Innovations technologiques en microbiologie
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39e Colloque National des Biologistes des Hôpitaux L’infection par VIH : 25 ans de diagnostic et d'innovations technologiques en microbiologie CHU Saint Louis Paris Pr François Simon Faculté de Médecine Paris- Diderot Hôpital Saint Louis Paris 10 CONFLITS D’INTERET 2008-2010 FRANÇOIS SIMON & VIROLOGIE ST LOUIS, PARIS • Honoraires : – Abbott, bioMérieux, MSD • Aides au laboratoire , bourses – dons –Abbott, Argène, bioMérieux, Biorad, Fondation Mérieux, Gilead, GSK, MSD, Pfizer • Trousses gratuites et prix préferentiels - Abbott, Orasure, Pathofinder • MAD d’automates aux titres de la recherche •- Abbott, bioMérieux • Academic supports : –Paris- Diderot , AP-HP, ANRS, Sidaction, SFLS, Fondation pour la recherche, InVs, AFSSAPS VIH /SIDA :LA PLUS IMPORTANTE ÉMERGENCE MICROBIOLOGIQUE DU XXÈME SIÈCLE 5 homosexuels masculins traités pour une pneumocystose dans différents hôpitaux de L. A. • Reports d’un cas de SIDA post transfusionnel en Californie • Enfant de 20 mois avec une • immunodéficience cellulaire profonde et infections opportunistes • Survenue après des TS massives à la naissance • Dont une poche prélevée chez un patient qui devait développer ultérieurement un SIDA MMWR Weekly, December 10, 1982 / 31(48);652-4 Centers for Disease Control and Prevention UNE DÉFINITION ÉPIDÉMIOLOGIQUE POUR UNE ORIGINE RÉTROVIRALE : 1982 -1983 – identification des groupes à risque • Homosexuels • Haitiens 3H • Hemophiles • Contamination sanguine - Toxicomanes Mai 1983 , Montagnier et al., Science – Isolement d’un rétrovirus, Lympho-Adenopathy Virus (LAV) May 1984 Gallo et al., Science – Detection, isolation, and continuous production of Human T-cell Lymphotropic Virus-III (HTLV-III) Il existe des anticorps dirigés contre ce rétrovirus dans le sang des patients !! Un test de dépistage est possible 1984 : VERS UN PREMIER TEST DE DÉPISTAGE DES ANTICORPSANTI VIH : ABBOTT HTLV III EIA • • Juin 1984: Abbott reçoit le virus du NCI Juin - Octobre 1984: – – • production du virus en culture jusqu’à 15,000 litres configuration d’un test EIA indirect Utilisant du lysat viral comme antigène coatés sur des billes d polystyrèneViral IgG anti-humaine conjugée à HRPO Octobre/Novembre 1984 – Dépistade de >20,000 donneurs de sans aux USA infectés par VIH (Barrett JE et al Am J Clin Path 1986;86:180-185) 0.14% IMPACT DU DÉPISTAGE DES DDS SF : HIV Infection Risk per Deferral of risk groups After HIV test introduced Risk Blood Donation 1:91 Donation 1:455 1:40,000 1:10,000 0 1981 1983 1984 After March 1985 Adapted from Busch MP, et al Transfusion 1991;31:4-11 L’AFRIQUE ET LE SIDA Les reports de cas en Europe du Nord concernent essentiellement des homosexuels En France et Belgique , plusieurs cas sont rencontrés aussi chez des patients originaires d’Afrique centrale SIDA & H capsulatum SIDA ET AFRIQUE 1985 L’ Afrique 1995 2007 15% de la population mondiale 88% des patients infectés par le VIH 92% des décès liés au SIDA en 2007 PERSPECTIVES ÉPIDÉMIOLOGIQUES : L’HISTOIRE • Premiers cas de SIDA en Ouganda et Tanzanie en 1978–79 (fin