Article original Ann Biol Clin 2011 ; 69 (2) : 181-9 Corrélation entre les anomalies centrosomiques et l’ADN-ploïdie dans le cancer du sein Are centrosomal abnormalities correlated to DNA ploidy in breast cancer? Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Rita Sakr1 Jocelyne Fleury2 Claudie Prengel2 Patricia Roynard2 Émile Daraï1 Serge Uzan1 Roman Rouzier1 Jean-François Bernaudin2 1 Hôpital Tenon, Service de gynécologie, Paris <[email protected]> doi:10.1684/abc.2011.0525 2 Université Pierre-et-Marie-Curie, Laboratoire d’histologie et de biologie tumorale - UPRES 3499, Paris Article reçu le 21 juillet 2010, accepté le 28 octobre 2010 Tirés à part : R. Sakr Résumé. Plusieurs études décrivent le rôle de l’ADN-ploïdie dans les instabilités génomiques des cellules cancéreuses et le pronostic. Le centrosome jouant un rôle important dans le cycle cellulaire, de nouveaux facteurs pronostiques pourront être introduits pour mieux cibler les traitements. L’objectif de ce travail est de rechercher dans le cancer du sein une anomalie centrosomique et la corrélation avec l’ADN-ploïdie. Des lames sont réalisées à partir des échantillons de prélèvements mammaires et des suspensions cellulaires (cellules mésothéliales et lignées cellulaires MRC5, MCF7, T47D). L’immunofluorescence indirecte est utilisée avec l’anticorps anti-␥-tubuline puis un fragment F(ab )2 conjugué au fluoro-isothyanate. Les centrosomes sont quantifiés au microscope à fluorescence. L’ADN-ploïdie est définie par l’index d’ADN analysée par cytométrie en flux. Les cellules mésothéliales normales (94 % des cellules avec un centrosome) et les cellules MRC5 diploïdes cyclantes (68 % avec deux centrosomes) sont des contrôles de qualité des expériences. Une corrélation entre l’ADNploïdie et le nombre de centrosomes est retrouvé dans les lignées MCF7 (64 % des cellules avec un nombre de centrosomes ≥ 3) mais pas dans les lignées T47D et les dix échantillons de carcinome invasif du sein analysés dans cette étude. L’absence de relation entre l’ADN-ploïdie et le nombre de centrosomes pourrait être due au petit nombre d’échantillons mammaires étudiés, aux empreintes cellulaires ou au mécanisme tumoral. Un élargissement de l’étude sur un grand nombre d’échantillons et de pathologies mammaires et l’étude des anomalies morphologiques du centrosome sont prévus. Mots clés : centrosome, ADN-ploïdie, cancer du sein Abstract. ADN ploidy was shown to play a role in genomic instability of cancer cells and prognosis. The implication of the centrosome in the cell cycle was also described. Therefore, new prognostic factors could be suggested for a bettertailored therapy. The purpose of this study is to search for correlation between centrosomal abnormality and ADN ploidy in breast cancer. Cell prints were prepared from cell culture of mesothelial ascitis, fibroblast cell line MRC5 and breast cancer cell lines MCF7 and T47D. Fresh cell prints were also obtained from cases with invasive carcinoma. The centrosome was labelled by an indirect immunofluorescence assay using anti-␥-tubulin antibody and F(ab )2 FITC before quantification with fluorescence microscopy. ADN ploidy was scored with DNA index obtained by means of flux cytometry. The normal mesothelial cells (94% of cells with only one centrosome) and the diploid cell line MRC5 (68% of cells with two centrosomes) were used as controls. DNA ploidy was found to be correlated with centrosomal abnormality in MCF7 cell line (64% of cells had more than three centrosomes) but not in the 10 cases of invasive ductal carcinoma analysed in this study. The absence of correlation between DNA ploidy and centrosomal abnormality in breast cancer samples may be due to the small numbers of cases, the cell prints or tumorigenesis. Correlation analysis of a larger number of cases and types of breast lesions to numerical and morphological abnormalities of the centrosome are ongoing. Key