Étude des interactions entre des bactéries pathogènes et

Étude des interactions entre des bactéries pathogènes
et Dictyostelium discoideum : analyse de la résistance
et de l’enrobage
Mémoire
Myriam Ouellet
Maîtrise en microbiologie
Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Myriam Ouellet, 2014
ii
RÉSUMÉ
Les amibes se nourrissent principalement de bactéries. Certaines bactéries pouvant
résister à la digestion dans la voie phagocytique amibienne s’y retrouvent enrobées et
sécrétées dans l’environnement par la suite. Cet enrobage augmente la résistance
bactérienne à différents stress. Les bactéries enrobées pourraient favoriser la propagation de
maladies infectieuses, mais aucune donnée n’est disponible à ce sujet. Les bactéries
pathogènes Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium et Pseudomonas
aeruginosa sont capables de résister à la digestion amibienne, mais leur capacité à être
enrobée est inconnue. L’étude de la résistance de ces bactéries face à l’amibe Dictyostelium
discoideum et l’analyse de la viabilité de cette dernière en présence des bactéries ont été
réalisées pour mieux cibler les souches bactériennes potentiellement enrobables. Des essais
d’enrobage ont été tentés, mais aucune bactérie enrobée n’a été observée en microscopie
électronique. D’autres analyses seront requises pour comprendre la propagation des
maladies infectieuses via les bactéries enrobées.
iii
iv
ABSTRACT
Amoebae mainly feed bacteria. Many bacteria are resistant to the digestion in the
phagocytic pathway of amoebae. There they can be packaged and then secreted into the
environment. Packaging increases the resistance of bacteria to different stresses. Packaged
bacteria could improve the spread of infectious diseases, but no data is available regarding
that so far. The pathogenic bacteria Escherichia coli O157:H7, Salmonella typhimurium
and Pseudomonas aeruginosa are able to resist to digestion by amoeba digestion, but their
ability to be packaged is unknown. The study of the bacteria resistance to the amoeba
Dictyostelium discoideum and the analysis of the viaibility of the latter in the presence of
bacteria were done to better target the bacterial isolates that can be packaged. Assays of
packaging of bacteria were done, but no packaged bacteria were observed by electron
microscopy. Other analyzes are required to understand the spread of infectious diseases by
packaged bacteria.
v
vi
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ .............................................................................................................................. iii
ABSTRACT............................................................................................................................ v
LISTE DES TABLEAUX .....................................................................................................ix
LISTE DES FIGURES ..........................................................................................................xi
LISTE DES ABRÉVIATIONS .......................................................................................... xiii
REMERCIEMENTS ............................................................................................................. xv
DÉDICACE ....................................................................................................................... xvii
CHAPITRE 1 - INTRODUCTION ........................................................................................ 1
1.1 Les protozoaires ............................................................................................................ 1
1.2 Dictyostelium discoideum ............................................................................................. 2
1.3 La voie phago-endocytique chez D. discoideum........................................................... 2
1.3.1 La dynamique de la voie phago-endocytique ......................................................... 5
1.3.2 Phagocytose versus macropinocytose .................................................................... 7
1.3.3 Les endosomes de recyclage .................................................................................. 9
1.3.4 Les lysosomes ....................................................................................................... 10
1.3.5 Les lysosomes tardifs ........................................................................................... 11
1.3.6 L’exocytose .......................................................................................................... 12
1.4 Résistance à la prédation : Mécanismes de résistance et corps multilamellaires (CML)
........................................................................................................................................... 12
1.5 Bactéries résistantes aux amibes ................................................................................. 17
1.5.1 E. coli O157:H7 .................................................................................................... 17
1.5.2 S. typhimurium ...................................................................................................... 17
1.5.3 P. aeruginosa ........................................................................................................ 18
1.6 Problématique des bactéries enrobées ......................................................................... 20
CHAPITRE 2 – HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS SPÉCIFIQUES ....................................... 21
CHAPITRE 3 – MATÉRIEL ET MÉTHODES ................................................................... 23
3.1 Cultures cellulaires et maintenance ............................................................................. 23
3.2 Test de prédation ......................................................................................................... 27
3.3 Test de lyse .................................................................................................................. 28
3.4 Essai d’enrobage de bactéries ..................................................................................... 29
3.5 Microscopie électronique à transmission (MET) ........................................................ 30
vii
3.6 Production de CML par d’autres amibes .................................................................... 30
CHAPITRE 4 - RÉSULTATS ............................................................................................. 33
4.1 E. coli O157:H7 .......................................................................................................... 33
4.1.1 Test de prédation .................................................................................................. 33
4.2 S. typhimurium ............................................................................................................ 35
4.2.1 Test de prédation .................................................................................................. 35
4.2.2 Essai de l’enrobage de bactéries .......................................................................... 38
4.3 P. aeruginosa .............................................................................................................. 39
4.3.1 Origine des isolats ................................................................................................ 40
4.3.1.1 RAPD ................................................................................................................ 40
4.3.1.2 Formation de biofilm ........................................................................................ 42
4.3.1.3 Production d’élastase ........................................................................................ 44
4.3.2 Test de prédation .................................................................................................. 45
4.3.3 Test de lyse .......................................................................................................... 48
4.3.4 Essai de l’enrobage de bactéries .......................................................................... 51
4.4 Levure provenant d’une contamination ...................................................................... 57
4.5 Production de CML par d’autres amibes .................................................................... 61
CHAPITRE 5 - DISCUSSION ............................................................................................ 63
5.1 E. coli O157:H7 .......................................................................................................... 63
5.2 S. typhimurium ............................................................................................................ 64
5.3 P. aeruginosa .............................................................................................................. 65
5.4 Levure provenant d’une contamination ...................................................................... 69
5.5 Production de CML par d’autres amibes .................................................................... 70
CHAPITRE 6 – CONCLUSIONS GÉNÉRALES ET PERSPECTIVES ............................ 71
CHAPITRE 7 - BIBLIOGRAPHIE ..................................................................................... 75
viii
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1. Ensemble des bactéries connues pour être résistantes aux amibes et leurs
caractéristiques...................................................................................................................... 14
Tableau 2. Tableau descriptif des souches d'E. coli O157:H7 utilisées dans cette étude. .... 24
Tableau 3. Tableau descriptif des souches de S. typhimurium utilisées dans cette étude. .... 25
Tableau 4. Isolats cliniques de P. aeruginosa isolés de patients ayant la fibrose kystique et
utilisés dans cette étude......................................................................................................... 26
Tableau 5. Isolats environnementaux de P. aeruginosa provenant d'unités dentaires et
utilisés dans cette étude......................................................................................................... 27
Tableau 6. Résultats des tests de prédation pour E. coli O157:H7. ...................................... 35
Tableau 7. Résultats des tests de prédation pour S. typhimurium. ........................................ 37
Tableau 8. Différents milieux de culture testés pour les tests de prédation de S.
typhimurium. ......................................................................................................................... 38
Tableau 9. Résultats des tests de prédation pour P. aeruginosa. .......................................... 47
Tableau 10. Lyse des cellules de D. discoideum exposées au surnageant des cultures des
isolats de P. aeruginosa. ....................................................................................................... 50
Tableau 11. Mise en commun des résultats des tests de prédation et des tests de lyse pour
les isolats de P. aeruginosa pour déterminer ceux qui sont potentiellement enrobables. .... 52
ix
x
LISTE DES FIGURES
Figure 1. Schéma décrivant la voie endocytique chez D. discoideum. ................................... 4
Figure 2. Les différents compartiments de la voie endocytique chez D. discoideum............. 5
Figure 3. Cytosquelette d'actine. ............................................................................................. 6
Figure 4. Visualisation des endosomes de recyclage grâce à la protéine p25. ..................... 10
Figure 5. Cycle de multiplication intracellulaire de L. pneumophila dans une cellule
eucaryote. .............................................................................................................................. 15
Figure 6. Bactéries L. pneumophila enrobées dans un corps multilamellaire produit et
sécrété par A. castellanii. ...................................................................................................... 16
Figure 7. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les souches d'E. coli
O157:H7................................................................................................................................ 34
Figure 8. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les souches de S.
typhimurium. ......................................................................................................................... 37
Figure 9. Microscopie électronique à transmission d'un essai d'enrobage pour la souche
sauvage X3339 de S. typhimurium. ...................................................................................... 39
Figure 10. Pourcentage des patients atteints de fibrose kystique étant infectés par différents
agents infectieux selon le groupe d'âge. ............................................................................... 40
Figure 11. Dendrogramme obtenu suite à l'analyse informatique du RAPD des isolats
cliniques et environnementaux de P. aeruginosa. ................................................................ 42
Figure 12. Diagramme de la capacité des isolats de P. aeruginosa à former un biofilm en
fonction de leur groupe de similitude. .................................................................................. 43
Figure 13. Diagramme de la production d'élastase par les isolats de P. aeruginosa. ........... 44
Figure 14. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les isolats de P.
aeruginosa. ........................................................................................................................... 46
Figure 15. Lyse des cellules de D. discoideum exposées au surnageant des cultures de P.
aeruginosa. ........................................................................................................................... 49
Figure 16. Phagocytose et exocytose chez D. discoideum. .................................................. 54
xi
Figure 17. Invagination de la membrane du lysosome tardif. .............................................. 55
Figure 18. Essai d'enrobage de bactéries pour l’isolat VD 706 de P. aeruginosa. .............. 56
Figure 19. Corps multilamellaires vides produits par les isolats VD 706 et Chir D-144 de P.
aeruginosa. ........................................................................................................................... 57
Figure 20. Exemple de coculture triple permettant de confirmer qu'une bactérie est une
ARB. ..................................................................................................................................... 58
Figure 21. Isolement et identification partielle du microorganisme inconnu. ..................... 60
Figure 22. Surproduction de couches multilamellaires dans le lysosome tardif contenant
une levure. ............................................................................................................................ 61
Figure 23. Production de CML par A. castellanii et H. vermiformis. .................................. 62
xii
LISTE DES ABRÉVIATIONS
ABC : Cassette liant l’ATP (ATP-binding cassette)
ARB : Bactérie résistante aux amibes (Amoeba Resistant Bacteria)
CML: Corps multilamellaire
CRIPA : Centre de recherche en infectiologie porcine et avicole
Ctrl : Contrôle
DO : Densité optique
Gb3 : Globotriosyl céramide
LES : Souche épidémique de Liverpool (Liverpool epidemic strain)
MET : Microscopie électronique à transmission
PCR : Réaction de polymérisation en chaîne (Polymerase Chain Reaction)
RAPD : Amplification aléatoire des polymorphismes de l’ADN (Random amplified
polymorphic DNA)
rpm : Rotation par minute
SPI1-T3SS : Îlot de pathogénicité 1 ou 2 du système de sécrétion de type 3 chez Salmonella
(Salmonella pathogenicity island type 3 secretion system)
spp : Sous-espèce (Subspecies)
SS : Système de sérétion
SST3 : Système de sécrétion de type 3
Tat : Twin Arginin Translocation
xiii
xiv
REMERCIEMENTS
Tout d’abord, je tiens à remercier les différents organismes subventionnaires qui ont
contribué au soutien financier pour la réalisation de ce projet, plus particulièrement le
Centre de recherche en infectiologie porcine et avicole (CRIPA) pour l’obtention d’une
bourse de voyage et d’une bourse de dépannage. J’aimerais aussi remercier les membres de
mon comité aviseur pour m’avoir soutenu : Steve Charette (directeur de recherche),
Caroline Duchaine (co-directrice), Jean Barbeau et Manon Couture.
Je tiens aussi à remercier Steve, mon directeur, pour toute l’aide et le support
apportés. Tu as fait grandir mes connaissances et ma passion pour la science, mais tu m’as
aussi fait grandir en tant qu’être humain. Merci de toute la confiance que tu m’as accordée,
merci d’avoir cru en moi. Merci aussi d’avoir été autant disponible.
Maintenant, j’aimerais remercier mes collègues et amis qui m’ont côtoyée durant
ma maîtrise. Premièrement, merci à Valérie, ma poule, d’être ma super acolyte de bactéries
enrobées. Toute ton énergie, en synergie avec la mienne, a fait de nous une équipe du
tonnerre! Faire mon tout premier stage à tes côtés a été vraiment plaisant! Depuis ce temps,
tu m’as permis de m’épanouir en tant que microbiologiste, mais aussi en tant que femme
« qui découvre le monde ». Merci à Geneviève, notre première maman du laboratoire. Ta
bonne humeur et ton sens de l’humour étaient toujours les bienvenus! Je sais maintenant
que je ne dois plus laisser traîner mon cellulaire, surtout durant les partys de Noël! Tu es
une très bonne conseillère, autant au sujet du travail que de la vie en général. Merci à
Stéphanie, la belle rousse, pour ta gentillesse et pour m’avoir fait découvrir et développer,
avec les gars de bio-info, mon goût pour les bonnes bières. Merci à Alix pour ton sens de
l’humour et nos nombreux délires. Merci à Katherine, Mélanie et Sabrina. J’ai moins eu la
chance de collaborer avec vous, mais votre présence au laboratoire a été des plus agréables.
Et merci Antony pour tes nombreux monologues et imitations!
xv
Un merci tout particulier à mon copain, Jean-Guillaume, qui a su être là pour me
supporter dans les moments plus difficiles et plus stressants. Tu as été là pour m’encourager
et pour me pousser toujours plus loin afin que je me surpasse. Tu as été généreux et patient
avec moi. Tu es l’homme rêvé et je t’admire vraiment beaucoup dans tout ce que tu fais. Je
t’aime mon amour! Tu me rends vraiment heureuse! Je te souhaite de réussir tout ce que tu
entreprends dans la vie.
Merci aussi à mes parents, France et Bruno, et à ma sœur Sophie, pour leur soutien
moral durant ces années d’étude. Depuis que je suis toute jeune, vous m’avez toujours dit :
« On ne te demande pas de faire l’impossible, on te demande juste de faire de ton mieux ».
Cette petite phrase, certains diront qu’elle est banale, mais elle signifie beaucoup pour moi.
Ce n’est pas seulement qu’en obtenant les meilleurs résultats que je vais apprendre. C’est
en faisant du mieux que je peux que la vie me rendra ce que j’ai semé. C’est valable autant
en recherche que dans la vie. Merci à Sophie, ma petite Puce, pour ta complicité. Malgré
que nous ne soyons plus des enfants, tu resteras toujours ma petite sœur que je protégerai.
Finalement, un merci un peu moins pertinent à ma « crème molle » du Chocolats
Favoris bien méritée après mon dépôt initial. Tu as été ma motivation dans les derniers
moments de rédaction.
xvi
DÉDICACE
À mes parents si fiers de moi
« On ne te demande pas de faire l’impossible,
on te demande juste de faire de ton mieux. »
xvii
xviii
CHAPITRE 1 - INTRODUCTION
1.1 Les protozoaires
Les protozoaires sont des organismes eucaryotes unicellulaires ubiquitaires dans les
environnements humides [1]. Leurs premières observations et descriptions ont été faites par
Antoni van Leeuwenhoek en 1675. Les protozoaires possèdent les mêmes structures et
organites que les autres cellules eucaryotes, mais avec quelques variations. Certains
protozoaires possèdent un seul noyau, alors que d’autres en possèdent deux voire plusieurs.
Il existe aussi différentes dimensions pour les protozoaires. Alors que les mononucléés font
de quelques micromètres à des centaines de micromètres, les multinucléés peuvent faire
une taille de plusieurs centimètres à plusieurs mètres. Les protozoaires se nourrissent par
phagocytose, macropinocytose et certains font de la photosynthèse [2].
Sur la base de leur mode de locomotion, les protozoaires se divisent en quatre
catégories, soit les ciliés, les amibes, les sporozoaires et les flagellés [3]. Parmi les
différents groupes de protozoaires, différentes espèces sont utilisées comme modèle
d’étude, dont les amibes Dictyostelium discoideum [4-6] et Acanthamoeba spp. [7] et
Tetrahymena spp. [8] chez les ciliés. Pour ce qui est des amibes, D. discoideum offre
plusieurs avantages que d’autres modèles amibiens n’offrent pas (voir la section 1.2). Par
contre, d’autres amibes ont aussi permis différentes avancées scientifiques. Il y a, entre
autres, les amibes libres Acanthamoeba castellanii et Hartmannella vermiformis qui ont
déjà été utilisées pour étudier la réplication intracellulaire de Legionella pneumophila, une
bactérie pathogène opportuniste responsable de la légionellose, une maladie respiratoire
parfois mortelle [9-10].
1
1.2 Dictyostelium discoideum
Comme mentionné précédemment, l’amibe D. discoideum est un modèle d’étude
d’eucaryote unicellulaire souvent utilisé en science. Cet organisme a été découvert en 1933
[11], mais ce n’est que depuis les dernières décennies que son utilisation, surtout sous sa
forme végétative, est plus courante. D. discoideum possède plusieurs caractéristiques
faisant de cette amibe un bon modèle d’étude. Parmi celles-ci, il y a sa capacité
d’internaliser les bactéries pour se nourrir, la facilité à la cultiver [5] et son génome
entièrement séquencé [12]. D. discoideum offre aussi l’avantage que son utilisation n’est
pas soumise aux contraintes éthiques et a un temps de génération beaucoup moins long que
certains autres modèles d’étude [5, 13]. De plus, cette amibe permet l’étude des effets de
différents composés ou mutations dans la formation des corps multilamellaires (CML) [14].
