen at )80 C (unstimulated PBMCs) and the other was cultured (stimulated
PBMCs). Stimulation of cells in culture increases HCV
RNA detection in PBMCs from patients who are apparently HCV RNA-negative [16]. Cells (1 · 107 million)
were washed and suspended in Roswell Park Memorial
Institute (RPMI) 1640 medium (Invitrogen, Cergy-Pontoise,
France) supplemented with 20% heat-inactivated fetal
bovine serum (SVF) (Invitrogen) and interleukin-2 (IL-2)
at 20 U/ml (Proleukin, Roche). They were cultured for
48 h, and then phytohemagglutinin (PHA, 5 lg/ml,
Remel, Santa-Fe, NM, USA) was added and culture was
continued for an additional 72 h. The cells were then separated by centrifugation. Samples of approximately
5 · 106 (3.5 · 106 to 6 · 106) of unstimulated or stimulated PBMCs were preserved at )80 C for analysis.
Methods
Study population
All anti-HCV antibody positive/RNA negative kidneytransplant patients were from the Department of
Nephrology, Dialysis and Multi-Organ Transplantation of
Toulouse University Hospital, and had attended outpatient and inpatient clinics between May 2006 and December 2008 (n = 26). All had recovered from HCV infection
while on dialysis, either spontaneously (n = 10) or after
anti-HCV treatment (n = 16). HCV infection was defined
as anti-HCV antibody-positive serum. The plasma from
these patients repeatedly tested HCV RNA-negative using
the conventional real-time RT-PCR COBAS Ampliprep/
COBAS Taqman HCV test (CAP/CTM; Roche Diagnostics, Meylan, France), with a detection limit of 15 IU/ml.
When sera from the viremic phase was available (n = 10),
HCV genotype was determined by sequencing a 382 nt
fragment within the NS5B region [15]. Serotyping of the
16 remaining patients with no available viremic frozen
samples was done using Murex HCV serotyping kit
(Abbott Murex, Rungis, France). This study used blood
samples collected between 2 and 16 years after HCV was
cleared from their serum.
Blood collection
Four ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) tubes
were collected from each patient, after they had given
Ultrasensitive detection of HCV RNA in plasma
Hepatitis C virus-RNA was extracted from 1 ml plasma
with the QIAmp UltraSens Virus kit (Qiagen, Courtaboeuf, France), following the manufacturer’s instructions.
The extracted RNA was precipitated with ethanol, suspended in RNase-free water, and placed into a single
reaction to obtain maximum sensitivity. HCV RNA was
detected by amplification of the 5¢ untranslated region
(UTR) region of the HCV genome. The following
primer pairs were used: 5¢-CTCGCAAGCACCCTATCAG
GCAGT-3¢ (antisense, KY-78) and 5¢-GCAGAAAGCGTC
TAGCCATGGCGT-3¢ (sense, KY-80) for the RT-PCR
round; and 5¢-CGGGAGAGCCATAGTGG-3¢ (sense, R-130)
and 5¢-CGGGAGAGCCATAGTGG-3¢ (antisense, R-290)
for the nested round. RT-PCR was performed with the
Superscript III one-step PCR (Invitrogen, Carlsbad, NM,
USA). The RT-PCR conditions were: reverse transcription
at 60 C for 30 min, followed by initial denaturation at
94 C for 2 min, and by 55 cycles of 94 C for 15 s,
68 C for 30 s, and 68 C for 30 s. The sensitivity of the
nested one-step RT-PCR amplification was determined by
testing stepwise dilutions of a quantified HCV RNA
plasma (the second World Health Organization standard
for HCV RNA, from National Institute for Biological
Standards and Control). The low HCV RNA values (10,
5, 2, and 1 IU/ml) were tested in triplicates. The
detection limit was 2 IU/ml (or five copies/ml). Negative
ª 2009 The Authors
Journal compilation ª 2009 European Society for Organ Transplantation 23 (2010) 594–601
595
No occult HCV in kidney-transplant patients
Nicot et al.
controls (plasma from uninfected patients) and positive
controls (plasma from chronically HCV-infected patients)
were simultaneously tested in each run.
Detection of HCV-RNA in PBMCs and liver biopsies
by nucleic acid hybridization assay
6
Hepatitis C virus-RNA was extracted from about 5 · 10
cells or 5–30 mg of frozen liver tissue stored at )80 C,
using the RNeasy minikit (Qiagen), following the manufacturer’s instructions. The total RNA extracted from
PBMCs or liver biopsies was precipitated with ethanol,
suspended in RNase-free water, and was used in a single
reaction to maximize sensitivity. HCV RNA was detected
by amplifying the 5¢ UTR region of the HCV genome by
RT-PCR, followed by a nested PCR (as for the plasma).
Negative controls, i.e., PBMCs or liver biopsies taken from
uninfected individuals, and positive controls, i.e., PBMCs
or liver biopsies taken from chronically HCV-infected
patients, were simultaneously tested in each run. The specificity of PCR amplicons and the validity of the detection
were confirmed by Southern blotting using 32P-labeled
(Perkin-Elmer SAS, France) HCV fragments as a probe.
This probe was generated by transcribing RNA isolated
from a chronically HCV-infected patient. The cDNA was
amplified with the sense primer Rad-S (5¢-(A/G)A(C/
T)CACTCCCCTGTGAGGAAC-3¢) and reverse primer
Core-506 (5¢-TCT ACC TCG AGG TTG CGA-3¢). The
final 517-bp product was purified and cloned into the
promoter pCR4 plasmid vector using the TOPO TA cloning kit for sequencing (Invitrogen). The probe was labeled
with 32P using the DecaLabel DNA labeling kit (Fermentas, Saint-Rémy-Lès-Chevreuses, France), following the
manufacturer’s instructions. The detection limit was 2 IU/
reaction (or five copies/reaction).
Results
Patients’ characteristics
The patients’ characteristics are summarized in Table 1.
Ten (39%) patients had spontaneous clearance of HCV
and 16 (61%) were cleared of HCV after interferon-a
(IFN-a) (n = 15) or PEG-IFN-a (n = 1) therapy while on
hemodialysis. The median follow-up time after HCV
RNA clearance was 10.5 years (range 2–16 years). Seventeen patients who had been infected with HCV had the
following: HCV genotype 1 (n = 12), genotype 2 (n = 2),
genotype 3 (n = 1) or genotype 4 (n = 1). Genotype was
not ascertained for the other nine patients (four who
were spontaneously cleared of the virus and five who were
therapeutically cleared of the virus) as they had undetectable or very low levels of anti-HCV antibodies. No
patient was coinfected with human immunodeficiency
596
Table 1. Patients’ characteristics.
Parameter
Gender (M/F)
Age, years (range)
Time since KT, months (range)
HCV treatment
No
Yes
Time since HCV RNA clearance, years (range)
Primary kidney disease
GN
CIN
PKD
Diabetes mellitus
Nephroangiosclerosis
Induction therapy
RATG
Anti-IL2R
RATG + rituximab
Immunosuppressive treatment (n, %)
Cyclosporin A
Tacrolimus
Mycophenolic acid
Sirolimus
Azathioprine
Steroids
Belatacept
Acute rejection (n, %)
Rejection therapy
Steroids
RATG
OKT3
19/7
50 (31–66)
59 (1–224)
10
16
10.5 (2–16)
15
5
4
1
1
22
13
8
1
9 (35)
14 (54)
20 (79)
2 (8)
4 (15)
16 (62)
1 (4)
8 (31)
4
3
1
M, male; F, female; IFN, interferon; GN, glomerulonephritis; CIN,
chronic interstitial nephropathy; PKD, polycystic kidney disease; RATG:
rabbit antithymocytes globulins; anti-IL-2R: interleukin 2 receptor
blockers; KT, kidney transplantation; HCV, hepatitis C virus.
virus (HIV). Four patients had positive HBs antigens
(HBV+), and three of these four had positive plasma
HBV DNA.