words: centrosome, DNA ploidy, breast cancer Pour citer cet article : Sakr R, Bernaudin JF, Daraï É, Fleury J, Prengel C, Rouzier R, Roynard P, Uzan S. Corrélation entre les anomalies centrosomiques et l’ADN-ploïdie dans le cancer du sein. Ann Biol Clin 2011 ; 69(2) : 181-9 doi:10.1684/abc.2011.0525 181 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Article original Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme. Environ 40 000 nouveaux cas par an sont diagnostiqués en France et c’est la première cause de décès par cancer chez la femme entre 35 et 55 ans. Le dépistage et le diagnostic reposent sur l’imagerie et l’examen anatomopathologique et la stratégie thérapeutique sur un contrôle locorégional ainsi que général de la maladie [1]. Pour le choix des stratégiques thérapeutiques, il s’est révélé important de définir des classes de pronostics différents afin de mieux cibler les traitements tout en respectant le rapport bénéfice/risque [2, 3]. Par ailleurs, même en tenant compte des facteurs de pronostic les plus pertinents, un nombre non négligeable de patientes vont rechuter, justifiant l’intérêt d’élargir la liste des facteurs pronostiques et prédictifs déjà identifiés. L’évaluation de la cinétique cellulaire n’est pas standardisée, mais l’étude de la prolifération cellulaire s’est révélée utile dans les choix thérapeutiques. Elle est évaluée par le pourcentage de cellules en phase S ou fraction de cellules en phase S (FPS) pouvant être estimée par cytométrie en flux (CMF) et par l’étude d’antigènes associés au cycle cellulaire (Ki67). L’ADN-ploïdie étudiée en CMF est un reflet des instabilités chromosomiques ou génomiques des cellules cancéreuses. Si la cellule ne possède plus le contrôle signalant que la mitose est anormale, elle poursuit sa division et produit des cellules aneuploïdes. Des études récentes ont montré le rôle important de l’ADN-ploïdie et de la FPS comme facteurs prédictifs de rechute dans les cancers du sein [4-10]. Le centrosome (centre de la cellule) est le centre organisateur des microtubules et se trouve près du noyau [11]. Il comprend deux centrioles organisés dans un matériel péricentriolaire mal défini appelé matrice (␥-tubuline) et le cycle du centrosome est distinct du cycle cellulaire. La duplication du centrosome débute à la transition G1/S. Les deux centrioles fils arrivent à maturité en taille et en structure à la fin de G2, parallèlement à la croissance de la matrice péricentriolaire (MPC). À la mitose, les deux centrosomes sont matures, ont acquis le maximum de MPC et peuvent se séparer. Le cycle de division cellulaire dépend de l’aster microtubulaire qui est organisé par le centrosome. Le centrosome joue un rôle important dans le contrôle de la ploïdie des cellules filles ; comme l’ADN, il est dupliqué une seule fois par cycle cellulaire sous la dépendance du point de restriction G1/S [12]. Avant son entrée en mitose, la cellule doit contenir deux lots identiques d’ADN et deux centrosomes soit quatre centrioles. La présence d’anomalies du centrosome provoquerait une aneuploïdie par défaut ou anomalie de formation du fuseau mitotique ou par défaut de cytokinèse. Une aneuploïdie associée à un nombre anormal de centrosomes est souvent observée dans les cellules tumorales [13, 14]. Dans les cancers du pancréas et du sein, des anomalies de taille, de forme ou de nombre du 182 centrosome sont fréquemment observées [15, 16]. Malgré ces différentes études corrélant les anomalies centrosomiques au processus tumoral, la relation cause à effet n’a pas été encore clairement démontrée [17]. Il y a un siècle, Théodore Boveri avait prédit que la moindre erreur au cours de la mitose pouvait aboutir à une instabilité chromosomique à l’origine du cancer. Des anomalies cellulaires comme l’augmentation du nombre des centrosomes augmentent le risque de formation de fuseaux multipolaires qui conduisent à l’aneuploïdie, instabilité