En effet, en présence de bactéries, D. discoideum produit et sécrète des CML [15]. La
phagocytose étant un processus dynamique, l’internalisation de bactéries entraîne le
déplacement de certaines protéines membranaires à l’intérieur de la voie phagoendocytique. Ces protéines sont aussi utilisées comme marqueurs moléculaires permettant
d’identifier les différents compartiments de la voie phago-endocytique [16].
1.3 La voie phago-endocytique chez D. discoideum
La voie endocytique apporte à l’amibe les nutriments essentiels à sa survie [17-18].
Cette voie est composée de nombreux compartiments de nature différente. Ces
compartiments sont des ensembles de vésicules de tailles et de formes différentes [19]. Ils
peuvent ainsi avoir une taille variant entre 100 nm et plusieurs micromètres. Ils peuvent
aussi adopter des formes rondes, ovales, voire même plus complexes comme la forme d’un
fer à cheval [19]. Même si de nombreux échanges ont lieu entre ces différents
compartiments, chacun conserve son identité et sa composition [20]. Pour maintenir cette
composition unique, les divers compartiments sont dotés d’une très grande efficacité de
triage [21]. Pour pouvoir être fonctionnels, les compartiments doivent recruter ce qui est
nécessaire, entre autres, à leur formation, leur transport, leur attachement et leur fusion
membranaire [22].
2
La voie endocytique chez D. discoideum peut être résumée à l’aide du schéma de la
Figure 1. Une coupe phagocytique ou macropinocytique (tout dépendant s’il s’agit de
particules solides ou de fluide) se forme à la surface cellulaire par réarrangement du
cytosquelette d’actine de la cellule (étape 1) [23]. Lorsque la coupe se referme, cela forme
le premier compartiment de la voie endocytique. Ce compartiment naissant est nommé
phagosome lorsqu’il contient des particules solides [24] et macropinosome quand son
contenu est un fluide (étape 2) [19].
Entre une à cinq minutes après l’internalisation, le phagosome/macropinosome perd son
manteau d’actine, ce qui rend possible la fusion d’endosomes contenant des pompes
H+-ATPase à ces compartiments [25]. Ces pompes à protons permettent l’acidification des
phagosomes/macropinosomes [26]. Ces compartiments deviennent alors des lysosomes
(étape 3). L’acidification permet la digestion du contenu du lysosome grâce à des enzymes
lysosomales [27]. Le matériel non digérable est conservé et le lysosome mature en
lysosome tardif (étape 4) [28]. Ce compartiment neutre [29] ne contient pas de pompe à
proton [30]. Le contenu non digérable s’y retrouve et de nombreuses couches protéolipidiques peuvent s’y former, donnant naissance aux CML [14]. L’exocytose du lysosome
tardif se fait par fusion de la membrane du compartiment avec celle de la membrane
cellulaire. Cela crée un domaine d’exocytose provisoire à la surface de l’amibe (étape 5)
[31].
Certaines protéines de la membrane plasmique de l’amibe se retrouvent internalisées
lors de la formation de la coupe phagocytique ou macropinocytique. Pour garder un bon
équilibre, certaines sont recyclées à la surface cellulaire via des endosomes de recyclage
(étape 6) [31]. Une autre organelle de l’amibe, la vacuole contractile, possède certaines
protéines, comme les pompes H+-ATPase qui pourraient être fournies à la voie endocytique
pour en permettre l’acidification. La principale fonction de cette organelle est de contrôler
la pression osmotique dans la cellule en évacuant le surplus d’eau (étape 7) [32]. Puisque la
voie endocytique est un processus continu plutôt qu’une succession distincte de
compartiments, il est difficile de déterminer combien il existe de compartiments
exactement. Toutefois, certains changements durant la voie, comme expliqué plus haut,
3
permettent de bien définir la présence des compartiments décrits. Une explication plus
détaillée de chacun des compartiments sera faites dans les sections suivantes.
Figure 1. Schéma décrivant la voie endocytique chez D. discoideum.
Étape 1: Formation de la coupe phagocytique ou macropinocytique par réarrangement du
cytosquelette d’actine. Étape 2: Fermeture de la coupe, formation du compartiment naissant
(phagosome ou macropinosome) et perte du manteau d’actine. Étape 3: Fusion de vésicules
lysosomales avec le compartiment naissant, acidification du compartiment qui devient un
lysosome, activation des enzymes lysosomales et digestion du matériel digérable. Étape 4:
Maturation du lysosome en lysosome tardif, augmentation du pH, formation de corps
multilamellaires et formation du manteau d’actine. Étape 5: Fusion du lysosome tardif à la
membrane plasmique et exocytose. Étape 6: Récupération de certaines protéines du
compartiment naissant vers la surface cellulaire via les endosomes de recyclage. Étape 7:
Vacuole contractile contenant des pompes H+-ATPase et servant à l’osmorégulation (figure
provenant de S. Charette, comm. personnelle).
La Figure 2 montre une cellule de D. discoideum marquée à l’aide de trois anticorps
différents reconnaissant trois protéines, soit les pompes H+-ATPase, p80 et Rh-50. L’image
a été obtenue en microscopie confocale. Le marquage des pompes H+-ATPase permet de
situer la membrane plasmique, la vacuole contractile et les compartiments acides, soit les
lysosomes alors que le marquage de la protéine p80 montre la membrane plasmique et tous
les compartiments de la voie endocytique [33]. Le marquage de la protéine Rh-50, quant à
lui, sert à situer la vacuole contractile [34]. Ainsi, on peut voir sur la dernière image de la
même cellule que les compartiments ayant un marquage plus prononcé sont des lysosomes
tardifs, puisqu’ils ne contiennent aucune pompe H+-ATPase.
4
Figure 2. Les différents compartiments de la voie endocytique chez D. discoideum.
Microscopie confocale d’une cellule de D. discoideum. La cellule est marquée à l’aide de
trois anticorps reconnaissant les protéines H+-ATPase (en rouge), p80 (en vert) et Rh-50 (en
bleu). La protéine H+-ATPase se retrouve dans la vacuole contractile et dans les
compartiments acides (lysosomes). La protéine p80 se retrouve à la surface cellulaire
(signal faible) et dans tous les compartiments de la voie endocytique. La protéine Rh-50 se
retrouve dans la vacuole contractile. Les compartiments marqués d’un astérisque sont les
lysosomes tardifs (protéine p80 fortement présente et absence de la H+-ATPase) (échelle à
5 µm) (figure provenant de S. Charette, comm. personnelle).
1.3.1 La dynamique de la voie phago-endocytique
Le cytosquelette d’actine est essentiel au bon fonctionnement de la voie endocytique,
que ce soit par le réarrangement de la membrane plasmique [18], par l’organisation du
cytosol, par le transport vésiculaire et dans le maintien de la morphologie cellulaire [35].
Pour qu’il y ait internalisation de milieu liquide ou de particules solides, il doit y avoir
réarrangement du cytosquelette d’actine [23]. Il y a d’abord accumulation d’actine par sa
polymérisation en périphérie de la cellule et qui provoque la formation de protrusions
membranaires nommées pseudopodes [36], pour former la coupe phagocytique ou
macropinocytique [37-38]. Le phénomène d’endocytose se produit à un rythme de 0,6
µL/106 cellules/heure, c’est-à-dire que 106 cellules ingèrent 0,6 µL à chaque heure [39].
L’endocytose représente ici, dans le cas de l’amibe D. discoideum, le phénomène général
d’internalisation de particules solides ou de fluide, soit respectivement la phagocytose et la
macropinocytose. Les filaments d’actine (F-actine) se désassemblent entre 16 et 20
secondes après leur formation [40-41] pour laisser place à l’assemblage de nouveaux
5
filaments d’actine. Ce nouvel assemblage ne dure que quelques secondes [41]. Cette actine
dirige le phagosome loin du cortex cellulaire [41-42]. Le cytosquelette d’actine aide ensuite
à certaines des étapes suivantes de la voie endocytique dont la fusion et le transport des
endosomes [43-44], mais aide aussi à prévenir la fusion avec d’autres endosomes dans les
moments inappropriés [18]. Au dernier compartiment de la voie endocytique, soit le
lysosome tardif, il y a de nouveau formation d’un manteau de F-actine [45] pour ensuite
permettre l’exocytose [18, 46]. Toutefois, ni l’endocytose ni l’exocytose n’ont lieu à des
sites fixes [28] (voir la Figure 3).
Figure 3. Cytosquelette d'actine.
Microscopie confocale d’une cellule de D. discoideum. La cellule est marquée à l’aide d’un
anticorps reconnaissant la protéine p80 (en vert) et d’une molécule se liant à l’actine, la
phalloïdine couplée au Texas Red (en rouge). L’élément 1 montre une coupe
macropinocytique. À l’élément 2, l’actine est toujours présente sur le macropinosome
nouvellement formé. L’actine disparaît à l’élément 3 (lysosome) et réapparaît à l’élément 4
(lysosome tardif) où on retrouve aussi une plus grande accumulation de p80. L’élément 5
montre un domaine d’exocytose de la cellule révélé par une forte présence de la protéine
p80 (échelle à 5 µm). L’élément 6 est un pseudopode en formation à la surface de la cellule
(figure provenant de S. Charette, comm. personnelle).
Les microtubules jouent un rôle crucial dans le transport vésiculaire. Par exemple, après
la formation du phagosome, celui-ci est transporté par les microtubules [47-48] vers le
centrosome [42]. Le transport peut se faire selon différents mouvements, soit par des
directions inversées, en zig-zag [42], bidirectionnellement [19, 49] ou avec des sauts
6
périodiques [50]. Le mouvement bidirectionnel se produit à une vitesse variant entre 0,5 et
2 µm/s [51]. La vitesse des sauts des petits endosomes est de 1,7 à 2,1 µm/s, alors que pour
les gros endosomes, il s’agit de 0,7 à 1,0 µm/s [19].
La voie endocytique est un processus linéaire, ce qui signifie que tout le matériel ingéré
traverse la voie endocytique, en partant de la phagocytose/macropinocytose, pour ressortir
de la cellule par exocytose [36, 52]. Plusieurs études s’entendent pour dire que la voie
endocytique se déroule au complet en 60 minutes [42, 53]. Toutefois, il y a une certaine
homéostasie qui s’installe, pour créer un équilibre entre l’endocytose et l’exocytose [28,
54]. Par exemple, lorsque les nutriments ne sont pas assez abondants, la voie endocytique
ralentie, c’est-à-dire que l’endocytose et l’exocytose sont beaucoup plus lentes [55].
1.3.2 Phagocytose versus macropinocytose
L’endocytose est le processus par lequel D. discoideum acquière les nutriments
essentiels à sa survie [19, 56] par internalisation de fluide ou de macromolécules du milieu
extracellulaire [33, 57]. L’internalisation de particules se nomme la phagocytose [24, 58],
alors que l’internalisation de fluide se nomme la macropinocytose [19, 57]. Lorsque D.
discoideum se trouve dans son environnement naturel (c’est-à-dire le sol forestier), ses
principales sources de nutriments sont les bactéries [41, 59] et d’autres microorganismes
qu’elle internalise par phagocytose.
Le processus de la phagocytose est essentiellement similaire à celui de la
macropinocytose [36, 57] que ce soit morphologiquement [36, 60], biochimiquement [61]
ou fonctionnellement [36]. Tous deux sont des moyens efficaces utilisés par la cellule afin
d’ingérer des nutriments [16, 31]. Les deux processus nécessitent la présence de filaments
d’actine (F-actine) [17, 57]. Toutefois, il existe certaines différences entre la phagocytose et
la macropinocytose. La cellule utilise la phagocytose pour ingérer des particules ayant une
taille de l’ordre du dixième de micromètre ou plus [52, 62]. Le processus débute par la
liaison d’une particule à des récepteurs spécifiques de la surface cellulaire [62-63] suivie du
réarrangement du cytosquelette d’actine tel que mentionné plus haut [64]. Un exemple de
7
récepteurs spécifiques serait les protéines SadA [65] et SibA [66]. Aucun récepteur n’est
connu pour la macropinocytose. Des pseudopodes sont générés et la coupe phagocytique
est alors formée et s’étend autour des particules liées aux récepteurs [38, 67]. Les particules
sont amenées à l’intérieur de la cellule grâce à l’action du cytosquelette d’actine [68]. Les
particules se retrouvent alors dans un phagosome [69]. Dans ce compartiment, le pH est
près de la neutralité [28].
Pour ce qui est de la macropinocytose, le processus débute par l’invagination en forme
de V [18] de la membrane plasmique à l’aide du cytosquelette d’actine [18, 57], ce qui
mène à la formation de pseudopodes [36]. De cette manière, une grande quantité de fluide
est ingérée [57]. Lorsque la coupe macropinocytique se referme, le fluide ingéré se retrouve
dans un compartiment nommé macropinosome [36, 57]. Celui-ci a, en général, une taille
supérieure à 500 nm de diamètre [18]. Le macropinosome naissant se met ensuite à bouger
de manière centripète afin d’avoir une forme circulaire [18].
Tout comme la présence de récepteurs spécifiques est observée seulement pour la
phagocytose, il existe aussi une particularité pour la macropinocytose : le macropinosome
peut se fragmenter en plusieurs petites vésicules (S. Charette, comm. personnelle). Ce
phénomène n’est pas observé pour les phagosomes, puisque ceux-ci contiennent des
particules solides.
Les étapes subséquentes de la voie endocytique, c’est-à-dire l’acidification du
phagosome ou du macropinosome, se déroulent de la même façon pour les deux processus.
L’internalisation de fluide ou de particules solides du milieu extracellulaire mène à la
capture de protéines de la membrane plasmique. De ce fait, le triage des protéines dans ces
compartiments précoces est un processus important pour conserver leur composition
spécifique [70]. Le triage des protéines sera discuté plus profondément dans la section sur
les endosomes de recyclage. Toutefois, certaines protéines sont exclues lors de la formation
de la coupe phagocytique et macropinocytique [70].
8
1.3.3 Les endosomes de recyclage
Comme mentionné dans la section précédente, lors de la phagocytose ou de la
macropinocytose, une partie de la membrane plasmique est internalisée [71]. Ainsi, un tri
de plusieurs protéines membranaires est nécessaire pour en recycler certaines à la surface
cellulaire via les endosomes de recyclage [16] afin de conserver la spécificité de la
composition des compartiments [70] de même que celle de la surface cellulaire [72]. Une
partie du triage se fait dans la coupe phagocytique/macropinocytique alors que le reste se
fait dans le phagosome [70]. Les protéines H36 et PM4C4 sont des exemples de protéines
recyclées dans la coupe phagocytique/macropinocytique avant sa fermeture [70]. Lors du
triage dans le phagosome, les particules et le fluide ingérés passent à l’étape de la digestion
lysosomale tandis que les protéines membranaires sont recyclées à la surface cellulaire par
les endosomes de recyclage [22]. Une des protéines membranaires recyclées dans le
phagosome est p25 [16]. La démonstration de l’existence des endosomes de recyclage chez
D. discoideum s’est faite grâce à la présence de cette protéine dans ces compartiments [16].
Cette protéine se retrouve à la surface de la cellule [33], dans la coupe phagocytique ou
macropinocytique [70], dans le phagosome [33] et dans les endosomes de recyclage [16].
La Figure 4 montre une cellule de D. discoideum en microscopie confocale. Les
protéines p80 et p25 sont marquées par immunofluorescence. Les endosomes de recyclage
(en rouge) se situent à l’extérieur des compartiments (en vert) [16]. Le processus de
recyclage des protéines se déroule pendant environ 10 minutes après l’internalisation des
particules ou du fluide [16]. Les endosomes de recyclage se forment par bourgeonnement
de petites vésicules tubulaires en provenance du phagosome [19].
9
Figure 4. Visualisation des endosomes de recyclage grâce à la protéine p25.
Microscopie confocale d’une cellule de D. discoideum. La cellule est marquée à l’aide de
deux anticorps reconnaissant la protéine p80 (en vert) et la protéine p25 (en rouge). La
protéine p80 est présente à la surface cellulaire et dans tous les compartiments de la voie
endocytique. La protéine p25 est aussi une protéine membranaire se retrouvant dans les
compartiments naissants (non montré sur cette image) et absente des compartiments de la
voie endocytique (lysosomes et lysosomes tardifs). Chaque petit point rouge représente un
endosome de recyclage (échelle à 5 µm) (figure provenant de S. Charette, comm.
personnelle).
1.3.4 Les lysosomes
Le lysosome est le compartiment qui permet la digestion enzymatique du matériel
ingéré par D. discoideum [17, 73]. Lors de la phagocytose comme de la macropinocytose, il
y a dépolymérisation du manteau d’actine qui entoure le compartiment naissant [57]. Cela
rend alors possible la fusion du compartiment avec des lysosomes déjà présents dans la
cellule [74]. Cette dépolymérisation d’actine se fait rapidement, c’est-à-dire en quelques
secondes tout au plus une minute [18, 47]. La fusion entre les compartiments naissants et
les lysosomes est facilitée par le transport des endosomes via les microtubules (discuté dans
la section 1.3.1). Cette fusion permet ainsi l’ajout de pompes H+-ATPase [25, 41].
