BIOCELL : LE CYTOSQUELLETTE Le cytosquelette est la charpente de la cellule qui la maintient en place. Il est dynamique (en perpétuel organisation/désorganisation) et permet, en plus du maintien cellulaire, le déplacement des organites rapide grâce à la coordination entre la protrusion de la membrane et la translocation du corps cellulaire. L’organisation et la dynamique des filaments sont régulés par des protéines qui leur sont associées. Microfilaments d’actine : Rôles : - Contraction musculaire - Adhésion cellulaire - Modification de la forme des cellules : rigidité et souplesse des érythrocytes (= globules rouges), microvillosités (augmentation de la surface d’échange), formation de filopodes… - Mobilité cellulaire : au cours du développement pour la mise en place mais également en cas de réponse immunitaire ou pour transporter des organites + déplacements des bactéries intracellulaires. - Intervient dans la formation du fuseau mitotique (division cellulaire) Composés de 2 brins de monomères globulaires d’actine qui s’assemblent en hélice, diamètre 7nm. Représente 5 à 20% du contenu protéique cellulaire. L’actine G (globulaire) porte un ATP ou un ADP dans son sillon. La polymérisation du filament n’a pas besoin d’apport d’énergie, mais elle est plus rapide à l’extrémité + qu’{ l’extrémité – Organisation en faisceaux (= fibres de stress) ou en réseaux grâce à des protéines associées. Filaments intermédiaires : Rôles : - Support mécanique : forces, résistances des cellules exposées aux contraintes (ex : épithéliales) - Protection l’ADN dans le noyau - Cohésion entre cellules ou au niveau des tissus (jonctions, contacts avec la matrice). - Architecture de la cellule (lamines nucléaires, desmines et kératines interviennent aussi dans la cyto-architecture) - Migration cellulaire : disposition en « cage » (résistance aux stress mécaniques) ou périnucléaire (assouplissement du cytoplasme pour permettre la pliabilité de la cellule et son extravasation) (ex : vimentine intervient dans la migration des lymphocytes). - Modulation des voies de signalisation : liaison à des récepteurs membranaires ou à des protéines adaptatrices pour réguler la transmission du signal (extint) Forment des câbles qui ne sont pas polarisés, de diamètre de 8 à 12 nm Présents dans le cytosol et dans le nucleoplasme (doublent l’enveloppe nucléaire et la stabilisent) Microtubules (MT) : Rôles : - Motilité des cils et des flagelles - Fuseau mitotique en cas de division cellulaire - Transport des organites. Association des hétérodimères en protofilament 13 protofilaments tube creux polarisé Le pôle (-) se trouve au centre initiateur du microtubule, le MTOC appelé centrosome, et le (+) est l’extrémité grandissante allant vers la membrane plasmique. Hétérodimères de tubulines α et β qui porte une molécule de GTP ou GDP par sous-unité (jamais hydrolysé sur la sous-unité α) indispensable pour un filament fonctionnel. Biocell : cytosquelette 2010 Page 1 Polymérisation plus lente que dépolymérisation (à cause du GTPGDP). En plus de la ligation au GTP, il faut que la concentration en tubuline soit donc bonne : au-delàs de la concentration critique Cc, il y a polymérisation, en-dessous il y a dépolymérisation. Les MT peuvent être stables, mais aussi éphémères, de même que parfois, ils ne sont pas reliés au MTOC : ce sont des MT non-centrosomaux comme les dendrites neuronaux. C’est un type de MT servant au transport de protéines motrices par treadmilling (décroissance côté (-) et croissance côté (+), causant un déplacement). Majoritairement, ils sont associes en réseaux. I. Les protéines associées aux microtubules : les MAPs Les MAPs s’associent latéralement la paroi des MT et leur confèrent des propriétés particulières (physico-chimiques, biologiques) et les guident vers des localisations cellulaires spécifiques. Elles possèdent 2 domaines : - Un domaine basique de fixation aux MT - Un domaine acide, en sailli sur la paroi des MT qui se lie soit aux membranes, soit aux filaments intermédiaires, aux microfilaments d’actine ou { d’autres MT et qui permet e régler la distance entre les MT. Les MAPs structurales - Organisation et modelage des réseaux de MT (MAPs d’assemblage) - Régulation de la polymérisation et stabilité des MT (MAPs stabilisantes/déstabilisantes) Les MAPS motrices - Déplacement des organites cellulaires - Régulation de l’instabilité des MT 1) Les MAPs structurales Les MAPs d’assemblage - De type 1A, 1B, 1S : Longues protéines