At last follow-up, i.e., at last blood collection, median
serum aspartate aminotransferase (AST) was 18 IU/l
(range, 7–63 IU/l), alanine aminotranferase (ALT) was
21 IU/l (range, 9–84 IU/l), and gamma glutamyl transpeptidase (c-GT) was 23 IU/l (range, 11–85 IU/l)
(Table 2). The abnormal enzyme values observed in some
patients (Table 2) can be explained by active HBV infection (patient 8), hepatic polycystic disease (patient 12),
alcohol consumption (patient 20) and everolimus intake
(patient 26). Four out of the 10 patients who spontaneously eliminated HCV have a liver biopsy necessitated by
HBV coinfection. For the 16 patients who were cleared of
HCV after treatment, four had a post-treatment liver
biopsy: A0F1 before treatment and A1F1 at 8 months
after the end of treatment for the first patient, A1F1
before treatment and A1F1 at 35 months after the end of
ª 2009 The Authors
Journal compilation ª 2009 European Society for Organ Transplantation 23 (2010) 594–601
Nicot et al.
No occult HCV in kidney-transplant patients
Table 2. HCV RNA in the plasma and PBMCs of patients with cleared HCV infection.
Patient/
Gender
1/F
2/M
3/M
4/F
5/M
6/M
7/M
8/M
9/M
10/M
11/F
12/F
13/F
14/F
15/M
16/M
17/M
18/M
19/M
20/M
21/M
22/M
23/F
24/M
25/M
26/M
HCV serology
Liver function test (IU/l) Last follow-up
Before
KT/after KT
ALT
(n = 5–45)
AST
(n = 3–35)
c-GT
(n = 11–60)
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/)
+/+
+/+
+/)
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/+
+/)
+/+
+/+
+/)
+/+
+/+
19
17
20
7
44
11
26
46
20
14
26
15
18
9
24
18
16
19
12
63
32
16
18
13
16
45
22
20
21
14
28
15
20
35
26
13
31
14
17
9
12
21
25
22
16
63
21
18
21
15
17
53
14
37
22
22
27
17
21
24
23
11
15
85
27
40
23
16
23
20
20
58
41
28
18
15
49
163
Ultrasensitive
HCV RNA in
plasma
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
HCV RNA in PBMCs
Unstimulated
Stimulated
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
(2)
(2)
(2)
(1)
(2)
(1)
(2)
(1)
(1)
(2)
(1)
(2)
(2)
(2)
(1)
(2)
(1)
(1)
(2)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(2)
(1)
(2)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(2)
(2)
(1)
ND
– (2)
– (1)
– (1)
– (2)
– (1)
– (1)
ND
– (1)
– (1)
– (1)
– (1)
Time between
KT and HCV
RNA testing
(months)
Time between
HCV RNA
clearance and
HCV RNA
testing (years)
56
4
133
1
180
10
52
131
60
59
20
59
123
12
224
99
17
71
9
93
101
26
117
82
2
16
11
5
13
5
12
4
14
14
10
7
5
14
16
7
13
13
3
12
10
9
10
3
13
11
2
16
F, female; M, male; KT, kidney transplantation; AST, aspartate aminotranferase; ALT, alanine aminotransferase; c-GT, gamma glutamyl transpeptidase; PBMC, peripheral blood mononuclear cell; HCV, hepatitis C virus.
Values just underneath AST, ALT and c-GT indicate normal range for male and female.
Number in brackets indicates the number of PBMC samples tested.
treatment for the second patient, A1F0 at 23 months after
the end of treatment for the third patient, and the fourth
patient had no liver biopsy before treatment but had
A0F0 liver biopsy at 27 months after the end of treatment. Thus no patient had a worse liver histology after
treatment.
The median last collection time at post-transplantation follow-up was 59 months (range 1–224 months).
After transplantation, eight patients experienced a
biopsy-proven acute rejection. Four were successfully
treated with steroid pulses and the remaining four
patients experienced steroid-resistant acute rejection episodes that required either rabbit antithymocyte globulins (RATGs) (n = 3) or anti-CD3 monoclonal
antibodies (OKT3) (n = 1). None of the patients experienced an acute antibody-mediated rejection. At last
blood collection, serum-creatinine level was 139 lmol/l
(range 94–273 lmol/l). Three out of 25 nondiabetic
patients at transplantation (12%) developed post-transplantation diabetes mellitus: all three had received a
tacrolimus-based immunosuppression. Proteinuria was
absent in all but two patients, i.e., 0.5 and 0.8 g/day.
No patient experienced any post-transplantation lymphoproliferative disorder, or an HCV-related de novo
glomerulonephritis.
HCV RNA detection in plasma
Hepatitis C virus-RNA was repeatedly tested in the
plasma of all patients using the COBAS AmpliPrep/
COBAS TaqMan HCV test (CAP-CTM, detection limit
of 15 IU/ml). In 23 patients (88%), HCV RNA was tested
at least three times with a mean number of five samples
per patient (range, 1–15). None of the plasma samples
taken during the 16-year period after HCV clearance had
detectable HCV genome RNA as assessed by conventional
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No occult HCV in kidney-transplant patients
Nicot et al.
techniques. No patient experienced a virologic relapse
during post-transplantation follow-up.
The plasma samples taken at the last blood collection
were also tested using an in-house ultrasensitive RT-PCR
assay with a detection limit of 2 IU/ml. No residual HCV
genome RNA was detected in any of the plasma samples
from the 26 patients (Table 2).
HCV RNA detection in PBMCs and liver biopsies
Peripheral blood mononuclear cells were collected from
all patients at least once. A second PBMC sample was
taken from 11 of the 26 patients at between 2 and
23 months after the first sample. A total of 37 PBMCs
samples were tested for HCV RNA using an in-house
ultrasensitive RT-PCR assay, followed by Southern blotting (detection limit, 2 IU/reaction). Furthermore, 24
PBMC samples (65%) were stimulated in culture before
testing for HCV RNA. None of the PBMC samples had
detectable HCV RNA (Table 2).
Liver biopsies from five patients were tested for the
presence of HCV RNA after they had recovered from
HCV: four biopsies were from the four patients who
spontaneously resolved their HCV infection and were
coinfected with HBV and the last one from one of the
four patients who had a liver biopsy after having HCV
clearance induced by interferon-based therapy. None of
the liver biopsy samples had detectable HCV RNA by
8 years (range: 2–12) after HCV clearance.
Discussion
Interferon-a is contraindicated after kidney transplantation because of the high risk of acute rejection [17].
However, it has been recently suggested that pegylated
interferon-a-based treatment could be considered late
after kidney transplantation [18]. In the recent Kidney
Disease: Improving the Global Outcomes (KDIGO)
guidelines [5], it has been recommended to treat all
HCV-positive/RNA-positive patients who are candidates
for a kidney transplantation with a-IFN. In this setting, a
SVR is observed in approximately 40% of treated
patients. It has been recently suggested that apparently
cured patients may have an occult HCV infection
[9,13,14,19] attributable to persistent low-level HCV replication. In a previous study, we did not observe any
relapse of HCV replication after kidney transplantation in
patients who were cleared of HCV RNA after IFN-a therapy while on dialysis [6]. In this study, we looked for the
persistence of HCV in immunocompromised kidneytransplant patients who were cleared of the virus while on
dialysis. In this very favorable situation for viral replication, we did not observe any relapse of HCV infection
598
after a long-term follow-up (median, 10.5 years) despite
intensive immunosuppressive therapy. In addition, using
very sensitive virologic tools, we failed to detect any residual HCV RNA in the liver, the plasma or the PBMCs of
the 26 immunocompromised patients.
Recently, Barril et al. [7] have detected occult HCV
infection in 45% of antibody-negative/RNA-negative
patients receiving dialysis with abnormal liver function.
Although it may be of interest, these results should be
interpreted with caution because of potential major concerns [20]. First, in their study, liver-enzyme levels were
abnormal in patients experiencing occult HCV infection
whereas, in dialysis patients with chronic active HCV
infection, liver-enzyme levels were often within the normal range [21,22]. Second, they reported a very high proportion of deaths (39%) during the short length of
follow-up. However, these deaths were not related to
HCV-liver disease. This suggests the presence of another
underlying disease other than HCV infection that may
have been responsible for the increased enzyme levels.