L’abaissement du pH du lysosome se fait à l’aide du transfert de protons par les pompes
H+-ATPase
10
à
l’intérieur
du
compartiment.
Ces
pompes
sont
des
protéines
transmembranaires du lysosome [26, 75]. L’acidification débute environ cinq minutes après
l’internalisation de fluide ou de particules solides [70].
Lors de l’acidification, le pH atteint une valeur inférieure à 3,5 [76]. Cette acidification
active les enzymes lysosomales présentes dans le compartiment, comme des protéases, des
nucléases, des lipases et des glycosidases [77]. Une fois activées, ces enzymes vont
dégrader le matériel digérable. D. discoideum peut digérer jusqu’à 1000 bactéries par
génération [1].
1.3.5 Les lysosomes tardifs
Après la digestion enzymatique, le pH du lysosome augmente pour devenir presque
neutre, soit de 6,0 à 6,2 [29, 77]. Cette augmentation dure environ 20 à 25 minutes [77].
Les enzymes lysosomales et les pompes à protons sont récupérées du lysosome tardif via
des vésicules de recyclage [17, 30]. Ces vésicules servent possiblement à acidifier les
nouveaux phagosomes subséquents [17].
Le lysosome tardif est le dernier compartiment avant l’exocytose. C’est aussi à cette
étape qu’il y a formation de corps multilamellaires (CML) [78]. Cependant, cette
production de CML est observée seulement quand les cellules sont cultivées en présence de
bactéries comme source de nutriments et non lorsque cultivées dans un milieu de culture
liquide [14-15]. Vraisemblablement, les CML se forment par invagination répétée de la
membrane du lysosome tardif pour former des couches protéo-lipidiques provenant de
l’amibe [14]. Le matériel non digéré par les lysosomes se retrouve dans les lysosomes
tardifs avant d’être exocyté hors de l’amibe [28, 42]. Le matériel non digéré peut être du
fluide ou des particules solides [19, 79].
Autour du lysosome tardif, il y a polymérisation d’un manteau de filaments d’actine
[45, 53]. Ce manteau est d’ailleurs nécessaire à l’exocytose (discuté dans la section 1.3.6)
[18] et prévient les interactions et fusions entre les lysosomes tardifs [80]. Il y a aussi une
11
présence plus importante de la protéine p80 à la surface de la membrane du compartiment
[33].
1.3.6 L’exocytose
L’exocytose est la dernière étape de la voie endocytique. Elle consiste en la
sécrétion hors de l’amibe de tout le matériel non digéré/accumulé contenu dans le lysosome
tardif [31, 53]. Le processus d’exocytose nécessite la présence accrue de filaments d’actine
[18, 45]. La protéine p80 est aussi présente de façon plus importante que pour le reste de la
voie endocytique. L’exocytose se fait par fusion du lysosome tardif avec la surface
cellulaire [28, 31]. L’exocytose dure quelques secondes seulement [17, 47]. Les CML se
retrouvent ainsi dans le milieu extracellulaire [78]. Même si certaines enzymes lysosomales
sont récupérées lors du passage au lysosome tardif, une fraction de celles-ci est aussi
sécrétée dans le milieu extracellulaire lors de l’exocytose [81-82]. Le processus
d’exocytose permet à la membrane plasmique qui a été internalisée au début de la voie lors
de la formation de la coupe phagocytique ou macropinocytique d’être récupérée à la surface
cellulaire [36]. Lorsque tout le contenu du lysosome tardif est à l’extérieur de la cellule, le
signal d’actine disparaît [18]. L’exocytose a lieu de 60 à 90 minutes après le début de la
voie, soit l’internalisation de fluide ou de particules solides [83-84].
1.4 Résistance à la prédation : Mécanismes de résistance et corps
multilamellaires (CML)
Certaines bactéries ont développé des mécanismes de résistance à la phagocytose
par les protozoaires [85]. Chez les amibes, on nomme ces bactéries des ARB (amoeba
resisting bacteria, bactéries résistantes aux amibes). Plusieurs bactéries sont connues pour
être ARB (Tableau 1). Certaines sont des pathogènes extracellulaires et d’autres sont des
pathogènes intracellulaires obligatoires ou facultatifs [85]. Puisque certaines bactéries
pathogènes pour l’humain telles les légionelles ou les mycobactéries résistent aussi à la
prédation par les amibes comme Dictyostelium [86], il est important de comprendre la
12
relation entre les ARB et les amibes dans la propagation des maladies infectieuses. La
prédation inclue les processus de phagocytose et de digestion.
Il existe trois grands mécanismes de résistance à la prédation. Il y a la lyse
amibienne, l’évitement de la phagoctyose et l’enrobage de bactéries. La résistance de
certaines bactéries a déjà été étudiée. C’est le cas de L. pneumophila, un pathogène
intracellulaire qui se laisse internaliser par les phagocytes, mais qui empêche sa digestion
pour ensuite profiter des nutriments de l’hôte pour sa multiplication [86]. Ce phénomène
n’est pas unique aux amibes puisque certaines bactéries en font de même chez les
macrophages [1, 87]. L. pneumophila est l’agent infectieux responsable de la légionellose,
une maladie pulmonaire parfois mortelle [88]. Cette bactérie contourne la voie
phagocytique de certaines amibes en recrutant des protéines du réticulum endoplasmique de
la cellule hôte. Ce recrutement est réalisé à l’aide de toxines sécrétées par le système de
sécrétion de type 4 de la bactérie. De cette manière, cette dernière n’est pas reconnue par la
cellule et peut donc profiter des nutriments offerts par celle-ci afin de se multiplier. À la fin
de son cycle de multiplication, la bactérie est sécrétée dans le milieu extracellulaire soit
suite à la lyse cellulaire [85, 89-90], soit par exocytose (Figure 5) [91]. Dans le dernier cas,
il peut y avoir formation de CML dans lesquels sont enrobées les bactéries (Figure 6) [10].
Donc, deux des mécanismes de résistance à la prédation peuvent être utilisés par
L. pneumophila : la lyse amibienne et l’enrobage de bactéries.
13
Tableau 1. Ensemble des bactéries connues pour être résistantes aux amibes et leurs
caractéristiques.
Tableau tiré de Greub et Raoult, 2004 [85]
14
Figure 5. Cycle de multiplication intracellulaire de L. pneumophila dans une cellule
eucaryote.
a. Liaison de L. pneumophila à la cellule hôte et formation d’une vacuole autour de la
bactérie; b. Évitement de la dégradation lysosomale; c. Sécrétion de toxines effectrices par
la bactérie et recrutement de protéines du réticulum endoplasmique de la cellule hôte;
d. Maturation de la vacuole de réplication; e. Multiplication intracellulaire; f. Sortie des
bactéries par lyse cellulaire ou exocytose (figure tirée de Hubber et Roy, 2010) [91].
15
Figure 6. Bactéries L. pneumophila enrobées dans un corps multilamellaire produit et
sécrété par A. castellanii.
Échelle à 1 µm (figure tirée de Berk, 1998) [10].
Le phénomène d’enrobage de bactéries est encore peu connu. Cet enrobage est sous
forme de CML. Comme mentionné dans la section 1.3.5 portant sur la voie endocytique, les
CML sont formés par l’invagination répétée de la membrane du lysosome tardif pour
former des couches protéo-lipidiques provenant de l’amibe [14]. Il s’agit d’un phénomène
dépendant de l’amibe et non de la bactérie internalisée [92]. Une caractérisation des lipides
des CML montre que ceux-ci sont principalement d’origine amibienne [15]. Toutefois, il y
a certaines variations morphologiques des CML dépendant de la bactérie digestible sur
laquelle croît les amibes [92]. Chez D. discoideum, les CML sont produits même s’il n’y a
pas de matériel non digérable présent. Par contre, la présence de bactéries digérables est
requise pour stimuler leur production. Une simple culture des amibes en milieu axénique ne
suffit pas à la production de CML [15]. D’autres amibes sont aussi connues pour produire
des CML telle A. castellanii [92]. La production de CML contenant des bactéries par les
amibes pourrait augmenter la transmission des ARB [92].
16
1.5 Bactéries résistantes aux amibes
Différents types d’ARB seront considérés dans la présente étude afin d’évaluer leur
interaction avec l’amibe D. discoideum (voir le chapitre 2). Les espèces bactériennes
considérées dans cette étude sont toutes des agents pathogènes infectant les humains. Il
s’agit d’Escherichia coli, de Salmonella typhimurium et de Pseudomonas aeruginosa. Une
brève description de leurs caractéristiques est donnée ci-dessous.
1.5.1 E. coli O157:H7
La bactérie à Gram négatif E. coli existe sous différents sérotypes. La majorité
d’entre eux fait partie de la flore gastrointestinale de l’humain. Toutefois certains sérotypes
sont des formes pathogènes de la bactérie. C’est le cas d’E. coli O157:H7, une souche qui a
acquis certains facteurs de virulence. Ces facteurs se retrouvent sur des plasmides, des
transposons, des bactériophages et des îlots de pathogénicité [93]. E. coli O157:H7 est un
agent pathogène responsable de diarrhées sanguignolantes dont la première description a
été faite en 1982 [94-95]. Aux États-Unis, elle cause de grandes pertes économiques
totalisant une somme annuelle de 405 millions de dollars [96]. Cette bactérie pathogène se
transmet principalement par la consommation d’eau et d’aliments contaminés [97].
Cependant, il existe aussi une autre voie de transmission potentielle : les aérosols [98].
Sachant qu’E. coli O157:H7 se retrouve dans les environnements humides, tout comme les
amibes, et que cette bactérie est capable de survivre et de se répliquer à l’intérieur de
certaines amibes, celles-ci pourraient favoriser la transmission de cette bactérie pathogène
[99].
1.5.2 S. typhimurium
S. typhimurium, dont le nom exact est S. enterica sérotype typhimurium, est une
bactérie pathogène intracellulaire facultative. Dans certains cas, cette bactérie a la capacité
de se multiplier à l’intérieur d’une cellule hôte. S. typhimurium est le principal agent
17
responsable de gastroentérites d’origine alimentaire chez les animaux et les humains. Elle
infecte les cellules épithéliales de l’intestin [100-101]. Cette maladie peut entraîner des
problèmes sanitaires et économiques majeurs. Par exemple, aux États-Unis, 550 décès liés à
ce type de gastroentérites sont recensés en moyenne par année [102]. S. typhimurium
possède un système de sécrétion de type 3 encodé par deux îlots de pathogénicité : le SPI1T3SS et le SPI2-T3SS (Salmonella pathogenicity island type 3 secretion system). Ces deux
types d’îlots de pathogénicité ont des fonctions différentes lors de la phagocytose de
S. typhimurium par des amibes ou des macrophages. Le SPI1-T3SS stimule la phagocytose
pour que la cellule hôte internalise la bactérie, tandis que le SPI2-T3SS favorise
l’établissement d’une niche de réplication par sécrétion de plusieurs protéines effectrices à
l’intérieur de la cellule [103-104]. Le SPI2-T3SS contrôle aussi la virulence de la bactérie
[105-106]. Puisque les différents types d’îlots de pathogénicité ont des fonctions jouant un
rôle sur la phagocytose par des amibes, il serait intéressant de vérifier leur impact sur le
processus d’enrobage de bactéries.
1.5.3 P. aeruginosa
P. aeruginosa est une bactérie à Gram négatif qui est un pathogène opportuniste.
C’est une bactérie ubiquitaire dans les environnements humides, les sols et l’eau, ainsi que
chez les plantes et les animaux [107-109]. C’est aussi un contaminant fréquent dans les
environnements humains comme les cabinets dentaires [110]. Elle a la capacité de former
des biofilms et elle possède plusieurs systèmes de sécrétion qui permettent la production de
facteurs de virulence [111-112]. Elle produit, entre autres, l’exotoxine A, des protéases, la
pyocyanine, la pyocine et des rhamnolipides [111, 113]. P. aeruginosa possède trois
systèmes de régulation de l’expression de ces gènes nommés quorum sensing : las, PQS et
rhl [111]. L’expression des gènes de virulence de P. aeruginosa est régulée par les
systèmes du quorum sensing. Outre l’atteinte d’un niveau seuil d’individu, les systèmes
nécessitent la présence de stimuli environnementaux pour permettre l’expression des gènes
de virulence de façon adéquate. Les facteurs environnementaux influençant les systèmes du
quorum sensing sont, notamment, le fer et l’azote disponibles, la température, l’osmolarité
ou la densité cellulaire de la population bactérienne [114-115].
18
P. aeruginosa possède plusieurs systèmes de sécrétion. Certains de ces systèmes de
sécrétion produisent des facteurs de virulence à différentes fins, que ce soit pour capturer
des ions essentiels comme le fer, pour se nourrir ou pour se défendre contre des cellules
hôtes eucaryotes ou d’autres bactéries [116]. Dans le dernier cas, les bactéries infectent
l’hôte en sécrétant des facteurs de virulence afin de diminuer la défense de l’hôte, de
bouleverser les signaux de la cellule pour bénéficier de celle-ci ou de l’utiliser pour se
répliquer [117].
Selon le type de système de sécrétion, il existe différents facteurs de virulence. Il
existe deux mécanismes distincts dans les systèmes de sécrétion. Il y a le mécanisme en une
étape et celui en deux étapes. Le mécanisme de sécrétion en une étape permet la
translocation des protéines du cytoplasme de la bactérie directement à la surface cellulaire
[116]. Le mécanisme en deux étapes, quant à lui, permet la transition des protéines dans le
périplasme avant d’être transloquées au travers de la membrane externe [116].
Les systèmes de sécrétion qui fonctionnent selon le mécanisme de sécrétion en deux
étapes utilisent soit la voie Sec-dépendant [118], soit Tat-dépendant (Tat : Twin Arginin
Translocation) [119] pour la première étape de translocation. Cette première translocation
du cytoplasme de la bactérie vers le périplasme est indépendante du système de sécrétion
[116]. Les substrats Sec-dépendants sont transloqués dans le périplasme sous une forme
non repliées, alors que les substrats Tat-dépendant ont une forme repliée [116]. Après la
première translocation, les protéines convergent vers leurs systèmes de sécrétion respectifs,
soit les types II et V. Les systèmes de sécrétion fonctionnant selon le mécanisme de
sécrétion en une étape sont, quant à eux, ceux de types I, III et VI. Étant donné la présence
de P. aeruginosa dans plusieurs environnements humides et même dans les installations
humaines et sa capacité d’être virulente par la formation de biofilm ou par la production de
facteurs de virulence, l’étude de l’interaction de cette bactérie avec des amibes serait
intéressante afin de mieux cibler l’impact des facteurs de virulence sur l’enrobage de
bactéries.
19
1.6 Problématique des bactéries enrobées
L’enrobage de bactéries procure certains avantages aux bactéries présentes à
l’intérieur des CML. Ainsi, il y a une augmentation de la résistance à différents stress
environnementaux [10, 120-121]. Ceux-ci sont, entre autres, les cycles de gel-dégel, les
biocides et les antibiotiques [10, 122-123]. Certaines études proposent que les humains
pourraient être infectés par inhalation de CML contenant des bactéries comme les
légionelles [88, 120] pourvu que les bactéries contenues dans les CML supportent plus
facilement le stress de l’aérosolisation que les bactéries qui ne sont pas enrobées. En effet,
les particules aérosolisées qui sont respirables sont celles ayant une taille inférieure à 3,5
µm de diamètre [124]. Puisque les bactéries enrobées par les protozoaires ont une taille
entre 2 et 6 µm [10, 120], celles-ci auraient la taille adéquate pour être respirées par les
humains et se retrouver dans les alvéoles pulmonaires [10]. Les bactéries enrobées
pourraient donc favoriser la propagation des maladies infectieuses via l’aérosolisation.
20
CHAPITRE 2 – HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS SPÉCIFIQUES
Hypothèse
Étant donné que certaines bactéries pathogènes se retrouvent dans les
environnements occupés par les humains et sachant que les amibes se retrouvent dans ces
mêmes environnements, j’émets l’hypothèse que ces bactéries pourraient se faire enrober
par les amibes. Ce projet de maîtrise permettrait de mieux comprendre le phénomène
d’enrobage de bactéries par les amibes et, ultimement, vérifier si cet enrobage favorise la
propagation de maladies infectieuses via l’aérosolisation. Pour aider à répondre à
l’hypothèse formulée ci-dessus, trois objectifs spécifiques ont été poursuivis au cours de
cette maitrise.
