Université d’ORAN Faculté des Sciences Département de Biotechnologie Mémoire de MAGISTER en Biotechnologie Option : Ecosystèmes microbiens complexes Présenté par Amaria HARMOUCHE Intitulé ETUDE DE L’ANTIBIORESISTANCE CHEZ 83 SOUCHES AUTOCHTONES DE BACTERIES LACTIQUES Devant le Jury : Président : Pr. ZADI-KARAM Halima Examinateurs : Dr. DALACHE Fatiha Dr. DRISSI Mourad Pr. Baba Ahmed Mohamed Bey Rapporteur : Pr. KARAM Nour-Eddine Soutenue le : / Université d’ORAN Université de MOSTAGANEM Université de TLEMCEN Université d’ORAN Université d’ORAN / 2010 REMERCIEMENTS J'exprime mes profonds remerciements au Pr. Karam Nour-Eddine, Professeur à l’université d’Oran, qui a dirigé ce projet de recherche : je vous remercie pour votre écoute, vos idées précieuses, votre disponibilité et, surtout, votre confiance. Ensuite, je tiens à remercier chaleureusement Pr. ZADI-KARAM Halima, Professeur à l’université d’Oran, qui a accepté de présider mon jury de soutenance et à qui je suis très reconnaissante pour sa disponibilité et ses conseils précieux. Je présente mes sincères remerciements aux Pr. Baba Ahmed Mohamed Bey, Professeur à l’université d’Oran, Dr. DALACHE Fatiha, Maitre de conférences à l’université de Mostaganem, et Dr. DRISSI Mourad, Maitre de conférences à l’université de Tlemcen, qui ont bien accepté d’examiner ce travail. Merci encore au Dr. DALACHE Fatiha pour ses discussions scientifiques et ses conseils. J’adresse également mes remerciements : A mon collègue Mohamed Merzoug pour sa disponibilité et son aide. A tous les chercheurs et le personnel du Laboratoire de Biologie des Microorganismes et de Biotechnologies (LBMB). A tous mes collègues. Et à toute personne qui a contribué de prés ou de loin à la réalisation de ce projet de recherche. Un merci tout spécial à ma famille et mes ami(e)s Assmaa, Wassila, Hayet, Fatima, Mohamed, Abdeslem, Ali, Yasser, pour leur soutien constant, leur amour et leurs mots d'encouragement qui m'ont permis de me rendre jusque là. DÉDICACES Aux membres de ma famille, qu’ils trouvent dans ce travail le témoignage de toute ma gratitude et qu’il soit pour eux le gage de mon amour infini A tous ceux qui me sont chers, ils se reconnaîtront……..... Amaria Sommaire Pages SOMMAIRE Liste des tableaux i Liste des figures ii 1. Introduction 1.1. Les bactéries lactiques 1.1.1. Définition et caractéristiques 1.1.2. Classification 1.2. Les antibiotiques 1.2.1. Modes et modalités d’action des antibiotiques 1.2.1.1. Les inhibiteurs de la synthèse du peptidoglycane 1.2.1.2. Les inhibiteurs de la synthèse protéique 1.2.1.3. Les inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques 1.2.1.4. Les inhibiteurs de la synthèse des folates 1.2.1.5. Les antibiotiques qui provoquent l’altération des membranes 1.2.1.6. Les antibiotiques agissant par inhibition compétitive 1.2.2. Usage des antibiotiques et ses conséquences 1.3. La résistance bactérienne aux antibiotiques 1.3.1. L’antibiorésistance chez les bactéries lactiques 1.3.1.1. Génétique de l’antibiorésistance chez les bactéries lactiques 1.3.1.2. Moyens du transfert des gènes de résistance 1.3.2. Mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Gram positives 1.3.2.1. Inactivation ou modification de l’antibiotique 1.3.2.2. Modification de la cible 1.3.2.3. Pompes à efflux actif 1.3.3. Les bétalactamases 1.3.3.1. Classification des bétalactamases 1.3.3.2. Les différents types de bétalactamases 1.3.3.3. Les bétalactamases des bactéries à Gram positif 1 4 4 5 8 9 9 11 12 12 13 13 13 15 16 16 21 23 24 26 27 29 29 31 32 2. Matériel et Méthodes 2.1. Souches bactériennes 2.2. Confirmation de l’appartenance des souches au groupe lactique et de leur pureté 2.3. Conservation des souches 2.4. Antibiogramme en milieu solide 2.5. Détermination des concentrations minimales d’inhibition des antibiotiques (CMI) 2.6. Recherche d’ADN plasmidique 2.6.1. Extraction d’ADN plasmidique 2.6.2. Electrophorèse sur gel d’agarose 2.7. Purification de l’ADN plasmidique par électroélution 2.8. Transformation de la souche Pediococcus sp. MA1 par électroporation 2.9. Recherche d’activité bétalactamase 2.9.1. Test de synergie 2.9.2. Test 3D 33 34 35 35 35 37 38 38 39 39 40 41 41 42 I Sommaire 3. Résultats et Discussion 3.1. Confirmation de l’appartenance des souches au groupe lactique et de leur pureté 3.2. Détermination de la sensibilité des souches aux différents antibiotiques testés 3.3. Détermination des concentrations minimales d’inhibition des antibiotiques (CMI) 3.4. Détection des plasmides des bactéries lactiques 3.5. Purification de l’ADN plasmidique 3.6. Transformation de la souche Pediococcus sp. MA1 3.7. Recherche d’activité bétalactamase 43 44 45 63 66 67 68 70 4. Conclusion et perspectives 5. Références bibliographiques 6. Annexe 72 75 90 II Pages Liste des tableaux Tableau 1 : Quelques résistances naturelles rencontrées chez les bactéries lactiques 17 Tableau 2 : Exemples de plasmides portant des gènes de résistances aux antibiotiques Tableau 3 : Principaux mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Gram positives Tableau 4 : Classification et propriétés des bétalactamases Tableau 5 : Souches lactiques étudiées Tableau 6 : Les différents disques d’antibiotiques utilisés Tableau 7 : Solutions mères d’antibiotiques Tableau 8 : Profils de résistance des bactéries lactiques étudiées (méthode de diffusion sur milieu solide) Tableau 9 : Taux (%) de résistance des bactéries étudiées / antibiotique Tableau 10 : Concentrations minimales d’inhibition (µg/ml) des antibiotiques testés Tableau 11 : Sélection des clones transformants 19 i 24 30 34 36 37 46 52 64 69 Pages Liste des figures Figure 1 : Résumé des principaux sites d’action des antibiotiques Figure 2 : Réseau de transfert de résistance aux antibiotiques Figure 3 : Illustration des mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Gram positives Figure 4 : Structure des systèmes d’efflux actif Figure 5 : Schéma de la technique de l'électroélution Figure 6 : Aspect microscopique de quelques souches Figure 7 : Antibiogramme de la souche Lactobacillus sp. V16 Figure 8 : Antibiogramme de la souche Pediococcus sp. MA1 Figure 9 : Antibiorésistance chez les bactéries lactiques étudiées Figure 10 : Comparaison des antibiorésistances des souches étudiées, selon leurs origines Figure 11 : Profil électrophorétique de l’ADN plasmidique des souches étudiées Figure 12 : ADN plasmidique de la souche Lactobacillus sp. V16 récupéré pour les expériences d’électroélution Figure 13 : Image de synergie entre AMC et CTX Figure 14 : Résultat du test 3D ii 9 14 23 28 40 44 45 45 51 58 67 68 71 71 Introduction Les antibiotiques sont d’un grand usage en santé humaine et animale ainsi que dans le contrôle des phytopathologies, mais leur efficacité est menacée par la capacité des bactéries, qui sont des organismes très adaptables, à développer une résistance à ces molécules. Par conséquent, la longue période d’utilisation de ces agents antimicrobiens ainsi que leur utilisation abusive ont abouti à la sélection de bactéries qui leur sont résistantes. L'ampleur du problème est sensiblement augmentée par l’aptitude des bactéries à transférer horizontalement les déterminants de la résistance (Levy, 1992). En effet, il a été démontré que l’exposition de bactéries hébergeant un gène de résistance à la tétracycline à de faibles concentrations de cet antibiotique aboutit à une augmentation de 10 à 100 fois de la fréquence du transfert de l’élément porteur de ce gène et ceci, tant in vitro qu’in vivo dans le tube digestif de souris gnotobiotiques (Doucet-Populaire et al., 1991). De même, Scott (2002) a conclu que le transfert de gènes se produit largement in vivo entre les bactéries du tractus gastro-intestinal et entre ces mêmes bactéries et les bactéries pathogènes du tractus gastro-intestinal, comme des gènes de résistance identiques sont présents dans diverses espèces bactériennes à partir de différents hôtes. Pendant plusieurs décennies, les études sur la sélection et la diffusion de la résistance aux antibiotiques ont porté principalement sur les espèces à intérêt clinique. Toutefois, de nombreux chercheurs ont émis l'hypothèse que les bactéries commensales présentes dans les aliments et dans le tractus gastro-intestinal pourraient servir de réservoirs pour les gènes de résistance aux antibiotiques et pourraient transférer ces gènes à des bactéries opportunistes et pathogènes de l’Homme, ce qui nuit à la réussite de l’antibiothérapie (Perreten et al., 1997a; Mathur et Singh, 2005). Les bactéries lactiques, qui font partie de la flore commensale et qui bénéficient d’une longue histoire de sécurité de leur utilisation en industrie agroalimentaire ainsi qu’en tant que probiotiques (Mathur et Singh, 2005; Ammor et al., 2007), peuvent être l’un de ces réservoirs. En effet, des gènes conférant la résistance à la tétracycline, l'érythromycine et la vancomycine ont été détectés et caractérisés chez Lactococcus lactis et des espèces d’entérocoques et de lactobacilles isolées à partir de produits carnés fermentés et de produits laitiers (Mathur et Singh, 2005), et la possibilité de leur transfert aux bactéries opportunistes et pathogènes de la flore digestive de l'Homme est fort envisageable. Toutefois, pour répondre aux préoccupations de la biosécurité des cultures starters et des probiotiques, un certain nombre d'initiatives ont été lancé par diverses organisations à travers le monde, tels que l'interdiction 2 Introduction de l’utilisation des antibiotiques à usage clinique en tant que promoteurs de croissance chez les animaux d’élevage (déjà appliquée en union européenne) et la limitation des caractères de résistance que doivent porter les probiotiques à ceux requis pour un but précis seulement (Mathur et Singh, 2005). C'est dans le contexte de la résistance bactérienne aux antibiotiques que s'inscrit notre travail qui a pour objectifs d’étudier le comportement de plusieurs souches de bactéries lactiques isolées de différents milieux naturels vis-à-vis de divers antibiotiques, et de tenter de préciser le déterminisme génétique de certaines résistances observées. 3 Introduction 1.1. Les bactéries lactiques : 1.1.1. Définition et caractéristiques : Les bactéries lactiques constituent un groupe de bactéries Gram positives, taxonomiquement hétérogène, qui produisent principalement de l’acide lactique par fermentation des sucres en anaérobiose comme en aérobiose (Axelsson, 2004 ; Atlan et al., 2008). Ce sont des bactéries asporogènes, de forme coccoide, bacillaire ou coccobacillaire, immobiles, dépourvues de catalases et de cytochromes (à l’exception de certains genres à pseudocatalase), anaérobies mais aerotolérantes, et tolérantes à des pH acides (Axelsson, 2004). Ces bactéries fermentent les sucres selon deux voies : la glycolyse (Embden-MeyerhofParnas), ou fermentation homolactique, qui conduit à la formation d’acide lactique, et la voie du 6-phosphogluconate / phosphocétolase (fermentation hétérolactique) qui produit, en plus de l'acide lactique, d’autres métabolites tels que l'éthanol, l'acétate et le CO2 (Axelsson, 2004 ; Atlan et al., 2008). Ces microorganismes ont une capacité de biosynthèse très faible, ce qui explique leurs exigences nutritionnelles complexes en acides aminés, peptides, vitamines, sels, acides gras, glucides fermentescibles et bases puriques et pyrimidiques (Axelsson, 2004 ; Wessels et al., 2004 ; Atlan et al., 2008). En raison de ces exigences et de leur nature anaérobie aerotolérante, ces bactéries sont associées à une grande variété de milieux naturels particulièrement riches tels que les divers produits alimentaires (lait, viande, boissons, légumes,…). Ces bactéries sont également présentes dans la flore normale de la cavité buccale, l’intestin et l’appareil génital de l’Homme et des animaux (Stiles et Holzapfel, 1997 ; Axelsson, 2004 ; Pot et al., 2008). Les bactéries lactiques bénéficient d’un statut GRAS (Generally Reconized As Safe) et jouent un rôle très important en industrie agroalimentaire et en santé. De nombreuses espèces de ces bactéries sont impliquées dans la fabrication et la conservation des aliments à partir de matières premières agricoles dans lesquelles elles sont présentes comme contaminants ou ajoutées, volontairement, comme starters pour contrôler les processus de fermentation (Stiles et Holzapfel, 1997 ; Leroy et de Vuyst, 2004 ; Pot et al., 2008). Ces processus contribuent aux propriétés organoleptiques, rhéologiques et nutritionnels des aliments fermentés (Leroy et de Vuyst, 2004) et produisent des acides organiques et d’autres composés antimicrobiens ce qui a pour conséquence d’inhiber la croissance des bactéries indésirables voire pathogènes 4 Introduction (Slover, 2008 ; Mäyra-Mäkinen et al., 2004 ). D’autres applications industrielles de ces bactéries, tels que le traitement des déchets et la production de diverses molécules (enzymes, métabolites,…), sont connues (De Roissart et Luquet, 1994). D’une autre part, certaines de ces bactéries, qui sont des hôtes normaux du tube digestif, sont connues d'exercer des effets bénéfiques pour la santé ; c’est la raison pour laquelle elles sont de plus en plus utilisées sous forme de probiotiques (Ouwehand et al., 2002). Il est important de signaler que le caractère pathogène des bactéries lactiques est extrêmement réduit puisque seules certaines espèces peuvent causer des infections chez l’Homme, et cela dans des situations particulières tel est le cas avec des malades immunodéprimés ou ceux recevant une antibiothérapie (Wessels et al., 2004). 1.1.2. Classification : La classification des bactéries lactiques est basée sur leurs critères morphologiques et écologiques et sur leurs propriétés physiologiques (croissance à des températures différentes, capacité de croître à une concentration élevée en sel, mode de fermentation du glucose,…) (Stiles et Holzapfel, 1997 ; Axelsson, 2004 ; Pot et al., 2008) et moléculaires (Axelsson, 2004). Ce groupe microbien comprend actuellement environ 20 genres (Pot et al., 2008) dont les principaux sont : Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella et Bifidobacterium (Stiles et Holzapfel, 1997 ; Axelsson, 2004 ; Pot et al., 2008). Les bactéries appartenant à ces genres sont regroupées, selon la composition de leur ADN en bases nucléotidiques GC, sous deux branches : celle des Actinomycètes qui est représentée par le genre Bifidobacterium ayant un pourcentage en bases GC supérieur à 55 % et celle des Clostridies qui regroupe toutes les bactéries à % GC inférieur à 55 % (Axelsson, 2004 ; Pot et al., 2008 ). 1.1.2.1. Lactococcus : les lactocoques sont des bactéries coccoides. Elles produisent l’acide lactique de forme L (+) par métabolisme homofermentaire et elles sont couramment présentes dans les produits fermentés, mais certaines espèces, notamment Lc. lactis, sont souvent isolées des végétaux (Axelsson, 2004). Parmi les cinq espèces appartenant à ce genre, seule 5 Introduction les souches de Lc. lactis sont utilisées comme starters dans la fabrication de divers produits fermentés, notamment les produits laitiers (Floréz et al, 2008). 1.1.2.2. Vagococcus : les espèces de ce genre sont distinguées des lactocoques par leur composition en acides gras (Axelsson, 2004). Elles sont isolées à partir des excréments des poulets, des eaux des fleuves et des truites malades (Dellaglio et al., 1995). 1.1.2.3. Streptococcus : ce genre est essentiellement représenté par l’espèce S. thermophilus. Les bactéries de cette espèce sont des coques lactiques thermophiles isolés à partir des produits laitiers, mais certaines souches ont été récemment trouvées dans des plantes (Delorme, 2008). Elles sont largement utilisées comme cultures starter dans la fabrication des yaourts et de certains fromages (Axelsson, 2004 ; Delorme, 2008). Ainsi, des combinaisons d’espèces probiotiques contenant S. thermophilus ont été décrites comme ayant des effets positifs sur la diarrhée chez les jeunes enfants et l'entérocolite chez les nouveaux nés prématurés (Delorme, 2008). 1.1.2.4. Enterococcus : les entérocoques sont des coques homofermentaires groupés en paires ou en chaînettes. Les espèces de ce genre occupent une grande variété de niches écologiques dont les sols, les eaux et les plantes ; elles font également partie de la microflore intestinale de l’Homme et des animaux, et sont couramment trouvées dans les produits fermentés comme contaminants ou bien ajoutées en tant que starters (Franz et Holzapfel, 2004). Cependant, ces espèces ne bénéficient pas du statut GRAS. En effet, la plupart d’entre elles, en particulier En. faecalis et En. faecium, sont habituellement associées à des infections humaines (Franz et Holzapfel, 2004 ; Ogier et Serror, 2008). 1.1.2.5. Aerococcus : ce genre est constitué de bactéries coccoides formant des tétrades (Axelsson, 2004). Ce sont des saprophytes microaérophiles (Dellaglio et al., 1995 ; Axelsson, 2004) groupés en cinq espèces qui n’ont pas de grande importance en technologie alimentaire (Axelsson, 2004). 1.1.2.6. Pediococcus : les bactéries de ce genre sont des coques formant des tétrades, acidophiles et homofermentaires. On les trouve dans les végétaux frais ou leurs dérivés fermentés, dans le fourrage, la peau, les cavités, le tractus ou les sécrétions d’animaux. Parmi les espèces de ce genre, P. acidilactici et P. pentosaceus sont utilisées comme cultures starter 6 Introduction pour la fabrication des saucisses, en ensilage et comme agents de maturation des fromages (Axelsson, 2004). 1.1.2.7. Tetragenococcus : C’est des coques formant des tétrades. Seules deux espèces, T. halophilus et T. muriaticus, sont actuellement reconnues. Ces bactéries sont extrêmement tolérantes au sel (> 18% NaCl), cela leur attribue une grande importance en fermentation des aliments à forte teneur en sel tel que la sauce de soja (Axelsson, 2004). 1.1.2.8. Leuconostoc : Ce genre regroupe des bactéries de forme coccoide ou coccobacillaire, hétérofermentaires, produisant l'acide D-lactique à partir du glucose et ne produisant pas l'ammoniac à partir de l'arginine (Axelsson, 2004). Ces bactéries sont habituellement rencontrées sur les végétaux ainsi que les produits laitiers et carnés. Leur présence intervient dans le goût et l’arôme des aliments et cela par production de certains composés aromatiques comme l’acétoïne et le diacétyle ; c’est la raison pour laquelle certaines de ces espèces, principalement Ln. mesenteroides subsp. cremoris, sont utilisées en industrie laitière. Ces bactéries sont également importantes dans les fermentations spontanées de légumes (Axelsson, 2004 ; Ogier et al., 2008). Cependant, certaines espèces peuvent également provoquer la détérioration des aliments suite à la production de composés indésirables (amines biogènes et dextrane) (Ogier et al., 2008). 1.1.2.9. Weissella : c’est des bactéries hétérofermentaires incluant des coques et des bacilles. Elles se distinguent des bactéries du genre Leuconostoc par de nombreuses caractéristiques telles que leurs modes de fermentation des sucres, la formation de dextrane et la croissance à différents pH et températures différentes. De nombreuses espèces de ce genre semblent être associées aux produits carnés (Axelsson, 2004). 1.1.2.10. Oenococcus : les bactéries de ce genre sont des coques lactiques qui se distinguent des leuconostocs par leur tolérance extrème à l’acide et à l’éthanol (Axelsson, 2004). 1.1.2.11. Lactobacillus : c’est le groupe le plus grand et le plus hétérogène parmi tous les genres lactiques. Il regroupe des bactéries, en forme de bâtonnets ou de coccobacilles, homo ou hétérofermentaires qui sont les plus tolérantes à l’acide (Axelsson, 2004). Ces bactéries sont les plus ubiquitaires, elles sont présentes chez l’Homme, les animaux et les plantes (Axelsson, 2004 ; Bernardeau et al., 2008). Elles sont ainsi très utilisées en industrie 7 Introduction alimentaire (ferments lactiques pour produits fermentés) et en tant que probiotiques (Axelsson, 2004 ; Bernardeau et al., 2008). 1.1.2.12. Carnobacterium : ce sont des bacilles à métabolisme principalement hétérofermentaires. Ils se distinguent des lactobacilles par leur croissance à des pH élevés (jusqu’à pH 9) et par leur composition en acides gras. Ces bactéries sont typiquement trouvées dans les viandes et les produits carnés (Axelsson, 2004). 1.2. Les antibiotiques : Depuis celle donnée par Waksman en 1942, la définition d’un antibiotique a connu plusieurs évolutions. À l’heure actuelle, le terme antibiotique désigne toute substance naturelle ou synthétique, d’origine microbienne ou dérivée chimiquement, capable d'inhiber spécifiquement la vitalité des micro-organismes (Walsh, 2003 ; Zomahoun, 2005). Les antibiotiques agissent à faibles doses et doivent présenter certains caractères pour être actifs sur les micro-organismes : ils doivent pénétrer tout d’abords dans la cellule, ensuite rencontrer leur cible et perturber la physiologie bactérienne, et ils ne doivent subir aucune transformation capable de les inactiver au cours de leur contact avec la cellule (Ogawara, 1981 ; Zomahoun, 2005). Ces molécules peuvent être classées selon différents critères : L’origine : les antibiotiques sont élaborés par un organisme vivant ou produits par synthèse (Yala et al., 2001). La nature chimique : ce critère permet de classer les antibiotiques en différentes familles (aminosides, macrolides, phénicolés, bétalactamines,…) au sein desquelles peuvent exister des groupes ou sous-groupes. En général, à une parenté structurale s'associera un même mode d’action (sur une même cible) et un même mécanisme de résistance (Courvalin, 2008). Le mode d’action : Les différentes classes d’antibiotiques agissent à différents niveaux chez la bactérie. Ils agissent notamment au niveau de la biosynthèse de la paroi bactérienne et des protéines, du métabolisme des acides nucléiques, et au niveau de la membrane cytoplasmique (Russell, 2002 ; Walsh, 2003). Les modalités d’action : Les antibiotiques peuvent entraîner la mort des bactéries (antibiotiques bactéricides) ou seulement inhiber leur croissance (antibiotiques bactériostatiques) (Walsh, 2003). 8 Introduction Le spectre d’activité : c’est la liste des espèces sur lesquelles les antibiotiques antibiotiques sont actifs (voir annexe). Il peut être étroit ou large, c’est-à-dire c’est dire qui englobe une clientèle précise de bactéries ou une large gamme d’espèces (Bryskier, 1999). 