1
2
A Monsieur le Docteur Axel CLOECKAERT, et Monsieur le Docteur Pascal SANDERS,
Qui ont accepté d’être rapporteurs de cette thèse.
Qu’ils trouvent ici le témoignage de notre respectueuse gratitude.
A Monsieur le Professeur Antoine ANDREMONT, et Madame le Professeur Christine
ROQUES,
Qui nous ont fait l’honneur d’accepter de faire partie de notre jury de thèse.
Qu’ils soient remerciés pour le temps consacré à lire et à juger ce travail.
A Monsieur le Docteur Alain BOUSQUET-MELOU, et Monsieur le Professeur Pierre-Louis
TOUTAIN,
Qui m’ont accueillie comme doctorant, m’ont aidée et sans cesse guidée tout au long de ces
années de thèse avec rigueur et optimisme.
Qu’ils soient assurés de ma sincère reconnaissance.
A Monsieur le Docteur Hubert BRUGERE,
Qui m’a guidée et patiemment conseillée.
Qu’il soit assuré de tout mon respect et de toute ma reconnaissance.
A tous les membres de l’équipe « Antibiothérapie et Antibiorésistance » de l’UMR181 qui ont
contribué à la réalisation de ce travail : Madame Nathalie ARPAILLANGE, Madame le
Docteur Véronique DUPOUY, Monsieur le Docteur Jean-Pierre FERRE, et Madame Sylvie
PUEL.
Sincères remerciements.
A Madame le Docteur Marie-Françoise PRERE,
Qui nous a apporté une aide indispensable dans nos travaux.
Sincères remerciements.
A toute l’équipe zootechnique de l’UMR181 : Monsieur Sylvain BRUYAS, Monsieur Jean
DENJEAN, Monsieur Jean-Pierre GAU, Monsieur Joseph MALIGOY, Monsieur Patrice
ROUBY, Monsieur René SCHAN,
Un grand merci pour leur soutien sans faille lors des phases animales.
3
4
A toute l’équipe des thésards, Julie ANTIC, Séverine COLLET (la relève est assurée !), Aude
FERRAN (un grand merci pour toutes tes corrections éclairées...), Elizabeth JEUNESSE,
Anne-Sylvie KESTEMAN, Julien LEGHAIT (compagnon de la première et de la dernière
heure...)
A tous les membres de l’UMR181, pour leur aide, leur soutien, leur bonne humeur et leurs
encouragements, sans oublier Minet et Minette....
Un grand merci.
A tous ceux qui me sont proches et chers,
Alexis,
mes parents,
mon frère et ma sœur,
mes tantes et mon oncle,
ma grand-mère,
pour leur amour et leur soutien toujours renouvelé.
5
6
AVANT-PROPOS
Ces travaux de thèse ont fait l’objet, à l’heure actuelle, des publications et des
communications suivantes :
Articles
Bibbal, D., Dupouy, V., Ferre, J.P., Toutain, P.L., Fayet, O., Prere, M.F., Bousquet-Melou, A.
Impact of three ampicillin dosage regimens on selection of ampicillin resistance in
Enterobacteriaceae and excretion of blaTEM genes in swine feces
Appl Environ Microbiol, Aug 2007, 73 (15) : 4785-4790
Bibbal, D., Dupouy, V., Prere, M.F., Toutain, P.L., Bousquet-Melou, A.
Relatedness of Escherichia coli strains with different susceptibility phenotypes
isolated from swine feces during ampicillin treatment
Appl Environ Microbiol, May 2009, 75 (10) : 2999-3006
Communications orales
Bibbal, D., Fajadet, D., Dupouy, V., Bousquet-Melou, A., Toutain, P.L., Fayet, O., Prere, M.F.
Evolution de la résistance aux antibiotiques des E. coli de la flore fécale au cours d'un
traitement à l'ampicilline chez des porcelets
In: Réunion Interdisciplinaire de Chimiothérapie Anti-Infectieuse, Paris, 2005
Bibbal, D., Bousquet-Melou, A., Dupouy, V., Prere, M.F., Fayet, O., Ferre, J.P., Toutain, P.L.
Impact of ampicillin administration on excretion of blaTEM genes in swine feces
In: 10th International Congress of the European Association for Veterinary Pharmacology and
Toxicology, Turin, 2006
Bibbal, D., Dupouy, V., Prere, M.F., Toutain, P.L., Bousquet-Melou, A.,
Relatedness of ampicillin resistant Escherichia coli strains isolated from pigs during
ampicillin treatment
In: Fourth International Conference on Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine, Prague,
2008
7
Posters
Bibbal, D., Bousquet-Melou, A., Dupouy, V., Ferre, J.P., Laroute, V., Toutain, P.L.
Impact of ampicillin administration on blaTEM genes excretion in swine stool
In: Third International Conference on Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine, Orlando,
2006
Dupouy, V., Bibbal, D., Bousquet-Melou, A., Prere, M.F., Fayet, O., Toutain, P.L.