Objectifs spécifiques
1- Déterminer, parmi plusieurs souches d’espèces bactériennes différentes, celles qui sont
résistantes à la prédation par l'amibe D. discoideum
2- Déterminer si les bactéries résistantes affectent la viabilité des amibes
3- Vérifier si les bactéries résistantes à la prédation et non cytotoxiques se font enrober par
D. discoideum
21
22
CHAPITRE 3 – MATÉRIEL ET MÉTHODES
3.1 Cultures cellulaires et maintenance
La maintenance des amibes D. discoideum DH1-10 [125], souche utilisée au
laboratoire, a été faite à raison de deux passages par semaine dans du milieu de culture frais
pour éviter la confluence des amibes. Le milieu utilisé était le HL5 (14,3 g/L de
bactopeptone (Oxoid L37), 7,15 g/L d’extrait de levure, 18 g/L de D-(+)-maltose
monohydrate, 0,641 g/L de Na2HPO4•2H2O et 0,490 g/L de KH2PO4 pour 1 L d’eau
distillée et un pH final d’environ 6,5) [6] additionné de tétracycline (15 µg/mL). La
maintenance des amibes a été faite dans des Pétris stériles en polystyrène (100 mm x 15
mm, Fisherbrand) dans 12 mL de milieu HL5 et incubée à 21°C. La densité optimale pour
l’utilisation des amibes se situe à environ 1 x 106 cellules/mL [6].
Pour les cultures cellulaires bactériennes, le milieu de culture majoritairement utilisé
était le milieu LB-agar (10 g/L de bactopeptone, 5 g/L d’extrait de levure, 10 g/L de NaCl
et 12 g/L de bactoagar) (EMD). Pour E. coli O157:H7, P. aeruginosa et S. typhimurium, les
cultures ont été faites à 37°C [126-127] avec agitation à 200 rpm lorsque cultivées en
milieu LB liquide (même recette que le LB-agar, mais sans bactoagar) (EMD). Étant donné
le caractère pathogène des bactéries utilisées, les manipulations ont été faites dans une
enceinte de biosécurité de classe II type B2 dans un laboratoire de niveau de confinement
de classe 2.
Les neuf souches d’E. coli O157:H7 (Tableau 2) ont été fournies par le laboratoire
de la Dre Josée Harel de l’Université de Montréal. Les sept souches de S. typhimurium
(Tableau 3) ont été fournies par le laboratoire de la Dre France Daigle de l’Université de
Montréal. Les 29 isolats de P. aeruginosa (isolats cliniques et environnementaux) ont été
fournis par le laboratoire de Dr Jean Barbeau. Les isolats cliniques ont été isolés à partir de
patients atteints par la fibrose kystique à l’hôpital de Sainte-Justine (Montréal, Qc). Les
patients étaient âgés entre 4 et 18 ans (Tableau 4). Les ioslats environnementaux ont été
23
isolés des unités dentaires de la Faculté de médecine dentaire (Université de Montréal)
(Tableau 5).
Tableau 2. Tableau descriptif des souches d'E. coli O157:H7 utilisées dans cette étude.
Nom de la
souche
EDL933
EDL933 +
pKen2-GFP
EDL933 ∆stx1stx2
EDL933
∆stx1-stx2
+ pKen2-GFP
EDL933 ∆stx1
EDL933 ∆phoB
EDL933
∆pstCAB
EDL933 ∆escN
EDL933 ∆eae
24
Type de souche
Description
Isolée d'une épidémie de la maladie
du hamburger au Michigan en 1982
Souche sauvage EDL933 exprimant
la GFP
Le plasmide pKen2-GFP est un
Souche sauvage contenant
phagemide à haute copie contenant
le plasmide pKen2-GFP
une GFP mutée s'excitant de 20 à 35
fois plus intensément que la GFP
sauvage à 488 nm
La cytotoxité de cette souche est
Mutant ne possédant pas les grandement diminuée
Shiga toxines stx1 et stx2
comparée à la souche sauvage
EDL933
La cytotoxité de cette souche est
Mutant de la souche
grandement diminuée
sauvage EDL933 possédant
comparée à la souche sauvage
le plasmide pken2-GFP,
EDL933
mais ne possédant pas les
Version GFP de la souche EDL933
Shiga toxines stx1 et stx2
∆stx1-stx2
Souche moins cytotoxique pour
Mutant ne possédant pas la
l'amibe A. castellanii que la souche
Shiga toxine stx1
sauvage EDL933
Mutant ne possédant pas le Ne régule plus la réponse face à la
gène phoB
limitation du phosphate
Activation constitutionnelle du
Mutant ne possédant pas le régulon Pho
gène pstCAB
Diminution de la virulence
bactérienne
Mutant ne possédant pas le Système de sécrétion de type 3 non
gène escN
fonctionnel
Perte de l'intimine
Mutant ne possédant pas le Perte de la capacité d'attachement de
gène eae
la bactérie aux cellules épithéliales
(in vitro)
Souche sauvage
Références
[94]
[128]
[129]
[129-130]
[129-130]
[131-132]
[132-133]
[134]
[135-136]
Tableau 3. Tableau descriptif des souches de S. typhimurium utilisées dans cette étude.
Nom de la
souche
X3339
DEF208
DEF458
X8298
UK-1
Type de souche
Souche sauvage
SL1344
Mutant de
SL1344 ne
possédant pas
invA
Mutant de
SL1344 ne
possédant pas
sseB
Description
Références
Souche sauvage virulente
[137]
Mutant du système de sécrétion de
type III dans l'îlot de pathogénicité 1
chez Salmonella (SPI-1) avirulent
chez la souris
[138]
Mutant du système de sécrétion de
type III dans l'îlot de pathogénicité 2
chez Salmonella (SPI-2)
[139]
Mutant de la composante phoP du
système phoP/Q
Ne permet pas la réplication
intracellulaire de S. typhimurium dans
les macrophages
Souche sauvage virulente isolée d'un
Souche sauvage
cheval
Mutant de
SL1344 ne
possédant pas
phoP
[140]
[141]
LT2
Souche sauvage
Souche sauvage virulente
X3000
[142]
14028
Souche sauvage
Souche sauvage virulente
X8019
[143]
25
Tableau 4. Isolats cliniques de P. aeruginosa isolés de patients ayant la fibrose
kystique et utilisés dans cette étude.
26
Nombre
Sexe du
patient
Date de
naissance
Ville
Date
d'échantillonnage
279
Femme
09-04-69
Montréal Nord
17-05-88
297
Femme
25-08-80
Saint-Pie-de-Bagot
01-06-88
358
Femme
28-11-80
Laprairie
04-10-88
359
Femme
10-03-75
04-10-88
392
Homme
16-11-84
403
Femme
19-04-74
Répentigny
Saint-Roch-del'Achigan
Trois-Rivière
E-500
506
578-A
Femme
Femme
Homme
24-02-76
26-08-75
25-09-73
Mont Laurier
Saint-Blaise
Montréal Nord
26-09-89
10-10-89
31-06-90
578-B
Femme
15-06-75
31-06-90
585
Femme
18-07-72
VD 171
Femme
04-11-75
Mont Laurier
Saint-Jean sur
Richelieu
McMasterville
VD 329
Femme
04-11-75
McMasterville
23-08-88
VD 706
Femme
04-11-75
McMasterville
17-10-89
VD 564
Femme
04-11-75
McMasterville
15-05-90
VD 609
Femme
04-11-75
McMasterville
05-12-90
24-11-88
10-01-89
21-08-90
27-10-87
Tableau 5. Isolats environnementaux de P. aeruginosa provenant d'unités dentaires et
utilisés dans cette étude.
Section de
clinique
dentaire
Abréviation
de la section
Numéro de
l'unité dentaire
1
2
7
Prothèse
partielle/fixe
PPF
13
18
19
20
21
Urgence
Urg
Orthodontie
Ortho
Chirurgie
Chir
5
7
1
D-144
D-144 assistante
3.2 Test de prédation
Le test de prédation a été utilisé afin de déterminer le niveau de résistance des
bactéries à la prédation par les amibes selon des concentrations variables de ces dernières
[144]. Le test a été fait trois fois pour chaque souche bactérienne afin d’en confirmer le
résultat. Les souches ont été cultivées dans du milieu LB liquide. Ces précultures toujours
initiées à partir de bactéries congelées et faites dans des tubes Snapcap, ont été incubées
pendant 24 heures à 37°C avec une agitation de 200 rpm. Ensuite, un volume de 300 µL de
la préculture a délicatement été étalé sur l’ensemble de la surface d’un Pétri de 10 cm
contenant 35 mL de milieu de culture gélosé afin d’obtenir un tapis bactérien uniforme. Les
milieux de culture utilisés étaient le HL5-agar (même recette que le HL5 liquide, mais avec
20 g/L de bactoagar) pour les souches d’E. coli O157:H7, de milieu SM-agar (10 g/L de
bactopeptone, 1 g/L d’extrait de levure, 2,2 g/L de KH2PO4, 1 g/L de K2HPO4, 1 g/L de
27
MgSO4•7H2O et 20 g/L de bactoagar pour 950 mL d’eau distillée additionné, après
autoclavage, de 50 mL de glucose 20 g/100 mL filtré stérilement) [6] pour les souches de
S. typhimurium et de milieu SM-agar dilué 1/10 pour les isolats de P. aeruginosa. Les Pétri
ont par la suite été séchés dans une hotte à flux laminaire.
Une fois les tapis bactérien séchés, différentes concentrations d’amibes DH1-10 ont
été déposées sur le tapis bactérien sous forme de gouttes de 5 µL. Les concentrations
d’amibes étaient de 50 000 cellules/5 µL à 0 cellule/5 µL. Les amibes utilisées dans ces
expériences provenaient de cultures n’ayant pas plus de 60% de confluence. Une fois les
gouttes séchées, les Pétri étaient incubés à 21°C. La présence de plages de phagocytose a
été observée après sept jours d’incubation.
3.3 Test de lyse
Le test de lyse a été utilisé afin de déterminer si les isolats de P. aeruginosa
sécrètent des produits ayant la capacité de lyser les cellules de D. discoideum [145]. Le test
a été fait dans une plaque 24 puits stérile en polystyrène. Dans chaque puits, 500 µL de
milieu HL5 contenant 500 000 cellules de D. discoideum ont été déposés pendant un
minimum d’une heure à 21°C. Les amibes pour ces expériences provenaient de cultures
n’ayant pas plus de 60% de confluence.
Le jour précédent l’expérience, une préculture bactérienne de chaque isolat de
P. aeruginosa a été incubée pendant 24 heures à 37°C avec une agitation à 200 rpm dans 2
mL du milieu LB. Par la suite, la préculture bactérienne a été centrifugée à 3220 g pendant
10 minutes. Le surnageant a été recueilli et filtré avec un filtre stérile en polyethersulfone
de 0,2 µm fixé sur une seringue. Ensuite, le milieu HL5 contenu dans le puits a doucement
été enlevé et délicatement remplacé par le surnageant filtré d’un des isolats de
P. aeruginosa. En utilisant une caméra Moticam Pro 252A montée sur un microscope
inversé et le logiciel Motic Images Advanced 3,2, des images des mêmes cellules
amibiennes ont été prises à 0 minute et 10 minutes. Cette procédure a été répétée avec le
surnageant de chaque isolat au moins quatre fois dans des expériences distinctes. La
28
disparition de la réfringence des amibes est associée à leur lyse [145]. Le pourcentage de la
lyse cellulaire a été déterminé. La souche PAO1 a été utilisée comme contrôle positif et les
images ont été prises à 0 minute et 5 minutes étant donné la cytotoxicité importante du
surnageant de cette souche [145]. Cette souche a initialement été isolée en 1955 à
Melbourne, en Australie, à partir d’une plaie [109].
3.4 Essai d’enrobage de bactéries
La stimulation de l’enrobage a permis de déterminer si les bactéries sélectionnées
étaient enrobables. La stimulation nécessitait une coculture de trois microorganismes
différents : des amibes, des bactéries Klebsiella aerogenes et des bactéries résistantes à la
prédation et non cytotoxiques pour les amibes. L’ajout de K. aerogenes dans la coculture
avait pour but de favoriser l’activité de la voie endocytique des amibes et la production de
CML [15].
Une préculture liquide des bactéries résistantes à la prédation et non cytotoxiques a
été incubée en milieu LB liquide à 37°C pendant 24 heures avec agitation à 200 rpm. Les
K. aerogenes ont seulement été cultivées sur milieu LB-agar et resuspendues en milieu
liquide lors des manipulations. Au moment de l’expérience, la densité optique (DO à 600
nm) des bactéries devait être de 1,0, ce qui correspond à 1 x 109 cellules/mL. Les amibes
provenaient d’une culture n’ayant pas plus de 60% de confluence. Pour la coculture, la
concentration d’amibes souhaitée était de 1 x 106 cellules/mL. La coculture d’amibes, de
K. aerogenes et de bactéries ARB a été faite dans des tubes Snapcap contenant un milieu
sans nutriment, le tampon Soerensen 1X (Solution stock 50X : Na2HPO4•2H2O à 100 mM
et KH2PO4 à 735 mM, additionné de 500 mL d’eau et le pH est ajusté à 6,0 une fois la
solution 1X faite) [146]. Un milieu sans nutriment était nécessaire afin d’éviter que les
bactéries enrobées stimulées ressortent de leur enrobage et se remettent à croître. Différents
ratios ont été testés. Par exemple, un ratio de 1 amibe pour 1000 bactéries digérables (K.
aerogenes) et 10 ARB correspond à 1 : 1000 : 10. En termes de quantités, cela représente
1 million d’amibes pour 1 milliard de bactéries digérables et 10 millions d’ARB. Les
quantités d’amibes utilisées parmi les différentes concentrations variaient entre 1 million et
29
5 millions d’amibes. Celles des K. aerogenes variaient entre 100 millions et 1 milliard et
celles des ARB entre 10 et 100 millions. Le volume final des cocultures devait être
d’environ 2 mL. Les cocultures ont été incubées à 21°C pendant 24 heures avec agitation à
200 rpm. L’observation de la présence de bactéries enrobées a été faite par microscopie
électronique à transmission.
3.5 Microscopie électronique à transmission (MET)
La biomasse produite après la stimulation de l’enrobage de bactéries a été
centrifugée une première fois à 200 g pendant 5 minutes afin de sédimenter les amibes. Le
culot d’amibes a été conservé et le surnageant a par la suite été recueilli pour subir une
deuxième centrifugation à 4000 g pendant 1 minute afin de sédimenter les résidus
extracellulaires comme des bactéries enrobées ou des bactéries libres. Ce culot a par la suite
été mélangé au culot résultant de la première centrifugation et le mélange des deux culots a
été fixé pendant 3 heures dans 0,1 M de tampon cacodylate de sodium à pH 7,3. Ce tampon
contient de la glutaraldéhyde à 2% et du tétroxyde d’osmium à 0,3%. Après trois lavages
avec le tampon cacodylate de sodium, il y a eu déshydratation des échantillons dans
différentes concentrations d’éthanol, soit respectivement de 5 minutes dans l’éthanol 30%,
5 minutes dans l’éthanol 50%, 5 minutes dans l’éthanol 70%, 10 minutes dans l’éthanol
95% et une heure dans l’éthanol 100%. Par la suite, les échantillons ont été enrobés dans de
la résine Epon et incubés toute la nuit à 37°C, puis pendant trois jours à 60°C. Après cette
incubation, de très fines tranches de l’échantillon ont été coupées (entre 60 nm et 80 nm) et
colorées à l’aide de citrate de plomb à 0,1% pendant 8 minutes suivi de 5 minutes à l’aide
d’acétate d’uranyl à 3%. L’observation des échantillons a été faite au microscope
électronique à transmission JEOL JEM-1230 à 80 kV.
3.6 Production de CML par d’autres amibes
La production de CML a aussi été vérifiée pour d’autres amibes, soit A. castellanii
et H. vermiformis. Puisque les amibes produisent des CML seulement en présence de
30
bactéries, des K. aerogenes ont été utilisées ici aussi afin de stimuler la production de
CML. Ainsi, une préculture liquide de cette bactérie a été incubée à 37°C pendant 24
heures avec agitation à 200 rpm dans du LB liquide. Par la suite, 300 µL de cette préculture
a été légèrement étalée sur un milieu SM-agar dans des Pétri de 15 cm. Une fois le tapis
bactérien séché, quatre gouttes d’une suspension d’amibes de 5 µL ont été déposées. Les
Pétri ont ensuite été séchés, puis incubés à 21°C. L’apparition de plages de phagocytose a
été observée et lorsque leur croissance était adéquate, le pourtour des plages a été prélevé à
l’aide d’un embout stérile. L’échantillon a été resuspendu délicatement dans 1 mL de PBS
1X (0,262 g/L de NaH2PO4•H2O, 1,442 g/L de Na2HPO4•2H2O et 9,00 g/L de NaCl,
ajouter 900 mL d’eau, ajuster le pH entre 7,2 et 7,4, puis compléter à 1 L d’eau) pour ne
pas faire éclater les amibes. La présence de CML a par la suite été observée en microscopie
électronique à transmission (voir section 3.5 pour les détails de la MET).