filamenteuses, flexibles et structurellement très proches (à la différence de 1A, le type 1B possède une tête globulaire), stabilisent les microtubules dans les neurones (1A et 1B) et d’autres types cellulaires (1S). (Sur l’image, M= site de liaison aux MT) - De types 2, 4 ou τ: Même séquence de 18 A.A. répétées 3 ou 4 fois dans leur domaine de liaison au microtubule. MAP 2 : dans les dendrites, faisant des ponts entre MT et filaments intermédiaires. MAP 4 : dans les cellules non-neuronales, associées aux MT pendant l’interphase et la mitose. τ : dans les axones/dendrites, accélérant la polymérisation et organisant les microtubules en épais faisceaux stables. Les MAPs qui se fixent latéralement sur les MT sont stabilisantes. Biocell : cytosquelette 2010 Page 2 Elles inhibent la dépolymérisation : empêchent les protomères de tubuline de quitter le centre et les extrémités des MT, tau accélère la polymérisation dans les cônes de croissance des neurones et les MAPs de type 2 rajoutées à une solution de tubuline accélèrent la nucléation (=formation du noyau). Les substances chimiques qui affectent les MT Les voies de signalisation C’est une phosphorylation/déphosphorylation qui régule la fixation des MAPs aux microtubules. La forme des MAPS liée aux MTs est déphosphorylée. Kinases impliqués : - MAP Kinase (prot activée par des mitogènes) - MARKs Kinase (in vitro MARK augmente l’instabilité dynamique des MT tau phosphorylé par MARK en présence d’ATP se dissocie des MT entrainant leur dépolymérisation) - Cdc2 Kinase La phosphorylation entraine le détachement des MAPs et la déstabilisation des microtubules et donc leur raccourcissement. Ex dans la maladie d’Alzheimer : tau est hyperphosphorylé et entraines la dégénérescence des neurofibrilles. Les protéines de séquestration La stathmine (op18) stabilise les tubulines sous forme d’hétérodimères, (en se liant à eux) inhibant leur polymérisation en MT et stimulant les phénomènes de catastrophe. Régulation par phosphorylation (inactive) et déphosphorylation (active). Elle est surexprimée dans les cellules en prolifération et cancéreuses. Elle a un rôle important pendant la mitose : elle est active en prophase, se désactive par phosphorylation au début de la prophase puis se réactive à la fin de la cytodirèse. Biocell : cytosquelette 2010 Page 3 Les protéines de coiffe A l’extrémité (-) : - La tubuline γ permet la nucléation des MT en croissance et l’ancrage des MT au niveau du MTOC selon 2 modèles possibles : Template model : la tubuline γ s’associe latéralement pour former un anneau protéique. Protofilament model : la tubuline γ s’associe longitudinalement en protofilaments prolonge par les dimères d’α et β (le tube est ainsi referme). Elle affecterait aussi la dynamique des MT { l’extrémité (+) par des mécanismes mal connus. - La catastrophine (centrosome) A l’extrémité (+) : - La catastrophine (kinétochore) : déstabilisatrice des MTdépolymérisation. Ce sont des dépolymérases membres de la famille des kinésines, induisent des catastrophes en déparant les protofilaments. - (+) Tip : stabilisateurs des MT (régissent les forces appliquées au MT), régulent différents aspects de l’architecture cellulaire en interagissant avec les facteurs de signalisationassurent un lien avec des structures cellulaires (cortex cellulaire, kinétochore, vésicules d’endocytose…) Clip : lient les vésicules d’endocytose, participent au trafic vésiculaire, { la formation de faisceaux, régulent la localisation des dynéines/dynactines. Clip 115 : très présente dans les dendrites des neurones. Clasp : stabilise les MT et intervient dans leur dynamique en interagissant avec les Clip. APC : à proximité de la membrane plasmique des cellules en migration, stabilise les MT et intervient dans la formation des faisceaux. Présente dans les cônes de croissance des neurones. EB1 : interagit avec APC, intervient dans la pousse neuritique. Les protéines de fragmentation - La Katanine casse les MT, les libère de leurs attaches sur le MTOC, rôle crucial dans la dépolymérisation rapide des MT au pôle du fuseau mitotique au cours de la mitose mais aussi dans les neurones. Nécessite de l’ATP. - La protéine STOP dans le système nerveux : confère une résistance à la dépolymérisation (inhibe la dynamique, stabilise les MT), au froid et au nocodazole, permet l’initiation de la pousse neuritique. Lorsqu’elle est phosphorylée, elle se détache des MT et va s’associer { l’actine et aux protéines synaptiques mais elle est pratiquement tout le temps associée aux MT, leur conférant leur grande stabilité. 