de la guerre) • RDC – ex Zaire en 1959, puis de façon épidémique dès le début des années 80 • Caractérisés par l’extrême diversité des souches rétrovirales SIVcpz HIV-1 groupes N & M SIVgor HIV- 1 groupes O & P STLV PTLV HYPOTHÈSES SUR L’ÉMERGENCE ÉPIDÉMIQUE DU VIH-1 EN AFRIQUE CENTRALE 1959 HIV-1 DIVERSITÉ DES VIH EN 2010 : Afrique et France P HIVHIV-1 HIV HIV--2 A O HIVHIV-1N HIVHIV-1M A K J (I) B H C D CRF01CRF01-AE* (E) F virus mosaïques G En France en 2009 : A B C D E H G F Plus de 45 formes recombinantes ou CRFs 50% d’infection par des sous types B 48% par non B , 2% par HIV-2, HIV-O LE DÉPISTAGE EN 2010 “Testing is the essential entry point to timely treatment” Kevin DeCock, HIV/AIDS Director, WHO1 1 Shetty P. Kevin DeCock: guiding HIV/AIDS policy at WHO The Lancet Infectious Diseases 2008: 8(2): 98-100 Vers une nouvelle stratégie : “Test and Treat” ? LES GÉNÉRATION DE TESTS EIAS DES ANTICORPS ANTI VIH -1 ET VIH-2 - : Antigène et format 1er génération 2eme génération 3eme génération Lysat viral (et confirmation par Western blot) protéines recombinantes, peptides de synthèse EIA Ac « sandwich » Ig G /Ig M sandwich EIA HIV-1/HIV2/HIVO 4eme génération Tests combinés Ag p24 +Ac anti-VIH Amélioration progressive des performances en séroconversion , pour les variants et en spécificité DIAGNOSTIQUE SÉROLOGIQUE DE L’INFECTION VIH 3rd Gen HIV Ab EIA 1st Gen HIV Ab EIA p24 Ag EIA Anti-HIV Anticorps ARN HIV (plasma) HIV p24 Ag 0 10 20 30 13 18 40 32 50 60 70 80 90 100 Day Fenêtre 3 jours EIA de 4th génération D’après Fiebig et al AIDS, 17:1871-1879 (2003) FERMETURE DE LA FENÊTRE DE SÉROCONVERSION EIA Fenêtre en semaines 1st generation EIA ~6 2nd generation EIA ~4-6 3rd generation EIA ~3-4 4th generation EIA ~2 PCR <1-2 Stekler J. et al., CID 2007; 44:459 TESTS DE 4e GÉNÉRATION ET VARIANTS VIH Figure 1 : Logarithmic representation of tested samples Architect Axsym Vidas Reactivity index (Log) 1000 100 10 1 HIV- 1 HIV-1 Gpe 1 Group M HIV-2 HIV-2 red mark : HIV-1 group O. Thresold positivity = 1 (Vidas DUO Quick included) HIV-1 HIV-1 + 2 Diversitygroup panel P HIV-1 HIV-1 gpe O group O UNE FORTE INCIDENCE VIH-1 EN FRANCE 30% 30% 15% 15% 0% 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Année de diagnostic * Personnes infectées en moyenne depuis moins de 6 mois avant le diagnostic CNR du VIH et InVS, données du 30/09/2009 brutes (non corrigées pour la sous-déclaration ni pour les délais) Proportion de sous types non-B parmi les découvertes de séropositivité VIH-1 France, 2003 - sept. 2009 50% 40% 30% 20% 10% 0% 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 3 tr Année de diagnostic 2 à 3 % des infections sont des infections par HIV-2 et rares HIV-0 CNR du VIH et InVS, données du 30/09/2009 brutes (non corrigées pour la sous-déclaration ni pour les délais) 19 MODIFICATION DES RECOMMANDATIONS DU DÉPISTAGE VIH EN FRANCE JUIN 2010 L’incidence et la diversité VIH en France ont conduit les autorités a modifier la stratégie du dépistage - Le dépistage se fait isolément sur le sérum ou le plasma de chaque individu avec un EIA marquée CE et à lecture objective de détection combinée des anticorps