31
32
CHAPITRE 4 - RÉSULTATS
4.1 E. coli O157:H7
4.1.1 Test de prédation
Les bactéries qui sont résistantes à la prédation amibienne sont celles qui ne permettent pas
la croissance des amibes lorsqu’elles sont en faible nombre sur le tapis bactérien. La Figure
7 montre un exemple de résultats obtenus pour la prédation d’E. coli O157:H7 par l’amibe
D. discoideum. On peut voir, en A, la souche sauvage EDL933, alors qu’en B, il s’agit de la
même souche, mais mutée pour le gène eae. Puisque la souche en A présente des plages de
phagocytose à toutes les concentrations d’amibes, cette souche n’est pas résistante à la
prédation. Par contre, la souche mutée ne présente qu’une seule plage de phagocytose, soit
à 50 000 amibes. Cela signifie que la souche EDL933 ∆eae est résistante à la prédation
comparativement à la souche sauvage. Le Tableau 6 présente l’ensemble des résultats
obtenus pour toutes les souches d’E. coli O157:H7. Les tests de prédation ont été faits trois
fois pour toutes les souches analysées. Les gènes mutés chez les différentes souches
impliquent des facteurs de virulence connus pour la résistance des bactéries à la prédation
(Voir le Tableau 2). L’absence de ces gènes chez les souches d’E. coli O157:H7 peut
influencer la résistance à la prédation [129-130]. En effet, on peut ainsi voir que la grande
majorité des souches ne sont pas résistantes à la prédation. Les seules souches qui sont
résistantes sont EDL933 ∆stx1 et EDL933 ∆eae. Toutefois, puisqu’il était nécessaire de
cultiver les souches d’E. coli en milieu riche (HL5-agar) pour avoir un tapis bactérien, cela
n’est pas compatible avec l’idée que les essais d’enrobage doivent être fait avec un milieu
sans nutriment. E. coli O157:H7 n’est donc pas une bonne candidate à l’enrobage.
33
Figure 7. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les souches
d'E. coli O157:H7.
Plusieurs quantités d’amibes ont été deposées sur un tapis d’E. coli O157:H7 (de 50 000 à 5
amibes par goutte). Après une incubation de 7 jours, des plages de phagocytose sont
visibles où les amibes ont internalisé les bactéries. La croissance des amibes sur le tapis
bactérien de deux souches est montrée: en A. la souche (EDL933) est sensible à la
prédation des amibes tandis qu’en B. la souche (EDL933 ∆eae) est résistante. Le contrôle
négatif (Ctrl-) était une goutte de milieu HL5 sans amibe.
34
Tableau 6. Résultats des tests de prédation pour E. coli O157:H7.
Souches d’E. coli O157:H7 Exp. 1a Exp. 2 a Exp. 3 a Moyenne
Résistance à
la prédationb
-
EDL933
5
5
5
5,0
EDL933+pKen2-GFP
5
5
5
5,0
EDL933 ∆stx1-stx2
5
5
5
5,0
EDL933 ∆stx1-stx2
5
5
5
5,0
+pKen2-GFP
EDL933 ∆stx1
2
2
3
2,3
Oui
EDL933 ∆phoB
5
5
5
5,0
EDL933 ∆pstCAB
5
5
5
5,0
EDL933 ∆escN
5
5
5
5,0
EDL933 ∆eae
1
1
1
1,0
Oui
a : « Exp. » : Expérience; Une valeur est associée à la quantité d’amibes requises pour
générer une plage de phagocytose : 0 lorsque la souche résiste à plus de 50 000 amibes;
1 lorsqu’il y a une plage de phagocytose à 50 000 amibes; 2 lorsqu’il y a des plages de
phagocytose à 5 000 amibes et plus; 3 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 500 amibes
et plus; 4 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 50 amibes et plus et 5 lorsqu’il y a des
plages de phagocytose à 5 amibes et plus.
b : Le symbole « - » signifie que la souche n’est pas résistante aux amibes.
4.2 S. typhimurium
4.2.1 Test de prédation
Comme pour E. coli O157:H7, les souches de S. typhimurium résistantes à la
prédation ne permettent pas la croissance des amibes lorsqu’elles sont en faible nombre sur
le tapis bactérien. La Figure 8 est un exemple de résultat obtenu pour les souches de cette
bactérie. La souche sauvage X3339 est en A et la souche mutée DEF458 est en B. La
souche X3339 ne montre pas de plage de phagocytose à 500 amibes et moins. Seules les
concentrations de 50 000 et 5 000 amibes/5 µL ont des plages de phagocytose. Cette souche
est donc résistante à la prédation. En B, pour la souche mutée DEF458 qui est un mutant de
la souche X3339, on peut voir que, tout comme la souche sauvage, il n’y a aucune plage de
phagocytose à 500 amibes et moins. Cette souche est donc elle aussi résistante à la
prédation. Comme mentionné dans le Tableau 3, le mutant DEF458 est un mutant pour le
gène sseB qui est impliqué dans le SST3 dans l’îlot de pathogénicité de type 2 chez
35
Salmonella [139]. Toutefois, le fait que cette souche soit résistante à la prédation ne
correspond pas au résultat attendu étant donné sa mutation. Aussi, si on regarde le Tableau
7, on peut voir que toutes les souches de S. typhimurium, sauvages ou mutantes, sont
résistantes à la prédation. Les tests de prédation pour S. typhimurium ont aussi été réalisés
trois fois pour confirmer les résultats.
Un paramètre important influence la résistance à la prédation des différentes
souches. La résistance varie en fonction de la richesse du milieu de culture (Tableau 8).
Plus le milieu est riche, plus la résistance à la prédation est grande. Les souches deviennent
sensibles à la prédation en présence d’un milieu pauvre en nutriments. Le milieu de culture
qui a été conservé est le milieu qui provoquait la plus grande résistance à la prédation, soit
le milieu SM qui est relativement riche. Étant donné cette variation de résistance à la
prédation, S. typhimurium n’est probablement pas une bonne candidate à l’enrobage de
bactéries. Toutefois, puisque cette bactérie est un pathogène intracellulaire facultatif, un
essai d’enrobage a été essayé.
36
Figure 8. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les souches de
S. typhimurium.
Plusieurs quantités d’amibes ont été deposées sur un tapis de S. typhimurium (de 50 000 à 5
amibes par goutte). Après une incubation de 7 jours, des plages de phagocytose sont
visibles où les amibes ont internalisé les bactéries. La croissance des amibes sur le tapis
bactérien de deux souches est illustrée: en A. la souche sauvage X3339 est résistante à la
prédation, tout comme en B où la souche DEF458 (mutant de la souche X3339) l’est aussi.
Le contrôle négatif (Ctrl-) était du milieu HL5 sans amibe.
Tableau 7. Résultats des tests de prédation pour S. typhimurium.
Souches de
S. typhimurium
Exp. 1a
Exp. 2 a
Exp. 3 a
Moyenne
Résistance à
la prédation
2
2
2
2
Oui
X3339
2
2
2
2
Oui
X8298
DEF 208
2
2
2
2
Oui
DEF 458
2
2
2
2
Oui
UK-1
2
2
2
2
Oui
LT2
2
2
2
2
Oui
14028
2
2
2
2
Oui
a : « Exp. » : expérience; Une valeur est associée à la quantité d’amibes requises pour
générer une plage de phagocytose : 0 lorsque la souche résiste à plus de 50 000 amibes;
1 lorsqu’il y a une plage de phagocytose à 50 000 amibes; 2 lorsqu’il y a des plages de
phagocytose à 5 000 amibes et plus; 3 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 500 amibes
et plus; 4 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 50 amibes et plus et 5 lorsqu’il y a des
plages de phagocytose à 5 amibes et plus.
37
Tableau 8. Différents milieux de culture testés pour les tests de prédation de
S. typhimurium.
Expérience 1*
Milieu
Milieu
Milieu
Milieu
SM
SM 1/2
SM 1/5 SM 1/10
X3339
2
5
5
5
X8298
2
4
5
5
*Une valeur est associée à la quantité d’amibes requises pour générer une plage de
phagocytose; 0 lorsque la souche résiste à plus de 50 000 amibes; 1 lorsqu’il y a une plage
de phagocytose à 50 000 amibes; 2 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 5 000 amibes
et plus; 3 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 500 amibes et plus; 4 lorsqu’il y a des
plages de phagocytose à 50 amibes et plus et 5 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 5
amibes et plus.
Souches de
S. typhimurium
4.2.2 Essai de l’enrobage de bactéries
L’essai de l’enrobage de bactéries est réalisé par coculture d’amibes avec une
bactérie digérable (K. aerogenes) et une bactérie résistante à la prédation. Cela permet de
vérifier si la bactérie résistante se fait enrober par D. discoideum. Étant donné que toutes les
souches étaient résistantes à la prédation, une seule a été testée pour l’enrobage de
bactéries, soit la souche X3339 qui était l’une des souches sauvages disponibles pour
l’étude. À la Figure 9, on peut voir en microscopie électronique à transmission, en A, une
amibe et un lysosome tardif contenant du matériel non digéré. Il y a une bactérie qui semble
être en train de se faire enrober par des couches multilamellaires. Toutefois, il est
impossible de dire s’il s’agit de K. aerogenes ou de S. typhimurium puisque ces deux
bactéries ont une morphologie cellulaire semblable. En B, il s’agit d’un corps
multilamellaire se trouvant dans le milieu extracellulaire. On peut voir les différentes
couches protéo-lipidiques. Par contre, ce CML ne contient pas de S. typhimurium. Parmi
tous les champs observés de cet échantillon en MET, aucune bactérie enrobée à l’extérieur
des amibes n’a été observée. Par contre, il y avait des CML vides dans le milieu
extracellulaire. La morphologie de ces CML ne semblait pas être différente de celle des
CML produits en présence de K. aerogenes seulement.
38
Figure 9. Microscopie électronique à transmission d'un essai d'enrobage pour la
souche sauvage X3339 de S. typhimurium.
Le ratio d’amibes/K. aerogenes/S. typhimurium utilisé pour cet essai était 5 amibes pour
1000 K. aerogenes et 100 S. typhimurium X3339. Les trois microorganismes ont été
incubés à 21°C pendant 24 heures avec agitation à 200 rpm. En A, on peut voir une bactérie
(flèche) en train de se faire enrober dans le lysosome tardif d’une amibe. En B, il s’agit
d’un CML vide dans le milieu extracellulaire. Pour les deux images, l’échelle de mesure est
de 0,2 µm.
4.3 P. aeruginosa
La fibrose kystique est une maladie génétique qui cause l’accumulation de sécrétion
plus visqueuse et plus épaisse au niveau des alvéoles pulmonaires. Ce milieu est donc
propice au développement d’infections [147]. Les traitements de cette maladie étant de plus
en plus efficaces, l’espérance de vie des personnes atteintes de fibrose kystique a
grandement augmenté [148]. Maintenant, ce sont les maladies infectieuses secondaires qui
causent la mort chez ces personnes [149]. À la Figure 10, on peut voir que P. aeruginosa
est le principal agent infectieux selon le pourcentage de gens colonisés au niveau
pulmonaire en fonction de l’âge [150]. Les sources de P. aeruginosa infectant les patients
atteints de fibrose kystique sont inconnues. Toutefois, il est connu que cette bactérie
pathogène se retrouve dans des environnements humains comme les cabinets dentaires
[110]. Puisque les amibes sont aussi des colonisateurs de ce type d’environnements, il se
pourrait que ce soit une des sources d’infection de ces patients à P. aeruginosa.
39
Figure 10. Pourcentage des patients atteints de fibrose kystique étant infectés par
différents agents infectieux selon le groupe d'âge.
Figure tirée de Harrison, 2007 [150].
4.3.1 Origine des isolats
Certaines analyses avaient déjà été réalisées par l’équipe du Dr Jean Barbeau de
l’Université de Montréal sur les isolats de P. aeruginosa utilisées dans cette étude. Les
isolats ont diverses origines, soit clinique et environnementale. Les résultats préliminaires
portent sur une analyse génétique et des analyses phénotypiques de ces isolats, soit une
analyse génomique qui a été réalisée par une amplification aléatoire des polymorphismes de
l’ADN (Random amplified polymorphic DNA - RAPD) et des essais de formation de
biofilm et de production d’élastase.
4.3.1.1 RAPD
Le RAPD consiste en l’hybridation aléatoire de courts oligonucléotides dans une
réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour former un patron de distribution
d’amplicons selon les polymorphismes. Cette technique a déjà été utilisée pour l’étude de
40
certains isolats chez P. aeruginosa [151]. Brièvement, une extraction de l’ADN génomique
a d’abord été faite [152-153]. Après avoir analysé 54 amorces avec deux isolats de
P. aeruginosa, seulement trois montrant des patrons d’amplification utiles ont été
conservées pour analyser les 29 isolats de P. aeruginosa. Les trois amorces sont 910-07
(5’-CCGCGGGAG-3’), 910-25 (5’-GCCCGGCAG-3’) et OPA-10 (5’-GTGATCGCAG3’). Les différents patrons de polymorphismes montraient entre trois et quatre bandes
variables. Par la suite, une analyse informatique a été faite avec les programmes
RestrictoScan®,
RestrictoTyper®,
Adanson®
et
Dendrograph®
pour
créer
le
dendrogramme présenté à la Figure 11. Les isolats surlignés en orange sont les isolats
cliniques et ceux en vert sont les isolats environnementaux.
Il y a formation de trois groupes distincts entre les différents isolats.
Majoritairement, les isolats cliniques se retrouvent dans le groupe I, sauf 578-B et 506 qui
se retrouvent dans le groupe II. Les isolats environnementaux, eux, se retrouvent dans les
groupes II et III. Le dendrogramme montre la similarité entre les différents isolats. Ainsi, si
on prend la série d’isolats débutant par VD (VD 706, VD 329, etc.) dans le groupe I, il
s’agit d’isolats prélevés à partir du même patient, mais sur une période de trois ans (voir
Tableau 4). Le pourcentage de similarité entre ces isolats est de 90%. L’isolat clinique 297
a aussi 90% de similarité avec la série d’isolats VD, mais il a été isolé à partir d’une autre
patiente atteinte de la fibrose kystique.
41
Figure 11. Dendrogramme obtenu suite à l'analyse informatique du RAPD des isolats
cliniques et environnementaux de P. aeruginosa.
Une analyse informatique permet de séparer les isolats en différents groupes (groupe I, II et
III) à partir des patrons de bandes obtenus par la méthode RAPD. Les isolats surlignés en
orange sont les isolats cliniques et ceux surlignés en vert sont les isolats environnementaux
provenant de cabinets dentaires. Les isolats cliniques se retrouvent majoritairement dans le
groupe I et les isolats environnementaux dans les groupes II et III (Jean Barbeau, comm.
personelle).
4.3.1.2 Formation de biofilm
La première analyse phénotypique réalisée sur ces isolats est la formation de
biofilm. La méthode utilisée était la coloration au Crystal violet en microplaque [154].
Cette méthode consiste en fait à produire un biofilm par incubation des isolats à 30°C
42
pendant 24 heures sans agitation. Après quelques étapes de lavages et de séchage, la
coloration des bactéries ayant formées un biofilm est faite avec le Crystal violet.
L’observation de la formation de biofilm se fait au spectrophotomètre à 570 nm. Les 29
isolats de P. aeruginosa ont été testés et les résultats sont présentés à la Figure 12 sous
forme d’un diagramme en boîte. On peut voir que les isolats du groupe III forment plus
facilement un biofilm, alors que ceux du groupe II n’en forment que très peu. Pour ce qui
est des isolats du groupe I, ils ont un phénotype variable dont la tendance pointe vers une
faible production de biofilm.
Figure 12. Diagramme de la capacité des isolats de P. aeruginosa à former un biofilm
en fonction de leur groupe de similitude.
La formation du biofilm par les isolats de P. aeruginosa est déterminée par coloration des
bactéries au Crystal Violet. La lecture au spectrophotomètre permet d’obtenir différentes
densités optiques représentées dans le diagramme en boîte. Les isolats du groupe III
forment significativement plus de biofilm que ceux des groupes I et II (Annie Leduc,
comm. personnelle).
43
4.3.1.3 Production d’élastase
La deuxième analyse phénotypique faite avec les 29 isolats de P. aeruginosa est la
production d’élastase. La méthode utilisée est tirée de Rust et al. (1994) et consiste à
ajouter de l’élastine au surnageant de P. aeruginosa et de vérifier si elle se fait digérer par
l’élastase en mesurant la densité optique [155]. Ainsi, les données recueillies sont
présentées à la Figure 13. Le groupe III se distingue encore une fois des autres, puisque les
isolats de ce groupe produisent significativement moins d’élastase que ceux des groupes I
et II. Pour ces derniers groupes, la production d’élastase est variable.
Figure 13. Diagramme de la production d'élastase par les isolats de P. aeruginosa.
La production d’élastase est déterminée par la capacité à dégrader l’élastine. L’observation
au spectrophotomètre permet d’obtenir ce diagramme en boîte. Les isolats du groupe III
produisent significativement moins d’élastase que ceux des groupes I et II (Annie Leduc,
comm. personnelle).