2) Les MAPs motrices Fonctions des moteurs moléculaires : - Transport des vésicules de sécrétion, d’endocytose et entre le RE et Golgi Tri et adressage des protéines dans les cellules polarisées Mouvements et organisation spatiale des organites Transport viral Mise en place du fuseau mitotique Battements des cils et flagelles Biocell : cytosquelette 2010 Page 4 2 types : - La Kinésine : transporte des vésicules du corps cellulaire vers la terminaison nerveuse de l’axone qui correspond { l’extrémité (+) des MT (identifiée dans l’axone géant de calmar). - La Dynéine : assure le transport en sens inverse, vers l’extrémité (-) des MT. Elle est associée à un complexe multiprotéique de dynactine comprenant un filament d’Arp1 apparenté { l’actine. Fonctionnement : La fixation d’ATP sur la tête antérieure (1) tire la tête postérieure (2) vers l’avant de 8nm. La libération d’ADP de la tête (2) et l’hydrolyse d’ATP de la tête (1) remettent les têtes dans la même position. Mise en place de l’appareil de Golgi Une des principales fonctions des moteurs moléculaires dans les cellules en interphase est de transporter et placer les organites entourés d’une membrane. Le remodelage du réseau de MT pendant la mitose induit un remodelage de l’appareil de Golgi. La dépolymérisation des MT par le nocodazole entraine une fragmentation de l’appareil de Golgi. L’altération des protéines motrices altère la morphologie de l’appareil de Golgi. Si on laisse les MT se reformer, les mini-citernes se déplacent vers le MTOC et fusionnent pour reformer le Golgi. Dynéine associée au Cis-Golgi et Golgi médian : maintien à proximité du MTOC. Kinésine associée au trans-Golgi : transport vers la membrane plasmique. Biocell : cytosquelette 2010 Page 5 Modèle d’implication des protéines motrices dans le positionnement et la vésiculation de l’appareil de Golgi Régulation des moteurs moléculaires dans le mouvement des mélanosomes La kinésine et la dynéine sont associées aux mélanosomes : ils subissent des mouvements dus à une traction de type « lutte de corde » entre la kinésine et la dynéine, l’activité des 2 protéines motrices permet une répartition homogène des granules dans le cytoplasme le long des MT - - Mouvements centrifuges saccadés avec des retours en arrière : la kinésine plus forte entraîne les granules vers la périphérie de la cellule. Mouvements centripètes, rapides et sans àcoups quand la kinésine est phosphorylée (inactive) Schéma récapitulatif de la formation des MT et de leurs régulations Biocell : cytosquelette 2010 Page 6 II. Les protéines associées à l’actine En se fixant sur les microfilaments (MF) ou sur les monomères, les protéines accessoires régulent : - La polymérisation/dépolymérisation des MF (prot nucléation/coiffe/fragmentation/stabilisation) - Leur nombre et leur longueur - Leur stabilisation - Leur organisation en faisceaux ou réseaux - Leur fragmentation/destruction - Leur ancrage à la membrane plasmique Dans les cellules, 40% de l’actine est sous forme non polymérisée (jusqu’{ 70% dans les plaquettes) 1) Régulation de la dynamique des MF d’actine Les protéines de séquestration de l’actine G La thymosine La profiline L’ADF/cofiline - La Thymosine Bloque le site de fixation de l’ATP, bloquant l’association des monomères aux extrémités (+) et (-) des MF d’actine. Biocell : cytosquelette 2010 Page 7 - La profiline Elle accélère à la fois la polymérisation (+) et la dépolymérisation (-) des MF. Elle est impliquée dans la nucléation et l’élongation des MF. Sa liaison aux phospholipides membranaires (PIP2) prévient la liaison { l’actine G et la liaison { des protéines de signalisation de la membrane plasmique permet de localiser le complexe profiline/actine G à la membrane plasmique. La profiline déplace les sous-unités d’actine séquestré. Quand l’actine G est liée { l’ATP, elle peut se fixer sur l’extrémité (+) Il existe une compétition entre ces deux protéines pour se fixer { l’actine : - Les ADF/cofilines : Elles favorisent le désassemblage des MF d’actine en liant l’actine { l’ADP et empêchent l’échange entre ADP-ATP. Ils démantèlent efficacement les plus anciens MF assurant leur renouvellement. Elles sont considérées comme des protéines de coiffe et de fragmentation. Substances chimiques affectant le cytosquelette d’actine Il y a trois étapes dans la polymérisation d’actine in vitro : - Nucléation : les monomères s’assemblent