Quantification of blaTEM genes in swine stool by real-time PCR
In: Third International Conference on Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine, Orlando,
2006
8
TABLE DES MATIERES
AVANT-PROPOS ................................................................................................................................. 7
TABLE DES ILLUSTRATIONS....................................................................................................... 11
LISTE DES ABREVIATIONS........................................................................................................... 13
INTRODUCTION ............................................................................................................................... 17
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................................................... 23
CHAPITRE 1 : PRESENTATION DES BETA-LACTAMINES ET UTILISATION CHEZ LE
PORC.................................................................................................................................................... 23
11- LES DIFFERENTES FAMILLES DE BETA-LACTAMINES ET LES MECANISMES DE RESISTANCE
MOLECULAIRE ................................................................................................................................... 23
111- Présentation générale des bêta-lactamines.......................................................................... 23
112- Les différentes familles de bêta-lactamines.......................................................................... 25
113- Résistance aux bêta-lactamines par production de bêta-lactamases ................................... 27
12-UTILISATION DES BETA-LACTAMINES CHEZ LE PORC .................................................................. 32
121- Utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire ......................................................... 32
122- Utilisation des bêta-lactamines en élevage porcin............................................................... 34
CHAPITRE 2 - IMPACT DE L’ADMINISTRATION DES BETA-LACTAMINES SUR LA
FLORE DIGESTIVE ET STRATEGIES DE PREVENTION ....................................................... 41
21- ECOSYSTEME INTESTINAL ET ANTIBIOTHERAPIE ........................................................................ 41
211- Description de la flore commensale digestive...................................................................... 41
212- Impact de l’antibiothérapie sur la flore digestive ................................................................ 42
213- Mesure du niveau de résistance de la flore digestive........................................................... 45
22- ANTIBIOTHERAPIE ET RESISTANCE DES ENTEROBACTERIES DANS L’ESPECE PORCINE............... 48
221- Etudes descriptives de la résistance des entérobactéries de la flore digestive .................... 48
222- Analyse de l’impact de l’usage des antibiotiques sur le niveau de résistance de la flore
digestive ........................................................................................................................................ 50
223- Facteurs autres que l’antibiothérapie gouvernant le niveau de résistance des bactéries de la
flore digestive ............................................................................................................................... 51
224- Dynamique populationnelle des souches d’E. coli résistantes de la flore commensale...... 52
23- IMPACT DES BETA-LACTAMINES SUR L’ECOSYSTEME INTESTINAL ET ACTIVITE BETALACTAMASE FECALE ......................................................................................................................... 53
231- Etude chez le porc ................................................................................................................ 53
232- Etude chez l’homme ............................................................................................................. 53
24- STRATEGIES THERAPEUTIQUES DE PREVENTION DE L’EMERGENCE DE RESISTANCE DANS LA
FLORE DIGESTIVE LORS D’ADMINISTRATION DE BETA-LACTAMINES................................................ 54
241- Optimisation de schémas thérapeutiques visant à limiter l’exposition de la flore digestive à
l’antibiotique ................................................................................................................................ 54
242- Destruction enzymatique des résidus d’antibiotiques dans le tube digestif ......................... 55
ETUDE EXPERIMENTALE............................................................................................................. 61
OBJECTIFS......................................................................................................................................... 61
CHAPITRE 3 : EVALUATION DE L’IMPACT DE TROIS MODALITES
D’ADMINISTRATION DE L’AMPICILLINE SUR LE NIVEAU DE RESISTANCE DE LA
FLORE DIGESTIVE DU PORC ET ETUDE DE LA DYNAMIQUE DE L’EMERGENCE DE
LA RESISTANCE............................................................................................................................... 65
31- INTRODUCTION ........................................................................................................................... 65
32- ETUDE DE LA BIODISPONIBILITE DE L’AMPICILLINE PAR VOIE ORALE CHEZ LE PORC ................ 67
321- Problématique ...................................................................................................................... 67
322- Objectif ................................................................................................................................. 67
9
323- Matériels et méthodes........................................................................................................... 67
324- Résultats ............................................................................................................................... 69
325- Discussion ............................................................................................................................ 70
33- IMPACT DE TROIS MODALITES D’ADMINISTRATION DE L’AMPICILLINE SUR LE NIVEAU DE
RESISTANCE DES ENTEROBACTERIES DIGESTIVES DU PORC .............................................................. 73
331- Problématique ...................................................................................................................... 73
332- Objectif ................................................................................................................................. 73
333- Etude de l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur l’excrétion
d’entérobactéries résistantes et de gènes blaTEM dans les fèces de porc ...................................... 74
334- Etude pharmacocinétique des trois modalités d’administration de l’ampicilline................ 79
335- Discussion générale ............................................................................................................. 81
ARTICLE 1 ........................................................................................................................................ 85