génétique la plus fréquemment observée dans de nombreux cancers chez l’homme et d’autres mammifères [18, 19]. Les cancers du sein et de la vessie ont été les premiers pour lesquels les mesures de corrélation entre l’aneuploïdie et la tumorigenèse ont été effectuées, l’aneuploïdie étant associée à un mauvais pronostic dans les carcinomes mammaires [20, 21]. Parmi les mécanismes de contrôle de la mitose, nous venons de voir que le centrosome joue un rôle important. Cependant, il n’a pas encore été démontré de relation entre les anomalies du centrosome et l’agressivité des tumeurs. Par ailleurs, l’ADN-ploïdie est un bon reflet de l’instabilité génomique et a été démontrée liée aux facteurs de pronostic dans les cancers du sein. L’objectif de notre étude est, d’une part, l’analyse des anomalies du centrosome dans le cancer du sein et, d’autre part, la recherche d’une relation entre le nombre de centrosomes et l’ADN-ploïdie et les signes de prolifération cellulaire comme la FPS, dans le but de rajouter des outils applicables aux empreintes cellulaires. Matériel et méthodes Lignées cellulaires de contrôle Dans l’objectif d’avoir un contrôle de cellules épithéliales normales, du liquide d’ascite non carcinomateux est utilisé. Deux litres de liquide d’ascite sont répartis dans des tubes de 50 mL et centrifugés. Les culots sont lavés plusieurs fois dans du PBS 10 % SVF après lyse des hématies et les cellules sont mises en suspension dans du PBS. La culture des différentes cellules étudiées se fait dans une étuve à CO2 5 % à 37 ◦ C dans un milieu comprenant du RPMI 1640 (Gibco) ou du DMEM 1880 (Gibco) supplémenté avec 10 % de SVF (Gibco), de la L-glutamine 5 mM (Sigma), de la pénicilline 50 U/mL (Sigma), de la streptomycine 50 g/mL (Sigma) et de l’hepes 20 mM (Gibco). Le milieu de culture est renouvelé deux à trois fois par semaine. Une fois arrivées au degré de confluence désiré, les cellules sont trypsinées à 37 ◦ C pendant cinq à dix minutes (trypsine-EDTA 1 X, Gibco) puis mises en suspension dans un volume égal de milieu de culture. Les suspensions cellulaires sont ensuite centrifugées à 1 000 g Ann Biol Clin, vol. 69, n◦ 2, mars-avril 2011 Anomalies centrosomique et ADN-ploïdie dans le cancer du sein Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. pendant quatre minutes à température ambiante. Le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans du PBS. Pour la mise au point du marquage de cellules diploïdes cyclantes et l’examen du cycle du centrosome, les lignées de fibroblastes MRC5 sont étudiées à 30, 60 et 90 % de confluence. Pour celle des cellules aneuploïdes, les lignées de cancer du sein MCF7 et T47D sont cultivées. Immunocytochimie Des échantillons de tissu mammaire sont prélevés par l’anatomopathologiste conformément à l’avis du Comité de protection des personnes et sont conservés dans l’azote liquide à - 80 ◦ C. Après décongélation des prélèvements, des empreintes cellulaires sont réalisées sur lame. Une lame est colorée par le MGG pour vérifier la qualité de la préparation cellulaire et les deux autres lames sont séchées à l’air pendant 24 heures puis congelées à - 20 ◦ C sans fixation. Les suspensions cellulaires sont concentrées à 106 cellules/mL. Des pastilles de cytocentrifugation sont préparées avec 100 L de cette suspension par lame (200 g pendant six minutes). Pour chaque type cellulaire, une lame est colorée par le MGG pour contrôler la qualité cellulaire et, pour le liquide d’ascite, confirmer la richesse en cellules mésothéliales. Les lames restantes de chaque type cellulaire sont séchées à l’air pendant une nuit puis congelées à - 20 ◦ C jusqu’à l’utilisation. La méthode d’immunomarquage utilisée est une immunofluorescence indirecte. Les lames préparées (empreintes ou pastilles de cytocentrifugation) sont décongelées pendant cinq minutes à température ambiante. Les cellules mésothéliales ont servi de contrôle