anti-VIH 1 et 2 et de l’ag p24 au seuil de 2 UI / mL - confirmation par western blot ou immunoblot à l’initiative du biologiste médical sur le même échantillon sanguin permettant de différencier une infection à VIH 1 ou à VIH 2 - Si confirmation négative ou douteuse : détection de l’antigène p24 du VIH 1 avec un réactif CE ( seuil 2 UI/mL) et neutralisation si + - Lorsqu’il en a la possibilité, le biologiste médical peut réaliser à la place de cette détection, une recherche d’ARN viral plasmatique du VIH 1. MODIFICATION DES RECOMMANDATIONS DU DÉPISTAGE VIH EN FRANCE JUIN 2010 • le prescripteur ou le biologiste médical communique le résultat au patient au cours d’un entretien individuel et organise sa prise en charge médicale rapide • Tout test rapide d’orientation diagnostique est obligatoirement validé, que la recherche soit négative ou positive, par un diagnostic biologique de l’infection à VIH 1 et 2 • consentement libre et éclairé du patient recueilli par le prescripteur DISPOSITIONS OBLIGATOIRES A COMPTER DU 01 10 10 Arrêté du 28 mai 2010 fixant les conditions de réalisation du diagnostic biologique de l’infection à virus de l’immunodéficience humaine (VIH 1 et 2) et les conditions de réalisation du test rapide d’orientation diagnostique dans les situations d’urgence LIMITE DE DÉTECTION DE L’AG P24 DES TESTS ELISA VIH COMBINÉS Tests combiné EIA 4th génération Standard Afssaps (pg VIH/ml) Abbott Murex HIV Combo 29 Abbott Axsym HIV1/2 Combo 21 Abbott Architect HIV1/2 Combo 18 20,5 BioMérieux Vidas HIV DUO Quick 13 BioMérieux Vidas HIV DUO Ultra 11,5 14,5 0,71 BioMérieux VIDIA HIV Duo 15,74 0,5 Bio Rad Genscreen HIV Ag/Ab Ultra 13 11,1 0,85 Adaltis Detect HIV v.4 19,5 Siemens Enzygnost HIV Integral II 14,3 Siemens ADVIA Centaur Ag/Ab Combo Roche Modular HIV combi or Elecsys Ly : J.Virol Methods 2007 Laperche : Colloque de Virologie de Versailles 2006 Lemee : Abstract ECCMID 2009 Laperche et Ly : JIB 2009 Standard WHO UI/ml 0,97 0,84 1,15 126,5 112 5,61 LA CHARGE VIRALE PAR PCR EN TEMPS RÉEL : DIAGNOSTIC ET SUIVI AIDS in the 5 years following primary infection Clinical prognosis 1st phase (T1/2 : 1 day) 2nd phase (T1/2 : 14 days) VL Residual replication Seuil de détection reservoir Eradication ??? HAART Initiation HAARTMonitoring FIABILITE DES CHARGES VIRALES • - GRANDE DIVERSITE GENOMIQUE DES VIH • - TESTS SUR LA BASE DES SOUS TYPES B • - AMORCES ET SONDES VARIENT D’UN TEST A L’AUTRE • - SENSIBILITES DIFFERENTES Prudence avec la diversité : mauvaise (ou non reconnaissance) du génome, nouveaux variants.. JCM 2009 2009 : UN NOUVEAU RECOMBINANT HIV INTERGROUPES EN FRANCE • • • • • • Mai 2008, 25 ans, originaire du Cameroun Hospitalisée à Reims , SIDA, 6 CD4 cells/mm3 Cobas TaqMan v1.0 = négatif RealTime HIV-1 = 4.8 log Donc HIV-O suspecté La séquence indique un nouveau variant recombinant entre HIV-1 groupe Major & HIV-1 groupe O A Vessière AIDS 2010 2009 : UN NOUVEL HIV DERIVANT DU SIV GORILLE • • • • • • 62 ans, originaire du Cameroun Suivie en France depuis 2004 Asymptomatique avec 350 CD4/mL Monitor 1.5 et TaqMan Roche V1.0 : négatives RealTime HIV1 Abbott = 4.4 à 5.3 log copies/mL