44
4.3.2 Test de prédation
Tout comme pour les autres espèces bactériennes, les isolats de P. aeruginosa étant
résistants à la prédation sont ceux qui ne permettent pas la croissance des amibes
lorsqu’elles sont en faible quantité sur le tapis bactérien. Ainsi, comme le montre la Figure
14, l’isolat 578-B en A est un isolat clinique sensible à la prédation des amibes puisqu’il
montre des plages de phagocytose à toutes les concentrations d’amibes. En B, il s’agit de
l’isolat environnemental PPF 2 qui est résistant à la prédation, car il n’a qu’une seule plage
de phagocytose. Le Tableau 9 montre l’ensemble des résultats obtenus pour les 29 isolats
de P. aeruginosa. On peut voir que la presque totalité des isolats sont résistants à la
prédation sauf les isolats cliniques 392 et 578-B et l’isolat environnemental PPF 7. Les
isolats sensibles n’appartiennent à aucun groupe en particulier, c’est-à-dire que les isolats
sensibles sont répartis dans chacun des trois groupes : l’isolat 392 dans le groupe I, l’isolat
578-B dans le groupe II et l’isolat PPF 7 dans le groupe III. La grande majorité des isolats
résistants à la prédation a une résistance élevée, puisqu’il n’y a qu’une seule plage de
phagocytose (à 50 000 amibes/5 µL).
45
Figure 14. Exemple de résultats obtenus avec le test de prédation pour les isolats de
P. aeruginosa.
Plusieurs quantités d’amibes ont été deposées sur un tapis de P. aeruginosa (de 50 000 à 5
amibes par goutte). Après une incubation de 7 jours, des plages de phagocytose sont
visibles où les amibes ont internalisé les bactéries. La croissance des amibes sur le tapis
bactérien de deux isolats est illustrée: en A. l’isolat (578-B) est sensible à la prédation des
amibes tandis qu’en B. l’isolat (PPF 2) est résistant. Le contrôle négatif (Ctrl-) était du
milieu HL5 sans amibe.
46
Tableau 9. Résultats des tests de prédation pour P. aeruginosa.
Isolats de
P. aeruginosa
Groupe
Exp. 1a
Exp. 2 a
Exp. 3 a
Moyenne
Résistance à
la prédationb
VD 706
I
1
1
1
1,0
Oui
VD 329
I
0
1
1
0,7
Oui
297
I
1
1
1
1,0
Oui
VD 564
I
1
1
1
1,0
Oui
VD 171
I
1
1
1
1,0
Oui
VD 609
I
1
1
1
1,0
Oui
403
I
1
1
1
1,0
Oui
585
I
2
2
2
2,0
Oui
359
I
1
0
1
0,7
Oui
E-500
I
1
2
1
1,3
Oui
392
I
5
5
5
5,0
279
I
1
1
1
1,0
Oui
358
I
1
3
3
2,3
Oui
578-A
I
1
2
1
1,3
Oui
PPF 18
II
1
1
1
1,0
Oui
Ortho 1
II
1
1
1
1,0
Oui
Chir D-144 ass.
II
1
1
1
1,0
Oui
Urg 7
II
1
1
1
1,0
Oui
Urg 5
II
1
1
1
1,0
Oui
PPF 19
II
1
1
1
1,0
Oui
PPF 20
II
1
1
1
1,0
Oui
PPF 13
II
1
1
1
1,0
Oui
578-B
II
5
5
5
5,0
506
II
1
1
1
1,0
Oui
PPF2
III
1
1
1
1,0
Oui
PPF1
III
2
1
2
1,7
Oui
PPF21
III
1
2
1
1,3
Oui
PPF7
III
4
3
4
3,7
Chir D-144
III
1
2
2
1,7
Oui
a : « Exp. » : expérience; Une valeur est associée à la quantité d’amibes requises pour
générer une plage de phagocytose : 0 lorsque l’isolat résiste à plus de 50 000 amibes;
1 lorsqu’il y a une plage de phagocytose à 50 000 amibes; 2 lorsqu’il y a des plages de
phagocytose à 5 000 amibes et plus; 3 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 500 amibes
et plus; 4 lorsqu’il y a des plages de phagocytose à 50 amibes et plus et 5 lorsqu’il y a des
plages de phagocytose à 5 amibes et plus.
b : Le symbole « - » signifie que l’isolat n’est pas résistant aux amibes et l’annotation
« ass. » signifie « assistante ».
47
4.3.3 Test de lyse
Le test de lyse sert à déterminer si les isolats de P. aeruginosa affectent la viabilité
des amibes. La lyse des amibes est déterminée selon la proportion de cellules survivantes
après 10 minutes d’exposition au surnageant de culture bactérienne exprimée en
pourcentage. Le résultat est considéré avoir une grande variabilité lorsque l’écart-type de
l’ensemble des résultats pour un même isolat est de 20% et plus. À la Figure 15, on peut
voir, en A, le contrôle négatif ne contenant que le milieu LB. Il y a la même quantité de
cellules après 10 minutes. En B, il s’agit du contrôle positif fait avec la souche de
P. aeruginosa PAO1, une souche virulente connue pour lyser les amibes [145]. Après aussi
peu que 5 minutes, il y avait une grande diminution du nombre de cellules intactes par
rapport à la quantité présente à 0 minute. Lorsqu’une cellule est lysée, on peut voir une
petite tache sombre à l’endroit où était la cellule (voir les flèches dans les panneaux B et
D). En C, il s’agit de l’isolat environnemental Chir D-144 qui ne lyse pas les amibes. Tout
comme le contrôle négatif (en A), il n’y a pas diminution du nombre de cellules après 10
minutes. Toutefois, en D, on peut voir une grande diminution des cellules intactes à 10
minutes. Il s’agit de l’isolat environnemental PPF 13 qui lyse les amibes, tout comme le fait
le contrôle positif. Le Tableau 10 montre l’ensemble des résultats obtenus pour les 29
isolats. Chacun des isolats a été testé quatre fois. On peut voir une certaine disctinction
concernant la capacité de lyse cellulaire entre les différents groupes. Les isolats du groupe I
ont, pour la plupart, une lyse variable. La majorité des isolats du groupe II lyse les amibes
et la totalité des isolats du groupe III ne les lyse pas. Les isolats qui n’affectent donc pas la
viabilité des amibes sont majoritairement des isolats environnementaux (1 du groupe II et la
totalité du groupe III), en plus de quelques isolats cliniques du groupe I. Le test de lyse a
aussi permis de déterminer encore plus précisément les isolats qui sont potentiellement
enrobables par les amibes.
48
Figure 15. Lyse des cellules de D. discoideum exposées au surnageant des cultures de
P. aeruginosa.
Après avoir mis en contact le surnageant des cultures de P. aeruginosa avec les amibes
déposées au fond d’un puits d’une plaque 24 puits, les photos ont été prises à 0 et 10
minutes. Étant donné la grande activité lytique de la souche PAO1 (contrôle positif), les
photos ont été prises à 0 et 5 minutes pour avoir des cellules encore en vie. Pour chaque
condition, les deux photos correspondent au même champ d’observation. A. Le contrôle
négatif a été fait en exposant des cellules de D. discoideum à du milieu de culture frais.
Aucune lyse cellulaire n’a été observée. B. Le contrôle positif a été fait avec le surnageant
d’une culture de la souche PAO1 [145]. Une grande quantité de cellules a été lysée après 5
minutes. C. Exemple d’un isolat étudié qui n’est pas capable de lyser les amibes (Chir D144). D. Exemple d’un isolat étudié qui provoque une lyse importante des cellules (PPF
13). Les cellules mortes laissent une marque sombre (flèche).
49
Tableau 10. Lyse des cellules de D. discoideum exposées au surnageant des cultures
des isolats de P. aeruginosa.
Isolats de P.
aeruginosa
Lyse cellulaire (% de cellules)*
Écart- Lyse
type
I
106,3 107,3 108,8 107,2
N
VD 706
107,4
1,1
I
41,0
95,7
9,3
18,4
V
VD 329
41,1
38,8
I
48,8
86,6
3,0
111,5
V
297
62,5
47,3
I
86,4
105,9 139,7 113,4
V
VD 564
111,3
22,1
I
100,0
86,4
40,5
100,0
V
VD 171
81,7
28,2
I
107,5
84,0
102,1 107,5
N
VD 609
100,3
16,0
403
I
90,4
0,6
1,2
0,0
V
23,1
44,9
585
I
106,2 112,9 112,8 107,2
N
109,8
3,6
359
I
124,0 110,5 132,0
1,1
V
91,9
61,2
I
116,1
83,8
105,9
7,1
V
E-500
78,2
49,3
392
I
0,0
22,4
0,0
0,0
L
5,6
11,2
279
I
120,8
68,9
97,0
92,9
V
94,9
21,2
I
131,8 100,0
8,9
7,3
V
358
62,0
63,6
578-A
I
97,6
88,4
106,9
96,9
N
97,5
7,6
PPF 18
II
1,3
1,7
21,3
0,0
L
6,1
10,2
Ortho 1
II
0,0
0,0
54,5
1,3
V
14,0
27,1
Chir D-144 ass.
II
0,4
1,4
0,0
0,0
L
0,5
0,7
Urg 7
II
21,0
0,0
0,0
0,0
L
5,2
10,5
Urg 5
II
0,0
100,9
0,0
19,6
V
30,1
48,1
PPF 19
II
35,4
2,4
0,0
0,0
L
9,5
17,3
PPF 20
II
0,0
25,3
0,0
1,5
L
6,7
12,4
PPF 13
II
15,4
15,7
1,2
22,2
L
13,6
8,8
II
109,4 114,7 112,5 110,0
N
578-B
111,6
2,4
II
6,7
111,3
20,5
112,7
V
506
62,8
57,1
PPF2
III
94,6
116,1 110,5 109,1
N
107,6
9,2
PPF1
III
112,2
97,2
84,7
85,5
N
94,9
12,9
PPF21
III
94,1
97,7
100,0
92,3
N
96,0
3,5
PPF7
III
104,7 110,7 119,8 116,9
N
113,0
6,7
Chir D-144
III
109,6 104,0 103,6 103,7
N
105,2
2,9
*Les différentes annotations signifient : « Exp. » : expérience; « L » en vert: lyse; « N » en
bleu: aucune lyse; « V » en orange: lyse variable; « ass. » : assistante.
50
Groupe
Exp. 1
Exp. 2
Exp. 3 Exp. 4 Moyenne
4.3.4 Essai de l’enrobage de bactéries
À partir des résultats des tests de prédation et des tests de lyse, il est possible de
déterminer les isolats qui sont potentiellement enrobables par les amibes. Ainsi, dans le
Tableau 11, on peut comparer les résultats des différents tests. Une bactérie est
potentiellement enrobable lorsqu’elle résiste à la prédation et lorsqu’elle ne lyse pas les
amibes. Donc, on peut voir que sur les 29 isolats, seulement huit sont de potentiels
candidats à l’enrobage de bactéries. Il s’agit des isolats VD 706, VD 609, 585 et 578-A qui
font partis du groupe I et les isolats PPF 2, PPF 1, PPF 21 et Chir D-144 du groupe III.
Aucun isolat de groupe II n’est un potentiel candidat.
51
Tableau 11. Mise en commun des résultats des tests de prédation et des tests de lyse
pour les isolats de P. aeruginosa pour déterminer ceux qui sont potentiellement
enrobables.
Bactérie
Lyse*
potentiellement
enrobable
I
N
Oui
Oui
VD 706
I
V
Oui
VD 329
I
V
Oui
297
I
V
Oui
VD 564
I
V
Oui
VD 171
I
N
Oui
Oui
VD 609
403
I
V
Oui
I
N
585
Oui
Oui
359
I
V
Oui
I
V
Oui
E-500
392
I
L
279
I
V
Oui
I
V
Oui
358
I
N
578-A
Oui
Oui
PPF 18
II
L
Oui
Ortho 1
II
V
Oui
Chir D-144 ass.
II
L
Oui
Urg 7
II
L
Oui
Urg 5
II
V
Oui
PPF 19
II
L
Oui
PPF 20
II
L
Oui
PPF 13
II
L
Oui
II
N
578-B
II
V
Oui
506
III
N
PPF2
Oui
Oui
III
N
PPF1
Oui
Oui
III
N
PPF21
Oui
Oui
PPF7
III
N
III
N
Chir D-144
Oui
Oui
*Les différentes annontations signifient : « L » en vert : lyse; « N » en bleu : aucune lyse;
« V » en orange : lyse variable; « ass. » : assistante; « - » : résultat négatif.
Isolats de
P. aeruginosa
Résistance à
Groupe
la prédation
L’essai de l’enrobage de bactéries a donc été fait pour les isolats VD 706, 585, Chir
D-144 et PPF 2, en plus d’un contrôle négatif, l’isolat 578-B, qui est sensible à la prédation
52
et qui ne lyse pas les amibes. D’autres isolats qui n’étaient pas de potentiels candidats à
l’enrobage ont aussi été testés : les isolats 297 et 358, tous deux des isolats résistants à la
prédation, mais ayant une lyse variable. En plus de vérifier si les bactéries sont enrobées,
les échantillons ont permis d’observer différents phénomènes intéressants. Par exemple, à
la Figure 16, on peut observer en microscopie élecctronique à transmission (MET) le début
et la fin de la voie endocytique sur la même image (A). Cette image a été prise lors de
l’essai de l’enrobage de l’isolat 297. Plus précisément, en B, il s’agit de la phagocytose
d’une bactérie par réarragement du cytosquelette d’actine, ce qui forme la coupe
phagocytique où se retrouve la bactérie. En C, il s’agit de l’exocytose d’un CML dans le
milieu extracellulaire. Le phénomène d’enrobage de bactéries n’a pas été observé avec cet
isolat. La Figure 17 montre aussi un phénomène intéressant avec l’isolat 358. En A, on peut
voir une amibe avec des bactéries dans le milieu extracellulaire. À l’intérieur de celle-ci, il
y a plusieurs compartiments de la voie endocytique. La flèche pointe un lysosome tardif en
train de former un CML. En agrandissant l’image (en B), on peut voir l’invagination de la
membrane du lysosome tardif pour former un CML. Cette observation confirme ce qui
avait été observé précédemment, mais dans des conditions artificielles [14]. Toutefois,
aucune bactérie enrobée n’a été observée pour cet isolat.
53
Figure 16. Phagocytose et exocytose chez D. discoideum.
Microscopie électronique à transmission d’une coculture de D. discoideum, K. aerogenes et
l’isolat 297 de P. aeruginosa selon un ratio de 5 amibes pour 1000 K. aerogenes et 10
P. aeruginosa 297 (5 : 1000 : 10). A. Une cellule de D. discoideum phagocyte une bactérie.
Sur la même image, il y a l’exocytose d’un CML (échelle à 1 µm). B. Agrandissement de
l’image de la bactérie en train de se faire phagocyter par l’amibe (échelle à 0,2 µm).
C. Agrandissement de l’image de l’exocytose du CML par l’amibe (échelle à 0,2 µm).
54
Figure 17. Invagination de la membrane du lysosome tardif.
Microscopie électronique à transmission d’une coculture de D. discoideum, K. aerogenes et
l’isolat 358 de P. aeruginosa selon le ratio 1 : 1000 : 10. En A, on peut voir une amibe avec
plusieurs compartiments de la voie endocytique (échelle à 2 µm). Si on agrandit l’image sur
le compartiment pointé, on peut voir, en B, qu’il y a une invagination de la membrane
(flèche). Il s’agit du début de la formation de CML dans un lysosome tardif [14].
L’isolat de P. aeruginosa utilisé dans l’essai de la Figure 18, VD 706, est un
potentiel candidat à l’enrobage de bactéries. En A, on peut voir en MET une amibe avec
différents compartiments de la voie endocytique. Si on regarde de plus près, en B, on peut
voir des bactéries à l’intérieur de l’amibe. Ces bactéries se situent dans le lysosome tardif.
Si on regarde encore plus près, en C, on peut voir qu’une bactérie est en train de se faire
enrober, ce qui confirme qu’il s’agit du lysosome tardif. La bactérie a donc résisté à la
digestion de l’amibe, du moins en partie, lors de son passage dans le lysosome. Toutefois,
aucune bactérie enrobée n’a été observée dans le milieu extracellulaire pour cet isolat. Par
contre, la Figure 19 montre, en A et en B, la présence de CML vide. En A, il s’agit d’un
CML à l’intérieur d’une amibe et en B, un CML dans le milieu extracellulaire. En C, il
s’agit aussi d’un CML à l’extérieur d’une amibe, mais la coculture était constituée de
l’isolat Chir D-144. On peut aussi observer que, en général, les CML à l’intérieur des
amibes (en A) ont des membranes beaucoup plus compactes comparées aux membranes des
55
CML dans le milieu extracellulaire (en B et en C). Donc, aucun des isolats de
P. aeruginosa testés n’a permis d’observer le phénomène d’enrobage de bactéries malgré
les différentes conditions essayées.
Figure 18. Essai d'enrobage de bactéries pour l’isolat VD 706 de P. aeruginosa.
MET d’une coculture de D. discoideum, K. aerogenes et de l’isolat VD 706 de
P. aeruginosa selon le ratio 5 : 100 : 10. En A, on peut voir une amibe avec plusieurs
compartiments de la voie endocytique (échelle à 2 µm). En B, il s’agit de bactéries ayant
résistées à la digestion lors du passage dans le lysosome (échelle à 1 µm). Si on agrandit la
partie pointée par la flèche, on peut voir, en C, que la bactérie est en train de se faire
enrober dans le lysosome tardif (échelle à 500 nm).
56
Figure 19. Corps multilamellaires vides produits par les isolats VD 706 et Chir D-144
de P. aeruginosa.