de cellules normales diploïdes, les fibroblastes MRC5 de contrôle de cellules diploïdes cyclantes pour l’étude de centrosomes dans le cycle cellulaire et les lignées tumorales MCF7 et T47D de contrôle de cellules tumorales ADN-aneuploïdes. Les cellules d’intérêt sont entourées au stylo hydrofuge (DakoCytomation). Une fixation par l’acétone à froid (+ 4 ◦ C) pendant dix minutes suivi d’un lavage dans du PBS 5 % SVF pendant cinq minutes a montré les meilleurs résultats. Les cellules sont ensuite perméabilisées avec du Triton® X-100 à 0,1 % pendant cinq minutes à température ambiante. Un anticorps (Ac) monoclonal de souris anti-␥tubuline (1,6 mg/mL) (Sigma) est utilisé pour le marquage du centrosome. Les lames sont incubées avec du sérum AB (SAB) humain (Bio West) à 30 % dans du PBS pendant 30 minutes puis avec l’Ac primaire à 1/300 pendant 60 minutes à température ambiante. L’isotype est une IgG1, non relevante (0,2 mg/mL) (Sigma). Après un lavage dans du PBS 5 % SVF pendant dix minutes, les lames sont incubées avec un Ac secondaire de chèvre anti-souris marqué au FITC à 1/50 (FITC-IgG,F(ab )2 [1,4 mg/mL] Ann Biol Clin, vol. 69, n◦ 2, mars-avril 2011 [Immunotech]), pendant 60 minutes à l’abri de la lumière. Pour la contre-coloration des noyaux, un lavage des lames dans du PBS pendant dix minutes est suivi par une incubation avec du DAPI pendant une minute à l’abri de la lumière. Les lames sont ensuite montées dans Vectashield® Mounting Medium (1,5 g/mL) (Vector). L’observation est faite à l’aide d’un microscope à fluorescence Leica DM 4000B (Wetzlar, Allemagne) aux grossissements × 10, × 60 et × 100 et utilisant un filtre bleu pour le DAPI ( d’excitation = 359 nm ; d’émission = 461 nm) et un filtre vert pour le FITC ( d’excitation = 490 nm ; d’émission = 525 nm). Le nombre de points verts (centrosomes) est compté dans chaque cellule sur au moins 100 cellules par lame. Les images sont numérisées à l’aide d’une caméra refroidie CCD (Cool Snaps cf ) et d’un logiciel d’acquisition d’image Genikon (Alphelys, Plaisir, France). Cytométrie en flux La cytométrie en flux (CMF) est réalisée sur les échantillons tumoraux prélevés par l’anatomopathologiste dans la région la plus représentative de la tumeur, congelés dans l’azote liquide et conservés à - 80 ◦ C. Après décongélation et réalisation d’empreintes permettant de confirmer la présence de cellules tumorales, les prélèvements sont dissociés mécaniquement et les cellules recueillies sont réparties dans deux tubes. Dans l’un des tubes, des lymphocytes humains (2.105 lymphocytes pour 106 cellules tumorales) normaux sont rajoutés comme témoins de la population diploïde. Les cellules sont ensuite incubées avec l’iodure de propidium (IP), [kit DNA prep, Beckman Coulter]. L’analyse d’un minimum de 2,104 cellules est réalisée en utilisant un cytomètre en flux (Epics Elite® , Beckman Coulter) équipé d’un laser Argon (( = 488 nm) et d’un filtre rouge ( = 635 nm). Les données sont enregistrées dans un fichier sous forme de listmod (LMD). Le contenu en ADN et la FPS sont évalués à l’aide du logiciel Wincycle (Phoenix, États-Unis) conformément aux recommandations et aux conférences de consensus [4, 22]. Le contenu en ADN définit les cellules ADN-diploïdes ou ADN-aneuploïdes et le calcul de la FPS les répartit en classes en fonction des terciles selon les règles de validation établies par les consensus. L’ADNploïdie est définie par l’index d’ADN (ID) qui est le rapport du canal moyen de fluorescence des cellules tumorales sur celui des cellules diploïdes de référence : une tumeur dont toutes les populations cellulaires ont un ID proche d’un est dite ADN-diploïde alors qu’une tumeur ayant au moins une population cellulaire avec un ID différent d’un est dite ADN-aneuploïde. Par ailleurs, pour les tumeurs ADNdiploïdes, la phase S est dite basse (B) si la FPS inférieure ou égale à 1,2 %, intermédiaire (I) si la FPS est