Optimisation de plasmides pour la thérapie génique : expression et
publicité
La thérapie génique Introduire un gène médicament à l’intérieur d’une cellule pour pouvoir : Optimisation de plasmides pour la thérapie génique : expression et régulation P. Bigey – 2002 • corriger une maladie génétique en introduisant dans les cellules malades le gène qui fait défaut • inhiber ou stimuler la synthèse d’une protéine génétiques, vaccination) donnée (maladies • provoquer la mort d’une cellule cancéreuse en y introduisant un gène suicide • stimuler la réponse immunitaire (cancer) • prévenir la mort cellulaire (neurones) Introduire de l’ADN dans un organisme Electrotransfert dans le muscle squelettique : principe • Techniques virales : adénovirus, rétrovirus… Ces techniques sont efficaces (transfert de g ènes), mais posent des problèmes : adénovirus immunogène, rétrovirus : intégration aléatoire peut-être néfaste (ex. des bébés-bulle) … • Techniques non virales : ADN nu ou électrotransfert, ADN formulé par des vecteurs chimiques. Dans ce cas, l’ADN est utilisé sous forme de plasmide. Problème : le transfert de gène est souvent inefficace. Muscle tibial cranial Générateur Electrodes à plaques Solution d’ADN Gel conducteur Utilisation du muscle squelettique comme organe sécréteur de protéines circulantes en thérapie génique : • Hémophilie → facteurs de coagulation (VIII ou IX) • Anémie → érythropoïétine (EPO) • Thalassémie → β-globine, EPO • Nanisme → facteurs de croissance Plasmides • Petite molécule d’ADN double brin, circulaire, présente dans les bactéries de façon extra-chromosomique. • Unités de réplication autonome : possèdent leur propre origine de réplication, se répliquent de manière indépendante du chromosome bactérien • Optionnels pour la cellule hôte (non indispensables au métabolisme) dans des conditions normales de croissance. • Inflammation ou cancer • Anticorps → Cytokines • Fonction parfois connue (résistance), parfois inconnue. • Les plasmides sont utilisés comme vecteur de clonage, et d’expression : on sait les produire et les manipuler Vecteur de clonage Vecteur d’expression eucaryote Contraintes de la thérapie génique M13 reverse KpnI (245) BamHI (253) SpeI (259) CMV beta promoteur LacZ ColE1 ori SpeI (671) MCS pUC ori (pMB1) XhoI (333) AcsI (688) XbaI (345) pCR2.1 ApoI (688) ApaI (355) EcoRV (700) T7 prom NotI (715) pVAX2 f1 ori 3906 bp • Niveau et durée de l’expression du transgène : EcoRI (688) 2933 bp XhoI (721) AvaI (721) PaeR7I (721) Bsp120I (733) Amp Efficacité du transfert de gènes DraII (733) Importance du plasmide structure du squelette, taille EcoO109I (733 Kana ApaI (737) Kanamycin PmeI (742) BGH polyA • Régulation de l’expression : promoteur kanamy • Marqueurs de sélection • Promoteur eucaryote • Signal polyA • marqueur de sélection Induire la sécrétion du transgène à volonté Promoteurs inductibles ADN bactérien Le plasmide pour la thérapie génique • Sécurité : sans gène de résistance aux antibiotiques (Kanamycine ou Neomycine tolérées) limiter la dissémination idéalement, spécifique du tissu choisi problème de l’ADN bactérien : limiter au maximum sa quantité. • • Problème de la taille : au dessus de 16 kb, l’expression du transgène diminue (transfection moins efficace?). • problème des séquences CpG L’ADN peut être méthylé en position 5 des cytosines. L’ADN bactérien et l’ADN eucaryote ne sont pas méthylés de la même façon. D’où : stimulation du système immunitaire par des séquences de type PuPuCGPyPy D’où production de cytokines proinflammatoires : Élimination des cellules transfectées Extinction des promoteurs, en particulier CMV Diminution de l’expression Production d’anticorps