Images en MET de deux cocultures différentes de D. discoideum, K. aerogenes et
P. aeruginosa selon le ratio 5 : 100 : 10. En A et en B, il s’agit de l’isolat VD 706 et en C,
il s’agit de l’isolat Chir D-144. Le CML de l’image en A se trouve à l’intérieur d’une amibe
(échelle à 200 nm). Les CML des images en B et en C se retrouvent dans le milieu
extracellulaire (échelles à 1 µm).
4.4 Levure provenant d’une contamination
Une contamination a été trouvée au centre de plages de phagocytose d’une coculture
triple. Ce test était initialement fait afin de mieux cibler les bactéries potentiellement
enrobables. Toutefois, le test n’était pas adapté aux souches étudiées. Un autre test a
remplacé la coculture triple : le test de lyse afin de vérifier la cytotoxicité des souches
bactériennes, plus particulièrement les isolats de P. aeruginosa, envers les amibes. La
57
coculture triple consistait à étaler, sur un milieu riche, une coculture contenant des amibes,
des K. aerogenes et la souche bactérienne résistante à la prédation. L’incubation se faisait à
21°C jusqu’à l’apparition de plages de phagocytose (10 jours). Étant donné le milieu de
culture riche, les bactéries qui résistaient à la prédation se remettaient à croître grâce aux
nutriments du milieu de culture. On pouvait ainsi voir une croissance bactérienne au centre
des plages de phagocytose. La Figure 20 montre le type de résultats attendus.
Figure 20. Exemple de coculture triple permettant de confirmer qu'une bactérie est
une ARB.
A. Les amibes D. discoideum (D.d.) ont été déposées sur des tapis bactériens différents, soit
de K. aerogenes (K.a.), de Mycobacterium smegmatis (M.s.) ou d’un mélange des deux
bactéries (K.a. + M.s.). Les cultures composites ont été incubées à 21°C pendant 10 jours.
La présence de plages de phagocytose sur le tapis de K. aerogenes montre que la bactérie
permet la croissance de l’amibe D. discoideum, alors que M. smegmatis ne le permet pas.
Lors de la coculture triple (image au centre), la présence de la bactérie K. aerogenes permet
la croissance de D. discoideum. Toutefois, on peut apercevoir une croissance à l’intérieur
des plages de phagocytose. B. Culture à 37°C pendant 48 heures de la croissance
bactérienne présente initialement sur la coculture triple. Il est possible de constater que le
tapis bactérien est majoritairement constitué de K. aerogenes (colonies luisantes), alors que
le centre des plages de phagocytose contient principalement de M. smegmatis (colonies
mates). Avec cette expérience, il était possible de démontrer que M. smegmatis résiste à la
prédation des amibes et est donc une ARB (S. Charette, comm. personnelle).
Ainsi, puisque la contamination se trouvait au centre des plages de phagocytose,
cela pouvait signifier que la contamination était résistante à la prédation. Cette
58
contamination a donc été isolée en culture pure. Les colonies étaient rondes, roses, opaques
et crémeuses (Figure 21 en A). Lorsque ce microorganisme est incubé dans du milieu de
culture riche additionné de tétracycline (HL5 liquide et 15 µg/mL de tétracycline), il y a
croissance et production d’un pigment rose. Il s’agit soit d’une bactérie résistante à la
tétracycline, soit d’un eucaryote.
La morphologie cellulaire observée dans un montage humide laisse croire qu’il
s’agit d’une levure, puisque les cellules sont beaucoup plus grosses que des bactéries et de
forme ovoïde. Étant donné que ce microorganisme pouvait résister à la prédation et ainsi
potentiellement se faire enrober, un essai d’enrobage a été tenté. Alors, une coculture de 5
D. discoideum pour 100 K. aerogenes et 10 cellules du microorganisme rose inconnu (ratio
de 5 : 100 : 10) a été faite et envoyée en MET pour observation. Les résultats sont présentés
dans les Figures 21 et 22. Dans la Figure 21, on peut voir que la contamination est bien une
levure. En B, la levure à l’intérieur du lysosome tardif présente des filaments autour d’elle.
Ce sont des fibrilles de glucan, phénomène connu chez les levures [156]. En C, on peut voir
le microorganisme dans le milieu extracellulaire. La levure est plus grosse que les
K. aerogenes présentes autour d’elle. Il y a aussi présence d’une paroi cellulaire et des
vacuoles à l’intérieur de la cellule. Toutes ces caractéristiques identifient le microorganisme
comme étant une levure. Dans la Figure 22, on peut constater que la levure cause une
surproduction de couches mulilamellaires à l’intérieur du lysosome tardif qui ont alors une
très grande taille. Toutefois, l’enrobage ne se situe pas autour de la levure. La condition 5 :
100 : 10 n’était peut-être pas optimale pour la levure. Aucune levure enrobée n’a donc été
observée.
59
Figure 21. Isolement et identification partielle du microorganisme inconnu.
A. Isolement en culture pure du microorganisme rose. Un essai de l’enrobage a été fait
selon le ratio de 5 D. discoideum pour 100 K. aerogenes et 10 microorganismes inconnus
(5 : 100 : 10), puis observé en MET. En B, on peut voir une amibe contenant le
microorganisme inconnu dans un des compartiments de la voie endocytique. Il y a présence
de filaments autour de la cellule (flèche) (échelle à 2 µm). En C, le microorganisme est
dans le milieu extracellulaire. On peut voir que sa taille est plus grande que celle des
K. aerogenes présentes autour. Il y a présence d’une paroi cellulaire (flèche) et de vacuoles
(astérisques) (échelle à 1 µm).
60
Figure 22. Surproduction de couches multilamellaires dans le lysosome tardif
contenant une levure.
Images en MET d’un essai d’enrobage pour la levure rose selon le ratio 5 D. discoideum
pour 100 K. aerogenes et 10 levures (5 : 100 : 10). En A, on peut voir une amibe avec
plusieurs compartiments de la voie endocytique (échelle à 2 µm). Si on agrandit la région
contenant la levure, on peut voir en B qu’il y a, autour de la levure, une surproduction de
couches multilamellaires dans le lysosome tardif contenant la levure (flèches) (échelle à
500 nm).
4.5 Production de CML par d’autres amibes
D’autres amibes pourraient être utilisées dans le cas où D. discoideum s’avère ne
pas être un bon modèle d’étude pour l’enrobage de bactéries. Il y a, entre autres,
A. castellanii et H. vermiformis. Les amibes de ces espèces utilisées dans cette étude
provenaient du laboratoire du Dr Jean Barbeau. L’amibe A. castellanii est connue pour faire
de l’enrobage de bactéries [10], alors que H. vermiformis est connue pour permettre la
multiplication et la survie de bactéries à l’intérieur d’elle [157-158]. Toutefois, leur
production de CML a été testée et observée en MET en utilisant les mêmes conditions que
pour D. discoideum, c’est-à-dire en présence de K. aerogenes. Ainsi, on peut voir à la
Figure 23 que les deux amibes produisent des CML. Par contre, on peut remarquer que leur
structure n’est pas tout à fait similaire à celle des CML chez D. discoideum. Si on compare
61
avec un CML de D. discoideum, on peut voir que la structure de ce dernier est plus
complexe que celle des deux autres amibes.
Figure 23. Production de CML par A. castellanii et H. vermiformis.
Images en MET d’amibes produisant des CML par stimulation de la voie endocytique par
des K. aerogenes. En A (échelle à 1 µm) et en B (échelle à 0,5 µm), on peut voir des CML
produits par A. castellanii et en C, un CML produit par H. vermiformis (échelle à 0,5 µm).
On peut comparer la structure des CML à celle du CML produit par D. discoideum en D
(échelle à 1 µm) (panneau D provenant de Valérie Paquet, comm. personnelle).
62
CHAPITRE 5 - DISCUSSION
5.1 E. coli O157:H7
E. coli O157:H7 est le principal agent infectieux responsable de diarrhées
sanguignolantes chez les humains [94-95]. Cependant, qu’en est-il de sa virulence chez
l’amibe modèle D. discoideum? Même si ce modèle est considéré comme très utile pour
l’étude de la virulence de plusieurs espèces bactériennes infectant les humains [5], ceci
n’est pas une règle absolue. Ainsi, dans la présente étude, des tests de prédation ont été faits
avec D. discoideum afin de déterminer le niveau de résistance d’E. coli O157:H7 à la
prédation des amibes. Les résultats montrent que seulement deux souches sur les neuf
analysées sont résistantes à la prédation. Les deux souches en question sont des versions
mutées de la souche sauvage EDL933, celle qui cause des diarrhées sanguignolantes.
Toutefois, celle-ci est sensible à la prédation des amibes. Les souches résistantes à la
prédation sont EDL933 ∆stx1 et EDL933 ∆eae.
La souche EDL933 ∆stx1 porte une mutation inactivant le gène codant pour la Shiga
toxine stx1. Puisque les Shiga toxines permettent à la bactérie sauvage d’être autant
virulente chez les humains et les modèles animaux comme la souris [94, 159-160], on se
serait attendu à ce que l’absence de la Shiga toxine stx1 diminue la virulence de la bactérie
chez l’amibe. Au contraire, celle-ci est augmentée, ce qui suggère que l’amibe est
insensible à cette Shiga toxine. Pour sa part, le gène eae fait partie de l’îlot de pathogénicité
LEE chez E. coli O157:H7. Le LEE encode un système de sécrétion de type 3 (SST3)
[161]. Ces résultats montrent que l’interaction hôte-bactérie peut varier d’un hôte à un
autre. Dans le cas présent, les interactions entre E. coli O157:H7 et les amibes ne sont pas
les mêmes qu’avec les humains. Par exemple, la souche sauvage EDL933 infectant les
humains possède la Shiga toxine stx2, un autre important facteur de virulence. Or, cette
Shiga toxine se lie au récepteur Gb3 (globotriosyl céramide) présent à la surface des
cellules épithéliales intestinales [162]. Toutefois, les amibes ne possèdent pas ce récepteur.
Ce facteur de virulence n’est vraisemblablement pas essentiel à la bactérie lors du test de
63
prédation. Cela pourrait expliquer en partie pourquoi la souche sauvage EDL933 qui est
virulente chez l’humain soit sensible à la prédation chez l’amibe.
Plusieurs choses pourraient expliquer la résistance augmentée des deux mutants
comparativement à la souche sauvage. Premièrement, dans certains cas, lorsqu’il y a
inactivation d’un gène, d’autres peuvent être surexprimés pour compenser la perte de
l’activité du gène muté [163]. Donc, peut-être que d’autres facteurs de virulence, mieux
adaptés pour faire face à l’amibe, sont surexprimés dans les deux mutants, ce qui pourrait
rendre la bactérie plus résistante à la prédation. Deuxièmement, l’inactivation de certaines
fonctions chez une bactérie peut lui donner un gain physiologique lui permettant une
croissance plus rapide. Par exemple, chez Aeromonas salmonicida, lorsqu’il y a
inactivation du SST3, la vitesse de croissance de la bactérie est augmentée (S. DallaireDufresne, comm. personnelle). Les bactéries mutantes EDL933 ∆stx1 et EDL933 ∆eae
pourraient donc avoir une croissance plus rapide et ainsi avoir l’avantage sur les amibes
lors du test de prédation comparativement à la souche sauvage.
La coculture entre D. discoideum, K. aerogenes et E. coli O157:H7 n’est
vraisemblablement pas adéquate dans les conditions de culture pour l’essai d’enrobage de
bactéries pour maintenir la résistance d’E. coli O157:H7 à la prédation par l’amibe. En
effet, E. coli O157:H7 requiert un milieu de culture riche (HL5 agar) pour être résistante à
la prédation par D. discoideum (résultat non montré). Toutefois, l’essai d’enrobage de
bactéries nécessite un milieu sans nutriment afin de conserver les bactéries dans leur
enrobage et ainsi imiter les conditions environnementales. Cela fait finalement de cette
bactérie une mauvaise candidate pour l’étude du phénomène d’enrobage chez
D. discoideum.
5.2 S. typhimurium
Chez S. typhimurium, la totalité des souches était résistante à la prédation par
l’amibe D. discoideum. Cela correspond à ce qui a déjà été observé dans la littérature :
S. typhimurium résiste à la prédation de D. discoideum [164]. Toutefois, la résistance varie
64
en fonction du milieu de culture. Comme le milieu de culture riche était le seul milieu dont
les résultats de prédation correspondaient à la littérature, c’est ce type de milieu qui a été
conservé. Certains nutriments constituant les milieux de culture pourraient influencer
l’expression de facteurs de virulence comme invA chez S. typhimurium [138] tel que
suggéré chez d’autres modèles bactériens [165-166]. Ainsi, un milieu pauvre n’offrait
probablement pas assez de nutriments pour l’expression des facteurs de virulence
nécessaires à la résistance aux amibes. Aussi, puisqu’il s’agit d’une bactérie pathogène
intracellulaire facultative, la présence de certains nutriments pourrait activer des voies
métaboliques permettant la survie et la réplication de S. typhimurium à l’intérieur de
D. discoideum [167-168]. De plus, parmi les souches analysées, les trois mutants de la
souche sauvage SL1344 n’ont montré aucun effet sur la virulence bactérienne. Cela signifie
que les gènes qui ont été mutés ne sont pas impliqués dans la résistance de la bactérie à la
prédation des amibes.
Comme l’essai d’enrobage se fait sur un milieu de culture sans nutriment, la
résistance à la prédation de S. typhimurium pourrait être affectée dans ce test
comparativement au test de prédation fait en milieu riche. En effet, les images en MET
montrent qu’aucune bactérie enrobée n’a été observée lors de l’essai (Figure 9). Comme
expliqué précédemment, si les nutriments influencent certaines voies métaboliques ou
l’expression de gènes correspondant à des facteurs de virulence, l’absence de nutriments
diminuerait probablement le niveau de résistance, jusqu’à rendre les souches sensibles à la
prédation [138, 167-168]. Donc, S. typhimurium serait finalement aussi une mauvaise
candidate pour étudier le phénomène d’enrobage de bactéries chez D. discoideum.
5.3 P. aeruginosa
P. aeruginosa a une grande capacité à s’adapter à son environnement. Trois grandes
stratégies peuvent être utilisées afin de s’adapter : la formation de biofilm, la diversification
phénotypique et les phénotypes mutateurs [169]. Les mutations induites par cette dernière
stratégie sont en général bénéfiques pour la survie de la bactérie. Ainsi, lorsque
P. aeruginosa se retrouve dans un environnement dont certaines de ses fonctions ne sont
65
pas nécessaires, elle perd celles-ci afin d’être plus efficace [170]. C’est le cas des isolats
cliniques qui se retrouvent à l’intérieur des poumons des patients atteints de fibrose
kystique. Ces bactéries n’ont plus besoin de certains facteurs de virulence et elles les
éliminent [170]. Cela pourrait aussi expliquer l’évolution des isolats VD [171]. En effet,
comme mentionné dans la section Matériel et Méthodes, ces isolats ont été prélevés à partir
de la même patiente, mais sur une période de trois ans. La bactérie a donc évolué dans le
temps, puisqu’on observe une variation dans les tests de lyse (aucune lyse ou lyse variable
selon les isolats).
La forme de vie des bactéries la plus courante est le biofilm. Les bactéries ont
certains avantages à vivre sous cette forme plutôt que sous forme planctonique. La matrice
du biofilm, constituée majoritairement d’exopolysaccharides, est en quelque sorte un
réservoir d’enzymes [172]. Le biofilm ne conserve pas que les enzymes. Il conserve aussi
les particules nutritives environnantes pour les utiliser comme sources de nutriments et
d’énergie. Le biofilm offre aussi l’avantage de protéger les bactéries de différents stress
comme la dessiccation, l’oxydation, les biocides, les antibiotiques et plusieurs autres [172].
Avec l’analyse de la formation de biofilm pour les isolats de P. aeruginosa, il est possible
de dire que les isolats du groupe III sont ceux qui forment significativement plus de
biofilm. Puisqu’il s’agit d’isolats environnementaux, ceux-ci sont probablement soumis à
différents stress environnementaux et ont donc besoin de se défendre. Une des manières
possibles d’y arriver est la formation de biofilm. Pour ce qui est des isolats cliniques du
groupe I, il y a une grande variabilité dans la formation du biofilm. Toutefois, la tendance
tire vers une faible formation de celui-ci.
Avec les différentes analyses phénotypiques, il est possible de remarquer qu’il y a
une grande variabilité des phénotypes pour certains isolats. Que ce soit pour la formation de
biofilm, pour la production d’élastase ou la lyse amibienne, la variabilité des résultats est
surtout présente pour les isolats du groupe I qui sont des isolats cliniques. En effet, cette
variabilité a déjà été observée pour des isolats cliniques provenant de patients atteints de
fibrose kystique et il s’agit d’une des caractéristiques de ce type d’isolats [173]. C’est, entre
autres, le cas pour les souches cliniques LES (Liverpool epidemic strain) [174]. Un des
66
facteurs pouvant influencer la variabilité phénotypique est le quorum sensing. Comme
mentionné dans l’introduction, les systèmes de régulation d’expression de gènes comme
las, rhl et PQS sont influencés par différents facteurs environnementaux comme le fer et
l’azote disponibles, la température, l’osmolarité ou la densité cellulaire de la culture [114115]. Puisque ces facteurs peuvent varier d’une expérience à l’autre et leur effet amplifié
sur les phénotypes de la bactérie par l’action des systèmes de détection du quorum, cela
pourrait expliquer pourquoi certains isolats ultra sensibles aux petites variations ont des
phénotypes variables d’une expérience à l’autre.