supérieure à 1,2 % et inférieure ou égale à 3 %, et haute (H) si la FPS 183 Article original est supérieure à 3 %. Pour les tumeurs ADN-aneuploïdes, la phase S est dite basse si la FPS inférieure ou égale à 3,85 %, intermédiaire si la FPS est supérieure à 3,85 % et inférieure ou égale à 8,7 %, et haute si la FPS est supérieure à 8,7 %. Analyse statistique Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Le calcul des moyennes et des écarts types ainsi que les histogrammes sont réalisés à l’aide du logiciel Statview® , Abacus, Berkeley. Résultats Immunofluorescence et quantification du centrosome La présence d’un centrosome correspond à un point brillant vert de fluorescence et toutes les expériences ont été reproduites au moins cinq fois (300 lames au total). La majorité des cellules mésothéliales diploïdes normales (94 %) ont un seul point fluorescent (centrosome) par cellule (figure 1). Dans quelques cellules (6 %), deux points fluorescents sont observés correspondant probablement à des cellules en cours de duplication. Lorsque les cellules MRC5 diploïdes cyclantes atteignent 60 % de confluence, elles ont un taux élevé de mitoses et de cellules en phase S (30 %) permettant d’étudier l’évolution du centrosome au cours du cycle cellulaire, d’une part, en comptant le nombre de centrosomes et, d’autre part, en évaluant la distance séparant les deux points d’une même cellule. Nous avons observé 32 % de cellules avec un seul point fluorescent et 68 % de cellules avec deux points fluorescents (figure 1). Les cellules des lignées tumorales MCF7 et T47D ont un, deux, trois ou quatre points fluorescents (figure 1). Leur nombre est détaillé dans le tableau 1. Dix prélèvements de carcinome canalaire infiltrant du sein sont marqués avec l’Ac anti␥-tubuline (figure 2). Les résultats de la numération des centrosomes sont présentés dans le tableau 2. C A B D E Figure 1. Immunomarquage avec l’anticorps anti-␥-tubuline observé au microscope à fluorescence Leica (× 100). A) Cellules mésothéliales d’ascite. B) Lignée cellulaire de fibroblastes MRC5. C) Cellule de la lignée fibroblastique MRC5 en cycle. D) Lignée cellulaire de cancer du sein MCF7. E) Lignée cellulaire de cancer du sein T47D. Bleu : noyau coloré par le DAPI ; vert : centrosome immunomarqué par FITC ; : un point vert ; : deux points verts. Tableau 1. Pourcentage de cellules des lignées MCF7 et T47D avec un, deux, trois et quatre centrosome(s). MCF7 T47D Cellules avec 1 centrosome (%) 24 25 Cellules avec 2 centrosomes (%) 12 52 Cellules avec 3 centrosomes (%) 60 21 Cellules avec 4 centrosomes (%) 4 2 ID 1,6 1,4 ID : index d’ADN. 184 Ann Biol Clin, vol. 69, n◦ 2, mars-avril 2011 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Anomalies centrosomique et ADN-ploïdie dans le cancer du sein A B C D Figure 2. Empreintes cellulaires de carcinome canalaire infiltrant du sein. A) Cellules colorées par MGG. B) immunomarquage avec l’anticorps anti-␥-tubuline observé au microscope à fluorescence Leica (× 100) : un centrosome. C) Immunomarquage avec l’anticorps anti-␥-tubuline observé au microscope à fluorescence Leica (× 100) : trois centrosomes. D) Immunomarquage avec l’anticorps anti-␥tubuline observé au microscope à fluorescence Leica (× 100) : quatre centrosomes. Bleu : noyau coloré par le DAPI ; vert : centrosome immunomarqué par FITC ; : un point vert ; : deux points verts. Cytométrie en flux Toutes les cellules mésothéliales sont ADN-diploïdes. Les fibroblastes MRC5 sont ADN-diploïdes avec une FPS variant en fonction du taux de confluence cellulaire dans la boîte de Petri. La FPS est maximale (30) à 60 % de confluence. Les lignées MCF7 et T47D sont ADNaneuploïdes avec ID à 1,6 et 1,4 respectivement. Trois cas de carcinome canalaire infiltrant sont ADN-diploïdes et les sept autres cas sont ADN-aneuploïdes, dont trois cas avec un ID autour de 1,5 (proches triploïdes) et quatre cas avec un ID autour de 1,8 (proches tétraploïdes). Un seul cas de carcinome canalaire infiltrant a une FPS basse, deux cas ont une FPS intermédiaire et cinq cas ont une FPS haute. Corrélation entre le nombre de centrosomes et l’ADN-ploïdie Cellules normales Dans les cellules diploïdes peu ou non cyclantes (cellules mésothéliales), le nombre de cellules avec un seul centrosome est maximal (94 %). Dans les cellules diploïdes cyclantes (fibroblastes MRC5) avec une FPS à 30 %, le pourcentage de cellules avec un centrosome est de 32 % et le pourcentage de cellules avec deux centrosomes est de 68 %. Ces types cellulaires sont de bons témoins de Ann Biol Clin, vol. 69, n◦ 2, mars-avril 2011 cellules normales et de cellules diploïdes cyclantes. Ces résultats correspondent à ce qui est attendu dans les cellules normales cyclantes ou non et sont donc des contrôles de qualité des expériences. Lignées tumorales Un nombre de centrosomes supérieur ou égal à trois est considéré comme anormal. Dans la lignée MCF7, 100 % des cellules sont ADN-aneuploïdes avec un ID à 1,6. Le pourcentage de cellules avec un nombre de centrosomes supérieur ou égal à trois est de 64 % en corrélation avec l’ADN-aneuploïdie. Dans la lignée T47D, 100 % des cellules sont également ADN-aneuploïdes avec un ID à 1,4. Le pourcentage de cellules avec un nombre de centrosomes supérieur ou égal à trois est de 23 %. Carcinomes infiltrants du sein Trois cas de carcinomes canalaires invasifs du sein sont ADN-diploïdes. Sept cas de carcinomes canalaires invasifs du sein sont ADN-aneuploïdes. Le pourcentage de cellules avec un nombre de centrosomes supérieur ou égal à trois est légèrement supérieur dans les cas ADN-aneuploïdes par rapport aux cas ADN-diploïdes (15 ± 9,6 % versus 13,3 ± 5,7 %). Une analyse détaillée des corrélations est illustrée par la figure 3. 185 B I H H H H I H 1,53 1 1,81 1,76 1,66 1,84 1,89 1 1,57 1 Discussion 186 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 D : ADN-diploïde ; A : ADN-aneuploïde ; FPS : fraction de cellules en phase S ; B : basse ; I : intermédiaire ; H : haute ; ID : index d’ADN. A D A A A A A D A D Cellules avec 3 centrosomes (%) 16 8 10 9 6 31 7 17 6 7 Cellules avec 2 centrosomes (%) 68 68 64 83 66 47 54 64 64 56 Cellules avec 1 centrosome (%) 15 22 23 7 25 17 37 16 25 34 Tumeur no Tableau 2. Résultats de l’étude de dix échantillons de carcinome infiltrant du sein. Cellules avec 4 centrosomes (%) 1 0 2 1 2 3 2 3 4 2 Cellules avec 5 centrosomes (%) 0 2 1 0 1 2 0 0 1 1 ADN-ploïdie Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Cellules aneuploïdes (%) 85,5 0 17,0 28,0 56,5 72,0 31,5 0 13,5 0 FPS ID Article original Les cellules cancéreuses possèdent fréquemment des anomalies chromosomiques qui portent sur leur structure ou sur leur nombre. L’anomalie de nombre appelée aneuploïdie est un facteur de mauvais pronostic. Il peut s’agir d’un évènement précoce en relation avec la tumorigenèse ou d’un évènement tardif en relation avec l’agressivité de la tumeur. Plusieurs études récentes convergent aussi bien pour comprendre ces mécanismes que pour déterminer de nouveaux facteurs et outils d’analyse dans l’objectif de mieux cibler les traitements. Une « amplification » centrosomique a été impliquée dans des aberrations mitotiques, des aneuploïdies et des instabilités génomiques. Chez l’homme, un dysfonctionnement du centrosome conduirait à un dérèglement du fuseau mitotique responsable d’anomalies chromosomiques et d’ADN-aneuploïdie [14]. Des études récentes explorant la relation entre l’aneuploïdie des cellules cancéreuses, l’instabilité génomique et les aberrations centrosomiques ont retrouvé des cellules avec anomalies du centrosome dans une moyenne de 9,6 % au sein d’un groupe de carcinomes infiltrants [13]. Le but de notre étude est de rechercher une relation entre les anomalies du centrosome, l’ADN-ploïdie et la FPS, l’ADN-ploïdie et la FPS étant le reflet à la fois de l’instabilité