1.2.1. Modes et modalités d’action des antibiotiques : Comme le montre la figure igure suivante, les antibiotiques ont divers modes d’action sur leurs cibles. Figure 1 : Résumé des principaux sites d’action des antibiotiques (Paquet Paquet-Bouchard, 2006) 1.2.1.1. Les inhibiteurs de la synthèse du peptidoglycane : Ces antibiotiques agissent ssent soit en inhibant la synthèse des précurseurs de la paroi, soit en inhibant le transfert de ces derniers sur un lipide porteur qui permet leur transport à travers la membrane plasmique, ou encore en inhibant l'insertion des unités glycaniques précurseurs précurse de la paroi. • Les bétalactamines : Les antibiotiques appartenant à cette famille sont caractérisés par la présence du cycle bétalactame. Ce sont des acides plus ou moins forts qui traversent difficilement la membrane 9 Introduction bactérienne (Zomahoun, 2005) et qui ont une action bactéricide (Prescott, 2004). Ces molécules agissent sur la paroi des bactéries en se fixant aux enzymes indispensables à la formation du peptidoglycane « PG » (transpeptidases, glycosylases et carboxypeptidases) appelés PLP ou protéines liant les pénicillines. En fait, ces enzymes lient l’antibiotique au lieu de lier leurs substrats. Il s’ensuit un affaiblissement du PG et une lyse osmotique qui mène à la mort bactérienne (Walsh, 2003 ; Mimoz, 2003). D’autre part, les antibiotiques de cette famille peuvent activer les enzymes responsables de la dégradation naturelle du PG, les autolysines ou muréine-hydrolases (Charpentier et Novak, 2000 ; Prescott, 2004). Les bétalactamines n’agissent donc que sur les bactéries en croissance. • La fosfomycine : Cette molécule possède une action bactéricide. Elle pénètre dans la bactérie par le système de transport actif de l’α-glycerophosphate et du glucose-6-phosphate et agit en inhibant MurA, la pyruvyl-transférase cytoplasmique qui est responsable de la formation de l’acide NAcétyl Muramique et cela de façon irréversible. Elle inhibe donc le premier stade de la synthèse du peptidoglycane (El Zoeiby et Sanschagrin, 2003). • La bacitracine : C’est un polypeptide cyclique (Tsuda et Yamashita, 2002), neutre et soluble dans l’eau (Paquet-Bouchard, 2006). Cette molécule interfère avec les phospholipides de la paroi bactérienne et perturbe la perméabilité membranaire en empêchant la déphosphorylation du phospholipide indispensable à la synthèse du peptidoglycane (Ming et Epperson, 2002). • Les glycopeptides : Ces antibiotiques inhibent la 2ème phase de la synthèse de la paroi des bactéries en croissance, et ce après fixation précoce et irréversible aux parois bactériennes. En effet, ils recouvrent le D-Ala-D-Ala terminal de l’UDP-N-acetylmuramyl-pentapeptide prêt à être incorporé dans le peptidoglycane en cours d’élongation. En raison de leur volume, les glycopeptides vont ainsi empêcher l’action des glycosyltransférases et des transpeptidases et bloquer l’élongation du peptidoglycane. La grande taille de ces antibiotiques fait, également, qu'ils ne peuvent pas emprunter les porines et sont donc, de ce fait, inactifs contre les bactéries à Gram négatif (Mimoz, 2003 ; Zomahoun, 2005). 10 Introduction 1.2.1.2. Les inhibiteurs de la synthèse protéique : Ces antibiotiques agissent préférentiellement sur la sous-unité 30S et/ou la sous-unité 50S des ribosomes et cela au niveau de l'une des trois étapes principales de la traduction (Euzéby, 2007). • Les aminosides ou aminoglycosides : Ce sont des antibiotiques bactériostatiques à faibles doses et bactéricides à fortes doses (Zomahoun, 2005). La cible principale de ces molécules est le ribosome, et en particulier sa sous-unité 30S. La plupart des aminosides se fixent aussi sur la sous-unité 50S. Cette fixation sur le ribosome conduit à une altération de la synthèse des protéines (Mimoz, 2003 ; Zomahoun, 2005). Ces molécules induisent également des erreurs de lecture de l’ARN messager provoquant ainsi la synthèse de protéines anormales (Zomahoun, 2005). • Les tétracyclines : Ce sont des molécules bactériostatiques ou bactéricides, qui se fixent sur la sous unité 30S du ribosome et inhibent la fixation de l’aminoacyl-ARNt sur son site ribosomal (Zomahoun, 2005 ; Euzéby, 2007). . • Les phénicolés : Le chloramphénicol est un antibiotique hydrophile bactériostatique mais qui peut être bactéricide sur certaines bactéries. Il se fixe à l’ARNr 23S sur la sous unité 50S du ribosome et inhibe la formation des liaisons peptidiques. Ses antagonistes compétitifs sont les macrolides et les lincosamides (Zomahoun, 2005). • Les macrolides, les lincosamides et les streptogramines (MLS) : Ces antibiotiques sont bactériostatiques ou bactéricides selon leur concentration. Ils se fixent sur la sous unité 50S du ribosome et bloquent les réactions de transpeptidation (streptogramines inhibant la fixation des aminoacyl-ARNt) et/ou de translocation (macrolides qui se fixent au niveau du site Aminoacyl) (Zomahoun, 2005 ; Philippon, 2006). • L’acide fusidique : De structure stéroïdique, cet antibiotique a un effet bactériostatique. Il inhibe la synthèse des protéines en agissant sur le facteur d'élongation de la traduction EF-G (substance responsable 11 Introduction de la translocation de la chaîne des peptides durant la synthèse des protéines) ; ceci entraîne le blocage de la traduction de l’ARN messager au niveau de la sous unité 50S du ribosome (Zomahoun, 2005 ; Philippon, 2006). 1.2.1.3. Les inhibiteurs de la synthèse des acides nucléiques : Les antibiotiques de cette catégorie agissent à différents niveaux du métabolisme des acides nucléiques. • Les quinolones et fluoroquinolones : Ces molécules ont une action bactéricide. Après leur pénétration dans la membrane externe des bactéries, elles inhibent la réplication de l’ADN. En effet, les quinolones agissent sur les topoisomérases (ADN gyrases) qui sont des enzymes régulant les changements de formes topologiques de l’ADN. Il s’en suit alors la formation d’un complexe ADN gyrase-Quinolone. C’est ainsi que ces antibiotiques empêchent la réplication, la transcription, la recombinaison et la réparation au niveau du noyau cellulaire inhibant donc la synthèse de l’ADN (Mimoz, 2003 ; Zomahoun, 2005 ; Euzéby, 2007). Ces molécules sont très utilisées dans le monde animal notamment chez les volailles et les poissons d’élevage (Courvalin, 2008). • Les rifamycines (Ansamycines) : Ce sont des antibiotiques bactéricides. Ils se fixent sur l’ARN polymérase en formant un complexe Irréversible ce qui bloque la formation de l’ARN messager (Zomahoun, 2005; Euzéby, 2007). • La mupirocine : Cet antibiotique inhibe l’isoleucyl-ARN-synthétase qui permet la synthèse de l’ARN de Transfert (Podie-Magne, 1999). 1.2.1.4. Les inhibiteurs de la synthèse des folates : • Les sulfamides et les diaminopyrimidines : La bactérie édifie l’acide folique à partir de l’acide para-amino-benzoïque, l’acide glutamique et la ptéridine grâce à la dihydroptéroate synthétase. L’acide folique ainsi secrété doit être réduit par une dihydrofolate réductase en tétrahydrofolate. Les sulfamides tel que la sulfadiazine et la Sulfadoxine, qui sont des antibiotiques bactériostatiques, inhibent compétitivement la dihydroptéroate synthétase (DHPS) et 12 Introduction bloquent ainsi la synthèse de l’acide folique. De leur part, le triméthoprime et la pyriméthamine (diaminopyrimidines) inhibent la dihydrofolate réductase (DHFR) et bloquent également la synthèse du folate. Ceci explique la synergie d’action entre les sulfamides et les triméthoprimes (Zomahoun, 2005 ; Euzéby, 2007). 1.2.1.5. Les antibiotiques qui provoquent l’altération des membranes : • Les polymyxines : Elles appartiennent à la classe des polypeptides cycliques. Elles agissent comme des détergents cationiques : grâce à leur caractère amphipathique, elles pénètrent dans la cellule bactérienne et s'insèrent parmi les phospholipides des membranes externes et cytoplasmiques, ce qui entraine la désorganisation de celles-ci et perturbe la perméabilité membranaire (Zomahoun, 2005). • La gramicidine : Cet antibiotique réagit, également, avec les phospholipides et détruit la membrane cytoplasmique (Podie-Magne, 1999). 1.2.1.6. Les antibiotiques agissant par inhibition compétitive : Il existe certains antibiotiques qui agissent par inhibition compétitive (au cours des étapes du métabolisme intermédiaire), parmi lesquels on cite les sulfamides et l’isoniazide qui sont, respectivement, des analogues de vitamines et du NAD (Philippon, 2006). 1.2.2. Usage des antibiotiques et ses conséquences: Les antibiotiques sont utilisés comme phytopharmaceutiques sur des plantes, comme adjuvants alimentaires pour l’accélération de la croissance et en tant que médicament et agents prophylactiques chez les animaux d'élevage, et aussi comme agents thérapeutiques chez l'homme (Wegener, 2003 ; Levy et Marshall, 2004 ; Kastner et al., 2006 ; Flórez et al., 2008). En Algérie, par exemple, les antibiotiques représentent 38% du marché de médicaments vétérinaires (Bouguedour, 2008) et ils englobent les pénicillines, les céphalosporines, les cyclines, les aminosides, les macrolides, les lincosamides, les quinolones et fluoroquinolones, les furanes, les phénicolés, les polymyxines, les sulfamides, les imidazolés, le triméthoprime, l’acide fusidique, la bacitracine et d’autres (Zeghilet, 2009). En 13 Introduction effet, l’antibiotique le plus fréquemment utilisé en thérapeutique vétérinaire est l’Oxytétracycline (80%) (Akloul, 2008). Ces modes d'utilisation des antibiotiques influent fortement sur le nombre d'organismes résistants qui se développent. D'autres D'a facteurs contribuent également à cette résistance dont les diagnostics incorrects, les prescriptions abusives et l'utilisation inappropriée d'antibiotiques par les patients, les cultivateurs ou les éleveurs, par exemple en complément alimentaire pour une croissance croissance accélérée des animaux d'élevage (ANMV, 2008). Cette dernière utilisation a conduit à la sélection de bactéries résistantes aux antibiotiques parmi celles de la microflore intestinale des animaux traités (Teuber, 2001; Wegener, 2003) avec possibilité de transmission ransmission potentielle de la résistance à l'Homme par le biais de la chaîne alimentaire (Witte, 1997 ; Teuber, 2001; Wegener, 2003). 2003 Cette transmission constitue une grande menace puisqu’elle peut être à l’origine de l'émergence et la propagation de la résistance chez les bactéries pathogènes qui deviennent, par conséquent, insensibles aux traitements par les antibiotiques (Mathur ( et Singh, 2005). La figure suivante illustre bien le réseau à travers lequel les gènes de résistance aux antibiotiques sont disséminés : Figure 2 : Réseau de transfert de résistance aux antibiotiques (Witte, 2000) 14 Introduction 1.3. La résistance bactérienne aux antibiotiques : Une souche est dite résistante lorsqu’elle peut croître en présence d’une concentration d’antibiotique beaucoup plus élevée que celle qui inhibe le développement de la majorité des autres souches de la même espèce (Zomahoun, 2005). Il existe deux grands types de résistance aux antibiotiques, la résistance intrinsèque et la résistance acquise : - Résistance naturelle ou intrinsèque : Cette résistance, généralement chromosomique, est présente chez toutes les souches d’une même espèce ou d’un même genre bactérien. Elle délimite le spectre d’action des antibiotiques et elle est due soit à une absence de cible pour l’antibiotique soit à une imperméabilité de la paroi à cet antibiotique (Levy et Marshall, 2004 ; Zomahoun, 2005 ; Courvalin, 2008). Cette résistance n’est pas transférable horizontalement et elle ne présente donc aucun risque chez les bactéries pathogènes (Normark et Normark, 2002 ; Levy et Marshall, 2004 ; Mathur et Singh, 2005). - Résistance acquise : Cette résistance ne concerne que quelques souches, d’une même espèce ou d’un même genre, normalement sensibles à un antibiotique donné (Zomahoun, 2005 ; Mathur et Singh, 2005 ; Courvalin, 2008). Elle est due à des modifications génétiques chromosomiques ou extrachromosomiques : mutations sur des gènes existants (gènes codant pour des cibles des antibiotiques, gènes régulateurs…) ou incorporation de nouveaux gènes codant à des mécanismes de résistances (Levy et Marshall, 2004 ; Zomahoun, 2005 ; Mathur et Singh, 2005). Ces gènes peuvent être originaires des micro-organismes producteurs d’antibiotiques (Davies, 1997) ou bien des gènes dont les produits originaux jouent un rôle dans le métabolisme bactérien mais qui ont subi des mutations à plusieurs reprises qui ont changé leurs substrats de substrats appropriés à des voies de biosynthèse ou biodégradation à des antibiotiques (Davies, 1994). Cette résistance peut être disséminée par transfert horizontal entre bactéries (Mathur et Singh, 2005). Le développement de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries est basé principalement sur deux facteurs : la présence de gènes de résistance et la pression de sélection imposée par l'utilisation des antibiotiques (Levy, 1992). Cette pression joue un rôle clé dans l'émergence de bactéries résistantes : quand une population bactérienne mixte est 15 Introduction exposée à des antibiotiques, il est probable qu'il y aura des bactéries résistantes à la concentration appliquée de ces agents. Cependant, sous la pression de sélection, le nombre de ces bactéries va augmenter et certaines d’elles peuvent transmettre leurs gènes de résistance à d’autres membres de la population (Aarestrup, 1999). 1.3.1. L’antibiorésistance chez les bactéries lactiques : Les aliments fermentés ou non, qui ne subissent pas de traitement avant leur consommation, peuvent constituer un véhicule pour les bactéries résistantes aux antibiotiques en conférant ainsi un lien direct entre la microflore indigène des animaux et celle du tractus gastrointestinal de l’Homme (Mathur et Singh, 2005). En effet, ces produits contiennent des bactéries lactiques qui pénètrent en grand nombre dans nos intestins et interagissent avec notre flore intestinale ; il se peut que certaines de ces bactéries soient porteuses de gènes d’antibiorésistance potentiellement transmissibles et il est possible que cette résistance soit transmise à des populations bactériennes humaines, notamment opportunistes et pathogènes, à travers la chaine alimentaire (Mathur et Singh, 2005 ; Ammor et al., 2007). Ainsi, ces bactéries occupent, comme a été déjà indiqué, une grande variété d’habitats ce qui augmente les possibilités de leur implication dans le phénomène d’antibiorésistance. De même, l’introduction commerciale de probiotiques contenant des souches résistantes aux antibiotiques peut également avoir des conséquences négatives dans le cas ou la résistance est transférée à des pathogènes intestinaux (Mathur et Singh, 2005). 1.3.1.1. Génétique de l’antibiorésistance chez les bactéries lactiques : La sensibilité réduite à certains antibiotiques n'est pas une caractéristique inhabituelle des bactéries lactiques. Plusieurs de ces résistances peuvent être dues à des caractéristiques intrinsèques complexes tels que les propriétés métaboliques des bactéries (Kastner et al., 2006), et à la présence d’un grand nombre de ces bactéries dans les produits fermentés et le tractus gastro-intestinal favorisant ainsi l’apparition de différents mécanismes de résistance par mutations (Ammor et al., 2007). Les données disponibles sur les résistances intrinsèques chez les bactéries lactiques sont relativement rares ; le tableau 1 en illustre quelques unes. Cependant, il existe toujours des différences entre et à l’intérieur des espèces. Ces bactéries peuvent également, comme a été déjà évoqué, acquérir des gènes de résistance provenant des autres bactéries de l’écosystème dont elles font partie. Ces gènes peuvent être portés sur le chromosome principal de la bactérie ou sur des éléments génétiques mobiles 16 Introduction (plasmides, transposons, intégrons), et ils ont, dans tous les cas, la capacité de se transmettre entre les bactéries qui, du coup, acquièrent l’élément responsable de leur nouvel état de résistance face à tel ou tel antibiotique (Davies, 1994 ; Tremblay, 2007). Tableau 1 : Quelques résistances naturelles rencontrées chez les bactéries lactiques Espèces Entérocoques Lactobacilles Certains lactobacilles Pédiocoques Leuconostocs Streptocoques Antibiotiques céphalosporines, faibles concentrations d’aminosides et de clindamycine vancomycine* vancomycine*, bacitracine, céfoxitine et ciprofloxacine, acide fusidique, kanamycine et gentamicine, métronidazole, nitrofurantoïne, norfloxacine, streptomycine, sulfamides vancomycine* Références Knudtson et Hartman, 1993 ; Teuber et al., 1999 Simpson et al., 1988 ; Hamilton-Miller et Shah, 1998 Danielsen et Wind, 2003 Simpson et al., 1988 ; Hamilton-Miller et Shah, 1998 vancomycine* Simpson et al., 1988 ; Hamilton-Miller et Shah, 1998 aminoglycosides, péfloxacine Euzéby, 2007 * La résistance élevée des lactobacilles, pédiocoques et Leuconostocs à la vancomycine est considérée comme un critère d’identification qui leur distingue des autres bactéries Gram positives (Simpson et al., 1988 ; Hamilton-Miller et Shah, 1998). - Le chromosome : La taille du chromosome des bactéries lactiques avait été estimée entre 1,8 et 3,4 Mb selon les espèces, et elle peut varier sensiblement au sein d’une même espèce (Davidson et al., 1996). A titre d’exemple, Lb. plantarum et En. Faecalis possèdent les plus grands chromosomes avec une taille aux environs de 3,4 Mb (Renault, 2008) et ceux de Lc. lactis IL1403 et Lb. gasseri ATCC 33323 ont des tailles de 2,42 Mb et 1.96 Mb, respectivement (Morelli et al., 2004). 17 Introduction Les gènes portés par les chromosomes de ces bactéries sont généralement ceux indispensables à la survie de ces dernières (Luquet, 1994). Toutefois, Danielsen (2002) a démontré que le gène de résistance à la tétracycline tetM détecté chez six différentes souches de lactobacilles n’est pas porté par des plasmides mais il est probablement situé sur le chromosome. - Les plasmides : Les plasmides sont des ADN circulaires ou linéaires, de tailles inférieures à 400 kb, autoréplicatifs, qui peuvent exister séparément du chromosome bactérien ou y être intégrés (Prescott, 2004 ; Morelli et al., 2004 ; Renault, 2008). Ces ADN, confèrent souvent des avantages importants à leurs cellules hôtes grâce aux gènes qu’ils peuvent porter et qui codent pour des propriétés diverses telles que la fermentation des sucres, l'hydrolyse des protéines, la production d'exopolysaccharides et la résistance aux antibiotiques (Prescott, 2004 ; Morelli et al., 2004 ; Mathur et Singh, 2005 ; Renault, 2008). Une souche peut contenir un voire plusieurs plasmides, les lactobacilles par exemple peuvent contenir de un jusqu’à seize molécules par souche (Mathur et Singh, 2005 ; Renault, 2008). Ainsi, chaque plasmide peut exister en un nombre spécifique de copies allant de une à deux copies pour les molécules de grandes tailles jusqu’à plusieurs copies pour celles qui sont petites (Clewell, 2005). Ces molécules sont divisées en deux catégories : la première regroupe les plasmides conjugatifs qui portent des gènes qui leur permettent d’engendrer leur propre transfert par conjugaison (Lanka et Wilkins, 1995) ; ces plasmides sont fréquents chez les entérocoques, les lactocoques, les leuconostocs, les pédiocoques et certaines souches de lactobacilles (Davidson et al., 1996). Et la deuxième est celle des plasmides non conjugatifs ou mobilisables qui ne peuvent être transférés entre les cellules que par des plasmides conjugatifs (Lanka et Wilkins, 1995), des facteurs chromosomiques F (chromosomally encoded sex-like factors) (Gasson et al., 1995) ou des bactériophages (Poyart, 2003). Les plasmides de résistance (plasmides R) peuvent porter de un jusqu'à une dizaine de gènes de résistance (Prescott, 2004 ; Zomahoun, 2005) et sont en constante évolution et leurs déterminants de résistance sont souvent modifiés par des transposons, des recombinaisons 18 Introduction homologues ou des intégrations de cassettes d'intégrons (Prescott, 2004). Des exemples de ces plasmides sont montrés dans le tableau suivant : Tableau 2 : Exemples de plasmides portant des gènes de résistances aux antibiotiques Plasmides Conjugatifs pK214 (30 kb) pRE25 (49 kb) pAMβ1 (26.5 kb) Non conjugatifs pLFE1 (40,31 kb) pCAT pMD5057 (10,9 kb) pLME300 - Souches hôtes Résistances codées Lactococcus lactis Streptomycine K214 (str), Tétracycline (tetS), Chloramphénicol (cat), MacrolidesLincosamidesStreptogramines (mdtA) Enterococcus Chloramphénicol faecalis RE25 (cat), cinq différents Macrolides et deux Lincosamides (ermB), trois Aminosides Enterococcus Macrolidesfaecalis LincosamidesStreptogramines Lactobacillus Erythromycine plantarum M345 (erm B) Lactobacillus Chloramphénicol plantarum (cat) caTC2R Références Perreten et al., 1997a ; Perreten et al., 2001 Schwarz et al., 2001 ; Mathur et Singh, 2005 Clewell et al., 1974 Feld et al., 2008 Ahn et al., 1992 Lactobacillus plantarum 5057 Tétracycline (tetM) Danielsen, 2002 Lactobacillus fermentum ROT1 Erythromycine (erm), Streptogramine A Gfeller et al., 2003 Les transposons : Les transposons sont des séquences d’ADN de taille allant de 16 à 70 kb, ayant comme caractéristique d’être capables de se déplacer d’une molécule d’ADN (chromosome ou 19 Introduction plasmide) à une autre ou d’un site à un autre à l’intérieur de la même molécule (Mahillon et Chandler, 1998 ; Zomahoun, 2005 ; Mathur et Singh, 2005). Ces éléments peuvent être constitués de séquences simples appelées séquences d'insertion (IS) dont la taille est généralement inférieure à 2,5 kb. Les IS ne contiennent que les gènes nécessaires à la transposition, qui sont flanqués par des séquences répétées inversées courtes. Il existe également des transposons dont la structure est beaucoup plus complexe, ce sont les transposons composites qui contiennent des gènes supplémentaires flanqués par des séquences IS (Morelli et al., 2004 ; Renault, 2008). Les transposons peuvent être conjugatifs en raison de leur structure modulaire qui fait qu’un antibiotique auquel ils confèrent la résistance peut stimuler spécifiquement leur transfert par conjugaison d’une bactérie à une autre (Fitzgerald et Gasson, 1988 ; Doucet-Populaire et al., 1991, Ammor et al., 2007). Ces transposons semblent être un moyen extrêmement important de dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques puisqu’ils ne se répliquent pas, affrontés à des problèmes d’exclusion ou d’incompatibilité comme est le cas avec les plasmides (Ammor et al., 2007). Chez les bactéries lactiques, les transposons conjugatifs codant des résistances aux antibiotiques n’ont été rapportés que chez les entérocoques et les streptocoques où ils codent pour des résistances aux chloramphenicol (cat), tétracycline (tetM), érythromycine (ermAM, ermB) et kanamycine (aphA-3) (Perreten et al., 1997b ; Huys et al., 2004 ; Mathur et Singh, 2005). Parmi ces transposons on peut citer : Tn916, Tn917, Tn918, Tn920, Tn925 et Tn2702 chez En. faecalis, Tn5233 chez En. faecium, Tn1545 chez En. sp. et Tn93951 chez S. agalactiae (Mathur et Singh, 2005). - Les intégrons : Les intégrons sont des éléments génétiques contenant un ou plusieurs gènes de résistance sous forme de cassettes. L’intégron lui-même est une structure immobile, dépourvue de réplication autonome, portée par des plasmides, des transposons ou plus rarement sur le chromosome des bactéries. Ce sont les cassettes qui constituent les unités mobiles qui peuvent être facilement intégrées dans un intégron par un mécanisme de recombinaison à site spécifique (Ploy et al., 2005 ; Tremblay, 2007 ; Courvalin, 2008). 20 Introduction Un intégron est constituée d’un gène intI, codant une intégrase chargée d'exciser et d'intégrer les cassettes, d’un site de recombinaison spécifique nommé attl où l'intégrase va intégrer préférentiellement les cassettes et d’un promoteur Pc qui permet l’expression des cassettes. Les cassettes elles-mêmes contiennent un autre élément de recombinaison nommé attC qui est aussi reconnu par l'intégrase (Ploy et al., 2005 ; Tremblay, 2007). Ces éléments ont été principalement étudiés chez les bactéries Gram négatives mais ils ont été également détectés chez certaines bactéries à Gram positif (corynebactéries et entérocoques) (Ploy et al., 2005 ; Tremblay, 2007). A titre d’exemple, Clark et al. (1999) ont pu mettre en évidence la cassette aadA1, codant la résistance à la streptomycine et à la spectinomycine chez En. faecalis mais la structure de l’intégron n’a pas été entièrement caractérisée. 