22/03 BIOPATHOLOGIE TISSULAIRE ET EXPLORATIONS IMAGERIE DE FLUORESCENCE : QUELQUES APPLICATIONS EN BIOLOGIE ET MEDECINE La fluorescence suppose l’absorption et l’émission de photons. C’est donc une technique radioactive. 1. Bases Physiques de la fluorescence Interaction lumière/ matière : Mouvements dans la molécule Polarisabilité / polarisation Liaison chimique Lumière = onde électromagnétique associée au photon Elle peut donc interagir avec les dipôles stables ou induits, et donc avec la matière Quand un photon rencontre une molécule, il peut être : Réfléchi Transmis (il traverse) Et surtout absorbé Pas d’effet L’énergie du photon est E=hν. 2. L’absorbance UV-visible : Construction du spectre d’absorbance o On regarde à différentes longueurs d’onde : Spectre d’absorbance : Courbe des niveaux d’énergie pour lesquels le composé absorbe la lumière en fonction de la longueur d’onde C : cellule optique contenant un liquide qui doit être traversé. Caractérisée par une concentration. Une cellule peut y être assimilée. L’émission de radiations constitue la fluorescence. En effet une molécule ayant absorbé de l’énergie doit la réémettre. On s’intéresse donc à ce qui est émis et pas ce qui traverse la cellule (c’est pourquoi le système d’enregistrement ne se situe pas dans le même plan que le système émetteur). 3. La fluorescence : Le spectre de fluorescence est équivalent au spectre d’absorption de la substance. La forme du spectre de fluorescence ne dépend pas de la longueur d’onde d’excitation Paramètres d’intérêt : L’intensité de fluorescence La distribution spectrale de la fluorescence Les longueurs d’ondes maximales Imax Le rendement quantique de fluorescence : phiF o Phi F est le nombre émis / nombre de photons absorbés Multiples processus de « quenching » de ‘énergie de fluorescence (quenching : excitation désactivation / inhibition) fluorescence d’une molécule non isolée : Le plus utilisé en biologie cellulaire : FRET Extinction de fluorescence par FRET : Le spectre de fluorescence de l’émetteur doit recouvrir partiellement le spectre d’absorption de la molécule réceptrice. Ce phénomène est d’énergie entre deux dipôles qui ne dépend que de la distance entre les deux. multiples processus de « quenching » de l’énergie de fluorescence (= excitation, désactivation, inhibition c’est un transfert d’excitation entre deux molécules voisines. Le transfert se fait par un couplage dipôle – dipôle. Il s’agit d’un phenomène qui dépend de la distance entre les deux fluorophores (l’accepteur et le donneur). On va exciter la molécule M et on observe dans certaines conditions de concentration l’émission de la molécule Q. pas de contact entre M et Q dépend de la distance MQ en 1/Ro spectres de M et Q inchangés La distance de Forster (Ro) est la distance pour laquelle l’efficacité de transfert est de 50% (50% de quenching entre M et Q pour une distance Ro) les fluorophores biologiques : a-intrinsèques On peut éventuellement utiliser le tryptophane et tyrosine, mais il est si peu spécifique qu’on ne l’utilise pas comme sonde de fluorescence. On utilise le NADH et NADPH qui sont plus spécifique, ils ont une auto fluorescence, on les utilise par exemple comme marqueur de l’activité des mitochondries. L’hème et la GFP( la Green Fluorescent Protein est la plus importante des molécules de fluorescente, on peut réaliser des phénomènes de fusion entre la GFP et n’importe quelle molécule) sont utilisés comme marqueur. GFP, ECFP et ECFP : très utilisé en microscopie sur cellules vivantes, survie de molécules uniques = outil fondamental Toutes les biomolécules ne fluorescent pas à cause d’autres processus de désexcitation compétitifs b-extrinsèques Peu de molécules naturelles sont de bons fluorophores on marque les molécules avec des fluorophores additionnels : (fluorophores :)acridine orange (cible :)Adn et lysosome 4. La microscopie de fluorescence : Paramètres déterminant la qualité de l’image -Source de lumière : laser lampes -Marqueurs fluorescent : intrinsèque, extrinsèque -Optique : objectif, lentille -Détection : œil, caméra Propriétés requises pour des fluorophores utilisables comme marqueurs de fluorescence en microscopie - Coefficient d’extinction molaire élevé Rendement quantique Brillance Type de fluorophore Auto fluorescence Avantages Intrinsèques Marqueurs fluorescent