en oligomères. - Elongation - Equilibre : état stable avec des sous-unités entrantes et sortantes. Cc côté (+) ATP < [sous-unités libres] < Cc côté (-) ADP Protéines de nucléation Complexe Arp 2/3 Formines Spire Cofiline Biocell : cytosquelette 2010 Page 8 - Complexe Arp 2/3 Elle présente 45% d’homologie de structure avec l’actine : mime un dimère ou trimère d’actine. Elle coiffe l’’extrémité (-) de l’actine permettant une élongation rapide de l’extrémité (+) et se fixe sur le côté d’un autre filament pour édifier un réseau. Elle est régulée par des molécules de signalisation intracellulaire placées à la face cytosolique de la membrane plasmique : les WASP. - Les formines Elles s’associent { 2 monomères d’actine et suivent l’extrémité (+) du MF en formation. Elles peuvent lier le complexe profiline/actine, accélérant l’addition de monomères { l’extrémité barbue. Plutôt impliquées dans la formation des faisceaux (câbles) d’actine. - Les Spires Elles se lient { 4 monomères d’actine pour former un tétramère longitudinal. Comme les complexes Arp, elles restent associées { l’extrémité (-) du filament. Elles seraient plutôt impliquées dans le trafic des organites cellulaires : quand il y a surexpression elles sont co-localisées avec les membranes de l’appareil de Golgi. - Les Cofilines Elles peuvent induire une nucléation de l’actine si elles sont présentes en grande concentration mais leur mécanisme d’action est inconnu. Les protéines de coiffe Elles stabilisent les extrémités des MF d’actine en empêchant soit l’addition soit la dissociation des monomères, ce qui ralentit la croissance ou la dépolymérisation des MF. La régulation du coiffage se fait par 2 voies de signalisation : le calcium et le PIP2 L’augmentation du Ca2+ active ces protéines entrainant le coiffage des MF d’actine. L’augmentation de PIP2 décoiffe les extrémités (+), élongation des MF à la surface de la cellule. - Gelsoline, Fragmine, Séverine : Elles piègent le calcium et bloquent la dissociation des monomères d’actine { l’extrémité (+). - CapZ : Elle n’a pas une activité dépendante du calcium. Sa forte affinité pour l’actine empêche les protomères de quitter le filament { l’extrémité (+). La plupart des MF sont coiffés par CapZ. - Tropomoduline L’actine musculaire est stabilisée par la tropomoduline { l’extrémité (-) et par CapZ { l’extrémité (+). Biocell : cytosquelette 2010 Page 9 Les protéines de fragmentation Elles découpent l’actine pour former de nouvelles extrémités +rôle fondamental dans l’exocytose + intervention dans le changement de forme des plaquettes (étalement) activées avec augmentation de [Ca2+] suivie d’une augmentation [PiP2]. 4 protéines : Gelsoline, cofiline, brévine, fragmine et séverine. Fonctionnement de la Gelsoline : 1) Changement de la conformation de la Gelsoline induite par la fixation du Ca 2+ 2) dislocation du filament d’actine par la Gelsoline 3) activation des monomères d’actine libre (actine-G-ADP) qui se lient à la profiline qui les rend disponibles à une nouvelle polymérisation élongation rapide des MF qui vont s’organiser en réseau formation de lamellipodes Activation des plaquettes sanguines : Les protéines de stabilisation Tropomyosine, nébuline, caldesmone se fixent sur les côtés des MF - Complexe troponine/tropomyosine La tropomyosine (40nm) se fixe sur 7 sous-unités d’actine adjacentes d’un protofilament, bloquant l’interaction avec d’autres protéines (cache les sites de fixation) empêche la contraction musculaire. Elle est régulée par la tropomoduline - Nébuline Protéine fibrillaire dans le muscle strié qui régule la longueur du filament en se fixant latéralement aux MF (empêche les échanges de monomères). - Caldesmone Protéine fibrillaire (75nm), dans le muscle lisse et les cellules non musculaires. Son extrémité C-ter interagit avec l’actine et N-ter avec la myosine. Elle régule l’interaction actine/myosine : quand [Ca2+] est basse, elle forme un complexe avec la tropomyosine et l’actine, empêchant la myosine d’accéder { l’actine. Biocell : cytosquelette 2010 Page 10 2) Régulation de l’organisation des filaments dans l’espace - - - - En réseaux bidimensionnel (lamellipodes) : principalement sous la membrane plasmique tridimensionnel (pseudopodes) En faisceaux contractiles : dans les fibres tractiles reliant les plaques d’adhérence (fibres de stress) et dans la ceinture périphérique des cellules épithéliales relie les jonctions adhérentes importante pendant contraction neurale et formation