Third, seven of these hemodialysis patients had received a
kidney transplant, but their serum HCV RNA remained
negative after kidney transplantation. In HCV RNA-positive patients, there is a significant increase in serum HCV
RNA concentration after transplantation because of the
loss of HCV-immune control under immunosuppression
[23–26]. Hence, it is surprising that no HCV RNA was
detected in the serum of the seven kidney-transplant
patients who had an occult HCV infection before transplantation. The number and/or type of immunosuppressive therapies were not reported in the Barril et al. study
[7]. In our study, 13 patients (50%) received RATG or
OKT3, and 20 patients (79%) received mycophenolic
acid. Both drugs have been found to increase HCV viremia in HCV-infected patients [26–28] but none of the 26
kidney-transplant patients had a detectable HCV RNA in
their plasma, which confirms and extends the results
obtained in our previous study [6]. Finally, interestingly,
none of our patients developed any HCV-related glomerulopathy or a liver disease within this long follow-up.
No patients who had a post-treatment liver biopsy
showed a deteriorating liver histology. Only three
patients, who received a tacrolimus-based therapy, developed post-transplant diabetes mellitus. The occurrence of
post-transplant diabetes mellitus in HCV-positive/RNApositive patients is usually much more frequent [29].
HCV infection has also been identified as one of the
important risk factors for tuberculosis in kidney-transplant patients [30]. In this study, none of the patients
developed tuberculosis after transplantation.
Our findings strengthen the results obtained from
recent studies that have detected no HCV genomic RNA
in the plasma or PBMCs of 156 successfully treated
ª 2009 The Authors
Journal compilation ª 2009 European Society for Organ Transplantation 23 (2010) 594–601
Nicot et al.
immunocompetent patients [31], or in the PBMCs of 69
anti-HCV-positive/HCV RNA-negative blood donors
[32]. The absence of detectable HCV RNA genome in
liver biopsies, PBMCs, and plasma of patients with
impaired immunity indicates no persisting HCV. However, other studies, in smaller cohorts of patients (15–24
patients), have found PBMCs to be the site of HCV infection after successful treatment or spontaneous elimination
of HCV infection in about 50% of patients
[10,13,14,19,33]. The disagreement between these studies,
i.e., either HCV elimination or HCV persistence, may be
linked to differences within the criteria used to define
plasma viremia in patients with apparent SVR. Indeed,
standardized techniques used to classify patients as SVR
differ between studies, ranging from 25 to 1000 copies/
ml. About 60% of patients with an occult HCV infection
had detectable HCV RNA virus in their plasma and their
mean viral load was 71 HCV RNA copies/ml (range 18–
192) [9]. Therefore, HCV genomic RNA would have
probably been detected by conventional tests if sensitive
RT-PCR assays [CAP/CTM or transcription-mediated
assay (TMA)] had been used to screen these patients.
Based on the previous published data [7,9,10,13], HCV
RNA could have been detected in the PBMCs of 13
patients (50%) and in the plasma of seven patients (37%)
in our cohort. Despite a small number of patients, the
size of the studied population seems adequate to detect
the presence of the HCV RNA genome in PBMCs or
plasma. Data on fibrosis after HCV clearance were not
available in all patients. The use of liver stiffness or fibrotest in this population for diagnosing liver fibrosis could
be an acceptable alternative for future studies [34].
There are several reasons why HCV persistence is unlikely. First, HCV is an RNA virus that has no latent stage
in its replication cycle and its genome cannot persist as
DNA, unlike viruses such as HIV, HBV and herpes
viruses. Second, long-term follow-up studies have shown
that HCV genomic RNA rarely reappears in the plasma
after SVR [35–37]. More recently, the clinical, virologic,
and biochemical outcomes of a cohort of 150 patients
with SVR followed for 5 years have not shown conclusive
evidence of a virologic relapse [38]. A few cases of HCV
recurrence in SVR patients who received immunosuppressive treatment have been reported supporting the hypothesis of HCV persistence. One patient was reinfected by
the same HCV genotype after chemotherapy for lymphoma [39]. Lin et al. [40] reported the re-emergence of
HCV in a patient who had received a short course of
prednisone 7 months after the end of HCV therapy, and
in another who underwent a kidney transplantation
7 months after the end of HCV therapy. All these patients
were reinfected by the same genotype, but no accurate
phylogeny was done on the hypervariable region of the
No occult HCV in kidney-transplant patients
HCV genome (e.g., region HVR1) to confirm that it was
the same virus [41] or to exclude the possibility of reinfection from the same source as the first infection, or that
they had a similar virus. This must be borne in mind in
studies describing late relapse.
This report deals with kidney-transplant recipients,
with cleared HCV infection, receiving subsequent immunosuppressive treatment which is usually thought to be
responsible for a boost in HCV replication. We found no
evidence of a persisting HCV reservoir in liver biopsies,
PBMCs and plasma using an ultra-sensitive RT-PCR
assay. The absence of a HCV relapse in formerly HCVinfected immunocompromised patients suggests the complete elimination of HCV while on dialysis.
Authorship
F. Nicot performed research, collected data and wrote the
paper. B. Mariamé gave technical assistance. L. Rostaing
and N. Kamar did the follow-up of patients and participated in paper writing. C. Pasquier and J. Izopet designed
the study and participated in paper writing.
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601
DISCUSSION
Le traitement de l’infection chronique par le HCV reste un défi majeur car près
de 50% des patients infectés traités ne guérissent pas. L’arsenal thérapeutique reste
à ce jour limité, en attendant l’arrivée des nouvelles molécules agissant directement
sur le virus. L’amélioration de la prise en charge thérapeutique nécessite une
meilleure connaissance du virus, de la physiopathologie de l’infection et des facteurs
influençant la réponse au traitement. Ceci permettra d’améliorer le taux de succès
thérapeutique. L’éradication du virus C est cependant remise en question du fait de
la description récente d’infection occulte. Dans ce travail, nous avons étudié la
variabilité des souches de HCV de génotypes 2 et 4, recherché les facteurs viraux et
pharmacologiques influençant la réponse thérapeutique de patients co-infectés par le
HIV ou infectés par un virus de génotype 1 ou 4 et enfin, recherché la présence
d’infection HCV occulte chez des patients immunodéprimés, transplantés rénaux.
Variabilité génétique des virus HCV de génotypes 2 et 4
L’épidémiologie moléculaire des virus de génotypes 2 et 4 dans le sud-ouest
de la France a montré une grande variabilité génétique de ceux-ci puisque 8 soustypes au sein du génotype 2 et 12 sous-types au sein du génotype 4 ont été
identifiés, sans compter les souches de sous-type indéterminé (16% pour les
génotypes 2 et 1,5% pour les génotypes 4) (publication n°1 et 2). La prévalence du
génotype 2 (11,3%) en région Midi-Pyrénées est similaire à celle retrouvée dans
d’autres régions de France (Martinot-Peignoux, 1999; Payan, 2005). Celle du
génotype 4 (7,4%) est supérieure à la moyenne nationale (4,5%) mais inférieure à
celle observée dans la région parisienne ou à Marseille, de 10-11% (MartinotPeignoux, 1999; Morice, 2001; Tamalet, 2003). Ceci peut s’expliquer par une
immigration plus importante dans ces régions. Dans les pays d’Europe centrale
présentant une faible immigration (Autriche et Slovénie), la prévalence du génotype 4
est très faible (2,7% et 1,2% respectivement) et celle du génotype 2 également
(4,5% et 5% respectivement) (Seme, 2009; Maieron, 2010).
Le HCV de génotype 2 est majoritairement transmis par transfusion sanguine
alors que le HCV de génotype 4, en particulier les sous-types 4a et 4d, diffuse plutôt
103
par toxicomanie. Un groupe particulier de patients, contaminés par toxicomanie, a
été identifié parmi les patients infectés par un virus de génotype 2. En effet, 70%
d’entre
eux
étaient
infectés
par
un
sous-type
2a.