1.3.1.2. Moyens du transfert des gènes de résistance : La résistance peut être acquise soit par des mutations dans le génome, on parlera alors de transmission verticale à la descendance, soit par l’acquisition de nouveaux gènes par transfert horizontal (Davison, 1999 ; Courvalin, 2008). Les gènes de résistance qui ont pu être tracés chez les bactéries isolées chez les animaux et celles isolées chez l’Homme sont non distinguables. Il faut considérer a priori que le transfert horizontal de gènes de résistance s’opère dans les deux sens entre les animaux et l’Homme (AFSSA, 2006). Ce transfert se fait principalement selon trois axes qui sont la transformation, la transduction et la conjugaison. - La transformation : La transformation bactérienne survient lorsque de l'ADN étranger présent dans le milieu extracellulaire est absorbé dans une cellule dite «compétente», elle permet un brassage génétique entre des bactéries très différentes (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Davison, 1999 ; Prescott, 2004). La compétence des bactéries est un phénomène lié à la perméabilité de la membrane, qui peut être induit (via des chocs électriques, thermiques ou des agents chimiques) ou se retrouver naturellement chez certaines espèces, seulement, comme S. pneumoniae et Bacillus subtilis. (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Prescott, 2004 ; Mathur et Singh, 2005). Ce phénomène naturel n'a été décrit chez les bactéries lactiques que chez Ln. carnosum (Helmark et al., 2004); Cependant, un système de transformation partiellement opérationnel 21 Introduction semblable à celui de S. pneumoniae a été identifié chez S. thermophilus (Blomqvist et al., 2006) de même que des opérons de compétence naturelle chez Lc. lactis IL1403 (Bolotin et al., 1999). Malgré ces découvertes, le mécanisme de transformation reste toujours mal connu chez ce groupe bactérien mais il peut être induit artificiellement ; en effet, plusieurs auteurs ont réussi à transformer des lactocoques (Holo et Nes, 1989), des lactobacilles (Badii et al., 1989 ; Beasley et al., 2004 ; Ziane, 2008) et des pédiocoques (Caldwell et al., 1996 ; Ziane, 2008) par électroporation. - La transduction : Ce mécanisme se produit lors de l'encapsidation erronée d'ADN génomique bactérien au cours du cycle de réplication d'un bactériophage, puis de l'infection d'une autre bactérie par ce phage. Dans le cas des phages tempérés, qui s’intègre dans le génome de l’hôte au cours de leur cycle, la transduction peut être limitée aux gènes situés à proximité du site d’insertion. On parle alors de transduction localisée, par opposition à la transduction généralisée au cours de laquelle n’importe quel fragment de l’ADN de l’hôte est intégré dans les capsides phagiques. Le matériel génétique ainsi transféré peut alors être intégré à son nouvel hôte par recombinaison homologue (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Nicklin et al., 2000 ; Renault, 2008). Ce mode de transmission d'ADN étranger est le premier à être exploité et utilisé pour le transfert des caractères à intérêt technologique entre les différentes souches lactiques (Fitzgerald et Gasson, 1988). Cependant, son importance en tant que moyen de diffusion des gènes d’antibiorésistance est encore discutable en raison de la grande spécificité des phages (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Morelli et al., 2004 ; Mathur et Singh, 2005 ; Ammor et al., 2007). - La conjugaison : Il s'agit d'un processus d'échange d'ADN se produisant lors d’un contact entre une cellule donneuse et une cellule réceptrice (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Davison, 1999 ; Morelli et al., 2004). La série de gènes nécessaires pour réaliser la conjugaison se retrouve souvent sur un plasmide conjugatif porté par la cellule donneuse, mais peut également se retrouver au niveau de son chromosome (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Clewell, 2005 ; Renault, 2008). Chez les bactéries Gram positives, y compris les bactéries lactiques, le contact est établi grâce à des mécanismes spécialisés telle que la production d’une protéine de surface par la cellule donatrice, qui permet l’attachement de celle-ci à la cellule réceptrice. L’expression de 22 Introduction cette protéine est induite par des phéromones de la cellule réceptrice (Clewell, 1993). Une fois le contact établi, un plasmide ou une partie du chromosome possédant l'origine de transfert (oriT) pourra être transmis (Joset et Guespin-Michel, 1993 ; Clewell, 2005). Ce mécanisme est considéré comme le principal responsable des transferts horizontaux de gènes de l’antibiorésistance (Teuber et al., 1999 ; Normark et Normark, 2002 ; Clewell, 2005). Les systèmes de conjugaison autochtones sont très communs chez les lactocoques ce qui reflète l'abondance de plasmides chez ces bactéries (Mathur et Singh, 2005). Ainsi, la littérature décrit plusieurs travaux qui montre la possibilité de conjugaison entre les autres espèces de bactéries lactiques (Neve et al., 1984 ; Morelli et al., 1988 ; Dessart and Steenson, 1991 ; Igimi et al., 1996 ; Perreten et al., 1997b ; Teuber et al., 1999 ; Schwarz et al., 2001 ; Gevers et al., 2003 ; Ouoba et al., 2008). 1.3.2. Mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Gram positives : Sur le plan biochimique, les bactéries ont développé de grands mécanismes qui empêchent l’interaction de l’antibiotique avec sa cible (figure 3, tableau 3). Trois principaux types de stratégies sont employées par les bactéries à gram positif, y compris les bactéries lactiques, pour annuler l’effet des antibiotiques sur elles : l’inactivation ou la modification des antibiotiques, la modification de la cible et l’efflux des antibiotiques à l’extérieur de la cellule par des pompes énergie dépendantes (Walsh, 2003 ; Tenover, 2006). Figure 3 : Illustration des mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Gram positives (Savard, 2008) 23 Introduction Tableau 3 : Principaux mécanismes de résistance aux antibiotiques chez les bactéries Gram positives (Zomahoun, 2005; http://www.microbes-edu.com/index.html) Mécanismes de résistance Antibiotiques Protéines impliquées Inactivation/ modification enzymatique - Aminosides - Bétalactamines - Chloramphénicol - Macrolides - Lincosamides - Streptogramines A, B - Acétyltransférases (AAC), Nucléotidyltransférases (ANT), phosphotransférases (APH) - Bétalactamases - Acétyltransférases (VatA-E, Cat) - Estérases, phosphotransférases ((mphA-C) - Nucléotidyltransférases (LinA, LnuA, LinB....) - Acétyltransférases, hydrolases Efflux actif (systèmes de transport membranaire) Altération de la cible - Aminosides - Bétalactamines - Altération des protéines ribosomales (Protéines L22…) - Altération ou nouvelle protéine liant la pénicilline (PLP2a) - Macrolides, Lincosamides, - Méthylation de l’ARN ribosomal (Méthylases Erm) Streptogramines - Quinolones - Altération de la topo-isomérase II et IV - Rifampicine - Altération de l’ARN-polymérase - Sulfamides - DHPS (dihydroptéroate synthétase) insensible - Tétracyclines - Protection ribosomale Tet(M)-(T) - Triméthoprime - DHFR (dihydrofolate réductase) insensible - Glycopeptides - Modification de la structure du précurseur du peptidoglycane - Bétalactamines - Mex, Mar, AcrAB-TolC - Macrolides - MFS (MdtA), MsrA, ABC - Lincosamides - LsA - Tétracyclines - Tet(A)-(L) - Quinolones 1.3.2.1. Inactivation ou modification de l’antibiotique : Ce mécanisme se produit via la production, par les bactéries, d’enzymes capables de détruire des liens chimiques nécessaires à l’intégrité fonctionnelle des antibiotiques (modification ou hydrolyse). Les substrats de ces enzymes sont les bétalactamines, les aminosides, le chloramphénicol, les macrolides, les lincosamides, les streptogramines et les tétracyclines (Chopra, 2001 ; Zomahoun, 2005). 24 Introduction - Enzymes inactivant les bétalactamines : La nature de ces enzymes, appelées bétalactamases, leurs différents types ainsi que leur présence chez les bactéries Gram positives seront présentés en détail dans le chapitre 1.3.3. - Enzymes inactivant les aminosides : Les aminosides peuvent être modifiés par l’ajout de trois types de groupements chimiques sur leur structure par les enzymes intracellulaires aminosides Phosphotransférases (APH), aminosides Nucléotidyltransférases (ANT) et aminosides N-Acétyltransférases (AAC) (Poole, 2002 ; Zomahoun, 2005). Ces modifications vont mener à l’acétylation, la phosphorylation et l’adénylation de ces antibiotiques qui perdront donc la capacité de se fixer sur leur cible, l’ARN du ribosome (Shaw et al., 1993 ; Zomahoun, 2005). Les gènes codant pour les enzymes inactivant les aminosides sont, principalement, portés par des plasmides autotransférables ou des transposons (Zomahoun, 2005), bien que certains semble être situés sur le chromosome bactérien (Poole, 2002), et ils peuvent également coder pour la résistance à d'autres antibiotiques (Zomahoun, 2005). - Enzymes inactivant les macrolides, lincosamides et streptogramines : Ces enzymes ont une faible influence sur la fréquence de la résistance aux antibiotiques de la famille des MLS. Chez les Staphylococcus, des enzymes inactivant l’érythromycine, les streptogramines A et B ou les lincosamides ont été décrites (Zomahoun, 2005). Des résistances à d’autres macrolides par inactivation enzymatique sont aussi connues (Poole, 2002). - Enzymes inactivant les chloramphénicols : La résistance aux chloramphénicols résulte, typiquement, de l’action des chloramphénicol acetyltransférases dont les gènes codant sont portés sur des plasmides présents chez certaines espèces appartenant au genres Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria et Haemophilus (Poole, 2002 ; Zomahoun, 2005). - Enzymes inactivant la tétracycline : L’inactivation de cet antibiotique résulte de l’action des produits des gènes tetT et X. Ce phénomène n’est connu que dans quelques rares cas (Poole, 2002). 25 Introduction 1.3.2.2. Modification de la cible : - Modification des sites de fixation sur le peptidoglycane : Les bactéries peuvent produire de nouvelles PLPs ou y introduire des mutations. Dans les deux cas, les PLPs auront moins d’affinité pour les bétalactamines (Hakenbeck et al., 1999 ; Walsh, 2000). Ce mécanisme de résistance est le plus fréquent chez les bactéries à Gram positif qui ne synthétisent pas ou rarement de bétalactamases (Poole, 2002). A titre d’exemple, la résistance des entérocoques aux pénicillines peut être en relation avec une hyperproduction (modification mutationnelle) de PLP d'affinité médiocre telle que les PLP3 (Zomahoun, 2005). Une résistance au glycopeptides peut, également, résulter de l’altération des sites de fixation de ces antibiotiques sur le peptidoglycane (Wright, 2003). La résistance à la vancomycine, par exemple, est due à la synthèse de pentapeptides anormaux possédant à leur extrémité un Dala-D-ser ou D-ala-D-lactate à la place du D-ala-D-ala. Cette synthèse est catalysée par les produits des gènes van (Cetinkaya et al., 2000) portés par le transposon Tnl546 (Tremblay, 2007). - Modification de la cible ribosomale : Toute modification acquise par mutation de la cible ribosomale diminue l’affinité du site de fixation de l’antibiotique et rend la bactérie résistante. Ainsi on peut observer des résistances aux : Macrolides et lincosamides : La résistance aux macrolides et lincosamides, la plus fréquemment rencontrée, se manifeste par la méthylation de l’ARNr 23S par des ARN méthylases (Leclercq et Courvalin, 1991 ; Schmitz et al., 2000 ; Poole, 2002) dont les gènes codant erm (erythromycin resistance methylase) sont situés sur des plasmides ou des transposons (Leclercq et Courvalin, 1991). Tétracyclines : Les gènes de résistance à la tétracycline tel que tetM et tetL codent pour un mécanisme de « protection ribosomale », encore mal compris, qui empêche l’association de la tétracycline avec sa cible ribosomale (Chopra et Roberts, 2001). Ces déterminants peuvent être portés par le chromosome, des plasmides, des transposons ou des intégrons (Chopra, 2001). 26 Introduction Aminosides : La résistance à ces antibiotiques peut résulter de mutations au niveau de leur cible ribosomale (Poole, 2002). C’est ainsi que les streptomycines deviennent inefficaces à la suite d’une mutation dans la protéine S12 du ribosome (Hogg, 2005). Ce mécanisme est moins rarement rencontré par rapport à celui de l’inactivation enzymatique (Zomahoun, 2005). - Modification des enzymes intervenant lors de la synthèse des acides nucléiques : Des mutations dans les gènes gyrA, gyrB (sous-unités A et B de l’ADN gyrase), parC et parE (sous-unités C et E de la topoisomérase IV) peuvent entraîner la production d’ADN gyrases et de topoisomérases insensibles à l’action des quinolones et fluoroquinolones. Elles peuvent également mener à la production d’une transcriptase modifiée qui est à l’origine des résistances aux rifamycines ((Edgar et Bibi, 1997 ; Zomahoun, 2005), et à la production de DHPS et DHFR insensibles à l’action des sulfamides et du triméthoprime, respectivement ; la résistance à ces derniers antibiotiques peut être, également, codée par des plasmides ou des transposons (Zomahoun, 2005). 1.3.2.3. Pompes à efflux actif : Il s'agit de transporteurs protéiques transmembranaires qui tirent leur énergie soit de la force proton-motrice, soit de l’hydrolyse de l’ATP. Leur fonction native est d'éliminer à l'extérieur de la bactérie des constituants inutiles à celle-ci et présents dans son cytoplasme. Ces pompes moléculaires permettent une sortie d’antibiotique plus rapide que l’entrée ; ainsi, la concentration intracellulaire d’antibiotique demeure à un niveau faible et inefficace (Edgar et Bibi, 1997 ; Walsh, 2000 ; Courvalin, 2008). Ces pompes peuvent contribuer à des résistances intrinsèques ou acquises (Poole, 2002). 27 Introduction Figure 4 : Structure des systèmes d’efflux actif (Courvalin, 2008) Quatre familles de pompes à efflux sont impliquées dans la résistance aux antibiotiques (figure 4) : la famille ABC (ATP Binding Cassette) qui rassemble des transporteurs primaires hydrolysant l’ATP, et les familles RND (Resistance Nodulation and cell Division), MSF (Major Facilitation Superfamily) et SMR (Small Multidrug Resistance) qui correspondent à des transporteurs secondaires utilisant le gradient de protons (H+) (Tremblay, 2007 ; Courvalin, 2008). Ces mécanismes peuvent être très spécifiques (résistance aux tétracyclines) ou d’une spécificité médiocre et sont, donc, responsables de multirésistance (Courvalin, 2008). Ils peuvent résulter d’un transfert de plasmides ou de transposons ou bien d’une surexpression, suite à une mutation ou plus, d’un système résident codé par le chromosome (NorA de Staphylococcus aureus) (Poole, 2002 ; Courvalin, 2008). Chez les bactéries à gram positif, les pompes à efflux sont le plus souvent associées au fluoroquinolones et à la tétracycline ; les pompes transportant ces derniers sont codées par les gènes tet qui sont, généralement, portés sur un plasmide ou un transposon. Ce mécanisme est également utilisé pour éliminer les macrolides (gènes mdtA et msrC), le Chloramphenicol (gène cmlA ) et les bétalactamines (Walsh 2000 ; Poole, 2002). Chez Lc. lactis K214, un transporteur multidrogues a été décrit. Il s’agit du LmrP, transporteur proton dépendant, qui confère la résistance aux macrolides, lincosamides 28 Introduction streptogramines et tétracyclines, et qui est codé par le gène mdt (A) porté sur le plasmide pK214 (Perreten et al., 2001). Ce dernier gène a été également détecté chez Lc. garvieae mais il diffère du gène original de la première souche par deux mutations et par son emplacement chromosomique (Walther, 2008). 1.3.3. Les bétalactamases : Le mécanisme majeur de résistance aux bétalactamines, en particulier chez les bactéries à Gram négatif, est la production de bétalactamases (Poole, 2004 ; Doi et Paterson, 2007), enzymes qui hydrolysent la liaison amide du noyau bétalactame de ces antibiotiques en les empêchant ainsi d'aller se lier à leurs cibles qui sont les protéines liant la pénicilline (PLPs) (Walsh, 2000 ; Poole, 2004 ; Zomahoun, 2005). Ces enzymes, très nombreuses et variées, sont définies par certains caractères (Zomahoun, 2005) qui sont : - La localisation : elle est extracellulaire pour les bactéries Gram positives et périplasmique pour les bactéries Gram négatives. - La biogenèse : elle est inductible (pénicillinases du Staphylococcus aureus et céphalosporinases des bactéries Gram négatives) ou constitutive (pénicillinases des bactéries Gram positives). - Le déterminisme génétique. - La sensibilité aux inhibiteurs tels que l’acide clavulanique (les pénicillinases sont inhibées par cet agent tandis que les céphalosporinases y résistent). La résistance via la production de bétalactamases résulte soit de la dérépression naturelle ou mutationnelle des gènes chromosomiques, ou bien de l'acquisition d’éléments génétiques extrachromosomiques portant des gènes codants à ces enzymes. Les mutations peuvent être individualisées soit au niveau des gènes de régulation soit au niveau des gènes de structure codant pour ces enzymes (Poole, 2004 ; Zomahoun, 2005). 1.3.3.1. Classification des bétalactamases : La classification moléculaire des bétalactamases (Classification d’Ambler) est basée sur la similitude de leurs séquences nucléotidiques et celles d'acides aminés (Bradford, 2001). Quatre classes moléculaires de bétalactamases sont connues (tableau 4), dont les pénicillinases classe A, les métallo-bétalactamases classe B, les céphalosporinases classe C et 29 Introduction les oxacillinases classe D. Les enzymes de classes A, C, et D ont la serine comme site actif tandis que les enzymes de classe B ont besoin de l’ion zinc pour effectuer leur activité catalytique (Poole, 2004 ; Doi et Paterson, 2007). Tableau 4 : Classification et propriétés des bétalactamases (Poole, 2004) 30 Introduction 1.3.3.2. Les différents types de bétalactamases : - Les pénicillinases : Ces enzymes peuvent être produites par les bactéries Gram négatives comme par celle à Gram positif. Elles ont pour substrat préférentiel les pénicillines (Zomahoun, 2005) et elles peuvent appartenir aux classes A et D (Poole, 2004). - Les bétalactamases à spectre étendu (BLSE) : Les BLSE sont typiquement codées par les plasmides mais elles sont également présentes sur les chromosomes, souvent en association avec les intégrons. Elles sont généralement inhibées par les inhibiteurs de bétalactamases, et sont produites par les bactéries Gram négatives (Poole, 2004) auxquelles elles confèrent une résistance aux pénicillines, céphalosporines (première, deuxième et troisième génération) et monobactams (Poole, 2004 ; Akujobi et al., 2008), tout en conservant leur sensibilité aux céphalosporines de quatrième génération et aux carbapénèmes (Poole, 2004). Ces enzymes dérivent, principalement, des bétalactamases de classes A (TEM-1, TEM-2, SHV-1). Des BLSE de classe D (OXA) sont également connues (Poole, 2004). - Les céphalosporinases : Les céphalosporinases de classe C (AmpC) sont produites par de nombreuses bactéries Gram négatives. Elles ont un large spectre d’activité contre la plupart des pénicillines et céphalosporines incluant, dans de nombreux cas, les céphalosporines de quatrième génération et les monobactams avec des spécificités variées (Poole, 2004 ; Sundin, 2009). Elles sont inefficaces contre les carbapénèmes et relativement insensibles aux inhibiteurs de bétalactamases (Poole, 2004). Les gènes codant les AmpC ont une localisation chromosomique ou plasmidique (Poole, 2004 ; Sundin, 2009), et beaucoup d'entre eux sont associés à des intégrons et des transposons (Walther-Rasmussen et Hoiby, 2002). Les plasmides codants les AmpC peuvent également porter des déterminants de résistance à des antibiotiques autres que les bétalactamines entrainant, ainsi, l’apparition de multirésistance (Poole, 2004). 31 Introduction - Les Carbapénémases : La majorité des carbapénémases appartiennent aux bétalactamases de classes A et B (Poole, 2004). En plus des carbapénèmes, ces enzymes peuvent hydrolyser les pénicillines, les céphalosporines et l'aztréonam et elles sont inhibées par l’acide clavulanique et le tazobactam (Moland et al., 2008). Ces enzymes sont portés par les plasmides ou les chromosomes (Poole, 2004). 1.3.3.3. Les bétalactamases des bactéries à Gram positif : Contrairement aux bactéries à Gram négatif, la résistance des bactéries Gram positives aux bétalactamines se manifeste, le plus souvent, par l’altération de leurs cibles (Poole, 2004). Cependant, certaines de ces bactéries sont également productrices de bétalactamases (Poole, 2004 ; Doi et Paterson, 2007). Des pénicillinases chromosomiques et plasmidiques (ex : Blaz) sont répandues chez les souches de Staphylococcus aureus (Dyke et Gregory, 1997). Une bétalactamase plasmidique (Blaz), suggérée être originaire d’un staphylocoque, a été également décrite chez Enterococcus faecalis (Smith et Murray, 1992). Des études sur Bacillus anthracis ont révélé la présence de deux gènes chromosomiques bla1et bla2 (Chen et al., 2003) codant, respectivement, pour une pénicillinase classe A et une métallo-bétalactamase (Materon et al., 2003), mais elles sont faiblement exprimées (Chen et al., 2003). Il a été également rapporté que les métallo-bétalactamases chromosomiques sont naturellement présentes chez de nombreuses espèces de bactéries à Gram positif (Bradford, 2001). 32 Matériel et Méthodes 2.1. Souches bactériennes : Les 83 souches lactiques utilisées dans cette étude (tableau 5) proviennent du souchier du laboratoire de Biologie des Microorganismes et de Biotechnologie (LBMB). Elles ont été isolées à partir de différents écosystèmes et elles appartiennent à divers genres bactériens (37 lactobacilles et 46 coques lactiques). Tableau 5 : Souches lactiques étudiées Souche LVK9, LVK11, LVK12, LVK13, LVK14, LVK15, LVK24, LVK27, LVK29, LVK30, LVK31, LVK32 LVK21 LVK25 CHTD27 BH14 Origine Lait de vache (El-Kerma) (Karam, 1995) Lait de chamelle (Tindouf) (Belkheir , 2004) Lait de chamelle (Illizi) (Bounoua, 2005) MA1 MA7 GHB8, GHB11, GHB15, GHB17, GHB24 GHB1, GHB2, GHB3, GHB4, GHB5, GHB6, GHB7, GHB9, GHB10, GHB12, GHB13, GHB14, GHB16, GHB18, GHB19, GHB20, GHB21, GHB22, GHB23, GHB25 V1, V2, V3, V6-1, V6-2, V101, V10-2, V11, V13-1, V17, V19, V24, V26-1, V26-2 V9, V18 V7, V8, V12, V13-2, V14, V16, V20, V21, V23, V25, V27 CHM1 CHM5, CHM9, CHM11, CHM12, CHM16, CHM17, CHM18, CHM19, CHM20 J3 J4 G6 *: blé fermenté (pré) Identifiée à Lactobacillus sp. Lactococcus sp. Enterococcus sp. Lactobacillus brevis Lactobacillus plantarum Pediococcus sp. Machroub* (Rélizane) (Bouziani et Sabaha, 2006) Streptococcus thermophilus Lactococcus sp. Ghars** (Biskra) (Benmouna, 2008) Enterococcus sp. Lactococcus lactis ssp lactis Viande bovine fraiche (Mostaganem) (Benbernou, 2008) Lactococcus lactis ssp cremoris Lactobacillus sp. Enterococcus sp. Lait de chamelle (Mauritanie) (Cheikh, 2008) Jéjunum poulet (Idoui, 2008) Gésier (Idoui, 2008) Lactobacillus sp. Lactobacillus helveticus Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus helveticus **: pâte de dattes 34 Matériel et Méthodes 2.2. Confirmation de l’appartenance des souches au groupe lactique et de leur pureté: L’observation macroscopique des colonies après culture des souches sur milieu MRS (De Man et al., 1960), la recherche de catalase et l’examen microscopique à l’immersion des bactéries après coloration de Gram permettent de déterminer l’appartenance de nos souches au groupe lactique. Le dernier test permet également de vérifier leur pureté. 2.3. Conservation des souches : Les souches étaient conservées en double exemplaire à +4°C sur milieu gélosé incliné MRS, ainsi que congelées à -20°C en lait écrémé à 10% ou en milieu MRS additionné de 20% de glycérol. 