HIV-1 group O suspecté La séquence indique un nouvel HIV proche des SIV caractérisés chez les gorilles HIV-1 group P Plantier JC et al. Nature Med. 2009;15:871-872. VIH : 25 ANS DE DIAGNOSTIC ET DE SUIVI • Des tests de dépistage de hautes performances • Un encadrement réglementaire qui évolue • Un suivi biologique à la hauteur des nouveaux traitements : sensibilité de la PCR temps réel • Attention à la diversité des souches et au choix des trousses EIA (un seul test) et de CV (sous types non B) Exiger une cohérence parfaite entre statuts cliniques, EIAs, Charges virales et CD4s… Les progrès technologiques avec l’épidémie du VIH et les risques émergents : Vers un nouvel âge pour le diagnostic et le suivi en microbiologie IDENTIFICATION DES PATHOGÈNES EN MICROBIOLOGIE 2010-2015 • Basées sur l’amplification génomique et de nouveaux systèmes de révélations des PCR – Différentes technologies de l’ADN : Luminex, Multiplex, spectrométrie de masse, puces séquençage haut débit • ou sur l’identification des protéines par spectrométrie de masse DIVERSITÉ DES PATHOGÈNES Bacteria Viruses Viruses Fungi NOUVELLES STRATÉGIES D’IDENTIFICATION Echantillons cliniques PCR , random PCR Luminex MultiFinder Spectrométrie de Mase Tag Mass 6 hrs Spectrométrie Type Plex ID 6-8 H (+) Puces AND 14 hrs (+) Pyro séquence Luminex • Analyseur fluorométrique de microbilles (5,6 microns) • Microsphères fluorescentes après excitation par 2 lasers – 1er laser excite le mélange de colorants à l'intérieur des microbilles – 2nd laser excite le fluorophore rapporteur en surface des microbilles • On peut fixer sur ces microbilles – des anticorps – des peptides – des oligonucléotides • Panel = 100 billes - ratio variable de fluorescence rouge et orange Microsphères 1 microsphère = 1 couleur = 1 test Jusqu’à 100 couleurs de microsphères différentes peuvent être combinées dans un même panel Immuno Assay 5,6 µ Développement de tests en coatant sur chaque microsphère de polystyrène de chaque couleur l’antigène ou l’anticorps approprié Identification : le laser rouge identifie la couleur de la bille = l’antigène ou l’anticorps correspondant Quantification : Le laser vert quantifie la fluorescence présente sur la surface des microsphères Multiplex type Finder: le principe Virus 1 Virus 2 Virus 3 probes MultiFinder reaction virus 1 virus 2 virus 3 virus 1 + 3 EVALUATION EN RÉANIMATION MÉDICALE • Patients immunodéprimés, CHU St LOUIS de Paris • Pneumopathie • 2008 • 98 échantillons / 91 patients IF + PCR tps réel Multiplex Nombre de patients ≥ 1 infection virale 23 (31%) 39 (53%) Infections virales multiples 3 8 (11%) (4%) Stratégie d’identification d’une virose émergente sur PUCES Echantillons PUCES Approche multiplexe et différentielle des maladies infectieuses surveillance virale Pathogènes respiratoires Recherche nouveaux virus surveillance “Panmicrobienne” “WHO Outbreak Surveillance “ Diagnostic Differentiel des fièvres hémorragiques PRINCIPE DES PUCES ADN de l’échantillon Hybridisation des produits sur lame de révélation coatées Avec les séquences cibles Random PCR Hybridationdu fluorophore PCR secondaire pour incorporer un tag