corrigé

Question 1 (temps conseillé 1 heure)
Chez les eucaryotes, les gènes des ARNt son présents en de nombreuses copies dispersées
dans le génome. Exposez précisément les différentes étapes qui vont conduire à partir de la
transcription d'un tel gène à la synthèse d'un ARNt chargé fonctionnel pour la traduction.
Réponse :
Chez les eucaryotes les gènes codant les ARNt sont monocistroniques (ou bien chaque gène
possède son propre promoteur). Leur transcription est réalisée par l'ARN polymérase III (ou
bien se sont des gènes de classe III). Ces gènes se caractérisent par un promoteur interne (par
rapport au site d'initiation de la transcription) = deux sites de reconnaissance (sites A et B)
présents dans la région transcrite du gène. Le recrutement de l'ARN polIII nécessite des
facteurs particuliers. Il y a tout d'abord reconnaissance des sites internes A et B par TFIIIc
qui joue le rôle de facteur d'assemblage. Il y a ensuite recrutement de TFIIIB (complexe
protéique contenant entre autre la TBP) = facteur de positionnement qui va recruter et
positionner correctement l'ARN polIII.
Le transcrit primaire qui est produit n'est pas fonctionnel et va subir un ensemble de
modifications regroupées sous le nom de maturation. L'extrémité 5' de l'ARNt va être définie
par une coupure du transcrit primaire par l'endoribonucléase P tandis que l'extrémité 3'
va être produite suite à l'intervention de plusieurs ribonucléases dont la Rnase Z. La séquence
CCA est ensuite ajoutée à l'extrémité 3' de l'ARN par l'ARNt nucléotidyl transférase.
(C'est au niveau de l'adenosine de cette séquence CCA que sera chargé ultérieurement l'acide
aminé). Certains gènes codant pour des ARNt possèdent un intron de petite taille. Cet intron
est éliminé par un processus d'épissage qui consiste en un clivage enzymatique de l'intron
suivi d'une ligature des deux extrémités de l'ARNt par une ARN ligase (le processus est donc
différent de celui décrit pour les ARN pré-messager qui est basé sur deux réactions
successives de transéstérifications).
En plus de cette maturation par clivage l'ARNt va subir des modifications covalentes de
certains nucléotides. Ces modifications sont catalysés par des enzymes spécifiques qui
modifient ou additionnent des résidus aux bases présentes dans l'ARNt. Parmi les
modifications les plus fréquentes on peut donner :
l'isomérisation de l'uridine en pseudouridine : l'uracile est liée au sucre par le
carbone C5 au lieu de l'azote N1.
la réduction de l'uridine en dihydrouridine : il y a perte de la double liaison
présente entre le C5 et le C6 de l'uracile.
la désamination de l'adenine en hypoxanthine (ou adenosine en inosine) :
remplacement du groupement NH2 présent en C6 de l'adénine par un groupement céto.
Parallèlement à ces modifications chimiques l'ARNt va adopter une structure secondaire dite
en feuille de trèfle et une structure III dite en L renversé. La structure secondaire en feuille de
trèfle comporte quatre structures caractéristiques :
- la tige acceptrice qui est formée par l'association de l'extrémité 5' et 3' de l'ARNt. La
séquence CCA présente à l'extrémité 3' de l'ARNt dépasse de cette tige.
- la boucle pseudouridine qui se caractérise par la présence de pseudouridine.
- la boucle D qui se carectérise par la présence de dihydrouridine.
- la boucle anticodon qui contient l'anticodon élément composé de trois nucléotides
complémentaire du codon présent sur l'ARNm.
Lorsque l'ARNt a adopté la structure en L inversé on retrouve à une extrémité le site de
fixation de l'acide aminé et à l'autre extrémité l'anticodon.