2.4. Antibiogramme en milieu solide : - Technique : Tout d’abord, des précultures des souches à étudier étaient préparées en prélevant une colonie de chaque souche conservée sur gélose inclinée (MRS) et en la mettant dans 5ml de milieu de culture liquide. Ces précultures étaient incubées à 30°C pendant 18 heures (DO600nm = 1). Ensuite, du milieu solide était coulé dans des boites Pétri stériles et il était laissé solidifier. Un tube contenant 15ml de milieu molle (contenant 50% d’agar) était ensemencé par 1ml de chaque préculture puis coulé sur la couche de milieu solide contenu dans la boite Pétri. Une fois le milieu séché, les disques d’antibiotiques (tableau 6) étaient déposés stérilement à la surface du milieu. Après incubation à 30°C pendant 24 heures, le diamètre des zones d’inhibition observées autour des disques était mesuré. Nous avons considéré que pour un diamètre inférieur à 15 mm la souche est résistante -R- à l’antibiotique testé, et pour un diamètre supérieur ou égal à 15 mm, elle est sensible -S- (Karam et Karam, 1994). 35 Matériel et Méthodes - Antibiotiques testés : Tous les disques d’antibiotiques utilisés dans cette étude (tableau 6) proviennent de Bioanalyse LTD (Turquie) à l’exception de l’oxacilline et l’amikacine qui proviennent des laboratoires Hi Media (Mumbai). Tableau 6 : Les différents disques d’antibiotiques utilisés Antibiotique Oxacilline (OX) Pénicilline G (P) Amoxicilline (AX) Amoxicilline + Acide clavulanique (AMC) Ampicilline (AM) Ticarcilline (TIC) Céfalexine (CL) Céfazoline (CZ) Céfoxitine (FOX) Céfotaxime (CTX) Ceftazidine (CAZ) Céfixime (CFM) Imipéneme (IPM) Spiramycine (SP) Erythromycine (E) Amikacine (AK) Kanamycine (K) Gentamycine (CN) Tobramycine (TOB) Nitrofurantoïne (F) Nitroxoline (NTX) Ofloxacine (OFX) Charge/disque 5 µg 10 UI 25 µg 20/10 µg 10 µg 75 µg 30 µg 30 µg 30 µg 30 µg 30 µg 5 µg 10 UI 100 µg 15 µg 30 µg 30 µg 10 µg 10 µg 300 µg 30 UI 5 µg Doxycycline (DO) 30 µg Tétracycline 30 µg Rifampicine (RA) 5 µg Famille Mécanisme d’action Bétalactamines Inhibition de la synthèse du peptidoglycane Macrolides Aminosides ou aminoglycosides Inhibition de la synthèse des protéines Nitrofuranes Fluoroquinolones Inhibition de la synthèse de l'ADN Tétracyclines Inhibition de la synthèse des protéines Rifamycines (Ansamycines) Blocage de la synthèse des ARN messagers 36 Matériel et Méthodes 2.5. Détermination des concentrations minimales d’inhibition des antibiotiques (CMI) : La détermination des CMI était réalisée en milieu solide en suivant la méthode décrite par Ziane (2008). Nous avons procédé comme suit : - Une solution mère de chaque antibiotique (tétracycline, érythromycine, amoxicilline et pénicilline G) était préparée à une concentration initiale de 5 mg/ml (tableau 7) puis diluée, dans du milieu MRS en surfusion, à des concentrations finales allant de 0,5 à 400 µg/ml. Tableau 7 : Solutions mères d’antibiotiques Formule utilisée pour la préparation des solutions mères d’antibiotique Antibiotiques Solvants Tétracycline W = (C x V) / P W : poids de la poudre d’antibiotique (mg) à dissoudre dans un volume de solvant (ml). C : concentration de la solution mère (mg/ml). P : indice de pureté de l’antibiotique. Ethanol 95% Erythromycine Amoxicilline Eau distillée Pénicilline G - Chaque dilution d’antibiotique était coulée dans une boite Pétri et après séchage du milieu, les boites étaient ensemencées en surface à l’aide d’un inoculateur multipoint préalablement trempé dans les puits d’une microplaque contenant les précultures de 18 heures des souches à étudier. Une boite témoin contenant du milieu sans antibiotique était également ensemencée. - Après séchage des inoculums, les boites étaient incubées à 30°C pendant 24 à 48 heures et la lecture des CMI était effectuée à l’œil nu en comparant la croissance des souches par rapport à la boite témoin. Les CMI correspondaient à la concentration minimale de chaque antibiotique pour laquelle aucune croissance n’était visible (Phillips et al., 1991). 37 Matériel et Méthodes 2.6. Recherche d’ADN plasmidique : Les souches sélectionnées pour rechercher leurs plasmides sont : Lactobacillus sp. V16, Lactococcus lactis ssp lactis V17 et Lactococcus lactis ssp cremoris V18. 2.6.1. Extraction d’ADN plasmidique : Le principe commun de la plupart des méthodes d’extraction d’ADN plasmidique repose sur trois grandes phases : - Lyse alcaline des cellules bactériennes. - Elimination des contaminants majeurs (ADN chromosomique, protéines, ARN). - Concentration de l’ADN plasmidique par précipitation alcoolique. Nous avons utilisé la technique d’O’Sullivan et Klaenhammer (1993) à laquelle nous avons apporté quelques modifications : cycles de congélation/décongélation pour bien fragiliser les parois bactériennes, et extractions au phénol seul et au chloroforme seul pour une meilleure déprotéinisation (Holmes et Quigley, 1981). Nous avons procédé de la manière suivante : Culture de 18 heures de la souche dans 5 ml de milieu MRS contenant un disque de 30 µg de tétracycline Récupération du culot cellulaire par centrifugation (12000 trs/min, +4°C, 15 min) Lavage du culot cellulaire deux fois dans de l’eau distillée stérile Resuspension du culot dans 200 µl d’eau distillée stérile Cycles de congélation/décongélation Ajout de 200µl d’une solution de saccharose à 25% contenant 30 mg/ml de lysozyme Incubation 1 heure à 37°C Ajout de 400 µl d’une solution de NaOH 0,2N contenant 3% SDS (pH 12,4) Incubation 15 min à température ambiante Dissolution du culot dans 320 µl d’eau distillée stérile Ajout d’un même volume de phénol (pH 8), Agitation prolongée par retournement Centrifugation : 12000 trs/min, + 4°C, 15 min Récupération de la phase liquide et ajout de 200 µl d’acétate d’ammonium et 350 µl de phénolchloroforme (v/v) ; Agitation prolongée par retournement, Centrifugation : 12000 trs/min, + 4°C, 15 min Récupération de la phase liquide et ajout d’un volume égal de phénol-chloroforme (v/v) Agitation prolongée par retournement, Centrifugation : 12000 trs/min, + 4°C, 15 min Récupération de la phase liquide et ajout d’un volume égal de chloroforme Agitation prolongée par retournement ; Centrifugation : 12000 trs/min, + 4°C, 15 min (Cette étape est répétée deux fois pour assurer l’élimination de toute trace de phénol) Ajout de 1ml d’éthanol absolu froid (-20°C) à la phase aqueuse Agitation par retournement ; Centrifugation : 12000 trs/min, + 4°C, 15 min Lavage du culot d’ADN plasmidique avec de l’éthanol 70% suivi de séchage à l’air libre Dissolution du culot plasmidique dans 40 µl de TE (50 mM Tris-HcL, 5 Mm EDTA, pH 7,5) contenant 0,1 mg/ml d’ARNase ; Incubation 1 heure à 37°C ; Conservation à 0°C 38 Matériel et Méthodes 2.6.2. Electrophorèse sur gel d’agarose : (Neve et al., 1984 ; Sambrook et Russel, 2001) Il s’agit d’une électrophorèse horizontale sur gel d’agarose à 0,8%. Un volume de 20 µl de chaque solution d’ADN additionnée de tampon de charge (5 à 10 µl) était déposé dans les puits du gel d’agarose. La cuve était remplie de tampon de migration TBE (pH 8) puis la migration était effectuée sous un voltage constant et elle était stoppée lorsque le tampon de charge arrivait au front du gel. Du bromure d’éthidium était ajouté au gel d’agarose, à une concentration finale de 0,5 µg/ml, afin de visualiser l’ADN sous la lumière ultraviolette. Les plasmides de la souche Escherichia coli V517 (Macrina et al., 1978) étaient utilisés comme standard de poids moléculaires, dont les tailles sont : 55.5, 7.4, 5.7, 5.3, 4.0, 3.1, 2.8 et 2.2 Kpb. Solutions pour l’électrophorèse sur gel d’agarose : Tampon de migration : TBE 89 mM Tris-HCl 2,5 mM EDTA 89 mM acide borique pH 8 Tampon de charge : 3 ml Glycérol 75 mg Bleu de bromophénol 7 ml Eau distillée 2.7. Purification de l’ADN plasmidique par électroélution : Nous avons utilisé la technique décrite par Ziane (2008) que la figure 5 illustre : - Le fragment du gel correspondant à l’ADN plasmidique de la souche Lactobacillus sp. V16 était découpé à l’aide d’une spatule stérile sous lumière ultraviolette. Il était, ensuite, placé sur un tamis dans une cuve d’électroélution dont les compartiments sont remplis de tampon de migration TBE. - Un courant électrique de 100 Volts était appliqué pendant 2 heures, provoquant ainsi l’élution de l’ADN du gel pour aller dans une couche de 200 µl d’acétate de sodium (3,5 M, pH 5,2). Le champ électrique était inversé, ensuite, pendant 15 min et le volume d’acétate de sodium contenant l’ADN plasmidique était récupéré dans un tube Eppendorf. - Cet ADN était, après, soumis à une extraction phénolique, précipité par l’alcool et le culot d’ADN plasmidique était, enfin, repris dans 15 µl d’eau distillée après son séchage. 39 Matériel et Méthodes Figure 5 : Schéma de la technique de l'électroélution 2.8. Transformation de la souche Pediococcus sp. MA1 par électroporation : - Culture de la souche réceptrice : (Hols et al., 1997 ; Holo et Nes, 1989 ; Badii et al., 1989) 60 ml de milieu MRS contenant 20 mM de D/L thréonine était ensemencé avec un inoculum issu d’une préculture de 18 heures de la souche réceptrice, puis incubé environ 5 heures à 30°C jusqu’à l’obtention d’une DO600nm de 0,8. - Préparation des cellules compétentes : (Serror et al., 2002 ; Badii et al., 1989) Les cellules étaient récoltées par centrifugation (15 min, 8000 trs/min, + 4°C), puis le culot était lavé deux fois avec 60 ml puis 20 ml de tampon d’électroporation E.B froid (0,4M saccharose, 1mM MgCl2, 5mM KH2PO4, pH 6) et il était ensuite resuspendu dans 5 ml de tampon E.B. 40 Matériel et Méthodes - Électroporation : (Badii et al., 1989) 100 µl de la suspension cellulaire étaient transférés stérilement au fond de la cuvette d’électroporation préalablement stockée au froid (-20°C), puis 15 µl d’ADN plasmidique précédemment élué était ajouté à la suspension. Après incubation du mélange dans la glace pendant 1 à 2 min, la cuvette était placée dans l’électroporateur (Gene Pulser, Bio Rad). Les paramètres d’électrotransformation utilisés étaient de 25 µF, 800 Ω et 1492 V pour un pulse de 2,7 ms. La préparation était, ensuite, diluée au 1/10 dans du milieu MRS froid (4°C) et incubée pendant 3 heures à 37°C, puis conservée à 0°C. - Sélection des transformants : La sélection des clones transformants était réalisée sur milieu MRS contenant la tétracycline à une concentration supérieure à celle qui a inhibé la souche réceptrice Pediococcus sp. MA1 non transformée : Un inoculum, prélevé à partir de la préparation issue de l’électroporation, était étalé par inondation sur ce milieu puis incubé à 30°C pendant plus de 48 heures. Une boite témoin ne contenant pas de tétracycline était également ensemencée. Ainsi, des cultures témoins de la souche réceptrice et celle donneuse étaient réalisées sur milieu avec et sans tétracycline. 2.9. Recherche d’activité bétalactamase : 2.9.1. Test de synergie : (Philippon et Arlet, 2006) Il s’agit d’une démonstration phénotypique de la production d’une bétalactamase à spectre élargi par la mise en évidence d’une image de synergie entre un disque de céphalosporine (troisième génération) et un disque d’Amoxicilline /acide clavulanique (AMC). ♦ Souches testées : LVK24, CHM1, MA7, G6, GHB15, GHB21, V3, V7, V13-1, V16, V17, V18, V19, V26-1. ♦ Technique : Un disque CTX (céfotaxime) et un disque AMC (amoxicilline + acide clavulanique) étaient appliqués, à une distance de 1,5 cm, sur un milieu MRS préalablement ensemencé par la souche à tester. 41 Matériel et Méthodes ♦ Lecture : Après incubation à 30°C pendant 24 heures, le résultat était considéré positif lorsqu’une image de synergie entre les deux disques était observée. 2.9.2. Test 3D : (Coudron et al., 2000) Ce test permet une confirmation phénotypique de la production de bétalactamases de classe C (AmpC) chez les bactéries résistantes aux bétalactamines. ♦ Souches testées : LVK27, LVK24, CHM1, MA7, G6, GHB15, GHB21, V3, V7, V131, V16, V17, V18, V19, V26-1. ♦ Technique : - La surface d’un milieu MRS en boite était ensemencée avec une souche indicatrice sensible au céfoxitine FOX (LVK27). - Un disque FOX était placé au milieu de la boite. - Avec une lame stérile, une fissure était crée à quelques millimètres du bord du disque dans une direction radiale extérieure. - Un inoculum d’une préculture de 18 heures de la souche à tester, qui est résistante au FOX, était inoculé dans la fissure. - Les boites étaient incubées pendant 24 heures, à 30°C. ♦ Lecture : Une déformation claire de la zone d’inhibition autour du FOX est interprétée comme résultat positif, la souche testée est donc considérée comme productrice d’AmpC. Si aucune déformation n’est observée, le résultat est négatif. 42 Résultats et Discussion 3.1. Confirmation de l’appartenance des souches au groupe lactique et de leur pureté : L’ensemble des bactéries lactiques étudiées ont poussé après 24 à 48 heures d’incubation. Les colonies observées sont blanchâtres, lisses, rondes, légèrement bombées, à aspect as crémeux et à pourtour régulier. Selon les souches, la taille des colonies varient de petite à un peu plus grande. En général, les colonies des lactobacilles sont plus grandes que celle des coques (V7 V7 et V27 par rapport aux GHB). GHB Elles sont toutes à Gram positif et à catalase négative. D’après l’examen microscopique, 46 souches sont cocciformes (LVK21, GHB15, V2, CHM1,…) et les 37 restantes sont des coccobacilles (LVK9, V12, CHM12,…) ou des bacilles (V7, G6,…) plus au moins allongés (figure 6). (B) (A) (C) Figure 6 : Aspect microscopique de quelques souches (G x100) 100) (A): Lactococcus lactis ssp lactis V2 ; (B): Lactobacillus helveticus G6 ; (C): Enterococcus sp. GHB21 44 Résultats et Discussion 3.2. Détermination de la sensibilité des souches aux différents antibiotiques testés : Au cours de cette étude, nous avons eu recours à la méthode de l’antibiogramme en milieu solide (MRS) pour déterminer la sensibilité de 83 bactéries lactiques (appartenant aux genre Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus et Lactobacillus) à 25 antibiotiques de différentes familles. Des exemples de résultats obtenus sont montrés dans les figures 7 et 8 qui représentent des antibiogrammes des souches Lactobacillus sp. V16 et Pediococcus sp. MA1, respectivement. TOB DO K TE SP RA OFX E NTX CN Figure 7 : Antibiogramme de la souche Lactobacillus sp. V16 P AK CFM OX AM CAZ SP AX AMC IPM Figure 8 : Antibiogramme de la souche Pediococcus sp. MA1 Le tableau 8 rassemble les résultats obtenus par la méthode de l’antibiogramme en milieu solide. Ceci permet de conclure aux phénotypes et de suggérer des génotypes des bactéries par rapport aux différents antibiotiques utilisés. 45 Résultats et Discussion Tableau 8 : Profils de résistance des bactéries lactiques étudiées (méthode de l’antibiogramme en milieu solide) Origine Souche Lactobacillus sp. Lait de vache (El-Kerma) Lactococcus sp. Enterococcus sp. Lait de chamelle (Tindouf) Lactobacillus brevis Lait de chamelle (Illizi) Lactobacillus plantarum Code Profil de résistance LVK9 LVK11 LVK12 LVK13 LVK14 LVK15 LVK24 LVK27 LVK29 LVK30 LVK31 LVK32 LVK21 OXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR OXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR OXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR OXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR OXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR OXR AMCR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR OXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR OXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR OXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR OXR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR OXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR OXR CLR FOXR CAZR CFMR CNR TOBR RAR LVK25 OXR CLR CZR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR CHTD27 OXR CZR FOXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR BH14 OXR FOXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR - OX : oxacilline, P : pénicilline G, AX : amoxicilline, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, AM : ampicilline, TIC : ticarcilline, CL : céfalexine, CZ : céfazoline, FOX : céfoxitine, CTX : céfotaxime, CAZ : Ceftazidine, CFM : céfixime, SP : spiramycine, E : érythromycine, AK : amikacine, K : kanamycine, CN : gentamycine, TOB : tobramycine, F : nitrofurantoïne, NTX : nitroxoline, OFX : ofloxacine, DO : doxycycline, TE : tétracycline, RA : rifampicine. - R : Résistant - Toutes les souches testées ont été sensibles à l’imipéneme (IPM). 46 Résultats et Discussion Tableau 8 (suite 1): Profils de résistance des bactéries lactiques étudiées (méthode de l’antibiogramme en milieu solide) Origine Gésier Souche Lactobacillus helveticus Code G6 Profil de résistance OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER RAR OXR PR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR PR TICR CLR CZR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR PR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR OXR PR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR OXR PR AXRTICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR GHB9 OXR PR AMR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR GHB10 OXR PR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR Enterococcus GHB12 Ghars (Biskra) OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR sp. GHB13 OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR GHB14 OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR GHB16 OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR GHB18 OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR GHB19 OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR GHB20 OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR GHB21 OXR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR GHB22 OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR - OX : oxacilline, P : pénicilline G, AX : amoxicilline, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, AM : ampicilline, TIC : ticarcilline, CL : céfalexine, CZ : céfazoline, FOX : céfoxitine, CTX : céfotaxime, CAZ : Ceftazidine, CFM : céfixime, SP : spiramycine, E : érythromycine, AK : amikacine, K : kanamycine, CN : gentamycine, TOB : tobramycine, F : nitrofurantoïne, NTX : nitroxoline, OFX : ofloxacine, DO : doxycycline, TE : tétracycline, RA : rifampicine. - R : Résistant - Toutes les souches testées ont été sensibles à l’imipéneme (IPM). GHB1 GHB2 GHB3 GHB4 GHB5 GHB6 GHB7 47 Résultats et Discussion Tableau 8 (suite 2) : Profils de résistance des bactéries lactiques étudiées (méthode de l’antibiogramme en milieu solide) Origine Souche Enterococcus sp. Ghars (Biskra) Lactococcus sp. Enterococcus sp. Lait de chamelle (Mauritanie) Lactobacillus sp. Lactobacillus helveticus Jéjunum poulet Lactobacillus delbrueckii Code Profil de résistance GHB23 GHB25 OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR GHB8 GHB11 GHB15 GHB17 GHB24 CHM1 OXR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR RAR OXR PR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR PR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR CHM5 CHM9 CHM11 CHM12 CHM16 CHM17 CHM18 CHM19 CHM20 J3 OXR AMCR CLR CZR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR AMCR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR OFXR DOR TER RAR OXR AMCR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR AMCR CLR CZR FOXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR RAR OXR AMCR FOXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER OXR FOXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER OXR AMCR TICR CLR CZR FOXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR OFXR TER RAR J4 OXR AMCR TICR CLR CZR FOXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR - OX : oxacilline, P : pénicilline G, AX : amoxicilline, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, AM : ampicilline, TIC : ticarcilline, CL : céfalexine, CZ : céfazoline, FOX : céfoxitine, CTX : céfotaxime, CAZ : Ceftazidine, CFM : céfixime, SP : spiramycine, E : érythromycine, AK : amikacine, K : kanamycine, CN : gentamycine, TOB : tobramycine, F : nitrofurantoïne, NTX : nitroxoline, OFX : ofloxacine, DO : doxycycline, TE : tétracycline, RA : rifampicine. - R : Résistant - Toutes les souches testées ont été sensibles à l’imipenème (IPM). 48 Résultats et Discussion Tableau 8 (suite 3) : Profils de résistance des bactéries lactiques étudiées (méthode de l’antibiogramme en milieu solide) Origine Machroub (Rélizane) Souche Pediococcus sp. Streptococcus thermophilus Code Profil de résistance MA1 OXR CLR CZR FOXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR MA7 OXR PR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER RAR V8 OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR TER RAR V12 OXR AMCR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR V13-2 OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR DOR TER RAR V14 OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR DOR TER RAR Viande bovine V16 Lactobacillus OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR fraiche OFXR DOR TER RAR sp. (Mostaganem) V20 OXR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER RAR V21 OXR PR AMCR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER RAR V23 OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER RAR V25 OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR TER RAR V27 OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR TER RAR - OX : oxacilline, P : pénicilline G, AX : amoxicilline, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, AM : ampicilline, TIC : ticarcilline, CL : céfalexine, CZ : céfazoline, FOX : céfoxitine, CTX : céfotaxime, CAZ : Ceftazidine, CFM : céfixime, SP : spiramycine, E : érythromycine, AK : amikacine, K : kanamycine, CN : gentamycine, TOB : tobramycine, F : nitrofurantoin, NTX : nitroxoline, OFX : ofloxacine, DO : doxycycline, TE : tétracycline, RA : rifampicine. - R : Résistant - Toutes les souches testées ont été sensibles à l’imipenème (IPM). V7 49 Résultats et Discussion Tableau 8 (suite 4) : Profils de résistance des bactéries lactiques étudiées (méthode de l’antibiogramme en milieu solide) Origine Souche Code V1 V2 V3 Viande bovine fraiche (Mostaganem) Lactococcus lactis ssp lactis V6-1 V6-2 V10-1 V10-2 V11 V13-1 V17 V19 V24 V26-1 V26-2 Lactococcus lactis ssp cremoris V9 V18 Profil de résistance OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR TER OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR DOR TER RAR OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR DOR TER RAR OXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER RAR OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR OFXR DOR TER RAR OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR OFXR DOR TER RAR OXR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR OFXR DOR OXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER RAR OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR NTXR OFXR DOR TER RAR OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR DOR TER RAR OXR PR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR DOR RAR OXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR AKR KR CNR TOBR FR OFXR DOR OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR DOR TER RAR OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR SPR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR DOR TER RAR OXR AMCR AMR CLR CZR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR OFXR RAR OXR PR AXR AMCR AMR TICR CLR CZR FOXR CTXR CAZR CFMR ER AKR KR CNR TOBR FR NTXR OFXR DOR TER RAR - OX : oxacilline, P : pénicilline G, AX : amoxicilline, AMC : amoxicilline + acide clavulanique, AM : ampicilline, TIC : ticarcilline, CL : céfalexine, CZ : céfazoline, FOX : céfoxitine, CTX : céfotaxime, CAZ : Ceftazidine, CFM : céfixime, SP : spiramycine, E : érythromycine, AK : amikacine, K : kanamycine, CN : gentamycine, TOB : tobramycine, F : nitrofurantoin, NTX : nitroxoline, OFX : ofloxacine, DO : doxycycline, TE : tétracycline, RA : rifampicine. - R : Résistant - Toutes les souches testées ont été sensibles à l’imipenème (IPM). 