L’étude
de
l’histoire
épidémiologique de certain virus de génotypes 2 et 4, chez des donneurs de sang en
France a montré que la dissémination des sous-types 2b, 2c et 2i aurait eu lieu entre
les années 1900 et 1960 alors que celle des sous-types 2a, 4a et 4d aurait eu lieu
plus tardivement dans les années 1960-1980 (Cantaloube, 2008). La prévalence de
ces derniers (2a, 4a, 4d) aurait considérablement augmenté sur une courte période
ce qui est compatible avec une diffusion par toxicomanie. Une forte prévalence du
génotype 4 (23%) a été observée chez les patients toxicomanes dans le Nord-Est de
la Pologne alors que la prévalence chez les patients tout venant était de 8,4%
(Chlabicz, 2008a; Chlabicz, 2008b). Aux Etats-Unis et au Canada, la diffusion du
génotype 4 est assez limitée (Lyra, 2004 ; Murphy, 2007) et les cas rapportés ont
des virus proches de ceux observés chez les toxicomanes ou les immigrants
africains (Li, 2009). Dans cette dernière étude, des différences nucléotidiques (basée
sur l’analyse des génomes complets) inférieures à 30 % entre les génotypes 1 et 4,
et à 16% entre les sous-types 4a et 4c ont été observées. Les génotypes 1 et 4 étant
originaires de pays d’Afrique centrale et de l’ouest (Kamal, 2008), ils pourraient
historiquement avoir appartenu à un génotype commun (Ndjomou, 2003). Notre
étude a également montré un cluster rassemblant les sous-types 4a et 4c,
indépendamment des autres sous-types (publication n°1) ce qui est en faveur d’une
origine commune.
Une étude réalisée sur 1532 patients infectés par un virus de génotype 4 en
France, incluant 249 patients d’Afrique sub-saharienne et 242 patients Egyptiens a
montré un profil épidémiologique comparable à celui rapporté dans notre étude
(publication n°1). En effet, les virus de sous-type 4a et 4d étaient prédominants
chez les patients d’origine française, avec pour principale voie de transmission la
toxicomanie par voie intraveineuse. Le sous-type 4a (93%) était majoritaire chez les
patients d’origine Egyptienne et 7 sous-types différents (4a, 4d, 4f, 4h, 4j, 4k, 4r) ont
été identifiés chez les patients d’origine sub-africaine, sans voies de transmission
prédominante identifiée (Roulot, 2007). Aux Pays-Bas, l’analyse phylogénétique des
séquences NS5B de 133 patients a également montré que la majorité des
séquences étaient de sous-types 4d (57%) et 4a (37%) (de Bruijne, 2009). Trois
clusters phylogénétiques distincts ont été identifiés, chacun spécifique d’un profil
104
épidémiologique: (i) immigrants Egyptiens infectés par un sous-type 4a, (ii) patients
d’origine allemande ayant une histoire de toxicomanie intraveineuse infectés par un
sous-type 4d et (iii) patients d’origine allemande homosexuels HIV séropositifs
infectés par un sous-type 4d également.
L’hétérogénéité génétique (représentée par la moyenne des distances des
séquences appariées) observée au sein des virus de génotype 2 (publication n°2)
est plus importante que celle observée au sein des virus de génotype 4 (publication
n°1), que ce soit au niveau de la région NS5B ou E2. Ceci suggère une évolution
plus longue et donc une introduction plus ancienne des virus de génotype 2 en
France. La dissémination du HCV de génotype 2 au niveau mondial serait le résultat
de la migration de populations à l’époque de l’esclavage. Il serait originaire d’Afrique
de l’Ouest et se serait ensuite étendu à l’Est (Ndjomou, 2003). Récemment, une
étude a reconstitué l’épidémiologie moléculaire et géographique du HCV de
génotype 2 expliquant sa dispersion au niveau du globe (Markov, 2009).
Premièrement, les auteurs ont montré que le cluster des souches de Guinée Bissau
ou Gambie était ancré à la base de l’arbre et qu’il était le plus diversifié
génétiquement. Ensuite, les analyses d’horloge moléculaire ont montré que la
présence du HCV était plus récente au Bénin, au Ghana ou en Afrique Centrale
qu’en Guinée Bissau ou Gambie. Il aurait été introduit en Guinée Bissau au 16ème
siècle puis aurait diffusé vers l’Afrique centrale aux 17-18ème siècles (Pouillot, 2008).
Dans cette étude, des souches de Martinique étaient regroupées avec celles
provenant du Bénin-Ghana. La datation de leur introduction en Martinique est
compatible avec l’hypothèse de l’introduction du virus lors des migrations de
population à l’époque de l’esclavage, aux 17ème et 18ème siècles. L’introduction du
HCV de génotype 2 au Cameroun serait en revanche plus tardive (1ère moitié du
20ème siècle) et simultanée aux campagnes de vaccinations ou à l’administration de
médicaments (contre les trypanosomes, la syphilis…) par voie injectable (Njouom,
2007; Pouillot, 2008; Markov, 2009). Les souches de Madagascar, se rapprochent
quant à elles soit des souches de Guinée Bissau-Gambie (pour un groupe de 7
séquences), soit des souches de Martinique et du Bénin-Ghana (pour 2 groupes
différents de séquences). En incluant des souches de la région Midi-Pyrénées
(publication n°2) dans leur analyse, ils ont observé que certaines étaient proches
des souches Martiniquaises ou de Madagascar. Le passé colonialiste de la France,
dans les Caraïbes et en Afrique de l’Ouest, et les échanges humains qui en ont
105
découlé, pourraient être à l’origine de l’introduction du HCV de génotype 2 en
France.
Les souches de génotype 4 sont originaires d’Afrique Centrale et d’Afrique de
l’Ouest (Smith, 1997; Ndjomou, 2003; Njouom, 2003; Simmonds 2004; Genovese,
2005; Ndong-Atome, 2008). Le sous-type 4f est majoritaire au Cameroun (60% des
génotypes 4), le sous-type 4e au Gabon (72% des souches HCV), les sous-types 4k
(48%) et 4c (27%) en République de Centre Afrique et les sous-types 4c et 4r sont
les plus prévalents en République du Congo (26% des souches présentes). Les
études de coalescence ont montré que la phase épidémique d’introduction de ces
sous-types s’étalait entre les années 1920 et 1960 et qu’elle avait été suivi d’une
phase
de
ralentissement
des
transmissions,
évocateur
d’une
transmission
iatrogénique (Njouom, 2007; Pepin, 2008; Njouom, 2009; Cantaloube, 2010). Pour
exemple, le sous-type 4f aurait été disséminé de manière accélérée au Cameroun
lors des campagnes de vaccination contre les schistosomiases menées dans les
années 30 (Pepin, 2008). Depuis les années 1930, les souches de sous-type 4a,
sont devenues prévalentes en Afrique du Nord, plus particulièrement en Egypte
(Angelico, 1997; Tanaka, 2004). Plus récemment, les virus de génotype 4 ont été
retrouvé dans les pays d’Europe du Sud autour du bassin Méditérranéen (Malaga,
France, Grèce) (Ansaldi, 2005; Payan, 2005; Fernandez-Arcas, 2006; Katsoulidou,
2006) et les différentes études réalisées, y compris la nôtre (publication n°1)
concordent sur une diffusion par toxicomanie. Au Pays-Bas, le sous-type 4a aurait
été importé à la fin du 19ème siècle de manière sporadique et il aurait diffusé entre les
années 1924 et 1965 principalement chez des descendants des immigrants
égyptiens (de Bruijne, 2009). L’introduction du sous-type 4d daterait des années
1960. Il aurait suivi l’introduction des sous-types 1a et 3a, traditionnellement
associées à la toxicomanie intraveineuse, et qui ont diffusé en Europe dans la
première moitié du 20ème siècle. Il est probable que ces mêmes sous-types aient été
introduits en France aux mêmes périodes.
La connaissance de la variabilité génétique des différents génotypes et soustypes est importante car elle permet aujourd’hui grâce à des analyses moléculaires
(méthode de coalescence, horloge moléculaire) de mieux comprendre l’origine et la
diffusion de ce virus dans le monde. L’impact de cette variabilité sur la
physiopathologie de l’infection et sur la réponse au traitement est mal connu et
106
nécessite le développement d’outils capables de discriminer les génotypes et les
sous-types pour pouvoir l’étudier.
Facteurs influençant la réponse au traitement
La réponse au seul traitement antiviral actuellement disponible, associant le
pegIFNα et la RBV, diffère selon les populations étudiées. Les personnes
coinfectées par le HIV et celles infectées par un génotype autre que 2 ou 3
répondent dans moins de 50% des cas. La réponse au traitement de ces patients
pourrait être améliorée si les facteurs influençant cette réponse étaient identifiés et
s’il était possible de les maîtriser.