génomique et de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, certains auteurs ont rapporté l’intérêt clinique de l’analyse d’ADN en CMF confirmant le lien entre la FPS, l’ADN-ploïdie et le risque de rechute chez des patientes atteintes de cancer du sein classé T1 ou T2 [4, 5]. Pour toutes les cellules étudiées, l’autofluorescence a été un obstacle dans l’observation de l’immunomarquage. Bien que dans la littérature, le PFA soit le fixateur le plus utilisé en raison d’une bonne qualité de la fixation, l’autofluorescence induite par ce fixateur a gêné la reconnaissance du centrosome (point fluorescent ≤ 2 m). En fait, le bruit de fond et l’autofluorescence doivent être très minimes ou absents pour une bonne discrimination d’un point fluorescent correspondant à un centrosome. Certains auteurs ont également décrit une certaine autofluorescence produite par les solutés à base de formaldéhyde ou de paraformaldéhyde [23]. Cette autofluorescence ayant disparu avec la modification du fixateur, nous avons donc choisi l’acétone comme fixateur. Nous avons étudié dans cette première étape la corrélation entre le nombre de centrosomes dans la cellule et l’ADN-ploïdie. Dans le choix des cellules normales de contrôle, nous avions besoin de cellules normales peu cyclantes comportant théoriquement un seul centrosome et de cellules cyclantes comportant un ou deux centrosomes. Plusieurs types cellulaires testés ont été abandonnés pour des problèmes Ann Biol Clin, vol. 69, n◦ 2, mars-avril 2011 Anomalies centrosomique et ADN-ploïdie dans le cancer du sein A B 100 100 90 80 Moyenne des cellules Moyenne des cellules Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. 80 60 40 20 70 60 50 40 30 20 10 0 1 et 2 Centro ADN-aneuploïde ; ≥3 Centro ADN-diploïde 0 ≥3 Centro 1 et 2 Centro ID égal à 1 ; ID proche triploïde ; ID proche tétraploïde Figure 3. Corrélation avec le nombre de centrosomes dans les dix cas de carcinome canalaire infiltrant en fonction de : A) l’ADN-ploïdie ; B) l’index d’AND. techniques ou d’autofluorescence et nous avons retenu les cellules mésothéliales d’ascite et les lignées de fibroblastes MRC5. Les cellules mésothéliales normales diploïdes ont une majorité de cellules avec un seul centrosome. Les fibroblastes MRC5 diploïdes cyclantes ont une majorité (68 %) de cellules avec deux centrosomes. Ces expériences ont permis de déterminer les contrôles des cellules diploïdes normales non cyclantes et des cellules diploïdes cyclantes. Les résultats sur les cellules normales nous ont également permis de valider la technique en raison de la présence d’un centrosome par cellule dans des cellules peu cyclantes et d’une majorité de cellules avec deux centrosomes dans des cellules cyclantes. Le fait de n’avoir jamais observé plus de deux centrosomes dans des cellules normales, valide la méthode d’immunomarquage et de numération des centrosomes. Les lignées de cellules tumorales MCF7 et T47D servent de contrôle de cellules ADN-aneuploïdes. L’étude de la lignée tumorale MCF7 retrouve 100 % de cellules ADNaneuploïdes avec 64 % des cellules ayant un nombre de centrosomes égal ou supérieur à 3. Ces cellules ayant une ADN-aneuploïdie et un ID proche de 1,6 confirment la corrélation entre l’ADN-aneuploïdie et le nombre de centrosomes. En revanche, l’étude de la lignée tumorale T47D retrouve 100 % de cellules ADN-aneuploïdes et un ID proche de 1,5 avec une majorité de cellules ayant un ou deux centrosomes. Bien que l’ID soit proche de 1,5, nous Ann Biol Clin, vol. 69, n◦ 2, mars-avril 2011 retrouvons ici une dissociation entre l’ADN-ploïdie et le nombre de centrosomes. Dans un premier temps, un caryotype doit être réalisé dans l’objectif de vérifier le nombre de chromosomes dans chaque lignée et de vérifier que l’ADNaneuploïdie observée correspond bien à l’augmentation du nombre de chromosomes. Dans les carcinomes mammaires étudiés, nous n’avons pas observé de