Méthodes alternatives à l`expérimentation animale pour l`étude de l
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Méthodes alternatives à l’expérimentation animale pour l’étude de l’angiogenèse : Modèle de la membrane chorioallantoïde du poulet (CAM) Plateforme GenoToul ANEXPLO Corinne Bousquet INSERM U858 / I2MR IFR-BMT / 150 Etude de l’angiogenèse Angiogenèse En physiologie… Au cours du développement embryonnaire Vasculogenèse Angiogenèse Chez l’adulte En physiopathologie… Pathologies associées à l’angiogenèse : cicatrisation inflammation Polyarthrite rhumatoïde croissance tumorale Cancers diabète / ischémie tissulaire Rétinopathie diabétique Méthodes d’études de l’angiogenèse In vitro : cellules endothéliales Essais de prolifération, migration, différenciation en matrigel co-cultures cellules endothéliales / cellules pariétales Ex-vivo (culture d’organes) : à partir d’explant d’aorte « aortic ring assay » (rat, souris, porc) à partir d’explant de veine cave / aorte à partir de tissus humain : explant placentaire, veine ombilicale In vivo : sur la cornée (lapin) en cancérologie : « Dorsal air sac » & « Dorsal skin fold chamber » xénogreffes sous-cutanées ou orthotopiques CAM CAM : Membrane extra-embryonnaire du poulet Rôles mutiples: échange de gaz (organe respiratoire) transport d’électrolytes (Na, Cl) mobilisation de Ca stockage des excrétions Staging stages (HH, Hamburger & Hamilton, 1952) 1 4 5 CAM 10 18 développement de la vascularisation artères, veines, plexus capillaires et lymphatiques Système immun non développé T B cell immunocompétent 21 naissance Avantages: Inconvénients In vivo Immunoréactions : espèce poulet Non sur animaux transgéniques Simplicité (extra-embryonnaire, très vascularisée, 60-80 µM) Rapidité Faible coût (œufs & entretien) Non soumis aux mêmes réglementations (pas de comités d’expérimentation animale) Possibilité de xénogreffes (non immun) Etude du microenvironnement Angiogenèse Lymphangiogenèse Réaction inflammatoire Métastases pH acide (idem hypoxie) microarrays Chick Affymetrix Comparaison résultats CAM / modèles murins / pathologies humaines Industrie pharmaceutique Juin 2006 = FDA autorise l’évaluation des produits en pré-clinique sur CAM Angiogenèse / anti-angiogenèse Cicatrisation (wound healing) Test de toxicité & biocompatibilité de biomatériaux, implants, biosensors… « Drug delivery system » cytotoxicité biocompatibilité activité cytotoxicité biodistribution pharmacocinétique des biocarriers des drogues En pratique… Traitements produits pro-(anti)-angiogéniques Xénogreffe de cellules normales ou tumorales - en culture - issues de biopsies… Dépôt Fixation Jour du développement 10 11 12 13 14 15 16 17 Age de la tumeur (jour) 0 1 2 3 4 5 6 7 Progression de l’angiogenèse des tumeurs Traitement cellules CAM invasion in ovo Nodules tumoraux En pratique… ex ovo Xénogreffe d’implants de collagène ± produits / cellules à tester J3 J5 J10 Développement de l’œuf ex ovo Xénogreffe des implants Analyse de l’angiogenèse Ribatti, Nature Protocols, 2006 Deryugina & Quigley, Methods Enzymol, 2008 Années 2000-2009: 775 publications Produits à activité pro(anti)-angiogénique Adénosine Chimiokines EGF FGF-2 Leptine Ostéopontine PDGF TGFb VEGF… Adiponectine Angiostatine Ghréline antagoniste intégrines avb3 / avb5 Interleukines Opioïdes Rétinoïdes Somatostatine Vitamine D3… Implantations de tumeurs (biopsies ou cellules