50 Résultats et Discussion D’après l’ensemble de ces résultats, nous observons que toutes les souches ont résisté à l’oxacilline, la ceftazidine et le céfixime mais elles ont été sensibles à l’imipenème. Sachant que nous avons effectué nos tests sur le milieu MRS, cela nous permet d’infirmer l’hypothèse suggérant que ce milieu peut inactiver l’imipenème (Ammor et al., 2007). Pour le reste des antibiotiques, une hétérogénéité de résistance a été remarquée en fonction des souches, des genres auxquels elles appartiennent et de leurs origines. Le comportement de l’ensemble de nos souches ainsi que celui de ces dernières selon leur appartenance, par genre, vis-àà-vis vis de chaque antibiotique et des familles d’antibiotiques sont illustrés dans la figure 9 et le tableau 9. Toutes les souches Lactococcus Enterococcus Lactobacillus % de souches 100 90 résistantes 80 70 60 50 40 30 20 10 Rifamycines Tétracyclines Fluoroquinolones Nitrofuranes Aminosides Macrolides Bétalactamines 0 Figure 9 : Antibiorésistance chez les bactéries lactiques étudiées 51 Résultats et Discussion Tableau 9 : Taux de résistance (%) des bactéries étudiées / antibiotique Antibiotique OX P AX AMC AM TIC CL CZ FOX CTX CAZ CFM IPM SP E AK K CN TOB F NTX OFX DO TE RA Toutes les souches Lactobacillus Lactococcus Enterococcus 100 54,22 15,66 59,04 39,76 65,06 79,52 79,52 79,52 75,90 100 100 0 51,80 63,85 91,56 97,59 98,79 98,79 31,32 86,74 93,97 30,12 32,53 71,08 100 27,02 10,81 54,05 21,62 37,83 54,05 56,76 62,16 48,65 100 100 0 81,08 45,94 97,30 100 100 100 13,51 89,19 94,60 29,73 40,54 51,35 100 63,63 31,81 86,36 77,27 90,90 100 95,45 95,45 95,45 100 100 0 27,27 68,18 95,45 95,45 100 100 50 68,18 95,45 63,63 54,54 86,36 100 86,36 04,54 54,54 31,81 86,36 100 100 90,90 100 100 100 0 27,27 95,45 81,81 100 100 100 45,45 100 95,45 0 0 95,45 D’après ces résultats, nous remarquons que les réponses de l’ensemble de nos souches aux antibiotiques testés sont variables selon les familles auxquelles appartiennent ces molécules et ce, même à l’intérieur d’une même famille. • Nos souches ont présenté une résistance très élevée aux antibiotiques appartenant aux familles des aminosides et des fluoroquinolones (représenté par l’ofloxacine) avec des pourcentages de 96,68% et 93,97%, respectivement. Pour les aminosides, les taux de résistance des 4 antibiotiques testés ont dépassé les 90%. 52 Résultats et Discussion • Un pourcentage élevé de résistance à la rifampicine (71,08%), aux bétalactamines (65,25%), aux nitrofuranes (59,03%) et aux macrolides (57,82%) a été enregistré. • Pour les bétalactamines, toutes les souches testées ont résisté à l’oxacilline, la ceftazidine et le céfixime. Des pourcentages de résistance dépassant les 75% ont été constatés pour la céfalexine, la céfazoline, le céfoxitine et le céfotaxime. Pour le reste des bétalactamines, les taux de résistance ont varié de 15,66% pour l’amoxicilline à 65,06% pour la ticarcilline. Quant aux nitofuranes, la plupart des souches ont résisté à la nitroxoline (86,74%) mais seulement 31,32% de ces souches l’ont fait pour le nitrofurantoïne. En ce qui concerne les macrolides, les taux de résistance à la spiramycine et l’érythromycine ne différaient pas beaucoup ; ils ont été de 51,80% et 63,85%, respectivement. • La résistance la moins élevée a été observée avec les antibiotiques de la famille des tétracyclines pour laquelle les pourcentages de résistance ont été de 32,53% pour la tétracycline et 30,12% pour la doxycycline. Il est à noter que la différence de sensibilité d’une bactérie aux antibiotiques d’une même famille a été déjà signalée par Walther et al. (2008), qui ont trouvé qu’une souche de Lactococcus lactis a résisté à l’amikacine, la kanamycine et la streptomycine grâce au gène de résistance aux aminosides aac(6`)-Ie-aph(2`)-Ia qu’elle héberge mais elle s’est montrée sensible à la gentamycine, ainsi que par Schnellmann et al. (2006) et Walther et Perreten (2007) qui ont détecté également des gènes de résistance aux aminosides chez des staphylocoques de phénotype sensible. Comme le montre la figure 9 et le tableau 9, nous pouvons également observer des différences de taux de résistance en fonction des genres auxquels appartiennent nos bactéries : - Lactococcus : Ces bactéries ont été majoritairement résistantes à l’ofloxacine (95,45%) et aux aminosides (97,72%). Un grand nombre de ces bactéries a également résisté à la rifampicine (86,36%) et aux bétalactamines (79,72%). Pour ces derniers, à l’exception de l’amoxicilline auquel seulement 31,81% des lactocoques ont résisté et de l’imipenème qui était efficace à 100%, 53 Résultats et Discussion aucun lactocoque ne s’est montré sensible à l’action de l’oxacilline, la céfalexine, la ceftazidine et le céfixime. Ainsi, plus de 63% de ces bactéries ont résisté à la pénicilline, l’ampicilline, l’association de l’amoxicilline et l’acide clavulanique, la ticarcilline, la céfazoline, le céfoxitine et le céfotaxime. Ces résultats concordent avec les données de la littérature pour l’ofloxacine (Kastner et al., 2006), les aminosides (Temmerman et al., 2002 ; Herreros et al., 2005 ; Kastner et al., 2006 ; Ziane, 2008), l’oxacilline (Herreros et al., 2005 ; Kastner et al., 2006), le céfoxitine (Herreros et al., 2005 ; Flórez et al., 2005 ; Alebouyeh, et al., 2005 ; Ziane, 2008), l’amoxicilline, le céfotaxime et la céfazoline (Ziane, 2008), l’imipéneme (De Fabrizio et al., 1994 ; Ammor et al., 2007), et la rifampicine (De Fabrizio et al., 1994 ; Herreros et al., 2005). Ainsi, pour ce dernier antibiotique, 48% de résistance chez des lactocoques a été enregistré par Ziane (2008). En revanche, la sensibilité de ces bactéries à la gentamycine (De Fabrizio et al., 1994 ; Walther et al., 2008), l’ampicilline (De Fabrizio et al., 1994 ; Herreros et al., 2005 ; Ammor et al., 2007 ; Toomey et al., 2010), l’oxacilline (De Fabrizio et al., 1994), l’amoxicilline, la ticarcilline et la rifampicine (Ammor et al., 2007) et la pénicilline G (De Fabrizio et al., 1994 ; Ammor et al., 2007 ; Walther et al., 2008) a été déjà indiquée. Les taux de résistance des lactocoques aux antibiotiques des familles des nitrofuranes et des tétracyclines ont été compris entre 50% et 68,18% ; cela était également le cas avec l’érythromycine. En revanche, seulement 27,27% de ces bactéries ont résisté à la spiramycine. Ces données sont d’une similarité avec ceux rapportés par différents auteurs concernant le comportement des lactocoques vis-à-vis des nitrofuranes (Herreros et al., 2005 ; Kastner et al., 2006 ; Walther et al., 2008), de la tétracycline (Delgado et Mayo, 2004 ; Kastner et al., 2006 ; Walther et al., 2008 ; Toomey et al., 2010) et de l’érythromycine (Raha et al., 2002 ; Ziane, 2008 ; Walther et al., 2008). Cependant, d’autres travaux ont montré la susceptibilité de ces bactéries au deuxième (De Fabrizio et al., 1994 ; Perreten et al., 2001 ; Herreros et al., 2005 ; Alebouyeh, et al., 2005 ; Ziane, 2008) et au troisième antibiotique (De Fabrizio et al., 1994 ; Perreten et al., 2001 ; Flórez et al., 2005 ; Hummel et al., 2007). - Enterococcus : Chez ces bactéries, nous avons enregistré 95,45% de résistance à l’ofloxacine, à la rifampicine et aux aminosides. Cependant, aucune de ces souches n’a résisté à l’action des tétracyclines testées. Des comportements similaires à ceux montrés par nos souches d’Enterococcus ont été notés par Belicova et al. (2007), Ziane (2008) qui a constaté 20% de 54 Résultats et Discussion résistance, et Valenzuela et al. (2009) vis-à-vis de la rifampicine, par Franz et al. (2001), Lopes et al. (2003) et Ziane (2008) vis-à-vis des aminosides et par Alebouyeh et al. (2005), Ziane (2008) et Toomey et al. (2010) vis-à-vis de la tétracycline. Par contre, d’autres auteurs ont enregistré la résistance des entérocoques à ce dernier antibiotique (Butaye et al., 2000 ; Franz et al., 2001 ; Huys et al., 2004 ; Maïetti et al., 2007 ; Valenzuela et al., 2009) ainsi que leur sensibilité aux aminosides (Belicova et al., 2007, Maïetti et al., 2007). Pour les nitrofuranes et les macrolides, nous avons observé une hétérogénéité de résistance au sein de chaque famille : bien que les entérocoques testés aient majoritairement résisté à la nitroxoline et l’érythromycine (100% et 95,45%, respectivement), leurs taux de résistance au nitrofurantoïne et à la spiramycine étaient de 45,45% et 27,27%, respectivement. La susceptibilité réduite au nitrofurantoïne (Valenzuela et al., 2009) et à l’érythromycine (Franz et al., 2001 ; Citak et al., 2004 ; Ziane, 2008 ; Valenzuela et al., 2009 ; Toomey et al., 2010) a été, déja, observée chez des souches d’Enterococcus. Cependant, leur sensibilité au deuxième antibiotique a été montrée par les résultats de différentes études (Flórez et al., 2005 ; Belicova et al., 2007, Maïetti et al., 2007). En ce qui concerne les bétalactamines, tous les entérocoques ont résisté à l’oxacilline, la céfalexine, le céfotaxime, la ceftazidine et le céfixime, mais ils ont été sensibles à l’imipéneme. Pour le reste des bétalactamines, à l’exception de l’amoxicilline (31,81% de résistance), les taux de résistance ont varié de 54,54% pour l’association de l’amoxicilline et l’acide clavulanique à 90,90% pour le céfoxitine. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus, chez les entérocoques, pour l’oxacilline (Citak et al., 2004), l’ampicilline et la pénicilline G (Franz et al., 2001) et pour l’amoxicilline, la céfazoline, la céfalexine, le céfoxitine et le céfotaxime (Ziane, 2008). D’autres auteurs ont, au contraire, constaté la susceptibilité élevée des entérocoques à l’ampicilline (Klein et al., 1998 ; Davies et Roberts, 1999 ; Franz et al., 2001 ; Maïetti et al., 2007; Valenzuela et al., 2009 ; Toomey et al., 2010) et à la pénicilline G (Valenzuela et al., 2009). - Lactobacillus : La plupart des lactobacilles testés ont résisté à l’ofloxacine (94,60%) et aux aminosides (99,32%). Les taux de résistance de ces souches aux macrolides, bétalactamines, nitrofuranes et rifampicine ont été compris entre 63,51% et 51,35%. Ceci est en accord avec les résultats obtenus par Danielsen et Wind (2003), Gevers et al. (2003), Elkins et Mullis (2004), Coppola 55 Résultats et Discussion et al. (2005), Herreros et al. (2005), Rojo-Bezares et al. (2006), Kastner et al. (2006), D’Aimmo et al. (2007) et Ziane (2008) pour les aminosides, par Gupta et Mittal (1995), Danielsen et Wind (2003), Coppola et al. (2005), Kastner et al. (2006), Ouoba et al. (2008) pour les fluoroquinolones et par Herreros et al. (2005) et Coppola et al. (2005) pour la rifampicine. Par contre, une sensibilité des lactobacilles à la gentamycine et la kanamycine a été observée par Swenson et al. (1990). Ainsi, d’autres auteurs (Swenson et al., 1990 ; Dalache et al., 2003 ; D’Aimmo et al., 2007 ; Ziane, 2008) ont constaté la sensibilité de la quasi-totalité des lactobacilles qu’ils ont étudié à la rifampicine. Pour les macrolides et les nitrofuranes, ce sont la nitroxoline et la spiramycine qui ont été les moins efficaces avec des pourcentages de résistance dépassant les 80%, contrairement au nitrofurantoïne et l’érythromycine auxquelles les fréquences de résistance des lactobacilles étaient de 45,94% et 13,51%, respectivement. Plusieurs auteurs ont rapporté la résistance des lactobacilles au nitrofurantoïne (Danielsen et Wind, 2003 ; Herreros et al., 2005 ; Kastner et al., 2006) et à l’érythromycine (Cauwerts et al., 2006 ; Toomey et al., 2010) tandis que d’autres ont constaté des phénotypes de sensibilité à ce dernier antibiotique chez les lactobacilles qu’ils ont étudiés (Swenson et al., 1990 ; Olukoya et al., 1993 ; Gupta et Mittal, 1995 ; Temmerman et al., 2002 ; Coppola et al., 2005 ; Rojo-Bezares et al., 2006 ; D’Aimmo et al., 2007 ; Ziane, 2008). Quant aux bétalactamines, une hétérogénéité de résistance a été constaté : toutes les souches ont été résistantes à l’oxacilline, la ceftazidine et le céfixime mais sensibles à l’imipéneme. Les taux de résistance aux autres bétalactamines ont varié de 10,81% pour l’amoxicilline à 62,16% pour le céfoxitine. Ces résultats rejoignent ceux enregistrés par Herreros et al. (2005) et Coppola et al. (2005) pour le céfoxitine et l’oxacilline, par Kastner et al. (2006) pour ce dernier antibiotique et pour le céfotaxime et la pénicilline G, par Olukoya et al. (1993) et Toomey et al. (2010) pour l’ampicilline et la pénicilline G, par Ziane (2008) pour la céfazoline, la céfalexine, le céfotaxime et le céfoxitine, par Danielsen et Wind (2003) et Delgado et al. (2005) pour le céfoxitine, et par Gevers et al. (2003) pour la pénicilline G. Néanmoins, la sensibilité des lactobacilles à l’ampicilline et la pénicilline G a été rapportée par d’autres auteurs (Gupta et Mittal, 1995 ; Herreros et al., 2005 ; Coppola et al., 2005 ; D’Aimmo et al., 2007) et (Temmerman et al., 2002), respectivement. 56 Résultats et Discussion Les tétracyclines étaient d’une efficacité moyenne sur les lactobacilles, comparés aux lactocoques et aux entérocoques. Les taux de résistance à ces antibiotiques étaient de 40,54% pour la tétracycline et de 29,73% pour la doxycycline. Ces résultats sont à rapprocher de ceux qui ont montré la sensibilité de plus de la moitié des lactobacilles étudiés à la doxycycline (Dalache et al., 2003) et à la tétracycline (Olukoya et al., 1993 ; Gupta et Mittal, 1995 ; Temmerman et al., 2002 ; Herreros et al., 2005). Cependant, des résistances à ce dernier antibiotique ont été observées par Kastner et al. (2006) et Toomey et al. (2010). - Streptococcus thermophilus : Cette souche a résisté à tous les aminosides et à la plupart des bétalactamines testées (à l’exception de l’imipéneme, l’amoxicilline et l’association amoxicilline + acide clavulanique) ; cependant, elle s’est montrée sensible à l’ofloxacine, à la rifamycine et à tous les macrolides et tétracyclines testés. Par ailleurs, en ce qui concerne les nitrofuranes, cette souche n’a résisté qu’à l’action de la nitroxoline. Ces résultats rejoignent ceux décrits chez des souches de Streptococcus thermophilus pour les aminosides (Aslim et Beyatli, 2004 ; D’Aimmo et al., 2007), la pénicilline G (Aslim et Beyatli, 2004), le céfoxitine (Alebouyeh et al., 2005 ; Ziane, 2008), la céfazoline, la céfalexine, le céfotaxime et l’amoxicilline (Ziane, 2008), la rifampicine (D’Aimmo et al., 2007 ; Ziane, 2008), l’érythromycine (D’Aimmo et al., 2007 ; Ammor et al., 2007 ; Hummel, 2007 ; Ziane, 2008) et la tétracycline (Aslim et Beyatli, 2004 ; D’Aimmo et al., 2007 ; Ammor et al., 2007). En revanche, d’autres études ont montré la résistance des souches de cette espèce à ce dernier antibiotique (Hummel, 2007 ; Ziane, 2008) ainsi que leur sensibilité à l’ampicilline et à la pénicilline G (D’Aimmo et al., 2007 ; Ammor et al., 2007). - Pediococcus sp. : La seule souche appartenant à ce genre, qui est Pediococcus sp. MA1, n’a résisté qu’à la nitroxoline, aux aminosides, et aux bétalactamines suivantes : oxacilline, céfalexine, céfazoline, céfoxitine, ceftazidine et céfixime. De nombreux auteurs ont obtenus des résultats semblables aux nôtres pour les aminosides (Swenson et al., 1990 ; Rojo-Bezares et al., 2006 ; Kastner et al., 2006 ; O’Connor et al., 2007 ; Ammor et al., 2007), l’oxacilline (Kastner et al., 2006), la céfazoline et le céfoxitine (Ziane, 2008), la céfalexine (O’Connor et al., 2007 ; Ziane, 2008), la ceftazidine (O’Connor et al., 2007), le céfotaxime (Kastner et al., 2006 ; O’Connor et al., 2007 ; Ziane, 2008), l’imipéneme et la pénicilline G (Ammor et al., 2007), l’érythromycine (Swenson et al., 1990 ; Rojo-Bezares et al., 2006 ; Ammor et al., 2007 ; 57 Résultats et Discussion Toomey et al., 2010), la tétracycline acycline (Swenson et al., 1990 ; Rojo-Bezares Bezares et al., 2006 ; Ziane, 2008 ; Toomey et al.,, 2010) et la rifampicine (Swenson et al., 1990 ; Ammor et al., 2007 ; Ziane, 2008). Au contraire, des résistances au nitrofurantoïne et à l’ofloxacine (Kastner et al., 2006), à la pénicilline G (O’Connor et al.,, 2007), à l’érythromycine (O’Connor et al., 2007 ; Ammor et al.,, 2007) ainsi qu’à la tétracycline (Kastner et al., 2006 ; Ammor et al., 2007) ont été également observées chez des souches de Pediococcus. La variabilité de la sensibilité des souches étudiées semble dépendre également de leurs leur origines (figure 10) : % de souches résistantes 100 Souches isolées de la viande 90 80 Souches isolées du lait de chamelle de différentes origines Souches isolées du lait de vache 70 60 50 40 Souches isolées du Ghars 30 20 10 Rifamycines Tétracyclines Fluoroquinolones Nitrofuranes Aminosides Macrolides Bétalactamines 0 Figure 10 : Comparaison des antibiorésistances des souches étudiées, selon leurs origines Toutes les souches isolées de la viande ont résisté à l’action des aminosides et de l’ofloxacine. Les taux de résistances de ces souches aux antibiotiques des autres familles ont varié de 61,10% pour les nitrofuranes à 85,18% pour la rifampicine. Unee hétérogénéité de résistance a été observée chez les souches isolées du lait de chamelle. Les antibiotiques les moins efficaces sur ces souches étaient ceux appartenant aux familles des fluoroquinolones (ofloxacine) et des aminosides (91,66% de résistance pour chaque famille) ; cependant seulement 25% de ces souches ont résisté aux tétracyclines. Pour les 58 Résultats et Discussion autres familles d’antibiotiques testés, les taux de résistance étaient de : 66,66% (macrolides), 58,33% (rifamycines), 42,94% (bétalactamines) et 41,66% (nitrofuranes). En ce qui concerne les souches isolées du lait de vache, elles ont été toutes sensibles à la doxycycline et la tétracycline, et seulement un faible nombre d’entre elles a résisté à la rifampicine (14,28%), les bétalactamines (31,31%) et les macrolides (32,14%). La moitié de ces souches se sont montrées sensibles à l’action des nitrofuranes mais la plupart d’elles ont résisté à l’ofloxacine (78,57%) et aux aminosides (94,64%). Pour les souches isolées du Ghars, elles ont toutes résisté à la rifampicine et l’ofloxacine mais aucune d’entres elles n’a résisté à l’action des tétracyclines. Les antibiotiques des autres familles ont été moins efficaces sur ces souches avec des taux de résistances qui variaient de 66% pour les macrolides à 96% pour les aminosides. Pour les souches isolées du Machroub, la souche Streptococcus thermophilus MA7 a résisté à un nombre d’antibiotique plus élevé que la souche Pediococcus sp. MA1 (tableau 8). La souche Lactobacillus helveticus G6, isolée du gésier, a résisté à la plupart des antibiotiques testés à l’exception de l’amoxicilline, l’ampicilline, l’imipéneme, la spiramycine et le nitrofurantoïne (tableau 8). Les souches isolées du jéjunum du poulet, Lactobacillus helveticus J3 et Lactobacillus delbrueckii J4, ont approximativement le même profil de résistance (tableau 8). Ces souches n’ont été sensibles qu’à la pénicilline, l’amoxicilline, l’ampicilline, le céfotaxime, l’imipéneme, l’érythromycine, le nitrofurantoïne et la doxycycline. Pour la nitroxoline, la tétracycline et la rifampicine, seulement l’une des deux souches à résisté à leurs actions. D’après ces résultats, on peut conclure que les souches les plus résistantes aux antibiotiques sont celles isolées de produits d’origine animale (viande bovine, lait de chamelle, gésier, jéjunum poulet). Ceci est assez attendu, vue l’utilisation intensive des antibiotiques, appartenant à des classes auxquels appartiennent les molécules que nous avons testées ou bien eux même, en élevage des animaux en Algérie (Bouguedour, 2008 ; Zeghilet, 2009). Il est bien admis que cet usage, à des fins thérapeutiques ou prophylactiques, peut être à l'origine de l’apparition d’antibiorésistances chez les bactéries de la flore digestive des 59 Résultats et Discussion animaux et de la présence de résidus d'antibiotiques dans le lait et la chair des animaux, qui peuvent également conduire à la sélection de bactéries résistantes aux antibiotiques. En effet, une recherche effectuée par Tarzaali et al. (2008) a mis en évidence la présence de résidus de tétracyclines et de bétalactamines dans des échantillons de lait cru de vache provenant de plusieurs régions du centre algérien (89,09% et 65,46% de laits positifs pour les tétracyclines et les bétalactamines, respectivement) ; de même, Benmohand et Benouadah (2008) ont détecté des résidus de pénicilline G et d’érythromycine dans des échantillons de poulet de chair. Cependant, la résistance modérée des souches isolées du lait de vache est probablement due au fait que les animaux à partir desquels ce lait provient ont été élevés de manière traditionnelle (alimentation non supplémentée d’antibiotiques, …) ce qui a conduit à une faible pression de sélection pour les antibiotiques dans cet environnement comparé aux autres milieux. D’autre part, la fréquence de résistance très élevée des souches isolées du Ghars aux différents antibiotiques, exceptés ceux appartenant à la classe des tétracyclines, pourrait s’expliquer par le fait que les antibiotiques ont été d’un grand usage en tant que phytosanitaires pour protéger ou traiter les palmiers desquels proviennent les dattes qui ont servi de matière première pour la production du Ghars. Ainsi, il se peut que des bactéries résistantes provenant des travailleurs aient contaminé le Ghars au cours de sa production et ont pu transférer les résistances qu’elles possèdent aux autres bactéries présentes dans ce produit. En plus de la variabilité des genres auxquels appartiennent les souches étudiées et des origines desquelles elles proviennent, l’hétérogénéité des profils de résistance de ces souches peut être attribuée à d’autres facteurs comme : - La nature des antibiotiques : les antibiotiques lipophiles comme la doxycycline ont un accès plus facile à l’intérieur des bactéries que ceux hydrophiles (bétalactamines) vue la composition de la paroi bactérienne (Zomahoun, 2005). - L’état physiologique des bactéries : selon Dhar et McKinney (2007), les phases et vitesses de croissance ainsi que l’âge des cellules peuvent entrainer des variations de résistance aux 60 Résultats et Discussion antibiotiques. Les bétalactamines, par exemple, ne sont actifs que sur les bactéries en croissance (Walsh, 2003). - Les activités physiologiques et biochimiques des bactéries : l’imperméabilité de la paroi cellulaire semble être l’un des mécanismes de résistance des lactobacilles à des antibiotiques de la classe des bétalactamines du moment que les espèces de ce genre sont dépourvues de cytochromes (Condon, 1983). Ainsi, des systèmes autolytiques défectueux de la paroi cellulaire peuvent être à l’origine des différences de sensibilité aux antibiotiques agissant sur cette cible (Kim et al., 1982). - Le profil génétique des bactéries : il se peut que des bactéries parmi celles que nous avons testé hébergent des gènes de résistance que certaines d’autres en sont dépourvues (Devirgiliis et al., 2008). - Le changement de la bactérie pour une forme L : il s’agit d’une résistance non génétique, donc non transmissible, qui se produit de façon transitoire lorsque une bactérie cesse de produire la majeure partie de sa paroi ce qui la rend insensible aux agents antimicrobiens qui agissent sur la synthèse de la paroi. Ce mécanisme est souvent une conséquence du milieu ou d'un changement brusque dans le métabolisme d'une bactérie (Tremblay, 2007). - Le milieu de culture : ce facteur peut influencer la susceptibilité des bactéries aux antibiotiques de même que l’efficacité de ces derniers (Huys et al., 2002 ; Tremblay, 2007 ; Ammor et al., 2007 ; Devirgiliis et al., 2008). A titre d’exemple, Ammor et al. (2007) ont rapporté que le milieu MRS peut inactiver certains antibiotiques. À la lumière des résultats sus cités et du tableau 8, il est bien remarquable que la fréquence de multirésistances (ou polyrésistances) est très élevée parmi les bactéries sujettes de notre étude : • les souches d’Enterococcus ont montré des résistances à un nombre qui varie de 11 à 20 antibiotiques de 3 à 6 familles différentes, respectivement. • les lactocoques ont résisté à un nombre variant de 8 à 24 antibiotiques de 3 à 7 familles différentes, respectivement. 