Correction Sujet Biotechnologies – bac STL option biotechnologies 2016 Q1 : Le plasmide pBR322 est adapté à une utilisation en génie génétique car il présente les caractéristiques suivantes : - Présence d’une origine de réplication (ori) Présence d’au moins un gène de sélection (ici 2 : tet R et amp R) Présence de sites de restriction (EcoR I, Hind III, BamH I) Q2 : EcoR I et Hind III BamH I = site de restriction Gène ampR Schéma annoté du plasmide recombinant obtenu Gene tetR Origine de réplication Gène proinsuline inséré Q3 : Le site bamH I est le seul situé au milieu d’un gène de sélection permettant ainsi de trier les plasmides ayant insérés le gène d’intérêt ou non. En effet, le gène de sélection deviendra inactif si le gène d’intérêt a été inséré, le gène n’ayant pas pu être traduit de façon continue en protéine. Q4 : Le clone A correspondant à la bactérie transformée avec le plasmide pBR322 est résistant à l’ampicilline et à la tétracycline car la bactérie a intégré le plasmide mais celui-ci ne contient pas le gène de la proinsuline ; ainsi les gènes de sélection ampR et tetR ont pu être traduits en protéine conférant à la bactérie une résistance pour les 2 antibiotiques. Le clone B contient le plasmide recombinant. Ainsi, le gène d’intérêt a pu s’insérer au niveau du site BamH I empêchant la traduction du gène tetR et inactivant ainsi le gène de résistance tetR. On obtient ainsi une absence de résistance à la tétracycline pour ce clone. Le clone C contenant uniquement le gène de la proinsuline circularisé ne contient pas les plasmides pBR322 ou recombinant. Ainsi le clone n’a pas acquis de résistance à l’ampicilline et à la tétracycline. Le clone D n’a pas du tout été transformé (pas de plasmide ni de gène de la proinsuline). Ainsi il n’a pas pu acquérir de résistance d’où une absence de sensibilité aux 2 antibiotiques pour ce clone. 1 en partenariat avec epicureweb.fr Gabarit - Copie.indd 1 1 21/06/2016 09:07 Q5 : Le clone de type A est résistant à l’ampicilline et à la tétracycline ainsi il est capable de pousser en leurs présences. Je relève donc les colonies ayant poussées sur les deux milieux soit les colonies : 1-3-4-6-7-8-9-10-12. Q6 : Les colonies de bactéries transformées par le plasmide recombinant sont celles résistantes à l’ampicilline mais sensibles à la tétracycline. Ainsi elles doivent avoir poussées sur le milieu 1 mais pas sur le milieu 2 ; ce sont donc les autres colonies : 2-5-11. Q7 : La durée de la phase de latence pour le milieu M1 est de 45 min La durée de la phase de latence pour le milieu M2 est de 25 min Q8 : Détermination des vitesses spécifiques de croissance : Pour M1 je choisis 2 points en phase exponentielle (140 ; 3) (50 ;0.5) µexpo = ln140-ln50/3-0.5 µexpo = 0.412 min-1 Pour M2, je choisis 2 points en phase exponentielle (40 ;0.75) et (60 ;1.05) soit µ expo = ln60-ln40/1.05-0.75 µexpo = 1.35 min-1 Q9 : le milieu M2 contient davantage d’éléments nutritifs que le milieu M1 (glucose, extrait cœur cervelle). La phase de latence est plus longue dans le milieu M1 car la bactérie doit synthétisée les enzymes nécessaires à la dégradation des éléments nutritifs (ici l’extrait de viande et les peptones) tandis que dans le milieu 2 il y a du glucose qui peut être directement dégradé d’où un début de croissance plus rapide. Q10 : Le milieu permettant une croissance optimale du clone D’E coli est le milieu 2 car il contient davantage d’éléments nutritifs ce qui en fait un milieu permettant une croissance plus rapide du clone (phase de latence plus courte) et une croissance en phase exponentielle plus élevée. Q11 : La phase stationnaire composée de billes de gels poreuses permet le passage à l’extérieur de l’insuline mature (molécule d’intérêt) tandis que le peptide C lui pénètre dans les billes. La phase mobile, ici du tampon, permet la création d’un flux entrainant les différentes molécules. Ce type de chromatographie se nome chromatographie d’exclusion, elle permet une séparation en fonction de la taille et de la forme. Q12 : La masse moléculaire de l’insuline mature est : 100*51 = 5100 Da La masse moléculaire du peptide C est : 100*31 = 3100 Da Q13 : le gel Sephadex G25 est le plus adapté à la purification de l’insuline mature car il retient les molécules de 1000 à 5000 Da or le peptide C qui doit être retenu ici fait 3100 Da : il rentre donc dans cette intervalle. De plus l’insuline mature sera ici rejetée des billes car sa taille est de 5100 Da donc supérieure à l’intervalle de masses moléculaires des composés ralentis par le gel Sephadex G25. 2 en partenariat avec epicureweb.fr Gabarit - Copie.indd 2 2 21/06/2016 09:07 Q14 : TMB Substrat coloré Q15 : L’absorbance à 450 nm est proportionnelle à la concentration d’insuline présente car chaque molécule d’insuline fixée permettra la dégradation par une peroxydase d’une molécule de TMB en un substrat coloré. Ainsi, plus il y aura d’insuline, plus il y aura de substrats colorés (d’où une proportionnalité entre l’absorbance et le produit coloré). Q16 : Obtention d’une souche d’E coli recombinante : utilisation de l’enzyme BamH I. Le clone B est retenu c’est à dire les colonies poussant sur la boite 1 mais pas sur la boite 2 Optimisation de la culture de la souche sélectionnée : utilisation du milieu 2 présentant une phase de latence plus courte et une vitesse spécifique de croissance plus élevée. Purification de l’insuline produite par la bactérie recombinante : utilisation d’une chromatographie d’exclusion avec le gel Sephadex G25 Dosage de l’insuline humaine purifiée : lecture des cupules après réaction à 450nm avec une absorbance proportionnelle à la concentration d’insuline présente dans l’échantillon 3 en partenariat avec epicureweb.fr Gabarit - Copie.indd 3 3 21/06/2016 09:07