Les concentrations de RBV peuvent influencer la réponse virologique des
patients coinfectés par HIV et porteurs d’un virus de génotype 1 ou 4 (publication
n°4). Les concentrations plasmatiques de RBV à S12 étaient significativement plus
élevées chez les patients répondeurs que chez les patients non répondeurs, infectés
par un virus de génotype 1 ou 4. Un seuil de concentration plasmatique de RBV à
2 300 ng/mL a été associé à la RVS. En revanche, les concentrations de RBV
n’avaient pas d’influence sur les patients traités par un virus de génotype 2 ou 3.
Nous n’avons pas mis en évidence de rôle des concentrations plasmatiques de
pegIFNα sur la réponse au traitement quelque soit le génotype. Dans une seconde
étude réalisée chez des patients infectés par un virus de génotype 1 ou 4
(publication n°5), nous avons montré que les concentrations sériques de RBV
mesurées à S12 étaient un facteur associé à la RVP et qu’elles étaient plus élevées
chez les patients qui avaient une RVS que chez les patients non répondeurs, bien
que la différence ne soit pas statistiquement significative. Le seuil de concentration
sérique de RBV associé à une proportion plus élevée de réponse virale à S12 a été
défini à 2 200 ng/mL, ce qui est proche du seuil déterminé chez les patients coinfectés par HIV dans la publication n°4. Dans cette étude comme dans la
précédente, nous n’avons pas mis en évidence d’influence des concentrations de
pegIFNα sur la réponse virale.
Les données récemment publiées sur l’impact des concentrations de RBV sur
la réponse au traitement montrent pour la plupart, que les patients répondeurs ont
des concentrations plasmatiques de RBV plus élevées que les patients non
répondeurs (Morello, 2008). Cette corrélation entre concentrations plasmatiques de
107
RBV et réponse virale peut être observée pour la RVP ou la RVS. En ce qui
concerne la RVP, une bonne corrélation a été observée entre les concentrations de
RBV à S4 et la RVP, et des concentrations cibles ont été proposées. Chez des
patients infectés par HCV seul, le seuil de 2 170 ng/mL était atteint par la moitié des
personnes qui avaient une RVP (Souvignet, 2005). Chez les patients coinfectés par
HIV, le seuil de 2 700 ng/mL à S4 a été proposé pour prédire la RVP avec une
sensibilité de 70% et une spécificité de 49% (Rendon, 2005). Un seuil des
concentrations résiduelles de RBV à 1 600 ng/mL entre la semaine 2 et 48 a été
proposé pour identifier les patients (infectés par un génotype 1 ou 4) ayant une RVP,
avec une sensibilité de 89% et une spécificité de 64% (Aguilar Marucco, 2008).
L’influence des concentrations plasmatiques de RBV sur la RVS, a été montré
pour la première fois en 2000 (Jen, 2000) : le taux de RVS (tout génotype confondu)
était de 49% pour des concentrations plasmatiques de RBV à S4 comprises entre
3 500-4 000 ng/mL, et de 62,5% pour des concentrations plasmatiques supérieures
à 4 000 ng/mL. Une autre étude réalisée chez des patients infectés par un génotype
1b, a montré que le taux de RVS était de 100% chez les patients qui avaient des
concentrations de RBV entre 2 500 et 3 000 ng/mL à S4 et > 3 000 ng/mL à S8
(Tsubota, 2003). Des résultats similaires ont été observés chez des patients infectés
par un virus de génotype 1 (Arase, 2005). Un seuil plus bas à 2 000 ng/mL à S4 a
été associé à la RVS chez des patients infectés par un virus de génotype 1, naïfs de
traitement ou rechuteurs (Maynard, 2008). Sur une centaine de patients infectés par
un virus de génotype 1, 2, 3 ou 4, les concentrations plasmatiques de RBV à S4, à
S12 et l’aire sous la courbe (AUC0-12h) à S12 étaient significativement plus élevées
chez les patients répondeurs que les patients non répondeurs (Breilh, 2009). En
analysant uniquement les 51 patients infectés par un virus de génotype 1, seul
l’indétectabilité de la charge virale HCV à S12 restait un facteur prédictif de la RVS
en multivarié, bien qu’une influence des concentrations de RBV sur la RVS ait été
observé en univarié. Plus récemment, l’impact de l’exposition de la première dose de
RBV sur la RVS a été évalué (Loustaud-Ratti, 2008). L’AUC0-4h après la première
dose de RBV était corrélée à la RVS et le seuil de 1755 µg/h/L a été déterminé avec
une sensibilité de 72% et une spécificité de 85%. Chez les patients coinfectés par
HIV, des concentrations plasmatiques cibles de RBV ont également été déterminées.
Des concentrations de RBV > 1 600 ng/mL, entre S2 et S48, permettaient de prédire
la RVS de patients infectés par un virus de génotype 1 ou 4 avec une sensibilité de
108
88% et une spécificité de 58% (Aguilar Marucco, 2008). Plus récemment, une étude
rétrospective réalisée chez 99 patients coinfectés par HIV, traités par pegIFNα et
RBV et répondeurs à S48, a montré que les facteurs prédictifs de rechute étaient
une concentration de RBV < 2 500 ng/mL à S4, une charge virale HCV préthérapeutique élevée et une infection par un virus de génotype 1 ou 4 (Morello,
2010). Enfin, chez 52 patients non répondeurs à un précédent traitement par IFNα,
IFNα + RBV ou pegIFNα + RBV, les facteurs associés à une RVS étaient l’infection
par un virus de génotype 2/3 et des concentrations de RBV > 2 070 ng/mL (Labarga,
2010). Seules 3 études ont montré un faible intérêt des concentrations de RBV dans
la prise en charge thérapeutique (Crespo, 2007; Dahari, 2007a; Lopez-Cortes,
2008), pouvant s’expliquer par un petit effectif ou un dosage trop précoce des
concentrations de RBV. Nous avons également montré que la diminution du taux
d’hémoglobine était inversement corrélée aux concentrations de RBV (publications
n°4 et 5), confirmant les résultats d’autres études (Jen, 2000; Maeda, 2004; Arase,
2005; Aguilar Marucco, 2008). Les concentrations de RBV peuvent donc influencer
la réponse au traitement et seraient un paramètre intéressant puisque des
adaptations de posologie peuvent être envisagées. L’adaptation des concentrations
plasmatiques de RBV permettra d’optimiser l’efficacité du traitement tout en
contrôlant les effets hématologiques.
Chez des patients hémodialysés, le taux d’éradication virale observé après un
traitement par IFNα est élevé en comparaison à des patients non urémiques (Izopet,
1997). Ceci est dû à des ASC d’IFNα plus élevées (Rostaing, 1998; Chatelut, 1999).