61 Résultats et Discussion • les lactobacilles ont présenté des résistances vis-à-vis de 8 à 24 antibiotiques de 2 à 7 familles différentes. • Pediococcus sp. MA1 et Streptococcus thermophilus MA7 ont montré des résistances à 11 antibiotiques de 3 familles différentes et à 16 antibiotiques de 4 familles différentes, respectivement. Cela est en concordance avec les différents rapports qui indiquent qu’un nombre croissant de souches lactiques présentant des résistances à des antibiotiques de familles différentes sont isolées, et cela quelque soit leurs origines et leur appartenance (Klein et al., 1998 ; Davies et Roberts, 1999 ; Halami et al., 2000 ; Temmerman et al., 2002 ; Dalache et al., 2003 ; Herreros et al., 2005; Mathur et Singh, 2005 ; Kastner et al., 2006 ; Ziane, 2008 ; Toomey et al., 2010). Le phénomène de multirésistance est généralement du soit à une résistance croisée, c'est-àdire résistance de la bactérie à tous les membres d’une classe d’antibiotiques due à un seul mécanisme de résistance (Chopra and Roberts, 2001 ; Courvalin, 2008) ou à des antibiotiques de classes différentes ayant la même cible d’action quand cette dernière est modifiée par un produit de gène de résistance (Roberts et al., 1999 ; Courvalin, 2008), soit à la présence de plasmides porteurs de plusieurs gènes conférant la résistance à divers familles d’antibiotiques comme c’est le cas avec le plasmide pK214 qui a été rapporté chez la souche Lactococcus lactis K214 isolée du fromage à base de lait cru et qui porte des gènes codant la résistance à la streptomycine, la tétracycline et le chloramphénicol ainsi qu’un gène codant un système d’efflux (mdtA ) qui confère la résistance à l’érythromycine et la tétracycline (Perreten et al., 1997a ; Perreten et al., 2001). Un autre transporteur multidrogues (LmrP) a été décrit chez une autre souche de Lc. lactis, il code la résistance aux macrolides, lincosamides, streptogramines et à la tétracycline (van Veen et al., 1999). D’autre part, il est à noter que les taux de résistances très élevés des bactéries testées vis-àvis de certaines familles d’antibiotiques, particulièrement celles des aminosides et des quinolones, indique fort probablement des résistances intrinsèques à ces molécules comme cela a été rapporté par Teuber et al. (1999), Danielsen et Wind (2003), Rojo-Bezares et al. (2006), Euzéby (2007) et Ouoba et Jensen (2008). Elkins et Mullis (2004) ont noté que la résistance intrinsèque des bactéries lactiques aux aminosides est probablement due à la structure de leur paroi cellulaire et l’imperméabilité de leur membrane plasmique, qui sont complémentées dans certains cas par des mécanismes d’efflux actif. De même, Petersen et 62 Résultats et Discussion Jensen (2004) ont associé la résistance naturelle des bactéries à Gram positif, y compris les bactéries lactiques, aux quinolones et fluoroquinolones à une substitution dans la séquence QRDR de la gyrA (sous-unité A de l’ADN gyrase) qui transforme la sérine de la position 83 en une arginine, ou le glutamate de la position 87 en une glycine ou lysine, ou encore la sérine de la position 80 en une leucine ou isoleucine. 3.3. Détermination des concentrations minimales d’inhibition des antibiotiques (CMI) : Notre étude a été poursuivie, comme nous l’avons déjà indiqué, par la détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) de divers antibiotiques, qui sont la tétracycline, l’érythromycine, l’amoxicilline et la pénicilline G, chez 16 de nos souches. Les CMI sont exprimées en mg/ml ou en µg/ml (Mathur et Singh, 2005). Le tableau 10 montre les valeurs de CMI des divers antibiotiques estimées chez l’ensemble des souches testées : ces valeurs sont de l'ordre de 0,5 à plus de 200 µg/ml pour les deux bétalactamines (amoxicilline et pénicilline G) et d’à peu près 8 à plus de 200 µg/ml pour la tétracycline et l'érythromycine. Cela indique que, selon Walsh (2003), les souches testées sont soit résistantes (CMI ≥ 32 µg/ml) soit sensibles (CMI < 8 µg/ml) ou bien elles ont des résistances intermédiaires (8 ≤ CMI < 32 µg/ml). - CMI de la pénicilline G : Les souches testées étaient majoritairement sensibles à la pénicilline G. En effet, nous avons enregistré des CMI qui ne dépassaient pas les 0,5µg/ml pour certaines souches comme Pediococcus sp. MA1, et des CMI comprises entre 2 et 5µg/ml ou entre 5 et 8µg/ml pour d’autres telles qu’Enterococcus sp. GHB22 et Lactococcus lactis ssp. lactis V17, respectivement. Des exceptions ont été observées pour les souches Lactobacillus helveticus G6, Lactobacillus sp. V7 et Lactobacillus sp. V16 pour lesquelles les valeurs de CMI ont dépassé 200µg/ml. Nos observations sont en concordance avec les résultats de différentes études qui rapportent des valeurs de CMI basses pour la pénicilline G. Ces CMI sont ≤ 2µg/ml chez des pédiocoques (Halley et Blaszyk, 1998 ; Rojo-Bezares et al., 2006), comprises entre 2 et 8µg/ml chez des lactocoques et des entérocoques (Ziane, 2008), ≤ 4µg/ml chez des lactobacilles (Halley et Blaszyk, 1998 ; Danielsen et Wind, 2003 ; Rojo-Bezares et al., 2006 ; D’Aimmo et al., 2007 ; Ouoba et al., 2008 ; Ziane, 2008) et ≤ 2µg/ml chez des souches de 63 Résultats et Discussion Streptococcus thermophilus (D’Aimmo et al., 2007 ; Ziane, 2008). De même, des valeurs de CMI élevées ont été constatées par Halley et Blaszyk (1998) et Zarazaga et al. (1999) chez des lactobacilles. Tableau 10 : Concentrations minimales d’inhibition (µg/ml) des antibiotiques testés CMI tétracycline CMI érythromycine CMI amoxicilline CMI pénicilline G Pediococcus sp. MA1 Streptococcus thermophilus MA7 >8 15≤ >50 100≤ >2 5≤ <0,5 >5 8≤ >5 8≤ >5 8≤ <0,5 Enterococcus sp. GHB21 En. sp. GHB22 >5 8≤ >5 8≤ >100 150≤ >100 150≤ >5 8≤ >5 8≤ >2 5≤ >2 5≤ Enterococcus sp. CHM1 >8 15≤ >100 150≤ >5 8≤ >2 5≤ Enterococcus sp. LVK25 Lactococcus sp. GHB15 Lactococcus lactis ssp. lactis V17 Lactococcus lactis ssp. cremoris V18 Lactococcus lactis ssp. lactis V26-1 Lactobacillus helveticus G6 Lactobacillus sp. LVK32 >8 15≤ >5 8≤ >200 300≤ > 200 300≤ >200 300≤ >100 150≤ >50 ≤100 > 200 300≤ >150 200≤ > 150 200≤ > 150 200≤ >50 100≤ >5 8≤ >15 20≤ >200 300≤ >200 300≤ >200 300≤ > 200 300≤ >2 5≤ >2 5≤ >5 8≤ >5 8≤ >5 8≤ >200 300≤ >40 50≤ >5 8≤ <0,5 <0,5 Lactobacillus sp. V7 Lactobacillus sp. V16 Lactobacillus sp. CHM16 >100 150≤ >100 150≤ >50 100≤ >50 100≤ >200 300≤ >200 300≤ >50 100≤ >20 32≤ >200 300≤ >200 300≤ <0,5 Lactobacillus sp. CHM19 50> ≤100 20> 32≤ <0,5 <0,5 Souche Pediococcus Streptococcus Enterococcus Lactococcus Lactobacillus <0,5 64 Résultats et Discussion - CMI de l’amoxicilline : Seule la souche Lactococcus sp. GHB15 avait une résistance intermédiaire à l’amoxicilline (15 < CMI ≤ 20µg/ml). Pour le reste des souches, tous les lactocoques ainsi que Lactobacillus sp. V7 et V16 et Lactobacillus helveticus G6 ont résisté à des concentrations de cet antibiotique supérieures à 200µg/ml, alors que les autres lactobacilles, les entérocoques, les souches Pediococcus sp. MA1 et Streptococcus thermophilus étaient tous sensibles (CMI ≤ 8µg/ml). Il y a relativement très peu d’études qui ont porté sur la détermination des CMI de l’amoxicilline chez les bactéries lactiques. En effet, Halley et Blaszyk (1998) ont décrit des CMI ≤ 8µg/ml pour cet antibiotique contre des lactobacilles et des pédiocoques. - CMI de la tétracycline : Une variabilité de sensibilité a été observée pour cet antibiotique : bien que Streptococcus thermophilus MA7 s’est montrée sensible (5 < CMI ≤ 8µg/ml), Pediococcus sp. MA1 avait une résistance intermédiaire. Les entérocoques isolés du Ghars étaient sensibles à la tétracycline, tandis que ceux isolés des laits de vache et de chamelle avaient des résistances intermédiaires. Quant aux lactobacilles, ils ont été tous résistants à cet antibiotique (40 < CMI ≤ 150µg/ml) ; c’est le même cas pour les lactocoques isolés de la viande (200 < CMI ≤ 300 µg/ml) et cela contrairement à celui de la souche Lactococcus sp. GHB15 isolée du Ghars dont la CMI était ≤ 8µg/ml. Plusieurs auteurs ont obtenus des résultats similaires aux nôtres : • Chez des lactobacilles, Ziane (2008), Ouoba et al. (2008), Devirgiliis et al. (2008) et Toomey et al. (2010) ont trouvé des CMI (32, 80 et 256µg/ml) indiquant des résistances variables à la tétracycline. • Chez des lactocoques, des résistances à cet antibiotique (CMI > 32µg/ml) ont été enregistrées par Walther et al. (2008), de même que des sensibilités ont été notées par ces mêmes auteurs et par Toomey et al. (2010). • Chez des entérocoques, Valenzuela et al. (2009) ont constaté que des bactéries appartenant à ce genre ont moyennement résisté à la tétracycline (8 ≤ CMI ≤ 16µg/ml), tandis que les CMI observées par Toomey et al. (2010) étaient ≤ 2µg/ml. • chez Streptococcus thermophilus, D’Aimmo et al. (2007) ont rapporté des CMI de 0,5µg/ml. 65 Résultats et Discussion Au contraire, certaines de ces études ainsi que d’autres ont également montré la susceptibilité (0,125 ≤ CMI ≤ 8µg/ml) des pédiocoques (Walther et al., 2008 ; Toomey et al., 2010) et des lactobacilles (D’Aimmo et al., 2007 ; Ouoba et al., 2008 ; Devirgiliis et al., 2008 ; Toomey et al., 2010) à la tétracycline, ainsi que la résistance intermédiaires (CMI ≤ 16µg/ml) de ces derniers (Halley et Blaszyk, 1998). - CMI de l’érythromycine : La plupart des souches se sont révélées résistantes à l’érythromycine avec des CMI comprises entre 50 et plus de 200µg/ml. Au contraire, les souches Streptococcus thermophilus MA7 et Lactobacillus sp. LVK32 étaient sensibles à cet antibiotique, tandis que les deux lactobacilles isolés du lait de chamelle Lactobacillus sp. CHM16 et CHM19 ont présenté des résistances intermédiaires (20 < CMI ≤32 µg/ml). Les seuils de sensibilité de la plupart de nos souches s'avèrent supérieurs à ceux décrits dans la littérature pour l’érythromycine. Entre autres, divers travaux ont montré la sensibilité et/ou la résistance intermédiaire des pédiocoques avec des CMI ≤ 1µg/ml (Halley et Blaszyk, 1998 ; Rojo-Bezares et al., 2006 ; Toomey et al., 2010), des entérocoques avec des CMI ≤ 16µg/ml (Valenzuela et al., 2009 ; Toomey et al., 2010), des lactocoques avec des CMI avec des CMI ≤ 16µg/ml ( Walther et al., 2008) et des lactobacilles avec des CMI ≤ 8µg/ml (Halley et Blaszyk, 1998 ; Rojo-Bezares et al., 2006 ; D’Aimmo et al., 2007 ; Ouoba et al., 2008 ; Devirgiliis et al., 2008 ; Toomey et al., 2010). Cependant, D’Aimmo et al. (2007) et Ouoba et al. (2008) ont rapporté quelques résultats comparables aux nôtres pour des souches de Streptococcus thermophilus (CMI ≤ 0,5µg/ml) et des lactobacilles (CMI ≥ 32µg/ml), respectivement. D’après ces résultats, nous déduisons que l’érythromycine était la moins efficace sur les souches que nous avons testé, contrairement à la pénicilline G dont l’efficacité était aussi élevée que celle de l’amoxicilline (ces deux antibiotiques appartiennent à la même famille). 3.4. Détection des plasmides des bactéries lactiques : Nous avons adapté la méthode d’O’Sullivan et Klaenhammer (1993) pour rechercher la présence de plasmides susceptibles d’être porteurs de gènes de résistance à la tétracycline chez trois de nos souches Lactobacillus sp. V16, Lactococcus lactis ssp. lactis V17 et 66 Résultats et Discussion Lactococcus lactis ssp. cremoris V18 qui se sont montrées résistantes à des concentrations dépassant les 100 µg/ml g/ml de cet antibiotique. La souche souc Pediococcus sp. MA1, qui a été inhibée par des concentrations inférieures à 15 µg/ml, a été utilisée comme témoin. Les résultats obtenus indiquent la présence d’au moins une bande d’ADN plasmidique chez chacune des souches résistantes alors qu’aucune bande n’a été révélée chez la souche témoin (figure 11). Figure 11 : Profil électrophorétique de l’ADN plasmidique des souches étudiées (MT : marqueurs de taille en Kpb) 3.5. Purification de l’ADN plasmidique : L’ADN plasmidique de la souche Lactobacillus sp. V16 était récupéré du gel d’agarose par électroélution comme a été décrit en chapitre 2.7. Cet ADN (figure 12), nommé pLSV16, était, ensuite utilisé dans l’expérience d’électrotransformation afin de préciser préci son rôle dans la résistance de cette souche à la tétracycline. 67 Résultats et Discussion Figure 12 : ADN plasmidique de la souche Lactobacillus sp. V16 récupéré pour les expériences d’électroélution 3.6. Transformation de la souche Pediococcus sp. MA1 : Nous avons précédemment remarqué que les souches résistantes à la tétracycline Lactobacillus sp. V16, Lactococcus lactis ssp lactis V17 et Lactococcus lactis ssp cremoris V18 hébergent de l’ADN plasmidique, alors que la souche Pediococcus sp. MA1 ne semble pas en contenir (figure 11). Plusieurs auteurs ont démontré que des gènes de résistance à la tétracycline sont localisés sur des plasmides chez les bactéries lactiques, notamment les lactobacilles (Vescovo et al., 1982 ; Gevers et al.,, 2003 ; Danielsen, Dani 2002 ; Kastner et al., 2006 ; Huys et al., al. 2006 ; Ziane, 2008). Ainsi, dans le but de confirmer l’implication des plasmides dans la résistance bactérienne aux antibiotiques, nous avons tenté de transformer la souche Pediococcus sp. MA1 (souche réceptrice) trice) par de l’ADN plasmidique de la souche Lactobacillus sp. V16 (souche donneuse) qu’on a dénommé pLSV16. Ce plasmide était « introduit » dans la souche réceptrice par électrotransformation et la sélection des clones transformants était effectuée sur milieu MRS contenant 20 µg/ml de tétracycline. 68 Résultats et Discussion Aucun clone transformant n’a poussé dans ces conditions de sélection, après 7 jours d’incubation (tableau 11). Tableau 11 : Sélection des clones transformants Lactobacillus sp. V16 Pediococcus sp. MA1 pLSV16 / MA1 +TE Croissance après 24h d’incubation Absence de croissance même après 7 jours d’incubation Absence de croissance même après 7 jours d’incubation -TE Croissance après 24h d’incubation Croissance après 24h d’incubation Croissance après 24h d’incubation L’échec de l’électrotransformation peut être du à divers facteurs : - Comme le montre la figure 12, la bande correspondante à l’ADN pLSV16 est d’une faible intensité ce qui reflète que la quantité d’ADN pur récolté par électroélution et donc celle de l’ADN transformant n’était peut être pas suffisante pour « réussir » la transformation. Il a été rapporté que l’augmentation de la concentration d’ADN utilisé pour l’électrotransformation favorise les chances d’obtention de clones transformants et conduit à l’augmentation du nombre de ces derniers (Rixon et Warner, 2003 ; Rodriguez et al., 2007). Dans ce même contexte, Serror et al. (2002) ont indiqué que la quantité d’ADN requise pour que la transformation soit plus efficace est comprise entre 0,3 et 2µg. - Les paramètres électriques de l’électroporation n’étaient pas optimaux. En effet, Rodriguez et al. (2007) ont rapporté que la puissance du champ électrique a une influence positive sur la probabilité d’obtention de clones transformants. - La grande taille du plasmide. Certains auteurs ont décrit que la fréquence d’électrotransformation est inversement proportionnelle à la taille de l’ADN transformant (Gasson et Fitzgerald, 1994 ; Rixon et Warner, 2003 ; Beasley et al., 2004). - L’instabilité de ce plasmide provenant d’un lactobacille dans l’environnement « pédiocoque » : il se peut que, même si ce plasmide a pu pénétrer à l’intérieur des cellules réceptrices, il a été perdu par dilution aux cours des divisions cellulaires pendant la période d’incubation, ou encore a été dégradé par des enzymes de restriction de la cellule réceptrice. - Les gènes que porte ce plasmide n’ont pas pu s’exprimer chez un pédiocoque. - Ces gènes codent pour des fonctions autres que la résistance à la tétracycline. 69 Résultats et Discussion 3.7. Recherche d’activité bétalactamase : La résistance d’un grand nombre de nos souches à la plupart des bétalactamines testées (tableau 8) nous a suscité à rechercher la présence d’enzymes dégradant ces molécules, ou bétalactamases, chez quelques unes de ces souches. Bien que l’activité bétalactamase représente un sujet très abondant parmi les études portant sur l’antibiorésistance chez les bactéries à Gram négatif (Yong et al., 2002 ; Lee et al., 2005 ; Pieboji, 2007 ; Dias et al., 2008 ; Akujobi et al., 2008 ; Drissi, 2008 ; Faure, 2009), il n y a que très peu de travaux qui l’ont abordé chez les bactéries lactiques (Rojo-Bezares et al., 2006). De nombreux tests permettant de rechercher la présence des différents types de bétalactamases chez les bactéries résistantes sont décrits dans la littérature, parmi lesquels on cite le test iodométrique (Courvalin et al., 1985), le test de Hodge (Yong et al., 2002) et le test à l’EDTA (Jesudason et al., 2005). Dans notre étude, nous avons utilisé deux tests qui sont le test de synergie et le test 3D. Ces tests ont été détaillés dans le chapitre 2.9. Pour le premier test, l’image de synergie entre les deux disques d’AMC (Amoxicilline associée à l’acide clavulanique) et de CTX (céfotaxime) n’a été observée que chez les souches Lactococcus sp. GHB15 et Enterococcus sp. GHB21 (figure 13). Cela pourrait être traduit par le fait que ces souches sont productrices de bétalactamases à spectre élargi BLSE, bien que la production de ces enzymes ne soit rapportée, à notre connaissance, que chez des bactéries à Gram négatif (Garcia-Rodriguez et Jones, 2002 ; Poole, 2004). Dans le test 3D, aucune déformation de la zone d’inhibition autour du disque de céfoxitine (FOX) n’a été observée (figure 14), et cela pour toutes les souches testées. Ces souches ne produisent, donc, pas de céphalosporinases chromosomiques AmpC. Ce résultat concorde avec les données de la littérature qui indiquent l’absence de ces enzymes chez les bactéries à Gram positif (Goossens, 2001 ; Poole, 2004 ; Sundin 2009). 70 Résultats et Discussion GHB21 Figure 13 : Image de synergie entre AMC et CTX G6 V13-1 V3 V7 Figure 14 : Résultat du test 3D 71 Conclusion et Perspectives Les bactéries lactiques, comme toute autre bactérie, peuvent être naturellement résistantes à des antibiotiques ou acquérir cette résistance de leur environnement grâce aux transferts possibles de gènes codants ces traits - qui auront certainement des conséquences négatives sur l’état de santé de l’Homme - entre les différentes bactéries. La présence de tels gènes chez une bactérie lactique lui permet d’annuler l’effet des antibiotiques sur elle par différents mécanismes dont l’inactivation enzymatique de ces molécules et la modification de leurs cibles. Au cours de ce travail, nous avons étudié le comportement de 83 souches autochtones de bactéries lactiques vis-à-vis de 25 antibiotiques appartenant à 7 familles différentes. A l’exception de l’oxacilline, la ceftazidine et le céfixime auxquels toutes nos souches ont résisté et de l’imipéneme qui était efficace sur toutes ces souches, les réponses aux antibiotiques testés étaient variables selon les classes auxquelles appartiennent ces molécules et même à l'intérieur d'une même classe. Dans l'ensemble, nos souches ont présenté une résistance beaucoup plus élevée aux antibiotiques des familles des aminosides et des fluoroquinolones avec des pourcentages dépassant les 90% et cela par rapport à leur résistance aux rifamycines (71,08%), bétalactamines (65,25%), macrolides (57,82%) et nitrofuranes (59,03%) ; la résistance la moins élevée a été observée avec les antibiotiques de la famille des tétracyclines (31,32%). La variabilité de la sensibilité de nos souches semble dépendre également du genre auquel elles appartiennent et de leur origine. De plus, nous avons remarqué une fréquence élevée de multirésistance parmi les souches que nous avons étudiées. Ce screening a conduit à la détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) de divers antibiotiques (pénicilline G, amoxicilline, érythromycine et tétracycline) chez 16 de nos souches. Les valeurs de CMI estimées étaient de l'ordre de 0,5 à plus de 200µg/ml pour les deux bétalactamines et d’à peu près 8 à plus de 200µg/ml pour l'érythromycine et la tétracycline. La présence de plasmides - susceptibles d'être porteurs de gènes de résistance à la tétracycline - est montrée chez trois de nos souches résistantes à cet antibiotique avec des valeurs de CMI dépassant les 100 µg/ml (Lactobacillus sp. V16, Lactococcus lactis ssp. lactis V17 et Lactococcus lactis ssp. cremoris V18) : ces trois bactéries contiennent, chacune, au moins une bande d'ADN plasmidique. Après avoir tenté de transformer une souche dépourvue de plasmides avec l’un des plasmides de la souche Lactobacillus sp. V16 en vue d’affirmer 73 Conclusion et Perspectives son rôle dans la résistance de cette souche à la tétracycline, nous n’avons obtenu aucun clone transformant, ce qui ne nous a pas permis de confirmer notre hypothèse. Ce résultat mérite d’être confirmé par des expériences complémentaires. Les résultats du screening d’antibiorésistance chez nos souches montrent la résistance d’un grand nombre de nos souches à la plupart des bétalactamines testées. Cette observation nous a conduit à rechercher la présence d’enzymes dégradant ces molécules, ou bétalactamases, chez quelques unes de ces souches. Les tests réalisés pour cet objectif ont montré que les souches Lactococcus sp. GHB15 et Enterococcus sp. GHB21 produisent des BLSE mais qu’aucune de ces souches n'est productrice d'AmpC. Ces résultats suggèrent que les bactéries que nous avons étudiées sont des réservoirs de gènes de résistance à différents antibiotiques, cela doit amener à penser aux conséquences négatives que peut avoir la présence de telles bactéries dans les aliments car la possibilité de transferts géniques entre les bactéries est toujours probable. Comme nous n’avons pas réussi à confirmer l’implication des plasmides dans les résistances observées et à concrétiser le concept de la possibilité d’acquisition de tels traits par transfert horizontal de gènes, il serait très intéressant de continuer à travailler sous cette optique tout en essayant d’optimiser les protocoles expérimentaux et de mener des études plus approfondies telle est la recherche directe et la caractérisation des gènes de résistance chez nos bactéries. 74 Références bibliographiques Aarestrup, F. M. (1999). Association between the consumption of antimicrobial agents in animal husbandry and the occurrence of resistant bacteria among food animals. Int. J. Antimicrob. Agents. 