Interprétation (!) EXEMPLES D’APPLICATION DU SYSTÈME GREENECHIP ANGOLA 2006 MARBURG ET PALUDISME Virus de Marburg P falciparum ANALYSE DU VIRUS DANDENONG POST TRANSPLANTATION 63 ans , Rein PCR: + plasma, CSF, urine, coeur, rate, cerveau Ac: neg 44 ans , Rein PCR: + sérum Ac: neg 64 ans , Foie PCR: + plasma, sérum, CSF, LBA AB: 1:40 IgG, 1:20 IgM 2.5 semaines après transplant Donneur PCR: négatives dans le sérum, la rate et le pancréas AB: 1:80 IgG, 1:20 IgM STAPHYLOCOQUES BACILLES VIRUS VIRUS BACTERIES CHAMPIGNONS POURQUOI LE PLEX-ID ? •COMMENT SAVOIR CE QUI EST PRÉSENT DANS L’ÉCHANTILLON •ORGANISMES PARFOIS NON CULTIVABLES •DÉTECTION DES MUTANTS OU RECOMBINANTS •DETECTION DE MULTIPLES PATHOGÈNES (ET FAMILLE) EN MÊME TEMPS •DÉTECTION DE RESISTANCE AUX TRAITEMENTS COMBINAISON DE DIFFÉRENTES TECHNIQUES PCR Universal primers Large spectre de détection sensibilité Spectrométrie de masse PLEXID automatisé, rapide précision PRINCIPE DU PLEX ID Mesure de la composition en bases des Amplicons par Spectrométrie de Masse I NA extraction II PCRPCR III IV ESI-TOF MS Composition en bases V Identification AVANTAGES PLEX-ID • Identification large de microorganismes – Bacteries, Virus, Champignons, Protozoaires • Plus de culture • 300 échantillons par jour – premiers résultats en 6-8 heures • • • • Mélanges complexes Nouveaux microorganismes Génotypage et identification de souches Test de résistance aux antibiotiques, aux antiviraux.. PRINCIPE DE LA SPECTROMÉTRIE DE MASSE Acceleration Drift + + + + Electrodes + + Detector Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Intensity Modified from: Lottspeich, Zorbas, eds “Bioanalytik”, Spektrum Akademischer Verlag, 1998 m/z CONCEPT DE LA TECHNOLOGIE IBIS (PLEX ID) ETAPE 1 Identification région génomique Séquences variable DNA entourée de régions conservées Conservé DNA STEP 3 Variable DNA ETAPE 2 primer Conservé DNA Pesage des Acides Nucléiques par spectrométrie de masse Amplification acides nucleiques STEP 4 • PCR primer Identification des pathogènes As: 17 Gs: 30 Cs: 11 Ts: 61 ETAPE 1 : PRÉPARATION ÉCHANTILLON ET PCR 49 PCR STRATEGIES: DE L‘ENSEMBLE À LA SINGULARITÉ Universal-PCR 16S/23S Large Identification Division-wide-PCR Gènes hautement conservés ex. Identification de plusieurs virus Drill Down-PCR PCR ciblée Resistance au traitement / Virulence / Genotypage PRIMERS À LARGE SPECTRE ADN RIBOSOMAL ET GÈNES HAUTEMENT CONSERVÉS • Primers liés aux régions conservées de toutes ou d’un large groupe de bacteries Région informative variable selon type de microorganismes 51 D [AwGxCyTz] ANALYSE EN SPECTROMÉTRIE DE MASSE. Spectral Signal Mass Spectrometer Ion Source (ESI) Generation of Ions Mass Analysis Seperation of Ions (TOF) Detector Detection of Ions Signal Processing Masses to Base Compositions # Mass Base Count Quantity 1 35875.03 A25G35C30T26 4260 2 35297.70 A29G33C27T25 1948 3 35619.87 A26G36C29T24 1555 4 36196.21 A23G37C31T26 1306 5 35297.70 A29G33C27T26 1949 6 33734.22 A19G21C17T27 1000 Base Compositions Map to Microbes COMPOSITIONS DE BASES: CLASSIFICATION DES VIRUS A Exemple du SARS SARS CoV [A27 G19 C14 T28] HCoV 229E [A25 G24 C11 T28] G HCoV