Pour pouvoir être utilisé lors de la traduction l'ARNt doit être chargé avec un acide aminé. Le
chargement d'un acide aminé consiste à l'établissement d'une liaison acyl entre le groupement
COOH de l'acide aminé et la fonction 2' ou 3' de l'adénosine à l'extrémité 3' de la tige
acceptrice. L'attachement de l'acide aminé à l'ARNt est catalysé par une aminoacyl ARNt
synthétase qui reconnaît à la fois l'acide aminé et l'ARNt. Il existe une enzyme pour chaque
acide aminé (donc 20 aminoacyl ARNt synthétase différentes). La reconnaissance de l'ARNt
se fait essentiellement au niveau de la boucle anticodon et de la tige acceptrice. La sélection
du bon acide aminé repose dans un premier temps sur une reconnaissance stérique et
chimique de l'acide aminé par le site catalytique. Il existe un mécanisme de correction de la
sélection du bon acide aminé qui est basé sur la vérification du produit d'adenylylation par un
site catalytique spécifique appelée poche d'édition. Si l'AA-AMP peut entrer dans la poche
d'édition celui ci-est hydrolysé et la réaction s'arrête (par contre si c'est le bon AA qui a été
sélectionné l'AA-AMP ne peut pas entrer dans la poche d'édition et la réaction continue)
L'attachement de l'acide aminé à l'ARNt se fait en deux étapes :
- Dans une première étape la fonction COOH de l'acide aminé réagit avec le phosphate
alpha de l'ATP pour donner un amino acyl AMP (acide aminé adénylé) Cette étape
est appelée l'adénylylation.
AA + ATP --> AA-AMP + PPi
- Dans une deuxième étape l'acide aminé adénylé réagit avec la fonction 3' OH de
l'adénosine à l'extrémité 3' de l'ARNt pour donner un aminoacylARNt et de l'AMP.
AA-AMP + ARNt --> AA-ARNt + AMP
Question 2 (temps conseillé 1 heure)
La protéine alpha est codée par un gène qui ne contient pas d’intron. Ce gène semble
impliqué dans des déficiences immunitaires héréditaires. Pour déterminer l’origine de ces
déficiences, des échantillons sanguins d’individus malades et sains sont examinés pour y
détecter le gène alpha et son niveau d’expression.
La figure 1A représente un Southern-blot obtenu en digérant l’ADN génomique par l’enzyme
SnaBI (site = 5’-TACGTA-3’), puis en hybridant l’ADN transféré par une sonde
radiomarquée spécifique du gène alpha (= ADN complémentaire de alpha). Les individus 1 et
2 sont normaux d’un point de vue immunitaire ; les individus 3, 4 et 5 présentent des
déficiences immunitaires.
Question 1 : D’après la figure 1A, pouvez-vous dire quels sont les individus homozygotes
pour le gène alpha ?
Réponse : Les individus 1, 3, 4 & 5 sont homozygotes (et donc l’individu 2 est
hétérozygote)
La figure 1B représente un Northern-blot et la figure 1C correspond à un Western-blot. Les
bandes détectées sont spécifiques au gène alpha.
Question 2 : Quelle molécule est détectée dans un Northern, et dans un Western ?
Comment dans ces techniques, peut-on spécifiquement reconnaitre le produit d’un gène
particulier ?
Réponse : Northern => détection des ARN. Nécessite une sonde d’acides nucléiques
pouvant s’hybrider (séquences complémentaires) avec l’ARNm.
Western => détection des protéines. Nécessite un anticorps spécifique de la protéine
cible.
Question 3 : A votre avis, quelles sont les causes des déficiences immunitaires des individus
4 et 5 ? (le cas de l’individu 3 sera traité ultérieurement dans la question 6)
Décrivez le type de mutation génétique qui pourrait expliquer les profils obtenus dans la
figure 1.
Réponse : Les échantillons des individus 4 & 5 présentent un profil de Southern et de
Northern strictement identique à celui de l’individu 1 qui est sain. Par contre, des
différences sont visibles au niveau du Western, ce qui laisse présager que les protéines
synthétisées ne sont pas de type sauvage => sans doute synthèse de protéines mutantes
non fonctionnelles.
Type de mutation envisagé : La première phrase de l’énoncé permet d’exclure les cas
d’épissage alternatif. Comme les profils de Southern et de Northern sont identiques, ont
peut également écarter les hypothèses de grandes délétions, insertion, translocation.
Reste les cas de mutations ponctuelles ou de micro-délétion/-insertion qui modifie le
cadre de lecture.