Brillants, grande variété spectrale Grand décalages des spectres Petite taille Inconvénients Non contrôlés Souvent vue comme un pb in vivo Prot fluorescentes Shift : déplacement en distance de la longueur d’onde Les marqueurs vitaux : - Cellules endothéliales pulmonaire bovine incubée simultanément avec Lyso Tracker Red et Mito –tracker green à 37°C pendant 30 min - Vague de calcium consécutive à la fécondation d’un ovocyte suivie en calcium green Le microscope : Généralement dans un système afocal (image projetée à l’infini) L’espace de travail est beaucoup plus important dans un microscope inversé : permet de visualiser un milieu de culture entier et d’interagir dedans en même temps qu’on observe au microscope Le microscope inversé : on a une platine et l’objectif sera en dessous, on aura a ce moment un espace de travail beaucoup plus grand que dans le microscope droit. Ceci sera un très gros avantage. 5. Les différents microscopes : Obtention d’un objet petit grossissement Localisation précise des structures -+ définition précise Mesurer et localiser la fluorescence système optique et détection Microscope droit à épi fluorescence : on a besoin d’un système de filtre de façon à pouvoir visualiser la cellule en absence de fluorescence et ensuite observer la fluorescence en l’excitant avec une lampe xénon. On a séparé la lumière d’excitation de l’illumination classique pour observer la fluorescence. Microscope inversé : la lampe mercure haute pression xénon permet d’exciter la fluorescence. On obtient sur platine un espace suffisant pour observer la fluorescence. Bloc de filtre (Ploem block) : on excite l’échantillon, normalement par diffusion on devrait tout recevoir sur l’œil ou la caméra. Effet de la diffraction : ceci gène l’observation. On a une diffraction avec interférence lumineuse et diffraction, càd une image maximale et des rebonds sur les cotés. Il y aura aussi les phénomènes d’interférences classiques. Ceci est mauvais pour l’image Il faut atteindre l’intensité du floutage de cette image, on bouge légèrement verticalement le plan image. On utilise des algorithmes pour éliminer les artefacts liés aux propriétés optiques. On a des algorithmes différents selon la qualité de l’appareil Microscopie confocale a balayage a. But Effet de la diffraction : but de Microscopie confocale à balayage : amélioration de la définition axiale Amélioration du profil … b. Montage Effet du trou dépingle (focalisation) : on marque au laser pour obtenir une fluorescence. On obtiendra un étalement à supprimer, pour ceci on s’arrange avec un diaphragme pour ne récupérer que limage au plan frontal. On aura à ce moment un plan focal. La déconvolution : excellente résolution à cout modéré. Acquisition en empilement en Z (Z-stack) pilotage précis en Z Applications : 1- micro injections Les micromanipulateurs Eppendorf installés sur le microscope à fluorescence inversé LEICA AM 6000 pour micro injections dans les cellules vivantes en culture. Métabolisme cellulaire : Il faut utiliser la fluorescence du NADH, marqueur de l’activité métabolique. Principe : micro injection d’un substrat du cycle de Krebs provoque la modification du rapport NAD (P)H/ NAD(P) à niveau intracellulaire (NAD(P)H +NADP) constant. On peut alors étudier la réponse à une substance exogène. Forte production de NADH dans les fibroblastes de souris préalablement traités avec du DNP et micro injectés (t=0) avec du malate, un des substrats clefs du cycle de Krebs Le DNP-2.4 dinitrophénol – découple la phosphorylation oxydative mitochondriale ce qui conduit à une augmentation rapide du NADH et de la consommation d’oxygène en parallèle à une faible formation d’ATP Le DNP est un toxique majeur de l’environnement (gaz de voiture, pesticides) … 2- Le phénomène de FRET On observe des interactions dans les cellules : substrat – enzyme ou enzyme –activation d’une voie intracellulaire. La protéine RAC : est une petite protéine a qui on couple un GFP normal, a partir de la on voit comment cette protéine activée par le GTP se lie a une autre protéine : protéine 21 (une kinase) et le problème c’est qu’on ne peut pas utiliser cette protéine trop grande, on utilisera a ce moment le domaine de fixation de la protéine qui est très fluorescent dans le rouge contrairement au GFP qui émet dans le vert. On obtient un phénomène de FRET. Au niveau cellulaire : on a des fibroblastes 3- le phénomène de FRAP Vitesse de réapparition de la fluorescence vitesse de déplacement des fluorochromes Courte distance, mouvements localisés Avec l’intensité » laser on va blanchir une partie et on aura un trou de fluorescence. Pour regarder la mobilité de la membrane on regarde comment les macromolécules vont revenir dans la zone irradiée. Ex : KRAS (une GTPase). 