Exemple : le plasmide pCOR Minicercle Miniplasmide Pir 116 . γ R6k ori R6K ori gamma CMV CMV E/P E/P (-522/+72) Origine de réplication sélection UAG ArgE pCOR pXL3296 2023pb bp 2023 cercer Site AttP Site AttB Recombinaison Décaténation MCS pUC28 MCS SphI (717) (! contains sup Phe expression cassette Sup Phe Chromosome bactérien SV40 late polyA signal Poly A SV 40 Gène thérapeutique Ne pousse pas sans le plasmide Gène thérapeutique Ne se réplique pas sans la bactérie Minicercle Plasmide Sur des souris β-thalassémiques Une application : EPO et β-thalassémie 2 sous-unités globine β Mauvaise expression de la chaîne β Hématocrite (%) 2 sous-unités globine α Emmanuelle Fabre et Mickaël Bettan ET 80 70 60 50 40 30 ET 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 agrégats membranaires de chaîne α mois D’où : hémolyse, surcharge en fer, anémie, déformations du squelette Augmentation de l’hématocrite EPO à haute dose stimule la production de chaîne γ qui peut remplacer la Allongement de la durée de vie des érythrocytes (de 5 à 10 jours) chaîne β Amélioration du phénotype des érythrocytes Régulation Système tétracycline But : • induire l’expression du transgène à volonté Dérivé du système bactérien de résistance à la tétracycline : • éventuellement contrôler le niveau d’expression du transgène tetR pas de transcription • limiter au maximum l’expression résiduelle Systèmes existants : • tétracycline (origine bactérienne) Tet O gène + Tet • Ecdysone (origine insecte) transcription • RU486 (hormone abortive) • Rapamycine (immunosuppresseur) • PPARγγ Tet O gène Utilisation dans une cellule eukaryote Contrôle de l’expression par un antisens: promoteur CMV VP16 50000 Activité SeAP en CPS tetR Protéine de fusion tetR-VP16 (VP16 est un activateur de transcription d’origine virale) codée par un plasmide Tet-on Tet-off transcription gène Tet O gène Tet O 45000 40000 35000 30000 25000 20000 15000 10000 5000 0 J8 J15 J22 J30 J63 J70J170J189J358J365 + Tet + Tet Lot 1 transcription SeAP pCMV pCMV + SeAP pCMV Contrôle de l’expression par un antisens : promoteur tétracycline SeAP Utilisation de ribozymes 16000 Activité SeAP en CPS Lot 2 gène Tet O gène Tet O J8 J15 J22 J30 J63 J70J170J189J358J365 3’ 5’ Hélice III C G 14000 12000 doxycycline A 10000 U 8000 G 4000 A U C U G A U G A G C G U G 6000 G G G C C G A A C C C G G U Hélice II A C G U AAG A C U C G C A C C Hélice I 2000 0 J8 J15 J22 J30 J63 J70 J170J189 J358 J365 J8 J15 J22 J30 J63 J70 J170J189 J358 J365 Lot 3 Lot 4 + pCMV SeAP pTet SeAP Activité catalytique de coupure intramoléculaire Promoteurs spécifiques du tissu Utilisation de ribozymes Hélice III N N N N N Y N’ R G A A A 3’ N N N A 5’ N’ N’ N’ U H U G Promoteur N A G Tissu cellulaire gène thérapeutique substrat N’ N’ N’ N’ 3’ C Le transgène ne doit s’exprimer que dans le tissu choisi (muscle, foie…) N N N N 5’ Structure secondaire Ribozyme-substrat Hélice I Hélice II PEPCK hépatocytes (PhosphoEnolPyruvate CarboxyKinase) facteur IX SPA cellules épithéliales CFTR (Surfactant ProteinA) ( Poumon) MLC1:3 Myoblastes (Myosin light chains) minidystrophine CEA cellules tumorales (CarcinoEmbryonic Antigen) HSV-tk Introduire la séquence cible en 5’, de façon à éliminer la coiffe : 5’ coiffe……………….N’N’N’UHN’N’N’N’….AUGNNNNNNNN ARNm 3’ ……………….NNNAAAGYNNNNNN’RAGNAGUCNNN…. Conclusion • mise au point de plasmides efficaces, adaptés et sûrs. • ne pas stimuler le système immunitaire • atteindre les cellules cibles uniquement • Réguler : exprimer le gène à un taux déterminé pendant une période déterminée en parvenant à un contrôle spatio-temporel efficace de l’expression des gènes MCK muscle squelettique (muscle creatine kinase)