12: 279-285. Afssa. (2006). Usages vétérinaires des antibiotiques, résistance bactérienne et conséquences pour la santé humaine. Rapport rédigé par l’agence française de sécurité sanitaire des aliments. Ahn, C., Collins-Thompson, D., Duncan, C. et Stiles, M. E. (1992). Mobilization and location of the genetic determinant of chloramphenicol resistance from Lactobacillus plantarum caTC2R. Plasmid. 27: 169-176. Akloul, K. (2008). Approche thérapeutique des affections respiratoires du mouton. 6ème journées des Sciences Vétérinaires, Ecole Nationale Vétérinaire d’El-Harrach, Alger, 19-20 avril 2008. Akujobi, C. O., Ogbulie, J. N. et Alisi, C. S. (2008). Occurrence of extended-spectrum betalactamases in Escherichia coli isolated from piggery farms in Imo State, Nigeria. World J. Microbiol. Biotechnol. 24: 2167-2170. Alebouyeh, M., Amirmozafari, N. et Forohesh, H. (2005). Evaluation of virulence factors and plasmid related transmissibility among different isolates of Enterococci. Ir. Biomed. J. 9 (2): 51-55. Ammor, M. S., Floréz, A. B. et Mayo, B. (2007). Antibiotic resistance in non-enterococcal lactic acid bacteria and bifidobacteria . Food Microbiol. 24: 559-570. ANMV. (2008). Rapport (du 22/02/08) sur le suivi des ventes de médicaments vétérinaires contenant des antibiotiques en France en 2006. Aslim, B. et Beyatli, Y. (2004). Antibiotic resistance and plasmid DNA contents of Streptococcus thermophilus strains isolated from Turkish yoghurts. Turk. J. Vet. Anim. Sci. 28: 257-263. Atlan D., Béal, C., Champomier-Vergès, M. C., Chapot-Chartier, M. P., Chouayekh, H., CocaignBousquet, M., Deghorain, M., Gaudu, P., Gilbert, C., Goffin, P., Guédon, E., Guillouard, I., Guzzo, J., Hols, P., Juillard, V., Ladero, V., Lindley, N., Lortal, S., Loubière, P., Maguin, E., Monnet, C., Monnet, V., Rul, F., Tourdot-Maréchal, R. et Yvon, M. (2008). Métabolisme et ingénierie métabolique. In bactéries lactiques: de la génétique aux ferments. pp. 271-511. ed. Corrieu G. et Luquet F. M., Tec & Doc, Paris. Axelsson, L. T. (2004). Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. In Lactic Acid Bacteria : Microbiological and Functional Aspects, 3rd Ed. pp. 1-66. ed. Salminen, S., Wright, A. et Ouwehand, A., Marcel Dekker Inc, New York. Badii, R., Jones S. et Warner P. J. (1989). Sphaeroplast and electroporation-mediated transformation of Lactobacillus plantarum. Lett. Appl. Microbiol. 9: 41-44. Beasley, S. S., Takala, T. M., Reunanen, J., Apajalahti, J. et Saris, P. E. J. (2004). Characterization and Electrotransformation of Lactobacillus crispatus Isolated from Chicken Crop and Intestine. Poultry Sci. 83: 45-48. 76 Références bibliographiques Belicova, A., Krizkova, L., Krajcovic, J., Jurkovic, D., Sojka, M., Ebringer, L. et Dusinsky, R. (2007). Antimicrobial susceptibility of Enterococcus species isolated from Slovak Bryndza cheese. Folia Microbiol. 52 (2): 115-119. Belkheir, K. (2004). Identification des souches de Lactobacillus isolées de lait de chamelle de Tindouf : étude de leur activité protéolytique. Mémoire d’ingéniorat d’état, Université d’Oran, Algérie. Benbernou, S. (2008). Effet inhibiteur des bactéries lactiques isolées de viandes bovines sur des germes indésirables. Mémoire de magister, école nationale vétérinaire, Alger, Algérie. Benmohand, C. et Benouaddah, A. (2008). Contribution à la recherche des résidus d'antibiotiques dans le muscle du bréchet du poulet de chair. 6ème journées des Sciences Vétérinaires, Ecole Nationale Vétérinaire d’El-Harrach, Alger, 19-20 avril 2008. Benmouna, Z. (2008). Bactériocines des coques lactiques isolées de “Ghars” de la région de Biskra. Mémoire d’ingéniorat d’état, Université d’Oran, Algérie. Bernardeau, M., Vernoux J. P., Henri-Dubernet, S. et Guéguen, M. (2008). Safety assessment of dairy microorganisms: The Lactobacillus genus. Int. J. Food Microbiol. 126: 278-285. Blomqvist, T., Steinmoen, H. et Havarstein, L. S. (2006). Natural genetic transformation: a novel tool for efficient genetic engineering of the dairy bacterium Streptococcus thermophilus. Appl. Environ. Microbiol. 72: 6751-6756. Bolotin, A., Mauger, S., Malarme, K., Ehrlich, S. D. et Sorokin, A. (1999). Low-redundancy sequencing of the entire Lactococcus lactis IL1403 genome. Ant. van Leew. 76: 27-76. Bouguedour, R. (2008). Legislation, enregistrement et procedures de controle des medicaments veterinaires au Maghreb. Conférence de l’OIE sur les médicaments vétérinaires en Afrique, Dakar, 2527 mars 2008. Bounoua, M. D. (2005). Isolement et préidentification de bactéries lactiques de différents laits de chamelles du sud Algérien. Mémoire d’ingéniorat d’état, Université d’Oran, Algérie. Bouziani, I. et Sebaha, F. Z. (2006). Isolement et Identification des bactéries lactiques à partir de Blé Fermenté : étude Technologique et extraction d’ADN plasmidique. Mémoire d’ingéniorat d’état, Université de Mostaganem, Algérie. Bradford, P. (2001). Extended-spectrum betalactamases in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin. Microbiol. Rev. 14: 933-951. Bryskier, A. (1999). Antibiotiques, agents antibactériens et antifongiques. Ellipses Marketing. 1216 p. Butaye, P., Damme, K. V., Devriese, L. A., Damme, L. V., Baele, M., Lauwers, S. et Haesebrouck, F. (2000). In vitro susceptibility of Enterococcus faecium isolated from food to growth-promoting and therapeutic antibiotics. Int. J. Food Microbiol. 54: 181-187. Caldwell, S. L., McMahon, D. J., Oberg, C. J. et Broadbent, J. R. (1996). Development and Characterization of Lactose-Positive Pediococcus Species for Milk Fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 62 (3): 936-941. 77 Références bibliographiques Cauwerts, K., Pasmans, F., Devriese, L. A., Martel, A., Haesebrouck, F. et Decostere, A. (2006). Cloacal Lactobacillus isolated from broilers show high prevalence of resistance towards macrolide and lincosamide antibiotics. Avian Pathol. 35 (2): 160-164. Cetinkaya, Y., Falk, P. et Mayhall, C. G. (2000). Vancomycin-resistant enterococci. Clin. Microbiol. Rev. 13: 686-707. Charpentier, E. et Novak, R. (2000). Mort bactérienne et antibiotiques de la famille des bétalactamines. Méd./sci. 16: 1125-7. Cheikh, O. A. M. (2008). Résistance et adaptation au sel chez des lactobacilles isolés de lait de chamelle de Mauritanie. Mémoire d’ingéniorat d’état, Université d’Oran, Algérie. Chen, Y., Succi, J., Tenover, F. C. et Koehler, T. M. (2003). betalactamases genes of the penicillin susceptible Bacillus anthracis Sterne strain. J. Bacteriol. 185: 823-830. Chopra, I. (2001). Glycylcyclines : third-generation tetracycline antibiotics. Curr. Opin. Pharmacol. 1: 464-469. Chopra, I. et Roberts, M. (2001). Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 232-260. Citak, S., Yucel, N. et Orhan, S. (2004). Antibiotic resistance and incidence of Enterococcus species in Turkish white cheese. Int. J. Dairy Technol. 57: 27. Clark, N., Olsvik, O., Swensen, J. M., Spiegel, C. A. et Tenover, F. C. (1999). Detection of a streptomycin adenyltransferase gene (aadA) in Enterococcus faecalis. Antimicrob. Agents Chemother. 43: 157-60. Clewell, D. B. (1993). Bacterial Sex Pheromone-Induced Plasmid Transfer. Cell. 73 (1): 9-12. Clewell, D. B. (2005). Antibiotic Resistance Plasmids in Bacteria. Encyclo. life sci., John Wiley and Sons, Ltd. Clewell, D. B., Yagi, Y., Dunny, G. M. et Schultz, S. K. (1974). Characterization of three plasmid deoxyribonucleic acid molecules in a strain of Streptococcus faecalis: identification of a plasmid determining erythromycin resistance. J. Bacteriol. 117: 283-289. Condon, S. (1983). Aerobic metabolism of lactic acid bacteria. Ir. J. Food Sci. Technol. 7: 15-25. Coppola, R., Succi, M., Tremonte, P., Reale, A., Salzano, G. et Sorrentino, E. (2005). Antibiotic susceptibility of Lactobacillus rhamnosus strains isolated from Parmigiano Reggiano cheese. Lait. 85: 193-204. Coudron, P. E., Moland, E. S. et Thomson, K. S. (2000). Occurrence and detection of AmpC betalactamases among Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Proteus mirabilis isolates at Veterans Medical Center. J. Clin. Microbiol. 38: 1791-1796. Courvalin, P., Goldstein, G., Philippon, A. et Sirot, J. (1985). Antibiogramme. MPC Ed. 225-235. Courvalin, P. (2008). La résistance des bactéries aux antibiotiques: combinaisons de mécanismes biochimiques et génétiques. Bull. Acad. Vét. (France), tome 161, n°1. 78 Références bibliographiques D'Aimmo, M. R., Modesto, M. et Biavati, B. (2007). Antibiotic resistance of lactic acid bacteria and Bifidobacterium isolated from dairy and pharmaceutical products. Int. J. Food Microbiol. 115: 35-42. Dalache, F., Kacem, M. et Karam, N. E. (2003). Antibioresistance of lactic acid bacteria isolated from cow’s, goat’s, sheep’s and camel’s raw milks of Algeria. Renc. Rech. Ruminants. 10: 231. Danielsen, M. (2002). Characterization of the tetracycline resistance plasmid pMD5057 from Lactobacillus plantarum 5057 reveals a composite structure. Plasmid. 48: 98-103. Danielsen, M. et Wind A. (2003). Susceptibility of Lactobacillus spp. to antimicrobial agents. Int. J. Food Microbiol. 82: 1-11. Davidson, B. E., Kordias, N., Dobos, M. et Hillier A. J. (1996). Genomic organization of lactic acid bacteria. Ant. van Leeuw. 70 (2-4): 161-183. Davies, J. (1994). Inactivation of antibiotics and the dissemination of resistance genes. Science. 264: 375382. Davies, J. (1997). Origins, acquisition and dissemination of antibiotic resistance determinants. In Antibiotic resistance: origins, evolution, selection and spread. pp. 15-27. ed. Chadwick, D. J. et Goode, J., Ciba Foundation Symposium, vol 207, Wiley, Chichester. Davies, R. et Roberts, T. A. (1999). Antimicrobial susceptibility of enterococci recovered from commercial swine carcasses: effect of feed additives. Lett. Appl. Microbiol. 29: 327-333. Davison, J. (1999). Genetic exchange between bacteria in the environment. Plasmid. 42: 73-91. De Fabrizio, S. V., Parada, J. L. et Ledford, R. A. (1994). Antibiotic resistance of Lactococcus lactis : an approach of genetic determinants location through a model system. Microbiol. Aliment. Nutr. 12: 307-315. Delgado, S. et Mayo, B. (2004). Phenotypic and genetic diversity of Lactococcus lactis and Enterococcus spp. strains isolated from Northern Spain starter-free farmhouse cheeses. Int. J. Food Microbiol . 90: 309-319. Delgado, S., Flórez, A. B. et Mayo, B. (2005). Antibiotic susceptibility of Lactobacillus and Bifidobacterium species from the human gastrointestinal tract. Curr. Microbiol. 50: 202-207. Dellaglio, F., Dicks, L.M.T. et Torriani, S. (1995). The genus Leuconostoc. In The Genera of Lactic Acid Bacteria. pp. 235-278. ed. Wood, B. J. B. et Holzapfel,W. H., Blackie Academic & Professional, London. Delorme, C. (2008). Safety assessment of dairy microorganisms: Streptococcus thermophilus. . Int. J. Food Microbiol. 126 : 274-277. De Man, J. C., Rogosa, M. E. et Sharpe, M. E. (1960). A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl. Bact. 23: 130-135. De Roissart, H. et Luquet, F. M. (1994). Bactéries lactiques, I et II. Lorica, France. Dessart, S. R. et Steenson, L. R. (1991). High frequency intergeneric and intrageneric transfer conjugal transfer of drug resistance plasmids in Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris. J. Dairy Sci. 74: 2912-2919. 79 Références bibliographiques Devirgiliis, C., Caravelli, A., Coppola, D., Barile, S. et Perozzi, G. (2008). Antibiotic resistance and microbial composition along the manufacturing process of Mozzarella di Bufala Campana. Int. J. Food Microbiol. 128: 378-384. Dhar, N. et McKinney, J. D. (2007). Microbial phenotypic heterogeneity and antibiotic tolerance. Curr. Op. Microbiol. 10: 30-38. Dias, R. C. S., Borges-Neto, A. A., Ferraiuoli, G. I. D., de-Oliveira, M. P., Riley, L. W. et Moreira, B. M. (2008). Prevalence of AmpC and other betalactamases in enterobacteria at a large urban university hospital in Brazil. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 60: 79-87. Doi, Y. et Paterson, D. L. (2007). Detection of plasmid-mediated class C betalactamases. Int.J. Infect. Dis.11: 191-197. Doucet-Populaire, F., Trieu-Cuot, P., Dosbaa, I., Andremont, A. et Courvalin, P. (1991). Inducible transfer of conjugative transposon Tn1545 from Enterococcus faecalis to Listeria monocytogenes in the digestive tract of gnotobiotic mice. Antimicrob Agents Chemother. 35: 185-187. Drissi, M. (2008). Etude de la résistance aux antibiotiques de Pseudomonas aeruginosa au niveau du C.H.U de Tlemcen. Mécanismes de résistance aux bétalactamines. Thèse de doctorat d’état, Université de Tlemcen, Algérie. Dyke, K. et Gregory, P. (1997). Resistance to betalactam antibiotics : resistance mediated by betalactamases. In The Staphylococci in Human Disease. pp. 139-157. ed. Crossley, K. B. et Archer, G. L., Churchill Livingstone, New York. Edgar, R. et Bibi, E. (1997). MdfA, an Escherichia coli multidrug resistance protein with an extraordinarily broad spectrum of drug recognition. J. Bacteriol. 179: 2274-2280. Elkins, C. A. et Mullis, L. B. (2004). Bile-mediated aminoglycoside sensibility in Lactobacillus species likely results from increased membrane permeability attributable to cholic acid. Appl. Environ. Microbiol.70: 7200-7209. El Zoeiby, A. et Sanschagrin, F. (2003). "Structure and function of the Mur enzymes: development of novel inhibitors". Mol. Microbiol. 47 (1): 1-12. Euzéby, P. (2007). Abrégé de Bactériologie Générale et Médicale. Récupéré de http://www.bacteriologie.net/generale/resistancenaturelle.html Faure, S. (2009). Transfert d’un gène de résistance aux bétalactamines blaCTX-M-9 entre Salmonella et les entérobactéries de la flore intestinale humaine : impact d’une antibiothérapie. Thèse de doctorat, Université de Rennes 1, France. Feld, L., Bielak, E., Hammer, K. et Wilcks, A. (2009). Characterization of a small erythromicin resistance plasmid pLFE1 from the food-isolate Lactobacillus plantarum M345. Plasmid. xx: xxx-xxx. Fitzgerald, G. F. et Gasson, M. J. (1988). In vivo gene transfer systems and transposons. Biochimie. 70: 489-502. Flórez, A. B., Delgado, S. et Mayo, B. (2005). Antimicrobial susceptibility of lactic acid bacteria isolated from a cheese environment. Can. J. Microbiol. 51: 51-58. 80 Références bibliographiques Flórez, A. B., Ammor, M. S. et Mayo, B. (2008). Identification of tet(M) in two Lactococcus lactis strains isolated from a Spanish traditional starter-free cheese made of raw milk and conjugative transfer of tetracycline resistance to lactococci and enterococci. Int. J. Food Microbiol. 121: 189-194. Franz, C. M., Muscholl-Silberhorn, A. B., Yousif, N. M., Vancanneyt, M., Swings, J. et Holzapfel, W. H. (2001). Incidence of virulence factors and antibiotic resistance among Enterococci isolated from food. Appl. Environ. Microbiol. 67: 4385-4389. Franz, C. M. A. P. et Holzapfel, W. H. (2004). The Genus Enterococcus: Biotechnological and Safety Issues. In Lactic Acid Bacteria : Microbiological and Functional Aspects, 3rd Ed. pp. 199-248. ed. Salminen, S., Wright, A. et Ouwehand, A., Marcel Dekker Inc, New York. Garcia-Rodriguez, J. A. et Jones, R. N. (2002). Antimicrobial resistance in Gram negative isolates from European intensive care units: data from the Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection (MYSTIC) programme. J. Chemother. 14: 25-32. Gasson, M. J. et Fitzgerald, G. F. (1994). Gene transfer systems and transposition. pp. 22. In Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. ed. Gasson, M. J. et de Vos, W. M., Blackie Academic & Professional, London. Gasson, M. J., Godon, J. J., Pillidge, C. J., Eaton, T. J., Jury, K. et Shearman, C. A. (1995). Characterization and exploitation of conjugation in Lactococcus lactis. Int. Dairy J. 5: 757-762. Gevers, D., Danielson, M., Huys, G. et Swings, J. (2003). Molecular characterization of tet (M) genes in Lactobacillus isolates from different types of fermented dry sausage. Appl. Environ. Microbiol. 69: 1270-1275. Gfeller, K. Y., Roth, M., Meile, L. et Teuber, M. (2003). Sequence and genetic organization of the 19.3kb erythromycin and dalfopristin resistance plasmid pLME300 from Lactobacillus fermentum ROT1. Plasmid. 50: 190-201. Goossens, H. (2001). MYSTIC program: summary of European data from 1997 to 2000. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 41: 183-189. Gupta, P. K. et Mittal, B. K. (1995). Antibiotic sensitivity pattern of various Lactobacilus acidophilus strains. Indian J. Exp. Biol. 33: 620-621. Hakenbeck, R., Grebe, T., Zahner, D. et Stock, J. B. (1999). betalactam resistance in Streptococcus pneumonia : penicillin-binding proteins and non-penicillin-binding proteins. Mol. Microbiol. 33: 673678. Halami, P. M., Chandrashekar, A. et Nand, K. (2000). Lactobacillus farciminis MD, a newer strain with potential for bacteriocin and antibiotic assay. Lett. Appl. Microbiol. 30: 197-202. Halley, R. A. et Blaszyk, M. (1998). Antibiotic challenge of meat starter cultures and effects upon fermentations. Food Res. Int. 30 (1): 513-522. Hamilton-Miller, J. M. T. et Shah S. (1998). Vancomycin susceptibility as an aid to the identification of lactobacilli. Lett. Appl. Microbiol. 26: 153-154. 81 Références bibliographiques Helmark, S., Hansen, M. E., Jelle, B., Sorensen, K. I. et Jensen, P. R. (2004). Transformation of Leuconostoc carnosum 4010 and evidence for natural competence of the organism. Appl. Environ. Microbiol. 70: 3695-3699. Herreros, M. A., Sandoval, H., González, L., Castro, J. M., Fresno, M. E. et Tornadijo, M. E. (2005). Antimicrobial activity and antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from Armada cheese (a spanish goat’s milk cheese). Food Microbiol. 22: 455-459. Hogg, S. (2005). Essential Microbiology. John Wiley and Sons editions. Holmes, D. S., et Quigley M. (1981). A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Anal. Biochem. 114: 193-197. Holo, H. et Nes I. F. (1989). High-frequency transformation, by electroporation, of Lactococcus lactis subs. Cremoris growing with glycine in osmotically stabilized medium. Appl. Environ. Microbiol. 55 (12): 3119-3123. Hols, P., Slos, P., Dutot, P., Reymond, J., Chabot, P., Belplace, B., Delcour, J. et Mercerier, A. (1997). Efficient secretion of the model antigen M6 GP 41E in Lactobacillus plantarum NCIMB 8826. Microbiology. 143: 2733-2741. Hummel, A., Holzapfel, W. H. et Franz, C. M. A. P. (2007). Characterisation and transfer of antibiotic resistance genes from enterococci isolated from food. Syst. Appl. Microbiol. 30: 1-7. Huys, G., D’Haene, K. et Swings, J. (2002). Influence of the culture medium on antibiotic susceptibility testing of food-associated lactic acid bacteria with the agar overlay disc diffusion method. Lett. Appl. Microbiol. 34: 402-406. Huys, G., D’Haene, K., Collard, J. M. et Swings, J. (2004). Prevalence and molecular characterization of tetracycline resistance in Enterococcus isolates from food. Appl. Environ. Microbiol. 70: 1555-1562. Huys, G., D’Haene, K. et Swings, J. (2006). Genetic basis of tetracycline and minocycline resistance in potentially probiotic Lactobacillus plantarum strain CCUG 43738. Antimicrob. Agents Chemother. 50: 1550-1551. Idoui, T. (2008). Les bactéries lactiques indigènes : isolement, identification et propriétés technologiques. Effet probiotiques chez le poulet de chair ISA15, le lapin de souche locale et le rat wistar. Thèse de doctorat d’état, Université d’Oran, Algérie. Igimi, S., Ryu, C. H., Park, S. H., Sasaki, Y., Sasaki, T. et Kumagai, S. (1996). Transfer of conjugative plasmid pAM-beta-1 from Lactococcus lactis to mouse intestinal bacteria. Lett. Appl. Microbiol. 23: 31-35. Jesudason, M. V., Kandathil, A. J. et Belaji, V. (2005). Comparison of two methods to detect carbapenemases and metallo-betalactamases production in clinical isolates. Indian J. Med. Res. 121: 780-783. Joset, F., Guespin-Michel, J. (1993). Prokaryotic genetics: génome organization, transfer and plasticity. Blackwell Pub, Williston, Vermont, USA. 82 Références bibliographiques Karam, N-E. (1995). Constitution d'un souchier de bactéries lactiques à intérêt biotechnologique : étude biochimique et moléculaire. Thèse de doctorat d’état, Université d'Oran, Algérie. Karam, N-E. et Karam H. (1994). Isolement et caractérisation de bactéries lactiques de laits crus d'Algérie. In Alimentation, Génétique et Santé de l'enfant. pp. 257-264. ed. Desjeux, J. F. et Touhami M., l'Harmattan. Kastner, S., Perreten, V., Bleuler, H., Hugenschmidt, G., Lacroix, C., et Meile, L. (2006). Antibiotic susceptibility patterns and resistance genes of starter cultures and probiotic bacteria used in food. Syst. Appl. Microbiol. 29: 145-155. Kim, K. S., Morrison, J. O. et Bayer, A. S. (1982). Deficient autolytic enzyme activity in antibiotictolerant lactobacilli. Infect. Immun. 36: 582-585. Klein, G., Pack, A. et Reuter, G. (1998). Antibiotic resistance patterns of enterococci and occurrence of vancomycin-resistant enterococci in raw minced beef and pork in Germany. Appl. Environ. Microbiol. 64: 1825-1830. Knudtson, L. M. et Hartman, P. A. (1993). Antibiotic resistance among enterococcal isoaltes from environmental and clinical sources. J. Food Protec. 56: 489-492. Lanka, E. et Wilkins, B. M. (1995). DNA processing reactions in bacterial conjugation. Annu. Rev. Biochem. 64: 141-169. Leclercq, R. et Courvalin, P. (1991). Bacterial resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin antibiotics by target modification. Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1267-1272. Lee, K., Hong, S. G., Park, Y. G., Lee, H. S., Song, W., Jeong, J., Yong, D. et Chong, Y. (2005). Evaluation of phenotypic screening methods for detecting plasmid-mediated AmpC betalactamases producing isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumonia. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 53: 319-323. Leroy F. et de Vuyst L. (2004). Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industrie. Trends Food Sci. Technol. 15: 67-78. Levy, S. B. (1992). The Antibiotic Paradox: How Miracle Drugs are Destroying the Miracle. Plenum Press, New York. Levy, S. B., Marshall, B. (2004). Antibacterial resistance world wide: causes, challenges and responses. Nat. Med. Rev. 10: S122-S129. Lopes, M. d. F. S., Ribeiro, T., Martins, M. P., Tenreiro, R. et Crespo, M. T. B. (2003). Gentamicin resistance in dairy and clinical enterococcal isolates and in reference strains. J. Antimicrob. Chemother. 52: 214-219. Luquet, F. M. (1994). Lait et produits laitiers. Tec & Doc, Lavoisier, Paris. Macrina, F. L., Kopecko, D. J., Jones, K. R., Ayers, D. J. et McCowen S. M. (1978). A multiple plasmid-containing Escherichia coli strain: convenient source of size reference plasmid molecules. Plasmid. 1: 417-420. Mahillon, J. et Chandler, M. (1998). Insertion séquences. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62: 725-774. 83 Références bibliographiques Maietti, L., Bonvini, B., Huys, G. et Giraffa, G. (2007). Incidence of antibiotic resistance and virulence determinants among Enterococcus italicus isolates from dairy products. Syst. Appl. Microbiol. 30: 509-517. Materon, I. C., Queenan, A. M., Koehler, T. M., Bush, K. et Palzkill, T. (2003). Biochemical characterization of betalactamases Bla1 and Bla2 from Bacillus anthracis. Antimicrob. Agents Chemother. 47: 2040-2042. Mathur, S. et Singh, R. (2005). Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria- a review. Int. J. Food Microbiol. 