Individu 4 = protéine plus grande, c’est sans doute une mutation qui supprime le codon
stop => traduction continue jusqu’au prochain => extension C-terminale
Individu 5 = protéine plus petite, c’est sans doute une mutation qui créé un nouveau
codon stop => traduction s’arrête prématurément => protéine plus courte coté Cterminal.
L’hypothèse d’une insertion ou d’une délétion de quelques nucléotides qui décale le
cadre de lecture (=> codons stop fréquents si on est hors cadre de lecture ouvert), est
naturellement acceptée
Un fragment d’ADN génomique de 4,5 Kb, contenant l’intégralité du gène alpha est cloné et
inséré dans le site EcoR I du plasmide pX (figure 2A). Le clonage a été réalisé pour le gène
alpha des individus 1 et 3. Afin d’expliquer les résultats du Southern, le plasmide recombinant
est digéré par plusieurs enzymes de restriction. Le résultat de ces diverses digestions est
présenté dans le tableau de la figure 2B.
Question 4 : Etablissez la carte de restriction du gène alpha de l’individu 1 et celle du gène
alpha de l’individu 3.
En quoi ces résultats peuvent expliquer les résultats du Southern de la figure 1A ?
Réponse :
Carte de restriction de l’individu 1 (pour l’individu 3, la carte est strictement identique
à l’exception du site SnaB I qui est absent.
L’absence du site SnaB I dans le gène X de l’individu 3 explique la différence au niveau
des Southern car c’est cette enzyme qui a été utilisée pour digérer l’ADN génomique.
L’absence de ce site implique que l’enzyme n’a pas pu couper à ce niveau mais qu’elle a
dû couper plus loin au niveau du site suivant, générant ainsi un plus grand fragment.
Le plus petit fragment EcoR I – Hind III du gène alpha est sous-cloné et séquencé par la
méthode des didésoxynucléotides. Une partie de l’autoradiogramme du gel de séquençage est
présenté sur la figure 3.
Question 5 : Déduisez la séquence nucléotidique du gène alpha des individus 1 et 3 (chaîne
nucléotidique d’ADN synthétisée à partir de l’amorce).
Orientez correctement ces séquences en marquez les extrémités 5’ et 3’.
Indiquez également de quel coté se trouve l’amorce qui a servit au séquençage.
Réponse :
Individu 1 = 5’-amorce-TGCTTACGTATAAAGTACAT-3’
Individu 3 = 5’-amorce-TGCTTACGTGTACAT-3’
La localisation du site d’initiation de la transcription du gène alpha, a permit de déterminer
que la mutation observée pour l’individu 3 se situe à 30 paires de bases en amont (coté 5’) de
ce site.
Question 6 : Quel modèle pouvez-vous proposer pour expliquer les conséquences de cette
mutation ?
Ce modèle devra prendre en compte les résultats obtenus dans la figure 1 pour les individus
2 et 3.
Réponse : La mutation observée pour l’individu 3 se situe à 30 paires de bases en amont
du site d’initiation, elle est donc située au niveau du promoteur du gène X.
On a : individu 1 = TGCTTACGTATAAAGTACAT
individu 3 = TGCTTACGT-----GTACAT
Pour l’individu 1, le site SnaB I est souligné et la TATA-box est en rouge. Pour
l’individu 3, une micro-délétion à supprimer le site SnaB I ainsi que la TATA-box.
L’individu 3 a donc un promoteur qui ne possède plus de TATA-box fonctionnelle. De ce
fait il ne peut plus être reconnu par le TFIID (ou TBP), bloquant ainsi la première étape
de la reconnaissance du promoteur par l’ARN polymérase II. On n’a aucune
transcription au niveau de ce gène => visible sur le Northern de la figure 1B, où aucun
ARNm n’est détecté.
L’individu 2 est hétérozygote. Un allèle est normal et l’autre est porteur de la délétion
supprimant la TATA-box. Donc seul un allèle sur les 2 permet une expression génétique
normale. Ce qui explique pourquoi les intensités des bandes sont plus faibles en
Northern et en Western (on a 2 fois moins d’ARNm et de protéines que pour un individu
sain homozygote). Néanmoins, cette plus faible production de protéine (fonctionnelle) est
suffisante pour donner un phénotype sain.