du tube neural). Parallèles serrés : dans les microvillosités et les filopodes. Protéines de réticulation Filamine, gélactine, spectrine, dystrophine … Filamine Protéines longues et flexibles qui relient 2 filaments d’actine presque en angle droit formant un gel lâche. Importante pour la formation des lamellipodes lors de la migration cellulaire. Protéines de fasciculation α-actinine, fimbrine, villine, fascine… relient les fibres en faisceaux serrés (fimbrine) ou large (α-actinine) dans villosités intestinales et stéréocils de l’oreille interne. Protéines d’ancrage membranaire Spectrine, dystrophine, ankyrine, ERM, vinculine … Elles associent les filaments à la membrane plasmique. Importantes pour : La forme de la cellule Le maintien de micro-domaines protéiques membranaires L’attachement { la matrice extra-cellulaire Présentes dans les érythrocytes, dans les nœuds de Ranvier des neurones (maintien de la forme des neurones et de l’accumulation des canaux sodiques), dans les muscles 3) Voies de signalisation impliquées dans les réarrangements du cytosquelette d’actine Elles modulent l’activité des protéines responsables de la forme et la fonction du cytosquelette d’actine (membres de la famille Rho ou de la superfamille Ras, des GTPases qui contrôlent les processus en passant d’un état actif GTP-lié à un état inactif après hydrolyse). Biocell : cytosquelette 2010 Page 11 Micro-injection de Rho-GTP dans des fibroblastes assemblage de fibres de stress et formation de contacts focaux. Micro-injection de Cdc42 de nombreux filopodes forment des contacts adhésifs avec le support, augmente la nucléation Micro-injection de rac- GTP formation d’un énorme lamellipode délimitant toute la circonférence de la cellule. 4) Les moteurs moléculaires associés à l’actine : les myosines 20 classes de myosines structurellement et fonctionnellement différentes. Composées de chaînes lourdes et légères sous forme monomérique ou dimérique. Elles utilisent l’énergie de l’hydrolyse d’ATP pour se déplacer vers l’extrémité (+) des MF d’actine. Fonctions principales : - Contraction musculaire (myosine II) - Migration cellulaire et adhésion - Trafic membrane : endocytose/exocytose - Transport intracellulaire - Localisation des organelles, protéines, ARN Sans ATP, la myosine s’attache fortement { l’actine comme c’est le cas dans la rigidité cadavérique. Voir cycle des ponts pour le mécanisme de déplacement de la myosine sur le MF d’actine, commun { toutes les myosines. Biocell : cytosquelette 2010 Page 12 La myosine II Sous forme de dimères grâce au super enroulement de la queue des chaines lourdes : les queues de plusieurs dimères se fasciculent pour former des filaments épais bipolaires contenant plusieurs centaines de têtes de myosine orientées dans des directions opposées. C’est la présence de Ca2+ qui permet l’interaction entre la myosine et l’actine. Sans calcium, la tropomyosine gène cette interaction puis la troponine favorise l’écartement de la tropomyosine grâce au Ca2+. Elle a également une activité contractile dans les cellules non musculaires (fibre de stress dans fibroblaste, anneau contractile de la cytodirèse dans une amibe, ceinture périphérique dans des cellules épithéliales. Myosine I - Implication dans la formation de protrusions membranaires - Transport d’endosomes et vésicules Golgiennes Myosine V - Transport de mélanosomes (dispersion dans les mélanophores) Lysosomes, endosomes Vésicules Golgiennes RE Vésicules de sécrétion - Présente dans système nerveux : importante dans la transmission de signaux nerveux - Associée aux granules de sécrétion d’insuline dans les cellules beta MIN-6 5) Implications des MF d’actine dans la formation des lamellipodes dans la migration cellulaire 12345- Adhérence Extension membranaire = protrusion du lamellipode Nouvelle adhérence Translocation du corps cellulaire Contraction et décollement des points focaux postérieurs 6) Pathologies associées au cytosquelette d’actine - Musculaire : myopathie de Duchenne _ mutation de l’expression de la dystrophine - Sanguine : elliptocytosis, sphenocytosis _ modification de la forme des erythrocytes suite a des mutations affectant les genes codant pour des spectrines ou ankyrines. - Motilite Cellulaire : mort prématurée du fœtus, disfonctionnement des cellules immunitaires - Infectieuses : listerioses, shigelloses, ou dysenteries. - Sensorielles et neuro-dégénérative : surdite, cecite, troubles moteurs Biocell : cytosquelette 2010 Page 13