6. Fluorescence in vivo Photo diagnostic du cancer en phase précoce fondé sur la spectroscopie tissulaire de fluorescence. Contexte médical : Intérêt du diagnostic des lésions précancéreuses et cancéreuses précoces : - Augmentation des chances de guérison - Ttt moins agressifs Technique de diagnostic actuel - Examen endoscopique en lumière blanche - Biopsies sur zones suspectes - Examen microscopique du prélèvement anatomopathologique Imagerie endoscopique de fluorescence : Objectif : - Information contenu dans les spectres sous forme d’une image - Image de fluorescence de même taille et résolution spatiale que limage endoscopique conventionnelle Axes de développement : - Bronches : auto fluorescence NADPH Par exemple, facteur important des cycles mitochondriaux, du CytP450 - Vessie : ALA –PPIX Protoporphyrine IX Acide aminolévulinique - Voies digestives : œsophage et colon Etat de l’art : - Recherche clinique active - Système commercialement disponible pour les bronches et la vessie Principe de l’imagerie d’auto fluorescence : fluorescence du NADH, utilisé comme marqueur de l’activité métabolique - Augmentation de la concentration globale de NADPH intracellulaire - Modification du ration NADPH / NADP à niveau intracellulaire constant - Augmentation de la fluorescence du NADH cohérent avec besoins accrus en énergie des cellules tumorales remarque : dans une cellule tumorale on a un taux de NADPH qui est en général augmenté Imagerie de fluorescence avec le 5 – ALA : Acide alpha – aminolévumique (ou 5-ALA) - Molécule non fluorescente - Précurseur de la PPIS dans la synthèse de l’hème - Pénétration limitée à l’épithélium Administration de 5-ALA exogène - Stimulation de la formation de PPIX - Accumulation préférentielle de PPIX dans les cellules tumorales Protoporphyrine IX (PPIX) fluorescente - Absorption dans le violet lambda max = 410 nm - Fluorescence dans le rouge l max = 365 nm Application clinique principale : détection des carcinomes uréthéliaux superficiels Détection des CIS de la vessie par imagerie de fluorescence (ALA) Carcinome uréthéliaux superficiel - Tumeur pluri focal - Lésions … Instrumentation commercialement disponible KARFL STORZ « D-Light system » - Filtre bleu sur la source de lumière 375-440 nm - Filtre passe haut de réception intégré lambda sup à 520 nm - … Procédure clinique : - Instillation intra vésicale - Durée d’incubation : 2-3 heures - Résection transuréthrale possible …. Résultats clinique - Plusieurs études … Sur le plan clinique - Capacité diagnostique cliniquement démontrée pour les bronches et la vessie - Nécessité d’essais randomisés WL vs WL + fluorescence pour chaque organe, type de tissu et pathologie Sur le plan fondamental - Optimisation des critères de discrimination pour l’auto fluorescence - Augmentation spécificité, évaluation du seuil de sensibilité Imagerie de fluorescence conclusion et perspective Sur le plan industriel : - Pas de verrou technologique majeur - Offre industrielle se diversifie - Présence accrue des leaders… Les cellules tumorales fonctionnent en anaérobie avec la glycolyse : taux de NADPH sous forme réduite augmentée (à cause de l’hypoxie) La protoporphyrine est un excellent photosensibilisateur utile en thérapie photo-dynamique. L’excitation des PPIX produit des espèces très réactives de l’oxygène (oxygène singulet) qui permettent de détruire les cellules tumorales. o Intérêt diagnostique et thérapeutique (notamment pour éradiquer les cancers des cellules squameuses) Mais également pour les cancers bronchiques, prostatiques … C’est donc l’excitation de la PPIX (injectée au préalable) par une sonde endoscopique lumineuse qui va déclencher la production d’EAO, toxique pour les cellules tumorales. C’est une technique qui permet une grande spécificité de destruction des cellules tumorales (peu de dégâts sur les cellules saines contrairement aux chimiothérapies).