Après administration d’un bolus de 3 MU d’IFNα, l’exposition à la molécule est plus
faible chez des patients non répondeurs que chez des patients répondeurs à la 12ème
semaine de traitement suggérant un impact des concentrations d’IFNα sur la
réponse virale au traitement (Boulestin, 2006). Dans nos 2 études (publication n°4
et n°5), les concentrations de pegIFNα n’ont pas été identifiées comme un facteur
influençant la réponse virale. Peu d’études ont évalué l’impact des concentrations
d’interféron sur la réponse virale, et celles disponibles ont été réalisées chez des
patients coinfectés par HIV. Chez 24 patients naïfs de tout traitement par IFNα, les
concentrations de pegIFNα-2b étaient similaires chez les patients répondeurs et non
répondeurs (Talal, 2006). Par contre, les concentrations de pegIFNα-2b qui réduisent
la production virale de 50% (concentration inhibitrice 50 ou CI 50) étaient moins
élevées chez les patients répondeurs que chez les patients non répondeurs. Le
109
quotient thérapeutique, défini par le rapport des concentrations moyennes de
pegIFNα-2b sur 7 jours sur la CI 50, était plus élevé chez les patients répondeurs
virologiques à S12 et 6 mois après l’arrêt du traitement que chez les patients non
répondeurs. Dans une autre étude réalisée sur 126 patients coinfectés par HIV, les
facteurs associés à la réponse au traitement étaient l’infection par un virus de
génotype 3, une charge virale basse à l’inclusion et une exposition à des
concentrations de pegIFNα-2a élevées tout au long du traitement (mesurées à S2,
S4, S8, S12, S16, S24, S36 et S48) (Lopez-Cortes, 2008). Chez les patients infectés
par un virus de génotype 1 ou 4, les concentrations de pegIFNα-2a étaient 3 à 4 fois
plus élevées chez les patients répondeurs que les patients non répondeurs. Chez les
patients infectés par un virus de génotype 3, les concentrations de pegIFNα-2a
n’avaient pas d’influence sur la réponse virale. Pourtant, une étude a montré que des
patients non répondeurs (12/303), infectés par un virus de génotype 2 ou 3 et traités
par pegIFNα-2a et RBV, avaient des concentrations plasmatiques de pegIFNα-2a
significativement plus faibles au 7ème et au 29ème jour que les patients répondeurs
(Alsio, 2010). Ces résultats sont discutables vu le faible nombre de patients non
répondeurs. Chez des patients d’origine caucasienne et afro-américaine les
concentrations de pegIFNα-2b étaient également comparables chez les patients
répondeurs et non répondeurs (Rozenberg, 2009). Cependant, les CI 50 observées
chez les patients caucasiens étaient significativement inférieures à celles observées
chez les patients afro-américains suggérant que les différences de décroissance
virale HCV observées entre les caucasiens et les afro-américains ne seraient pas
dues à une pharmacocinétique différente de l’IFN mais plutôt à une plus faible
sensibilité du virus ou des facteurs de l’hôte à l’IFN chez les afro-américains. Dans
cette étude, les patients qui avaient une Cmax < à la CI 90 étaient non répondeurs
dans 100% des cas. Le maintien des concentrations à des niveaux supérieurs à la CI
90 pourrait être compatible avec une induction plus forte de la réponse cellulaire
antivirale, et avec une élimination plus efficace du virus. Au final, les concentrations
de pegIFNα auraient peu d’influence sur la réponse au traitement, par contre les
paramètres pharmacodynamiques (combinant les concentrations d’IFN et la
diminution de la charge virale les 1ers jours de traitement) pourraient permettre de
prédire la RVS (Talal, 2006; Rozenberg, 2009).
110
Le sous-type viral du HCV pourrait être un facteur à prendre en compte dans
l’individualisation du traitement HCV puisque les patients infectés par un sous-type
1b (48%) répondent plus fréquemment au traitement que les patients infectés par un
sous-type 1a (23%) (Publication n°5). Le génotype du HCV est le principal facteur
influençant la réponse au traitement d’une hépatite C chronique. De nombreux
essais cliniques ont montré que les patients infectés par un virus de génotype 1 ou 4
répondaient plus fréquemment au traitement que des patients infectés par un virus
de génotype 2 ou 3 (Svensson, 2000; Manns, 2001; Fried, 2002; Hadziyannis,
2004a). Cependant, l’influence des sous-types sur la réponse virologique au
traitement par pegIFNα et RBV n’avait pas été évaluée jusqu’à présent. La principale
limitation à cette évaluation a été l’utilisation de techniques de génotypage non
appropriées pour la détermination des sous-types. En effet, elles sont en majorité
basées sur l’analyse de la région 5’NC du HCV qui est peu variable, et ne permet
donc pas une bonne discrimination des sous-types. La technique INNO-LIPA version
1, la plus communément utilisée, classifie des souches de sous-type 1a en sous-type
1b dans une proportion non négligeable (Chen, 2002). Bien que la version 2 de la
technique INNO-LIPA permette maintenant de discriminer correctement ces 2 soustypes (Bouchardeau, 2007), la plupart des essais pivots ont été réalisés avec la
première version ne permettant pas d’étudier l’influence du sous-type sur la réponse
virale (Manns, 2001; Fried, 2002). La détermination du génotype par séquençage
direct et analyse phylogénétique de la région NS5B du génome HCV, utilisée dans
notre étude, permet une discrimination précise des sous-types au sein des différents
génotypes (Sandres-Saune, 2003; Cantaloube, 2006; Murphy, 2007), et une
classification similaire à celle obtenue par analyse de génomes complets (Hraber,
2006). Seules deux autres études ont évalué l’influence des sous-types HCV sur la
réponse virale au traitement. Une étude multicentrique française, réalisée sur 597
patients a montré que l’infection par un sous-type 1b, 4a ou 4d était un facteur
prédictif de réponse au traitement (Legrand-Abravanel, 2009). Une autre étude
multicentrique réalisée chez 242 patients infectés par un virus de génotype 4 et
traités par pegIFNα et RBV a montré que les patients infectés par un sous-type 4a
répondaient mieux au traitement que ceux infectés par un autre sous-type (60%
versus 35%, p<0,005) (Roulot, 2007). Des données récentes suggèrent que la durée
du traitement chez des patients infectés par un virus de génotype 1 pourrait être
adaptée en fonction de la charge virale mesurée à l’inclusion, à S4 et à S12. Un
111
allongement de la durée de traitement à 72 semaines est proposé chez les patients
qui ont une réponse virologique lente, définie par une charge virale détectable à S12
mais indétectable à S24 (Berg, 2006; Pearlman, 2007). La durée de traitement
pourrait également être adaptée en fonction du sous-type, et par exemple prolongée
chez les patients infectés par un virus de sous-type 1a qui répondent moins bien. Au
regard des résultats de ces différentes études, le sous-type viral pourrait donc être
un facteur à prendre en compte pour l’individualisation du traitement anti-HCV.
Actuellement, le HCV de génotype 1 est une cible de choix pour les nouvelles
molécules anti-HCV ciblant directement le génome viral: à savoir les antipolymérases
et les antiprotéases. Dans une étude récente de phase IIb, évaluant le telaprevir en
association avec le pegIFNα et la RBV, un échec virologique a été observé plus
fréquemment chez les patients infectés par un virus de sous-type 1a que ceux
infectés par un virus de sous-type 1b (McHutchison, 2009). Ceci s’explique par le fait
que l’une des mutations conférant une résistance au telaprevir, la R155K est acquise
plus rapidement par les virus de sous-type 1a (la mutation du 2e nucléotide suffit)
que les virus de sous-type 1b (nécessite la mutation des 2 1er nucléotides) (Sarrazin,
2010). Des activités antivirales différentes ont également été observées pour les
inhibiteurs de polymérase en fonction du sous-type viral avec le plus souvent une
activité réduite chez les patients infectés par un génotype 1a, à l’exception du filibuvir
qui induirait une réponse plus fréquente chez les patients infectés par un sous-type
1a que 1b (Nyanguile, 2010; Sarrazin, 2010).
Des méthodes de génotypage discriminant correctement les sous-types sont
donc indispensables, et la méthode de génotypage du HCV par analyse de la région
NS5B sur puce ADN que nous avons développée en est une. Cette technique
permet d’identifier correctement 6 génotypes et une trentaine de sous-types
différents (Publication n°3). La concordance de cette méthode avec l’analyse
phylogénétique des séquences de la région NS5B est de 100% pour la détermination
des génotypes et de 99.7% pour l’identification des sous-types testés. Elle est
toutefois plus simple à mettre en œuvre que le séquençage direct de la région NS5B
qui nécessite d’avoir un séquenceur et une analyse phylogénétique des séquences
par la suite. Plusieurs études commencent à montrer que les sous-types peuvent
influencer la réponse au traitement et avoir des sensibilités différentes aux
traitements, que soit pour une bithérapie par pegIFNα et RBV (Roulot, 2007;
Legrand-Abravanel, 2009) (Publication n°5) ou une trithérapie par telaprevir associé
112
au pegIFNα et à la RBV (McHutchison, 2009; McHutchison, 2010). Il devient donc
indispensable d’identifier correctement les sous-types par une technique simple et
rapide. Actuellement, en dehors du séquençage de la région NS5B ou du Core/E1,
peu de techniques sont en mesure de le faire. La version 2 de la technique INNOLIPA ainsi que la technique de génotypage par RT-PCR en temps réel de Abbott
discriminent les sous-types 1a et 1b, mais ne sont pas capables de discriminer
d’autres sous-types tels que le 4a et le 4d (Bouchardeau, 2007; Ciotti, 2010). Notre
technique de génotypage du HCV sur puce ADN est actuellement la seule technique
d’hybridation sur puce en mesure d’identifier autant de sous-types différents. Les
techniques récemment développées pour déterminer le génotype sur puces à ADN
(Park, 2009; Mao, 2010) discriminent au maximum une dizaine de sous-types. La
technique de génotypage par séquençage automatisé (CLIPTM sequencing) de la
région core du HCV permettrait également d’identifier un grand nombre de soustype, avec un rendu de résultat par analyse automatique de la séquence (Martro,
2008). Notre technique ne permet pas de détecter des virus recombinants car une
seule région du génome est analysée mais elle présente l’avantage d’être évolutive,
puisque l’ajout de nouvelles sondes peut être réalisé, en fonction des sous-types
et/ou génotypes nouvellement identifiés.