105: 281– 295. Mäyra-Mäkinen, A. et Bigret M. (2004). Industrial Use and Production of Lactic Acid Bacteria. In Lactic Acid Bacteria : Microbiological and Functional Aspects, 3rd Ed. pp. 175-198. ed. Salminen, S., Wright, A. et Ouwehand, A., Marcel Dekker Inc, New York. Mimoz. O. (2003). Impact des résistances bactériennes. Conférences d'actualisation, Elsevier SAS. p. 665672. Ming, L. J. et Epperson, J. D. (2002). Metal binding and structure-activity relationship of the metalloantibiotic peptide bacitracin. J. Inorg. Biochem. 91 (1): 46-58. Moland, E. S., Kim, S. Y., Hong, S. G. et Thomson, S. K. (2008). Newer betalactamases: Clinical and Laboratory Implications, part II. Clin. Microbiol. Newslett. 30 (11): xxx-xxx. Morelli, L., Sarra, P. G. et Bottazzi, V. (1988). In vivo transfer of pAM-beta-1 from Lactobacillus reuteri to Enterococcus faecalis. J. Appl. Bact. 65: 371-375. Morelli, L., Vogensen, F. K. et Wright, A. (2004). Genetics of Lactic Acid Bacteria. In Lactic Acid Bacteria : Microbiological and Functional Aspects, 3rd Ed. pp. 249-293. ed. Salminen, S., Wright, A. et Ouwehand, A., Marcel Dekker Inc, New York. Neve, H., Geis, A. et Teuber, M. (1984). Conjugal transfer and characterization of bacteriocin plasmids in group N (lactic acid) streptococci. J Bacteriol. 157 (3): 833-858. Nicklin, J., Graeme-Cook, K., Pafet, T. et Killington, R. (2000). L’essentiel en microbiologie. Berti editions. Nissen, H., Holck, A. et Dainty, R. H. (1994). Identification of Carnobacterium spp. and Leuconostoc spp. in meat by genus-specific 16S rRNA probes. Lett. Appl. Microbiol. 19: 165-168. Normark, B. H. et Normark, S. (2002). Evolution and spread of antibiotic resistance. J. Intern. Med. 252: 91-106. O’Connor, E. B., O’Sullivan, O., Stanton, C., Danielsen, M., Simpson, P. J., Callanan, M. J., Ross, R. P. et Hill, C. (2007). pEOC01: a plasmid from Pediococcus acidilactici which encodes an identical streptomycin resistance (aadE) gene to that found in Campylobacter jejuni. Plasmid. 58: 115-126. Ogawara, H. (1981). Antibiotic resistance in pathogenic and producing bacteria with special reference to betalactam antibiotics. Microbiol. Rev. 45 (4): 591-619. Ogier, J. C. et Serror, P. (2008). Safety assessment of dairy microorganisms: The Enterococcus genus. Int. J. Food Microbiol. 126: 291-301. 84 Références bibliographiques Ogier, J. C. Casalta, E., Farrokh, C. et Saïhi, A. (2008). Safety assessment of dairy microorganisms : The Leuconostoc genus. Int. J. Food Microbiol. 126 :286-290. Olukoya, D. K., Ebigwei, S. I., Adebawo, O. O. et Osiyemi, F. O. (1993). Plasmid profiles and antibiotic susceptibility patterns of Lactobacillus isolated from fermented foods in Nigeria. Food Microbiol. 10: 279-285. O’Sullivan D. J. et Klaenhammer, T. R. (1993). Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus ssp. Appl. Environ. Microbiol. 59 (8): 2730-2733. Ouoba, L. I. I., Lei, V., Jensen, L. B. (2008). Resistance of potential probiotic lactic acid bacteria and bifidobacteria of African and European origin to antimicrobials: Determination and transferability of the resistance genes to other bacteria. Int. J. Food Microbiol. 121: 217-224 Ouwehand, A. C., Salminen, S. et Isolauri, E. (2002). Probiotics: an overview of beneficial effects. Ant. van Leew. 82: 279-289. Paquet-Bouchard, C. (2006). Caractérisation moléculaire de la protéine antibiotique P1 du phage AP205. Maîtrise en microbiologie-immunologie, Université de Laval, Québec. Perreten, V., Schwarz, F., Cresta, L., Boeglin, M., Dasen, G., Teuber, M. (1997a). Antibiotic resistance spread in food. Nature. 389: 801-802. Perreten, V., Kolloffel, B. et Teuber, M. (1997b). Conjugal transfer of the Tn916-like transposon TnFO1 from Enterococcus faecalis isolated from cheese to other Gram-positive bacteria. System Appl. Microbiol. 20: 27-38. Perreten, V., Schwarz, F. V., Teuber, M. et Levy, S. B. (2001). Mdt(A), a new efflux protein conferring multiple antibiotic resistance in Lactococcus lactis and E. coli. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 1109-1114. Petersen, A. et Jensen, L. B. (2004). Analysis of gyrA and parC mutations in enterococci from environmental samples with reduced susceptibility to ciprofloxacin. FEMS Microbiol. Lett. 231: 7376. Philippon, A. (2006). Antibiotiques I. Cours de Bactériologie Générale. Faculté de Médecine COCHINPORT-ROYAL, Université PARIS V. Récupéré de : http://ufr2.free.fr/d1/10.antibiotiques1. pdf. Philippon, A. et Arlet, G. (2006). Bétalactamases de bacilles à Gram négatif : le mouvement perpétuel. Ann. Biol. Clin. 64 (1): 37-51. Phillips, I., Andrews, J. M., Bridson, E., Cooke, E. M., Spencer, R. C., Holt, H. A., Wise, R., Bint, A. J., Brown, D. F. J., Greenwood, D., King, A. et Williams, R. J. (1991). A Guide to Sensitivity Testing. Report of the Working Party on Antibiotic Sensitivity Testing of the British Society for Antimicrobial Chemotherapy. Pieboji, J. G. (2007). Caractérisation des bétalactamases et leur inhibition par les extraits de plantes médicinales. Thèse de doctorat, Université de Liège, Belgique. Ploy, M. C., Gassama, A., Chainier, D. et Denis, F. (2005). Les intégrons en tant que support génétique de résistance aux antibiotiques. Immun. Biol. spécial. 20: 343-352. 85 Références bibliographiques Podie-Magne N. K. (1999). Evaluation de la sensibilité aux antibiotiques des germes les plus fréquemment isolés au laboratoire de bactériologie du CNHU de Cotonou. Thèse de doctorat, Université du Mali. Poole, K. (2002). Mechanisms of bacterial biocide and antibiotic resistance. J. Appl.Microbiol. 92: 55S64S. Poole, K. (2004). Resistance to betalactam antibiotics. Cell. Mol. Life Sci. 61: 2200-2223. Pot, B. (2008). The taxonomy of lactic acid bacteria. In bactéries lactiques: de la génétique aux ferments. pp. 1-152. ed. Corrieu G. et Luquet F.M., Tec & Doc, Lavoisier, Paris. Prescott, L. M., Harley, J.P., Klein, D.A. (2004). Microbiology. McGraw-Hill Higher Education. Raha, A. R., Ross, E., Yusoff, K., Manap, M. Y. et Ideris, A. (2002). Characterisation and molecular cloning of an erythromycin resistance plasmid of Lactococcus lactis isolated from chicken cecum. J. Biochem. Mol. Biol. Biophys. 6: 7-11. Renault, P. (2008). Génétique des bactéries lactiques. In bactéries lactiques : de la génétique aux ferments. pp. 153-269. ed. Corrieu G. et Luquet F.M., Tec & Doc, Lavoisier, Paris. Rixon, J. E. et Warner, P. J. (2003). Introduction: Background, Relevant Genetic Techniques and Terms. In Lactic acid bacteria: Genetics of Lactic Acid Bacteria. pp. 1-24. ed. Wood, B. J. B. et Warner,P. J., vol 3, Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. Roberts, M. C., Sutcliffe, J., Courvalin, P., Jensen, L. B., Rood, J. et Seppala, H. (1999). Nomenclature for macrolide and macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance determinants. Antimicrob. Agents Chemother. 43: 2823-2830. Rodriguez, C., Alegre, T. et Mesas, J. M. (2007). Optimization of technical conditions for the transformation of Pediococcus acidilactici P60 by électroporation. Plasmid. 58 (1): 44-50. Rojo-Bezares, B., Sáenz, Y., Poeta, P., Zarazaga, M., Ruiz-Larrea, R. et Torres, C. (2006). Assessment of antibiotic susceptibility within lactic acid bacteria strains isolated from wine. Int. J.Food Microbiol. 111: 234-240. Russell, A.D. (2002). Antibiotic and biocide resistance in bacteria: Introduction. J. Appl. Microbiol. 92: 1S–3S. Sambrook, J. et Russel, D.W.(2001). Molecular cloning : a Laboratory Manual. CSHL PRESS, vol 1. Savard, P. Y. (2008). Caractérisation structurale et dynamique de la bétalactamase TEM-1 de la bactérie Escherichia coli par RMN liquide. Thèse de Doctorat, Université de Laval, Québec. Schleifer, K. H. et Ludwig. W. (1995). Phylogeny of the genus Lactobacillus and related genera. System. Appl. Microbial. 18: 461- 467. Schmitz, F. J., Sadurski, R., Kray, A., Boos, M., Geisel, R., Kohrer, K., Verhoef, J. et Fluit, A. C. (2000). Prevalence of macrolide resistance genes in Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium isolates from 24 European University hospitals. J. Antimicrob. Chemother. 45: 891-894. Schnellmann, C., Gerber, V., Rossano, A., Jaquier, V., Panchaud, Y., Doherr, M. G., Thomann, A., Straub, R. et Perreten, V. (2006). Presence of new mecA and mph(C) variants conferring antibiotic 86 Références bibliographiques resistance in Staphylococcus spp. isolated from the skin of horses before and after clinic admission. J. Clin. Microbiol. 44: 4444-4454. Schwarz, F. V., Perreten, V. et Teuber, M. (2001). Sequence of the 50-kb conjugative multiresistance plasmid pRE25 from Enterococcus faecalis RE25. Plasmid. 46: 170–187. Scott, K. P. (2002). The role of conjugative transposons in spreading antibiotic resistance between bacteria that inhabit the gastrointestinal tract. Cell. Mol. Life. Sci. 59: 2071–2082. Serror, P., Sasaki, T., Elilich, D. et Magin, E. (2002). Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus and Lactobacillus delbrueckii subsp lactis with various plasmids. Appl. Environ. Microbiol. 68 (1): 46-52. Shaw, K. J., Rather P. N., Hare R. S. et Miller G. H. (1993). Molecular genetics of aminoglycoside résistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes. Microbiol. Rev. 57: 138-63. Simpson, W. J., Hammond, J. R. M. et Miller, R. B. (1988). Avoparcin and vancomycin - useful antibiotics for the isolation of brewery lactic acid bacteria. J. Appl. Bact. 64: 299-309. Slover, C. M., Danziger, L. (2008). Lactobacillus: a Review. Clin. Microbiol. Newslett. 30 (4): 23-27. Smith, M. C. et Murray, B. E. (1992). Comparison of enterococcal and staphylococcal betalactamase encoding fragments. Antimicrob. Agents Chemother. 36: 273-276. Stiles, M. E., Holzapfel, W. H. (1997). Lactic acid bacteria of foods and their current taxonomy. Int. J. Food Microbiol. 36: 1-29. Sundin, D. R. (2009). Hidden Betalactamases in the Enterobacteriaceae: dropping the Extra Disks for Detection, part II. Clin. Microbiol. Newslett. 31 (7): xxx-xxx. Swenson, J. M., Facklam, R. R. et Thornsberry, C. (1990). Antimicrobial susceptibility of vancomycinresistant Leuconostoc, Pediococcus and Lactobacillus species. Antimicrob. Agents Chemother. 34: 543-549. Tarzaali, D., Dechicha, A., Gharbi, S., Bouaissa, M. K., Yamnaine, N. et Guetarni, D. (2008). Recherche des résidus des tétracyclines et des bétalactamines dans le lait cru par le MRL Test (ROSA TEST). 6ème journées des Sciences Vétérinaires, Ecole Nationale Vétérinaire d’El-Harrach, Alger, 1920 avril 2008. Temmerman, R., Pot, B., Huys, G. et Swings, J. (2002). Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products. Int. J. Food Microbiol. 81: 1-10. Tenover, F. C. (2006). Mechanisms of Antimicrobial Resistance in Bacteria. Amerian J. Med. 119 (6A): S3-S10. Teuber, M., Meile, L. et Schwarz, F. (1999). Acquired antibiotic resistance in lactic acid bacteria from food. Ant. van Leew. 76: 115-137. Teuber, M. (2001). Veterinary use and antibiotic resistance. Curr. Op. Microbiol. 4: 493-499. 87 Références bibliographiques Toomey, N., Bolton, D. et Fanning, S. (2010). Characterisation and transferability of antibiotic resistance genes from lactic acid bacteria isolated from Irish pork and beef abattoirs. Res. Microbiol. 161: 127135. Tremblay, S. (2007). Etude moléculaire du recrutement des gènes de résistance aux antibiotiques. Mémoire de maître es sciences (M.Se.), Université de Laval, Québec. Tsuda, H. et Yamashita, Y. (2002). Genes involved in bacitracin resistance in Streptococcus mutans. Antimicrob. Agents Chemother. 46 (12): 3756-64. Valenzuela, A. S., ben Omar, N., Abriouel, H., López, R. L., Veljovic, K., Cañamero, M. M., Topisirovic, M. K. L. et Gálvez, A. (2009). Virulence factors, antibiotic resistance, and bacteriocins in enterococci from artisan foods of animal origin. Food Contr. 20: 381-385. van Veen, H. W., Putman, M., Margolles, A., Sakamoto, K. et Konings, W. N. (1999). Structurefunction analysis of multidrug transporters in Lactococcus lactis. Biochim. Biophys. Acta. 1461: 201206. Vescovo, M., Morelli, L. et Bottazzi, V. (1982). Drug resistance plasmids in Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus reuteri. Appl. Environ. Microbiol. 43: 50-56. Walsh, C. (2000). Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature. 406 (6797): 775-81. Walsh, C. (2003). Natural and produced immunity versus acquired resistance. In Antibiotics: actions, origins, resistance. pp. 91-106. ed. ASM Press, Washington. Walther, C. et Perreten, V. (2007). Methicillin-resistant Staphylococcus epidermidis in organic milk production. J. Dairy Sci. 90: 5351. Walther, C., Rossano, A., Thomann, A. et Perreten, V. (2008). Antibiotic resistance in Lactococcus species from bovine milk: Presence of a mutated multidrug transporter mdt(A) gene in susceptible Lactococcus garvieae strains. Vet. Microbiol. 131: 348-357. Walther-Rasmussen, J. et Hoiby, N. (2002). Plasmid-born AmpC betalactamases. Can. J. Microbiol. 48: 479-493. Wegener, H.C. (2003). Antibiotics in animal feed and their role in resistance development. Curr. Opin. Microbiol. 6: 439-445. Wessels, S., Axelsson, L., Bech Hansen, E., De Vuyst, L., Laulund, S., Lahteenmaki, L., Lindgren, S., Mollet, B., Salminen, S. et Wright, A. (2004). The lactic acid bacteria, the food chain, and their regulation. Trends Food Sci. Technol. 15: 498-505. Witte, W. (1997). Impact of antibiotic use in animal feeding on resistance of bacterial pathogens in humans. In Antibiotic resistance: origins, evolution, selection and spread. pp. 61-75. ed. Chadwick, D. J. et Goode, J., Ciba Foundation Symposium, vol 207, Wiley, Chichester. Witte, W. (2000). Ecological impact of antibiotic use in animals on different complex microflora : environment. Int. J. Antimicrob. Agents. 14: 321-325. Woese, C. R. (1987). Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51: 221-271. 88 Références bibliographiques Wright, G. D. (2003). Mechanisms of resistance to antibiotics. Cur. Op. Chem. Biol. 7: 563-569. Yala M., Mered, A. S., Mohamdi, D. et Ouar Korich, M. N. (2001). Classification et modes d’action des antibiotiques. Méd. Maghreb. 91: 13-14. Yong, D., Park, R., Yum, J. H., Lee, K., Choi, E. C. et Chong, Y. (2002). Further modification of the Hodge test to screen AmpC betalactamase (CMY-1)-producing strains of Escherichia coli and Klebsiella pneumonia. J.Microbiol. Methods. 51: 407-410. Zarazaga, M., Sáenz, Y., Portillo, A., Tenorio, C., Ruiz-Larrea, F., Del Campo, R., Baquero, F. et Torres, C. (1999). In vitro activities of ketolide HMR3647, macrolides, and other antibiotics against Lactobacillus, Leuconostoc, and Pediococcus isolates. Antimicrob. Agents Chemother. 43: 3039-3041. Zeghilet, N. (2009). Optimisation des paramètres de détection et de quantification des résidus d’antibiotiques dans la viande blanche par chromatographie liquide haute performance (HPLC). Mémoire de magister, Université de Constantine, Algérie. Ziane, M. (2008). Antibiorésistance et transferts horizontaux de plasmides chez les bactéries lactiques indigènes. Mémoire de magister, Université d’Oran, Algérie. Zomahoun, C.I.N.P. (2005). Evaluation de la sensibilité aux antibiotiques des bactéries isolées des infections urinaires au laboratoire de bactériologie du centre national hospitalier universitaire-Hubert Koutoukou Maga (C.N.H.U.H.K.M.). Thèse de doctorat d’état, Université du Mali. 89 Annexe Annexe : Principales classes d’antibiotiques et leurs spectres d’activité (Zomahoun, 2005 ; Euzéby, 2007) Familles ou molécules non classées (Modes d'action) Acide fusidique (Inhibition de la synthèse Principaux groupes ou molécules Spectre Étroit (coques et bacilles à Acide fusidique des protéines) Gram positif, coques à Gram négatif) Aminosides ou Amikacine, Apramycine, aminoglycosides Gentamicine, Kanamycine, Large (sauf bactéries (Inhibition de la synthèse Néomycine, Streptomycine, anaérobies). des protéines) Tobramycine Groupe de la pénicilline G : Pénicilline G, Pénicilline V Pénicillines antistaphylococciques : Oxacilline, Cloxacilline, Dicloxacilline, Méticilline Aminopénicillines : Amoxicilline, Ampicilline, Epicilline Bétalactamines (Inhibition de la synthèse du peptidoglycane) Étroit (coques et bacilles à Gram positif, coques à Gram négatif) Étroit (identique à celui de la pénicilline G). Large Carboxypénicillines : Carbénicilline, Carfécilline, Large Ticarcilline Uréido-pénicillines : Azlocilline, Mezlocilline, Pipéracilline Carbapenems : Imipéneme Large Large Oxapenams : Acide clavulanique Inhibiteurs de (associé à l’amoxicilline ou à la ticarcilline), Tazobactam (associé à la bétalactamases utilisés en pipéracilline), Sulbactam ( associé à association avec une autre l’ampicilline). bétalactamine). 91 Annexe Annexe (suite 1) : Principales classes d’antibiotiques et leurs spectres d’activité (Zomahoun, 2005 ; Euzéby, 2007) Familles ou molécules non classées (Modes d'action) Principaux groupes ou molécules Monobactams : Aztréonam Spectre Étroit (bacilles à Gram négatif) Céphalosporines de 1ère génération : Céfazoline, Céfalexine, Large Céfaloridine, Céfalotine Céphalosporines de 2ème Bétalactamines (Inhibition de la synthèse du peptidoglycane) génération : Céfoxitine, Large Céfamandole, Céfotétan, Céfuroxime Céphalosporines de 3ème génération : Céfotaxime, Ceftazidime, Ceftizoxime, Large Ceftriaxone Autres céphalosporines : Céfixime, Céfalonium, Céfopérazone, Large Cefsulodine, Cefquinome Diaminopyrimidines Baquiloprim, Triméthoprime Large Fosfomycine Large (Blocage de la synthèse de l'acide folique) Fosfomycine (Inhibition de la synthèse du peptidoglycane) Glycopeptides (Inhibition de la synthèse du peptidoglycane) Teicoplanine, Vancomycine Étroit (bactéries à Gram positif) 92 Annexe Annexe (suite 2) : Principales classes d’antibiotiques et leurs spectres d’activité (Zomahoun, 2005 ; Euzéby, 2007) Familles ou molécules non classées (Modes d'action) Polypeptides Principaux groupes ou molécules Polymyxine B, Colistine (Action sur la membrane Spectre Étroit (bacilles à Gram négatif) externe et/ou sur la membrane cytoplasmique Bacitracine, Gramicidine, Tyrocidine des bactéries) Étroit (bactéries à Gram positif) Quinolones de première génération : Acide nalidixique, Étroit (bacilles à Gram Quinolones et Acide oxolinique, Acide négatif) Fluoroquinolones pipémidique, Fluméquine (Inhibition de la synthèse Fluoroquinolones : Norfloxacine, de l'ADN) Ofloxacine, Ciprofloxacine, Énoxacine, Difloxacine, Large Enrofloxacine, Sulfamides Sulfadiazine, Sulfadimérazine, (Blocage de la synthèse de Sulfadiméthoxine, Sulfadoxine, l'acide folique) Large Sulfaméthoxazole Streptogramines ou synergistines Pristinamycine, Virginiamycine, (Inhibition de la synthèse Synercid des protéines) Étroit (coques et bacilles à Gram positif, coques à Gram négatif) Tétracyclines Tétracycline, Chlortétracycline, (Inhibition de la synthèse Oxytétracycline, Doxycycline, des protéines) Lymécycline, Minocycline Rifamycines (Ansamycines) (Blocage de la synthèse des ARN-messagers) Rifamycine SV, Rifaximine Étroit Rifampicine Large Large 93 Annexe Annexe (suite 3) : Principales classes d’antibiotiques et leurs spectres d’activité (Zomahoun, 2005 ; Euzéby, 2007) Familles ou molécules non classées (Modes d'action) Imidazolés Principaux groupes ou molécules (Coupure des brins d'ADN Métronidazole, Ornidazole et déroulement de l'ADN) Clindamycine, Lincomycine des protéines) Macrolides (Inhibition de la synthèse des protéines) Nitrofuranes (Inhibition de la synthèse de l'ADN) strictes) Gram positif, coques à Gram négatif) Érythromycine, Spiramycine, Azithromycine, Clarithromycine, Josamycine, Midécamycine, Roxithromycine, Tylosine Nitrofurantoïne, Nitrofurazone, Furazolidone, Nifuroxazide Étroit (coques et bacilles à Gram positif, coques à Gram négatif) Large Étroit (coques et bacilles à Novobiocine (Inhibition de la Étroit (bactéries anaérobies Étroit (coques et bacilles à Lincosamides (Inhibition de la synthèse Spectre Novobiocine réplication de l'ADN) Gram positif, coques à Gram négatif) Oxazolidinones (Inhibition de la synthèse des protéines) Phénicolés (Inhibition de la synthèse des protéines) Linezolid Chloramphénicol, Florfénicol, Thiamphénicol Large Large 94 Résumé Dans le but d’étudier le phénomène d’antibiorésistance chez des bactéries lactiques autochtones, 83 souches ont été affrontées à 25 antibiotiques de 7 familles différentes puis les concentrations minimales inhibitrices (CMI) de 4 de ces molécules ont été mesurées chez 16 de ces souches. L’activité bétalactamase et la présence de plasmides susceptibles de porter des gènes de résistance à la tétracycline ont été recherchées chez les souches résistantes à un grand nombre de bétalactamines et à la tétracycline, respectivement. Les résultats obtenus ont montré que ces souches ont des profils d’antibiorésistance variés qui dépendent principalement des genres auxquels elles appartiennent et de leurs origines, et qu’un grand nombre d’entres elles présentent des multirésistances ; certaines de ces souches sont également productrices de bétalactamases. Par ailleurs, les valeurs de CMI estimées étaient de l'ordre de 0,5 à plus de 200µg/ml pour deux bétalactamines (pénicilline G, amoxicilline) et d’à peu près 8 à plus de 200µg/ml pour l'érythromycine et la tétracycline. Parmi les souches résistantes à ce dernier antibiotique, trois hébergent également des plasmides susceptibles d’être porteurs de gènes de résistance à cette molécule. Mots clés : antibiorésistance, bactéries lactiques, antibiotiques, CMI, bétalactamases, plasmides, tétracycline. Abstract In order to study the phenomenon of antibiotic resistance in indigenous lactic acid bacteria, 83 strains were tested against 25 antibiotics of 7 different antibiotic families’, then minimal inhibitory concentrations (MIC) of 4 of these molecules were measured for 16 of these strains. The betalactamase activity and the presence of plasmids carrying tetracycline resistance genes were investigated in some strains that were resistant to many betalactams and to tetracycline, respectively. The results showed that these strains had different antibiotic resistance profiles relaying primarily on genus to which they belong and on their origins, and that many of them exhibit multidrug resistance ; some of these strains are also producers of betalactamases. In addition, estimated MIC values were in the range of 0.5 to 200µg/ml for two betalactams (penicillin G, amoxicillin) and about 8 to more than 200µg/ml for erythromycin and tetracycline. Among strains resistant to the last antibiotic, three host also plasmids that may carry tetracycline resistance genes. Key words : antibiotic resistance, lactic acid bacteria, antibiotics, MIC, betalactamases, plasmids, tetracycline. ملخص مضاد حيوي ينتمون لسبعة25 ساللة ضد83 تم تجريب،من أجل دراسة ظاھرة مقاومة بكتيريا اللبن للمضادات الحيوية تم، بعد ذلك. من ھذه السالالت16 ( لأربعة من ھذه الجزيئات عندCMI) عائالت مختلفة ثم تم قياس التركيزات األدنى المثبطة وذلك عندtétracycline و عن وجود البالزميدات التی قد تكون حاملة لجينات مقاومةbetalactamaseالبحث عن النشاط . على التوالي، tétracycline ولbétalactamines بعض السالالت التي أظھرت مقاومتھا للكثير من النتائج المحصل عليھا بينت بأن أنماط مقاومة ھذه السالالت للمضادات الحيوية كانت متنوعة وذلك أساسا حسب الأجناس التي .betalactamases و بأن كثيرا منھا أظھرت مقاومات متعددة ؛ بعض ھذه السالالت ھي أيضا منتجة ل،تنتمي إليھا وأصولھا pénicilline G ) bétalactamines بالنسبة إلثنين من200µg\ml إلى0،5 في نطاقCMI قدرت قيم، باإلضافة إلى ذلك من بين السالالت المقاومة.tétracycline وérythromycine ل200µg\ml إلى أكثر من8 ( وحواليamoxicilline, .tétracycline ثالثة تملك بالزميدات قد تكون حاملة لجينات مقاومة،للمضاد الحيوي األخير ، بالزميدات، betalactamases، CMI، مضادات حيوية، بكتيريا اللبن، مقاومة المضادات الحيوية: الكلمات المفاتيح .tetracyclin