OC43 [A22 G22 C14 T30] Rotate by T 28 30 C Compositions de bases: différenciation des microorganismes Espèce inconnue d’entérobactérie Exemples de Cluster d‘entérobactéries DÉTECTION DU NOUVEAU VARIANT H1N1 par le PLEXID Le test PLEX-ID Flu a été capable de détecter le nouveau variant. …Further characterization by PCR assay and electrospray ionization mass spectrometry indicated a swine-origin virus, and sequence data that were sent to the CDC revealed that the viruses in the two samples were identical… – D Faix, et al. New England Journal of Medicine 2009;.10.1056 KIT PLEX-ID BAC-Spectrum • Identification de Bactéries et levures Candida ainsi que détermination de certaines résistances antibiotiques – Sur sang total, le marquage CE-IVD en cours • Format: 6 échantillons par plaque PCR, 60 échantillons par kit • Points forts: – permet de détecter une gamme vaste de pathogènes – Résultats rapides – Permet d’informer sur la résistance ou non à un antibiotique KIT PLEX-ID BAC-Spectrum: CE, IVD B(road Bacteria) , C(andida), A(ntimicrobial Resistance) 18 paires de primers – 1: controle d’extraction (pumpkin DNA) – – – – – – – 4: ensemble des groupes de bactéries (via 16S et 23S rRNA) 5: groupes spécifiques, différenciation des espèces proches 4: identification des espèces Candida (via 25S rRNA) 4: resistance aux antibiotiques Temps par cycle de PCR: 2 heures Temps total< 8 h PLEX-ID Fungal Spectrum CE, IVD, Début 2011 16 paires de primers – – – – – 1: controle d’extraction (pumpkin DNA) 3: Ascomycètes/ Basidiomycetes (via rRNA) 3: identification et spéciation des Candida (via mtDNA et autres) 1: large spectre (via rRNA) 1: Aspergillus – 2: Cryptococcus – 1: Coccidioides – 2: Mucorales – 1: Ajellomyces – 1: Pneumocystis Temps par cycle de PCR: 2 heures Temps total< 8 h Non-respiratory Invasive Fungal Infections Major Known Causative Agents *Most common Covered by PLEX-ID Fungal Spectrum PLEX ID Viral IC Spectrum VIRAL IC SPECTRUM PATIENT POPULATION • Patients Immunodéprimés (ImmunoCompromised) – VIH – Oncologie – Transplantation – Personnes âgées – Nourrissons • Echantillons CE-IVD : • Autres appropriés: Serum Sang Total LCR Tissus Plasma PLEX ID Viral IC Spectrum 12 échantillons (plasma et autres) par plaque Temps par cycle de PCR: 2 heures Temps total< 8 h PLEX ID VIRAL CNS SPECTRUM Exemples d’espèces identifiées TEST DE SURVEILLANCE INFLUENZA • Principe • 8 paires de primers – 1 pan-influenza (Influenza A, B, and C) • cible: PB1 – 5 specifiques de Influenza A • cibles: Nuc, M1, PA, NS1, NS2 – 2 specifiques de Influenza B • cibles : PB2, Nuc • Description • Caracterisation de virus grippe A, B, et C ou emergents à partir d’échantillons humains, animaux ou environnementaux • Differencie grippe aviaire des autres souches humaines 25 ans en perspectives • - Formidables mutations en cours avec les technologies de l’ADN • - Mais ne pas oublier qu’un pathogène peut être éliminés et responsable de pathologie : le statut immun – et la sérologie– garderont toute leur importance et les techniques évolueront • - Des enjeux universitaires, médicaux, politiques et humains pour les biologistes de 2010-2035