Eradication ou persistance du HCV ?
La RVS, définie par un ARN HCV indétectable dans le sérum 24 semaines
après l’arrêt du traitement antiviral par pegIFNα et RBV, est l’objectif principal du
traitement. Des études montrant la persistance du HCV sous forme d’infection
occulte, malgré un ARN HCV constamment indétectable dans le plasma, remettent
en cause l’éradication du HCV. Les données actuellement disponibles sont
contradictoires avec des études en faveur d’une persistance du HCV sous la forme
d’une infection occulte (Castillo, 2004; Pham, 2004; Castillo, 2005; Radkowski,
2005a; Radkowski, 2005b; Carreno, 2006; Castillo, 2006) et d’autres en faveur d’une
éradication virale chez des patients suivis plusieurs années après l’élimination du
HCV (Wiegand, 2004; Bernardin, 2008; Maylin, 2008; George, 2009; Maylin, 2009).
La signification clinique d’une réplication virale HCV à bas bruit n’est pas
connue actuellement et s’il y en a une, un fort taux de rechute devrait être observé à
distance du traitement. Hors le taux de rechute (ARN HCV détectable 6 mois à 7 ans
113
après l’arrêt du traitement selon les études) est estimé à 3% chez les patients
immunocompétent et à 2% chez les patients immunodéprimés (transplantés
hépatiques ou rénaux ou coinfectés par HIV…) (Welker, 2009). Si l’infection HCV
occulte est fréquente, elle devrait être plus facilement mise en évidence chez des
patients immunodéprimés. Or, chez 26 patients transplantés rénaux, sous traitement
immunosuppresseur, l’ARN HCV recherché dans le plasma et dans les CMSPs par
une technique ultrasensible n’a pas mis en évidence la présence d’ARN HCV 59
mois après la transplantation et 10.5 ans après l’élimination du virus (publication
n°6). Les résultats de notre étude sont en faveur d’une élimination définitive du virus.
Pourtant, une infection HCV occulte a été observée chez 45% de patients
hémodialysés, avec des fonctions hépatiques anormales et ni Ac anti-HCV ni ARN
HCV détectables (Barril, 2008). Bien que ces résultats soient important pour la prise
en charge des patients hémodialysés, ils doivent être interprétés avec précaution
pour différentes raisons (Kamar, 2009). Premièrement dans cette étude, les enzymes
hépatiques des patients étaient anormales, ce qui est étonnant sachant que chez
des patients hémodialysés chroniquement infectés par HCV, les taux sériques des
transaminases sont le plus souvent dans les normes (Fabrizi, 1997; Espinosa, 2000).
Deuxièmement, les auteurs ont rapporté une forte proportion de décès (39%) sur un
suivi assez court (12-15 mois). La cause des décès n’était pas liée à une maladie
hépatique due au HCV. Ceci suggère la présence de pathologies à l’origine de
l’augmentation des enzymes hépatiques, autres qu’une infection HCV. Dans cette
étude, 7 patients hémodialysés ont reçu une greffe rénale. Chez les patients ARN
HCV (+), une augmentation significative de la charge virale HCV est observée après
la transplantation du fait de la perte du contrôle immunitaire de l‘infection HCV
causée par les traitements immunosuppresseurs (Gane, 1996; Pereira, 1997;
Rostaing, 2000; Kneteman 2001). Il est donc étonnant que l’ARN HCV ne soit pas
détecté chez ces 7 patients après transplantation rénale. Dans cette étude, les
traitements immunosuppresseurs n’ont pas été répertoriés. Dans la nôtre
(publication n°5), 50% des patients ont reçu des anticorps de lapin antithymocytes
ou des anticorps anti-CD3 (OKT3), et près de 80% des patients ont reçu de l’acide
mycophénolique. Ces molécules sont connues pour augmenter la charge virale HCV
plasmatique chez des patients chroniquement infectés (Rostaing, 2000; Nelson,
2001; Zekry, 2004) et malgré leur présence, aucun des patients testés n’a été ARN
HCV (+) dans le plasma ou les CMSPs. De plus, aucun patient n’a développé de
114
glomérulopathie ou de maladie hépatique au cours du suivi, appuyant ainsi l’absence
d’infection HCV occulte chez les patients testés. Seuls 3 patients ont développé un
diabète post-transplantation. Ces 3 patients avaient reçu un traitement par
tacrolimus. L’apparition de diabète post-transplantation chez des patients ARN HCV
positif est généralement plus fréquente.
D’autres études montrent des résultats en faveur de l’absence de l’existence
d’infection HCV occulte. Chez 344 patients immunocompétents traités avec succès,
et suivi 3,3 ans en médiane, la présence d’ARN HCV n’a été détectable ni dans le
plasma, ni dans les CMSPs des 156 patients testés et détectable dans seulement
2/114 PBH post-traitement testées (Maylin, 2008). Une amélioration ou une stabilité
de la fibrose a été observée chez 88% des patients et une régression de la cirrhose
chez 64%. Une autre étude a suivi pendant 5 ans, 150 patients en succès
thérapeutique après une bithérapie anti-HCV afin d’évaluer l’état du foie et une
possible rechute biochimique et/ou virologique (George, 2009). Parmi les patients qui
avaient eu une PBH avant et après traitement, 82% ont eu une amélioration du score
de fibrose. Seuls 3 patients ont eu une élévation de l’activité des enzymes
hépatiques, expliquée chez 2 d’entre eux par une nouvelle pathologie hépatique.
Aucune rechute virologique avérée n’a été observée. Neuf patients ont eu ARN HCV
détectable par technique de sensible de TMA (transcription mediated assay, limite de
détection à 5 UI/mL), sur un seul prélèvement, correspondant au dernier testé. Une
réinfection ne peut donc pas être exclue chez ces patients. La recherche d’ARN HCV
dans les CMSPs de 69 donneurs de sang Ac anti-HCV (+)/ARN HCV (-) (guéris
spontanément ou après traitement) a été négative chez les tous les patients
(Bernardin, 2008). La présence d’infection HCV occulte a été recherchée chez des
patients ayant une pathologie hépatique d’origine inconnue (Ac anti-HCV (-)/ARN
HCV (-)), une vascularite systémique associée au HCV (dont 13/21 Ac anti-HCV
(+)/ARN HCV (+)) ou une maladie du tissu conjonctif (dont 4/27 Ac anti-HCV (+)/ARN
HCV (+)) (Halfon, 2008). L’ARN HCV génomique a été détecté uniquement dans les
CMSPs des patients qui étaient virémiques mais chez aucun patient non virémique.
L’absence d’ARN HCV génomique détectable dans le plasma, les CMSPs et le foie,
montré par des techniques de PCR sensibles, que ce soit chez des patients
immunocompétents ou immunodéprimés est en faveur de l’absence d’hépatite C
occulte.