issues de cultures primaires ou immortalisées) ADK endomètre Lymphome B cell non-Hodgkinien Cellules lymphoblastoïdes, myélome multiple Glioblastome Cellules de glioblastome Carcinome peau, foie Cellules foie, colon, pancréas Mélanome Cellules mélanome Méningiome, Neuroblastome… Cellules prostate… Implantation de biopsies ou cellules « normales » Biopsie synoviale (polyarthrite rhumatoïde) Cellules Dendritiques Lymphocytes Macrophages Neutrophiles / Eosinophiles / Basophiles Cellules Endothéliales + FGF-2 Etudes dans le cadre de la rétinopathie diabétique Ribatti D, Int Rev Cell Mol Biology, 2008 Cancer du pancréas Biomicroscopie nodules vascularisés Dumartin, Bousquet, Bikfalvi, et al, Gastroenterology, 2009 Cancer du pancréas Coloration HES Nodules Invasion surface de la CAM cellules tumorales vaisseaux sanguins Dumartin, Bousquet, Bikfalvi, et al, Gastroenterology, 2009 Cancer du pancréas Microscopie à fluorescence Cytokératine-19 Lectin Dumartin, Bousquet, Bikfalvi, et al, Gastroenterology, 2009 Cell Tracker Blue Gliomes Biomicroscopie Hagedorn et al, PNAS 2005 CAM & Lymphangiogenèse 10AS pancreatic cancer cells : tumeur ISH VEGFR3 Anticorps anti-prox1 poulet disponible Papoutsi M, Microscopy Res & Tech 2001 CAM & Lymphangiogenèse A375 Melanoma cells : tumeur angiogenèse ISH VEGFR3 Papoutsi M, Histoch Cell Biol 2000 CAM & réaction stromale Implant de collagène + GF ou cell. tumorales Rouge: chick MMP9 (hétérophiles) Vert: noyau cellulaire Implant de collagène + GF ou cell. tumorales Rouge: chick macrophages/monocytes Vert: noyau cellulaire Myofibroblastes (αSMA) Seandel M, Blood, 2001 & Zijlstra A, Blood, 2006 mock 60 *** mock sst2 siRNA TSP-1 si TSP-1 si cont Tumor Volume (% of si cont) 200 100 0 mock sst2 merge 100 100 0 300 Surface of intervascular spaces (% of si cont) ** 200 SNA-lectine siRNA Control CK 19 *** CK 19 SNA-lectine 60 * 20 0 si TSP-1 0 sst2 20 400 si cont 100 Tumor Volume (% of mock) Surface of intervascular spaces (% of mock) TSP-1 is critical for sst2-mediated inhibition of angiogenesis merge Laklai, Bousquet et al, PNAS 2009 Etude de la cascade métastatique Métastase spontanée Métastase expérimentale organes de l’embryon Détection de métastases Qualitative Zijlstra A, Cancer Res, 2002 Quantitative séquences Alu Zijlstra A, Cancer Cell, 2008 Détection et visualisation de cellules en « intravasculaire » ou « extravasées » sur CAM Cellules GFP Rhodamine-linked lectine Z projection Zijlstra et al, Cancer Cell 2008 control Extravasation & migration dans le stroma Anti-CD151 Z projection Z projection Zijlstra et al, Cancer Cell 2008 Projets en cours, en prévision, sur le modèle CAM Ingénieur d’Etudes : Melle Mélanie Pucelle ([email protected]) s croissance et angiogenèse des glioblastomes AC Prats seurs gastriniques D Fourmy C Seva es et Mélanome T Levade génique des facteurs pF4 et pF4v1 génique de cellules souches de glioblastome eur de l’angiogenèse pathologique ? H Prats tostatine sst2 dans activité pro-tumorigène ncreatic cancer-associated fibroblastes) nco-suppresseur du réc. Somatostatine sst2 C Susini N Jabrane-Ferrat) ngiogenèse via cPLA2 mbes) F Meggetto) laire et métabolisme énergétique (S Dehez) giogéniques de petites molécules ulation cérébrale normale versus tumorale U858 P Le Bouteiller JL Davignon JJ Fournié P Brousset L Casteilla U563 CNRS UMR 501 M Poirot S Lorthois ICR IMFT CNRS F Lauwers INSERM U825