P. aeruginosa possède les systèmes de sécrétion (SS) de types I, II, III, V et VI. Ces
SS produisent des facteurs de virulence qui ont différentes fonctions. Les SS sont contrôlés
par les systèmes de quorum sensing mentionnés ci-haut. Les différents facteurs de virulence
sécrétés peuvent, entre autres, être l’exotoxine A, la pyocyanine, des protéases comme
l’élastase et des rhamnolipides [111, 113]. Ces facteurs ont différents modes d’action et
sont essentiels à la virulence de P. aeruginosa.
Prenons le cas de l’élastase. D’abord, l’élastine est un constituant important des
fibres élastiques retrouvés dans les poumons, les vaisseaux sanguins et la peau [155]. Étant
donné que l’élastase a une activité protéolytique envers l’élastine, cette protéase détruit des
cellules des poumons, causant des dommages aux tissus et des hémorragies [175]. Elle peut
aussi détruire certaines immunoglobulines [176]. De plus, l’élastase améliore la croissance
bactérienne in vivo [177]. Cela pourrait expliquer que la production d’élastase pour les
isolats cliniques du groupe I soit plus élevée, puisque ces isolats se retrouvent dans les
poumons des patients atteints de fibrose kystique. L’élastine étant produite par beaucoup
d’organismes, la production d’élastase par les isolats environnementaux, dans ce cas-ci les
isolats du groupe II, serait un moyen efficace pour P. aeruginosa de demeurer virulente et
d’infecter d’autres organismes.
Un autre facteur de virulence connu chez P. aeruginosa est le rhamnolipide. Ce
glycolipide est connu pour rapidement lyser les cellules de D. discoideum lorsque produits
par la souche PAO1. Toutefois, les rhamnolipides ne sont pas la seule cause possible
67
expliquant la lyse de l’amibe [145]. Les facteurs de virulence chez P. aeruginosa sont très
nombreux. Advenant que ce ne soit pas les rhamnolipides qui soient responsable de la lyse
amibienne, il pourrait être intéressant d’en identifier la cause.
On peut constater avec le Tableau 10 que la majorité des isolats qui lysent les
amibes se retrouvent dans le groupe II. Les isolats de ce groupe proviennent, pour la
plupart, d’environnements de cabinets dentaires. Puisque ces isolats et les protozoaires ont
plus de probabilités d’interagir ensemble que les isolats cliniques, la lyse des cellules de
D. discoideum causée par les isolats du groupe II pourrait être un moyen de résister à la
prédation. De plus, les isolats du groupe II ne forment pas de biofilm, alors que les isolats
du groupe III qui forment des biofilms ne lysent pas les amibes. La lyse amibienne pourrait
donc être, pour le groupe II, le moyen de résister à la prédation des amibes, alors que la
formation de biofilm pourrait constituer une façon, pour les isolats du groupe III, d’être
virulents. Aussi, ce ne sont pas tous les facteurs de virulence qui lysent les amibes. Ainsi,
certains isolats sont virulents sans nécessairement lyser les amibes. Cela pourrait expliquer
le fait que la grande majorité des isolats de P. aeruginosa, cliniques et environnementaux,
résistent à la prédation.
L’essai d’enrobage de bactéries a été tenté après avoir mis en commun les résultats
de tests de prédation et de tests de lyse. Parmi toutes les conditions testées, aucune n’a
permis d’observer des bactéries enrobées parmi les isolats analysés. Toutefois, un autre test
pourrait être fait afin d’optimiser encore plus la façon de cibler les potentiels candidats à
l’enrobage. Il s’agit du test de killing [164]. Brièvement, ce test consiste à déterminer si les
isolats analysés se font tuer par les amibes une fois phagocytés par D. discoideum. En effet,
il existe trois mécanismes de résistance à la prédation des amibes : l’enrobage de bactéries,
la lyse amibienne et le fait d’échapper à la phagocytose. Le dernier mécanisme pourrait
donc être vérifié par le test de killing. Le phénomène d’enrobage de bactéries chez
D. discoideum pourrait aussi être étudié avec d’autres espèces bactériennes qui seraient de
meilleures candidates. Par exemple, l’enrobage de L. pneumophila a déjà été observé chez
l’amibe A. castellanii [10]. Il pourrait être intéressant d’étudier l’enrobage de cette bactérie
pathogène chez D. discoideum.
68
Certains phénomènes intéressants ont été observés en MET lors de l’essai
d’enrobage de bactéries. La Figure 16 montre le début et la fin de la voie endocytique. La
coupe phagocytique et l’exocytose d’un CML sur la même image prouve, entre autres, que
ces deux phénomènes n’ont pas lieu au même endroit. Ils sont indépendants l’un de l’autre
[31]. Puis, la Figure 17 montre l’invagination de la membrane du lysosome tardif. Ce
phénomène a déjà été observé et permet de comprendre comment se forme l’enrobage de
bactéries [14, 92]. Finalement, la Figure 19 montre des CML plus compacts à l’intérieur
des amibes que dans le milieu extracellulaire. Cela peut s’expliquer par le fait que, à
l’intérieur, il y a une pression cytoplasmique qui force les membranes à être beaucoup plus
compactes.
Cette étude est la première de ce genre à avoir été faite sur autant d’isoltas de
P. aeruginosa provenant de sources si distinctes. De plus, c’est la première fois que des
isolats environnementaux provenant de cabinets dentaires sont analysés avec ce modèle.
Cette recherche est donc pertinente pour déterminer si les isolats provenant des cabinets
dentaires sont similaires aux isolats responsables de l’infection à P. aeruginosa chez les
patients atteints de fibrose kystique. En effet, les isolats environnementaux du groupe II
sont ceux qui, du point de vue génomique, ont le plus de similarités avec les isolats
cliniques. De plus, les résultats des analyses phénotypiques montrent que les isolats du
groupe II ont des phénotypes se rapprochant plus de ceux du groupe I que de ceux du
groupe III.
5.4 Levure provenant d’une contamination
Une levure contaminante est apparue lors d’un test de coculture triple. Sa croissance
était très évidente au centre de plages de phagocytose et laissait croire que cette
contamination pourrait être résistante à la prédation des amibes et peut-être même se faire
enrober par celles-ci. Les différentes analyses ont permis de confirmer qu’il s’agissait bel et
bien d’une levure. De plus, on a pu observer lors de l’essai d’enrobage que la présence de la
levure provoquait la surproduction de couches multilamellaires dans les amibes. En effet, si
on regarde la Figure 22, on peut voir que le lysosome tardif est beaucoup plus rempli de
69
couches multilamellaires que lors de la seule présence de K. aerogenes. Cependant,
puisqu’aucune levure extracellulaire contenue dans des CML n’a été vue, l’interaction
amibe-bactérie digestible-levure non digestible semble plus complexe que suspecté.
Puisque la levure est d’une taille plus grande que les bactéries généralement utilisées lors
des essais, peut-être que l’amibe est forcée de faire beaucoup plus de couches
multilamellaires pour réussir à enrober la levure, mais sans succès. Quelques études
montrent que des levures comme Cryptococcus neoformans diminueraient la capacité de
phagocytose chez des amibes comme A. castellanii [178]. Il faudrait donc déterminer si
c’est aussi le cas pour cette levure-ci, ce qui constituerait une façon de résister à la
prédation des amibes. La production de levure enrobée reste toutefois à confirmer dans
d’autres conditions. De plus, il serait intéressant d’étudier le phénomène de surproduction
de couches multilamellaire afin de comprendre pourquoi cette interaction existe entre la
levure et l’amibe. L’essai d’enrobage avec une levure de plus petite taille pourrait
confirmer cette hypothèse.
5.5 Production de CML par d’autres amibes
La production de CML par d’autres amibes a été vérifiée afin d’utiliser les amibes
A. castellanii et H. vermiformis comme autres modèles d’étude dans le cas où
D. discoideum s’avérerait ne pas être un bon modèle pour l’enrobage de bactéries. La
production de CML par ces amibes a été confirmée par l’observation en MET (voir Figure
23) et correspond à ce qui est connu dans la littérature [10, 92]. La morphologie de ces
CML est différente de ceux produits par D. discoideum. Toutefois, cela demeure une bonne
alternative pour l’étude du phénomène d’enrobage de bactéries. Ces amibes se retrouvant
aussi continuellement en interaction avec les bactéries dans leur contexte naturel, le
phénomène d’enrobage est autant intéressant que pour D. discoideum. Un essai d’enrobage
avec des billes de polystyrène similaire à ce qui a été fait avec D. discoideum [92]
permettrait de comprendre comment ces amibes enrobent les bactéries résistantes à la
prédation.
70
CHAPITRE 6 – CONCLUSIONS GÉNÉRALES ET PERSPECTIVES
L’hypothèse de départ de cette étude était que certaines bactéries pathogènes qui se
retrouvent dans les environnements humains pourraient se faire enrober par les amibes.
Puisque cette étude portait aussi sur plusieurs souches mutées pour des gènes de virulence,
cela aurait permis de déterminer si l’enrobage de bactéries pouvait être influencé par
l’action de ces gènes. Parmi toutes les conditions analysées, les différentes bactéries
pathogènes utilisées n’ont pas permis d’observer de bactérie enrobée par l’amibe
D. discoideum. Toutefois, cette étude a permis de tirer certaines conclusions pouvant
expliquer pourquoi les bactéries utilisées n’étaient pas de bonnes candidates pour l’étude du
phénomène d’enrobage.
L’analyse des résultats des tests de prédation chez E. coli O157:H7 permet
d’affirmer que l’amibe D. discoideum n’est peut-être pas sensible aux Shiga toxines,
facteurs de virulence importants lors d’infections chez les humains. Cela permet de dire que
les interactions hôte-bactérie peuvent varier d’un hôte à l’autre. Une étude du transcriptome
permettrait de confirmer cette hypothèse. Puisque les Shiga toxines n’affectent pas la
virulence de la bactérie envers l’amibe, d’autres facteurs de virulence pourraient être mieux
adaptés pour résister à la prédation des amibes. Dans le cas des mutants, des facteurs de
virulence pourraient être surexprimés. L’analyse du niveau des gènes transcrits chez les
mutants comparativement à la souche sauvage pourrait permettre d’identifier les facteurs de
virulence potentiels ayant une expression augmentée. Il serait aussi intéressant de vérifier si
E. coli O157:H7 est toxique chez les amibes par un test de cytotoxicité du même type que
celui fait pour les souches de P. aeruginosa. Puis, la résistance à la prédation des mutants
EDL933 ∆stx1 et EDL933 ∆eae pourrait aussi être causée par un gain physiologique de la
bactérie suite à l’inactivation de certaines fonctions. Cette hypothèse pourrait être
confirmée en étudiant les courbes de croissance des souches mutantes comparativement à la
souche sauvage. Finalement, les conditions de coculture entre l’amibe (D. discoideum), la
bactérie digestible (K. aerogenes) et E. coli O157:H7 ne sont pas adéquates pour l’essai
d’enrobage, puisque la résistance de la bactérie pathogène ne serait pas maintenue.
71
Les tests de prédation réalisés avec la bactérie pathogène S. typhimurium ont permis
d’affirmer que celle-ci est résistante à la prédation des amibes. Toutefois, la résistance des
souches bactériennes varie en fonction de la richesse en nutriments du milieu de culture
utilisé. En effet, la présence de certains nutriments pourrait activer des voies métaboliques
chez la bactérie permettant sa survie et sa réplication dans l’amibe. Ainsi, il serait
intéressant de vérifier si les nutriments permettent l’expression de gènes pécis en étudiant le
transcriptome de la bactérie dans différents milieux de culture, soit de pauvre à riche en
nutriments. De plus, aucune bactérie enrobée n’a été observée lors de l’essai d’enrobage.
Dans le même ordre d’idée, puisque le milieu de culture de l’essai doit être pauvre en
nutriments, l’absence de nutriments pourrait diminuer le niveau de résistance de la bactérie
jusqu’à la rendre sensible à la prédation. Cela fait donc de S. typhimurium une mauvaise
candidate à l’enrobage chez D. discoideum.
Les différentes analyses faites avec les isolats de P. aeruginosa ont permis de tirer
plusieurs conclusions. La première est que l’évolution de la série d’isolats cliniques VD
pourrait être expliquée par le fait que P. aeruginosa a une grande capacité de s’adapter à
son environnement, tel les poumons ou les cabinets dentaires. Lorsqu’elle se retrouve dans
un type d’environnement donné, la perte de fonctions non essentielles à la survie de la
bactérie est induite par des mutations bénéfiques pour la rendre plus efficace [170]. Puis, la
formation de biofilm offre, entre autres, l’avantage aux bactéries de se protéger de
différents stress. C’est probablement la raison pour laquelle les isolats environnementaux
du groupe III forment plus de biofilm. Il s’agirait de leur moyen de se protéger. Un autre
phénomène observé lors des différentes analyses des isolats de P. aeruginosa est qu’il y a
une grande variabilité phénotypique pour les isolats cliniques du groupe I. C’est le cas lors
de l’analyse de la formation de biofilm, de la production d’élastase et de la lyse amibienne.
La variabilité phénotypique de ces isolats pourrait être expliquée par le quorum sensing. En
effet, certains facteurs pouvant influencer le quorum sensing, comme la densité cellulaire,
peuvent varier d’une expérience à l’autre [114-115].
Ensuite, P. aeruginosa possède plusieurs facteurs de virulence. Le principal facteur
étudié est l’élastase. L’élastine est un constituant important des fibres élastiques dans les
72
poumons, mais aussi chez plusieurs organismes. D’autres facteurs de virulence ont été
analysés via la lyse amibienne. Les rhamnolipides pourraient être un exemple de facteur de
virulence lysant les amibes. D’autres tests pourraient permettre l’identification de ces
facteurs. La majorité des isolats du groupe II lysant les amibes sont d’origines
environnementales. Ils ont donc plus de probabilité d’interagir avec les amibes. La lyse
amibienne pourrait donc être un moyen de résister à la prédation des amibes.
Puis, aucune bactérie enrobée n’a été observée parmi celles analysées et les
conditions testées. Avec les analyses génomiques et phénotypiques, l’étude des isolats de
P. aeruginosa permet d’affirmer que les isolats cliniques du groupe I et les isolats
environnementaux du groupe II provenant de cabinets dentaires montrent plus de
similarités entre eux qu’avec les isolats environnementaux du groupe III.
Cette étude a aussi permis d’observer le phénomène de résistance à la prédation
pour une levure. Toutefois, aucune levure enrobée n’a été observée. Cependant, un
phénomène intéressant a été observé : la surproduction de couches multilamellaires dans les
amibes. Ce phénomène est peut-être causé par la plus grande taille de la levure
comparativement à celle des bactéries. Cette hypothèse pourrait être confirmée en réalisant
l’essai d’enrobage avec une levure de plus petite taille.
Différentes alternatives sont possibles pour l’étude de l’enrobage de bactéries par
les amibes. Puisque les bactéries pathogènes étudiées dans ce projet ne sont pas de bonnes
candidates pour l’enrobage, d’autres modèles bactériens pourraient être utilisés. Il y a, entre
autres, L. pneumophila connue pour se faire enrober par l’amibe A. castellanii. L’étude de
son enrobage par le modèle amibien D. discoideum pourrait être intéressante. Une autre
alternative possible est l’utilisation d’autres amibes. En effet, la production de CML par les
amibes A. castellanii et H. vermiformis a été confirmée dans la présente étude. L’analyse de
l’enrobage de billes de polystyrène par ces amibes pourrait être une première étape pour
comprendre comment ces amibes enrobent les bactéries résistantes à la prédation.
73
Dans le cas où les alternatives proposées permettraient d’observer des bactéries
enrobées, il faudrait purifier ces bactéries enrobées, les aérosoliser et vérifier leur viabilité
post-aérosolisation comparativement à des bactéries libres de même espèce. La quantité de
bactéries enrobées nécessaire à l’aérosolisation est pour le moment inconnue, mais, après
une première aérosolisation, la viabilité des bactéries enrobées pourrait donner une idée de
la quantité requise. Lors des essais d’enrobage de bactéries, le volume utilisé de coculture
d’amibes, de K. aerogenens et d’ARB était de l’ordre du millilitre. Pour l’aérosolisation,
une plus grande quantité est nécessaire et le volume de la coculture serait plutôt de l’ordre
du litre. Aucune donnée n’est présentement disponible quant à l’aérosolisation de bactéries
enrobées et la viabilité des bactéries post-aérosolisation. Toutefois, une étude a déjà était
faite pour l’aérosolisation de CML vide et les CML étaient intactes après l’aérosolisation
(Valérie Paquet, comm. personnelle). Dans le cas où la viabilité des bactéries enrobées
n’est pas affectée, cela permettrait de vérifier si le phénomène d’enrobage de bactéries
favorise la propagation de maladies infectieuses via l’aérosolisation.
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CHAPITRE 7 - BIBLIOGRAPHIE
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