115
D’autres études, réalisées sur des petites cohortes de patients ont montré que
les CMSPs pouvaient être le site d’une infection HCV, après traitement efficace ou
une élimination spontanée apparente du HCV, chez 50% des patients (Pham, 2004;
Radkowski, 2005a; Castillo, 2006 ; Gallegos-Orozco, 2008; MacParland, 2009). Les
discordances entre ces 2 écoles, élimination définitive ou persistance du HCV,
peuvent être liées aux critères utilisés pour définir la RVS. En effet, dans les études
en faveur de la persistance du HCV, l’indétectabilité de l’ARN HCV a été déterminée
par des techniques ayant des limites de détection variant de 50 à 600 UI/mL. Les
études qui montrent une éradication définitive du HCV, définissent la RVS grâce à
des techniques de quantification de l’ARN HCV sensibles avec une limite de
détection variant de 5 à 15 UI/mL. Sachant que 58% des patients avec une infection
HCV occulte ont un ARN détectable dans le plasma avec en moyenne, une charge
virale de 71 ARN HCV copies/mL (bornes : 18-192) (Bartolome, 2007), ces charges
virales auraient probablement été détectées si des techniques de RT-PCR sensibles
telles que le CAP/CTM ou le TMA avaient été utilisées dans cette étude. Chez des
patients toxicomanes par voie intraveineuse qui ont éliminé spontanément une
première infection par le HCV, le taux de réinfection est de 50% (Osburn, 2010). Les
individus peuvent être à nouveau contaminés par un même génotype et/ou sous-type
ou un génotype différent. Cette étude a montré que la charge virale observée lors
d’une réinfection était inférieure d’environ 3 log à la charge virale observée lors de la
première infection et que la durée de la virémie était également 4 fois plus courte.
Les faibles charges virales, observées de manière épisodique dans les études
décrivant des hépatites C occultes, pourraient donc s’expliquer par des réinfections
par HCV contrôlées par le système immunitaire.
De nombreux arguments rendent la persistance du HCV peu vraisemblable.
Le virus HCV est un virus à ARN, qui n’a pas de phase de latence au cours de son
cycle de réplication virale et dont le génome ne peut pas persister sous la forme d’un
ADN, contrairement à d’autres virus comme le HIV, le HBV, ou les herpès virus. Le
suivi sur le long terme de patients ayant éliminé le HCV après un traitement montre
que les rechutes 6 mois après l’arrêt du traitement sont rares (McHutchison, 2002;
Wiegand, 2004; Formann, 2006; Bernardin, 2008; Maylin, 2008). Seuls quelques cas
de récurrence chez des patients sous traitement immunosuppresseur ont été
rapportés. Un patient a été réinfecté par le même génotype après une chimiothérapie
116
pour un lymphome (Thomopoulos, 2008). Une réémergence du HCV a également
été rapportée chez un patient qui a reçu un court traitement par prednisone, 7 mois
après la fin du traitement anti-HCV et chez un autre patient qui a eu une
transplantation rénale, 7 mois après la fin du traitement (Lin, 2008). Ces patients ont
été réinfectés par le même génotype, mais dans ces études, les analyses
phylogénétiques, quand elles ont été réalisées, l’ont été sur des régions très
conservées, ne permettant pas de discriminer des virus proches. L’analyse de la
région HVR1 est indispensable pour savoir si le virus présent avant et après
traitement est le même (Izopet, 2005). Une étude récente, dans laquelle 3 rechutes
ont été observées entre la 24ème et la 48ème semaine d’arrêt de traitement, est la
seule à avoir étudié les souches avant et après traitement, par analyse
phylogénétique d’un fragment de la région E1/E2 (Medrano, 2009). Chez 2 patients,
les distances génétiques étaient significativement différentes bien que des souches
de même sous-type 1b aient été identifiées. Le 3ème patient, infecté par un génotype
3a, avait des souches virales avant et après traitement phylogénétiquement proches,
faisant suspecter une rechute. Cependant les proches de ce patient étant des
anciens toxicomanes, une nouvelle contamination par la même souche virale 3a
épidémiologiquement liée semble être l’explication la plus plausible. Les rechutes ou
réémergences observées dans les différentes études seraient donc plutôt dues à des
réinfections par des souches différentes ou semblables, ce qui est cohérent avec les
modes de contamination le plus souvent observés chez ces patients : la toxicomanie
ou un mode de contamination inconnu.
Les résultats obtenus chez des patients immunodéprimés (publication n°6) et
l’ensemble de ces données sont en faveur de l’absence d’hépatite C occulte chez
des patients guéris d’une hépatite C aiguë ou chronique. En effet, l’absence d’ARN
HCV dans le plasma et les CMSP de patients suivis plusieurs années après
l’éradication virale et l’absence d’évolution de la fibrose du foie sont en faveur de
l’éradication virale.
117
En conclusion, notre travail a permis de mettre en évidence la grande
variabilité génétique des virus de génotypes 2 et 4, et la transmission par
toxicomanie des génotypes 4a, 4d et 2a dans notre région. Ces études ont contribué
à la mise au point d’une nouvelle méthode de génotypage du HCV sur puce à ADN,
qui permet une identification précise de différents sous-types du HCV. L’identification
du sous-type devient essentielle puisque chez les patients infectés par un virus de
génotype 1 notamment, il pourrait être un facteur déterminant les modalités de prise
en charge thérapeutique. En effet, nous avons mis en évidence une moins bonne
sensibilité du sous-type 1a à la bithérapie anti-HCV, et les données disponibles sur
les inhibiteurs de protéase et de polymérase montrent que ces molécules seraient
moins efficaces sur les virus de sous-type 1a. Des différences de réponse au
traitement pourraient également être observées pour d’autres sous-types. Ce point
nécessite de réaliser de nouvelles études sur un nombre suffisant de patients. Nous
avons pu objectiver que les concentrations plasmatiques de RBV avaient également
un rôle dans la réponse au traitement, chez les patients difficiles à traiter. Le seuil
minimal à atteindre et le stade permettant une adaptation de posologie doivent être
validés dans des études cliniques. Enfin, actuellement il y a très peu d’argument en
faveur d’une infection HCV occulte et la signification clinique de ce type d’infection
reste à définir. Des études de suivis long terme de patients ayant guéris
spontanément ou après traitement, avec des analyses phylogénétiques permettant
de discriminer les quasi-espèces virales (région HVR1) avant et après traitement, et
des suivis de patients plus rapprochés, sont nécessaires pour répondre
définitivement à cette question.
118
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154
TITLE
Genetic variability of hepatitis C virus and viral persistence
ABSTRACT
Identification of new factors influencing viral response and HCV persistence is needed.
Genetic diversity of HCV genotype 2 and 4 strains in Midi-Pyrénées areas was studied and
revealed 8 and 12 subtypes, respectively. Intravenous drug use was the major route of
infection for HCV subtypes 4a, 4d and 2a. A microarray-based molecular approach was
developed for identification of HCV genotype and subtype. The impact of HCV variability and
pharmacological parameters on the virological response was evaluated and showed that
ribavirin concentrations and HCV subtype influence the virological response to pegylated
interferon and ribavirin. Indeed, patients infected with HCV subtype 1b have a better chance
of achieving sustained virological response than those infected with 1a. Finally, we have
shown absence of HCV persistence in formerly HCV-infected immunocompromised patients
suggesting the complete eradication of HCV.
AUTEUR : Florence NICOT
TITRE : Variabilité génétique du virus de l’hépatite C et persistance virale
DIRECTEUR DE THESE : Pr Jacques IZOPET et Pr Christophe PASQUIER
LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : Toulouse, le 13/07/2010
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RESUME en français :
Les facteurs influençant la réponse virologique au traitement et la persistance du HCV
nécessitent d’être mieux caractérisés. La diversité génétique des souches de génotype 2 et
4 dans la région Midi-Pyrénées a été étudiée et montre la présence de 8 et 12 sous-types
différents. La toxicomanie était le principal mode de diffusion des souches de sous-type 4a,
4d et 2a. Une nouvelle technique de génotypage du HCV par analyse de la région NS5B sur
biopuce a été mise au point. L’étude de l’impact des facteurs viraux et pharmacologiques sur
la réponse virologique a montré que les concentrations de ribavirine et le sous-type viral
influençaient la réponse au traitement par interféron pégylé et ribavirine. Les patients
infectés par un sous-type 1b avaient un taux de réponse plus élevé que ceux infectés par un
1a. Enfin, nous avons montré l’absence de persistance du génome HCV chez des patients
immunodéprimés, anciennement infectés par le HCV suggérant une réelle éradication du
HCV.
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TITRE et résumé en anglais au recto de la dernière page
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MOTS-CLES :
Virus de l’hépatite C, variabilité, génotype 2, génotype 4, ribavirine, sous-type, infection
occulte
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DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Immunologie
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INTITULE ET ADRESSE DE L'U.F.R. OU DU LABORATOIRE :
Laboratoire de Virologie, Inserm U563, Centre Hospitalier de Toulouse Purpan