en tête DEA

Master Ecosciences, Microbiologie
Parcours Recherche « Ecologie Microbienne »
Bâtiment Dubois – 2ème étage
Université Claude Bernard Lyon 1
69622 – VILLEURBANNE CEDEX
Tel : 04 72 43 13 77
E-mail : [email protected]
http://spiral.univ-lyon1.fr/Files_m/M5298/WEB/EcologieMicrobienne.htm
PROPOSITION SUJET de MASTER 2015-2016
TITRE : Interaction pathogène Agrobacterium-plante : localisation in situ des opines, des bactéries
consommatrices et des cellules végétales transformées
Nom, Prénom du Maitre de Stage :
Qualité :
Maitre de Conférences
Téléphone :
04.26.23.71.26
Lavire Céline
E-mail : [email protected]
Laboratoire d’accueil, Responsable et équipe :
UMR CNRS 5557 Ecologie Microbienne. (dir. Yvan Moënne-Loccoz)
Equipe Diversité et adaptation des bactéries phytopathogènes
Adresse :
Bât. Forel, Campus de La Doua, 43 bd du 11 novembre 1918, 69622 Villeurbanne
Nom du candidat éventuellement proposé :
S'il n'est pas retenu, acceptez-vous un autre candidat ?
Oui - Non
Description du sujet au verso

Sujet (objectif, démarche et technique, collaboration(s),...) :
La galle du collet se caractérise par la formation de tumeurs sur de nombreuses espèces végétales. Elle se manifeste
notamment de manière récurrente dans les pépinières où elle affecte la qualité commerciale des productions. Elle
est causée par des bactéries du genre Agrobacterium uniquement si celles-ci hébergent un plasmide Ti (Tumor
inducing - pTi), qui est le véritable agent causal de la maladie. La libération de composés par des cellules végétales
blessées attire les bactéries pathogènes et induit l’expression du programme de pathogénie. Ceci aboutit au
transfert d’un fragment d’ADN du plasmide Ti (ADN-T) dans les cellules végétales, et à son intégration dans le
génome où les gènes de cet ADN-T sont exprimés. L’anatomie et la physiologie de la plante transformée sont alors
fortement modifiées, provoquant la biosynthèse d’hormones de croissance induisant la formation de tumeurs et de
composés propres aux tumeurs, les opines. Ces molécules, non métabolisées par la plante, servent de ressource
trophique aux agrobactéries hébergeant le pTi. Par ailleurs, certaines opines induisent, à des concentrations très
faibles, le transfert conjugatif du pTi vers des Agrobacterium non pathogènes. Ces dernières acquièrent ainsi des
capacités infectieuses, ce qui conduit à terme à la contamination pérenne des sols. La mise en place de la
pathogénie et la transformation de la cellule végétale sont actuellement bien comprises et étayées par de nombreux
travaux. A l’inverse, nous disposons de peu de connaissances sur la structure de la tumeur, la production et le
transport d’opines, et comment les agrobactéries les utilisent. Des données préliminaires indiquent d’une part, une
répartition non uniforme des opines eu sein de la tumeur et d’autre part, qu’en fonction de la plante, les opines ne
présentent pas les même niveaux dispersion dans la plante (cantonnées à la tumeur ou dispersées de manière
systémique).
Hypothèse : Nous faisons l’hypothèse que, pour certaines plantes, (i) les opines sont produites dans de nombreuses
cellules de la tumeur, (ii) qu’une partie de celles-ci est consommée par des agrobactéries pathogènes se multipliant
au niveau des couches superficielles de la tumeur, et (iii) qu’une autre partie est transportée par les vaisseaux
conducteurs et peut parvenir aux bactéries de la rhizosphère ou de la phyllosphère. Il s’agit d’un aspect important
de la biologie de la galle du collet qui pourrait nous permettre de mieux comprendre le rapport entre agrobactéries
pathogènes et non-pathogènes (hôtes potentiels du pTi) en lien avec la contamination des sols.
Objectif : A travers ce projet, nous souhaitons déterminer si la différenciation des tissus de la tumeur et la
colonisation bactérienne dépendent de la plante, et si cette dernière influence aussi la localisation et le transport
des opines. Nous répondrons à ces questions en couplant la détection de microquantités de métabolites à des
analyses par imagerie confocale pour étudier et localiser simultanément les cellules végétales transformées, les
bactéries et les molécules produites du fait de cette transformation.
Démarche : Les plantes modèles utilisées dans ce projet seront la tomate (Solanum lycopersicum, Solanacées) et le
kalanchoé (Kalanchoe daigremontiana, Crassulacées), deux espèces modèles couramment utilisées dans les études
d’infection par Agrobacterium spp. Sur ces deux espèces végétales, nous comparerons :
1. Distribution et translocation des opines dans les plants infectés. Les plants seront blessés et infectés par des
quantités calibrées de la souche modèle Agrobacterium fabrum C58. La détection et la quantification des opines
seront effectuées à différents niveaux de la plante (tige, feuille, racine) et dans les exsudats par une méthode
chromatographique couplée à la spectrométrie de masse développée au laboratoire.
2. Localisation des bactéries consommatrices d’opines. La localisation des agrobactéries dans la tumeur ainsi que
l’expression des gènes de dégradation des opines (gènes induits en présence des opines) seront analysés par
microscopie confocale à balayage laser. Plus précisément, les plantes seront infectées par des bactéries modifiées
pour exprimer un gène codant une protéine fluorescente sous contrôle du promoteur des gènes de catabolisme des
opines.
3. Localisation des cellules végétales transformées. Nous construirons des souches bactériennes porteuses d’un pTi
modifié dans son ADN-T par intégration d’un gène rapporteur sous contrôle d’un promoteur constitutif de plante.
Ces constructions seront développées puis utilisées pour l’analyse des tumeurs des deux espèces végétales.
Méthodes : Au cours de son stage de M2R, l’étudiant développera différents outils moléculaires (fusions
transcriptionnelles, plasmide Ti modifié), qu’il utilisera pour étudier l’infection de différentes plantes par
Agrobacterium, notamment grâce à la microscopie confocale à balayage laser. Il sera aussi amené à utiliser des
approches de chromatographie couplée à de la spectrométrie de masse (détection et quantification d’opines).
Contexte et collaborations.
Les outils et méthodes nécessaires à l’aspect de génétique fonctionnelle sont parfaitement maîtrisés par l’équipe
d’accueil. Isabelle Kerzaon, co-encadrante du sujet, apportera son expertise pour les approches de chromatographie
et spectrométrie de masses. Ce sujet, pour lequel une poursuite en thèse est envisagée, s’inscrit dans un programme
plus large impliquant des collaborations avec Y. Gouriou et B. Combourieu (Rovaltain Research company), F.
Thévenard (LEHNA), et les membres du CESN (UMR5557).