corrélation significative entre l’ADN-ploïdie, la FPS et le nombre de centrosomes. Dans les tumeurs ADNdiploïdes, nous retrouvons un taux non négligeable mais relativement faible (13,3 %) de cellules ayant un nombre de centrosomes égal ou supérieur à 3. Ce résultat pourrait être dû à un faible taux de cellules aneuploïdes non détectées en CMF. Cependant, dans les tumeurs ADNaneuploïdes, le taux de cellules avec un nombre anormal de centrosomes est également relativement faible (15 %), mais légèrement supérieur à celui des tumeurs ADN-diploïdes. Bien que non significative, la différence entre les pourcentages de cellules avec un nombre de centrosomes supérieur ou égal à trois révèle un taux légèrement supérieur dans la population ADN-aneuploïde par rapport à la population ADN-diploïde. Parmi les sept tumeurs ADN-aneuploïdes, les trois tumeurs « proches triploïdes » (ID autour de 1,5) ont un taux faible de cellules avec un nombre de centrosomes égal à 3 ; cependant, l’une de ces tumeurs n’a que 13,5 % de cellules aneuploïdes. Les quatre tumeurs « proches tétraploïdes » n’ont pas un taux significativement plus élevé de cellules avec deux ou quatre centrosomes que celui des 187 Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 25/05/2017. Article original autres tumeurs. Cette absence de relation peut être due au petit nombre de cas étudiés. Elle peut être également due aux échantillons tumoraux. En effet, les cellules présentes sur les empreintes sont différentes de celles utilisées pour la CMF. Certaines difficultés sont également rencontrées dans l’observation des empreintes : cellules altérées ou peu nombreuses. Le mécanisme tumoral lui-même peut aussi être à l’origine de nos résultats : d’une part, le nombre de centrosomes ne serait pas la conséquence de l’ADNaneuploïdie et, d’autre part, nous n’avons évalué que le nombre de centrosomes et non pas sa taille ou ses anomalies morphologiques. La poursuite le travail est envisagée sur un grand nombre d’échantillons et de pathologies mammaires, sur un plus grand nombre de cellules par échantillon, ainsi que sur l’étude des anomalies morphologiques et de taille du centrosome. Conclusion Les anomalies du centrosome sont considérées comme des marqueurs de carcinogenèse cellulaire. Une « amplification » centrosomique a été impliquée dans des aberrations mitotiques, des aneuploïdies et des instabilités génomiques de plusieurs lésions cancéreuses. Ces anomalies sont également recherchées dans le cancer du sein. Cette étude préliminaire a permis la mise au point et la validation d’une méthode cytologique de reconnaissance et de comptage des centrosomes. Les premiers résultats n’ont pas montré de corrélation entre l’ADN-aneuploïdie et le nombre de centrosomes en raison du petit nombre d’échantillons analysés et de l’absence d’étude des anomalies morphologiques des centrosomes. La poursuite de l’étude permettra l’élargissement de l’échantillon et l’introduction des méthodes de biologie moléculaire et de cytogénétique. Conflits d’intérêts : aucun. Références 1. Harris JR, Lipman ME, Morrow M, Osborne CK, editors. Disease of the breast, 2nd ed. Philadelphie : Lippincott Williams & Wilkins, 1999. 2. Rabindran SK. Antitumor activity of HER-2 inhibitors. Cancer Lett 2005 ; 227 : 9-23. 3. Ring BZ, Seitz RS, Beck R, Shasteen WJ, Tarr SM, Cheang MC, et al. Novel prognostic immunohistochemical biomarker panel for estrogen receptor-positive breast cancer. J Clin Oncol 2006 ; 24 : 3039-47. 4. Chassevent A, Jourdan ML, Ferrero-Pous M, Colonna M, Romain S, Spyratos F, et al. Standardization and quality control in the evaluation of proliferation parameters in T1T2, N0N1, M0 breast cancer: multicentric 188 retrospective study II. DNA-ploidy and S-phase fraction. Bull Cancer 1999 ; 86 : 685-91. 5. Moureau-Zabotto L, Bouchet C, Cesari D, Uzan S, Lefranc JP, Antoine M, et al. 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