34- ETUDE DE LA PARENTE PAR ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE DES SOUCHES D’E. COLI
ISOLEES DE FECES DE PORC DURANT L’ADMINISTRATION D’AMPICILLINE ....................................... 93
341- Problématique ...................................................................................................................... 93
342- Objectif ................................................................................................................................. 93
343- Matériels et méthodes........................................................................................................... 93
344- Résultats présentés dans l’article 2...................................................................................... 94
345- Résultats complémentaires : profils de résistance et pulsotypes des souches provenant des
animaux témoins ......................................................................................................................... 100
346- Discussion générale ........................................................................................................... 102
ARTICLE 2 ...................................................................................................................................... 107
CHAPITRE 4 : STRATEGIE THERAPEUTIQUE DESTINEE A PREVENIR
L’EMERGENCE DE BACTERIES DIGESTIVES RESISTANTES LORS
D’ADMINISTRATION DE BETA-LACTAMINES : ETUDES PRELIMINAIRES................. 119
41- INTRODUCTION ......................................................................................................................... 119
42- ETUDE COMPAREE DES BIODISPONIBILITES ABSOLUES DE LA PIVAMPICILLINE ET DE
L’AMPICILLINE PAR VOIE ORALE CHEZ LE PORC ............................................................................. 121
421- Problématique .................................................................................................................... 121
422- Objectif ............................................................................................................................... 121
423- Matériels et méthodes......................................................................................................... 121
424- Résultats ............................................................................................................................. 123
425- Résultat complémentaire: biodisponibilité absolue de l’amoxicilline par voie orale chez le
porc à jeun .................................................................................................................................. 124
426- Discussion .......................................................................................................................... 125
43- ETUDE DE L’ABSORPTION DE CAFEINE ENROBEE AVEC L’EUDRAGIT® FS30D CHEZ LE PORC 127
431- Problématique .................................................................................................................... 127
432- Objectif ............................................................................................................................... 127
433- Matériels et méthodes......................................................................................................... 128
434- Résultats ............................................................................................................................. 129
435- Discussion .......................................................................................................................... 131
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES .......................................................................................... 135
REFERENCES .................................................................................................................................. 143
TITRE ET RESUME EN ANGLAIS .............................................................................................. 151
10
TABLE DES ILLUSTRATIONS
Tableaux
Tableau 1 : Mécanismes de résistance pour chaque famille de bêta-lactamine ....................... 24
Tableau 2 : Antibiotiques représentatifs de chaque famille de bêta-lactamine........................ 25
Tableau 3 : Classification des bêta-lactamases selon Ambler et Bush-Jacoby-Meideros........ 30
Tableau 4 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (1) ............................................ 36
Tableau 5 : Paramètres pharmacocinétiques de l’amoxicilline (1) .......................................... 37
Tableau 6 : Pourcentage de résistance des souches d’E. coli isolées de porcs à l’abattoir ...... 49
Tableau 7 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (2) ............................................ 70
Tableau 8 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (3) ............................................ 80
Tableau 9 : Pourcentage de souches d’E. coli résistantes ........................................................ 95
Tableau 10 : Pourcentages des phénotypes résistants à l’ampicilline...................................... 96
Tableau 11 : Principaux phénotypes résistants à l’ampicilline et pulsotypes associés ............ 99
Tableau 12 : Pourcentage de pulsotypes associés à chaque profil de résistance...................... 99
Tableau 13 : Distribution des gènes de résistance.................................................................. 100
Tableau 14 : Principaux profils de résistance et pulsotypes associés .................................... 101
Tableau 15 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (4) ........................................ 124
Tableau 16 : Paramètres pharmacocinétiques de l’amoxicilline (2) ...................................... 125
Tableau 17 : Paramètres pharmacocinétiques de la caféine................................................... 130
Figures
Figure 1 : Relations entre l’administration d’antibiotique par voie orale et l’exposition des
flores bactériennes chez l’animal. .................................................................................... 17
Figure 2 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (1) ....................................................... 69
Figure 3 : Pourcentages d’entérobactéries et de souches d’E. coli résistantes......................... 76
Figure 4 : Nombre de copies de gènes blaTEM/g de fèces......................................................... 77
Figure 5 : Comparaison entre le log du nombre de copies de gènes blaTEM/g de fèces et le log
des dénombrements d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline/g de fèces .................. 77
Figure 6 : Distribution des CMI des souches d’E. coli aux jours 0, 1, 4 et 7........................... 78
Figure 7 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (2) ....................................................... 80
Figure 8 : Pourcentage des groupes phylogénétiques .............................................................. 96
Figure 9 : Dendrogramme et profil des pulsotypes .................................................................. 97
Figure 10 : Distribution des pulsotypes (1).............................................................................. 98
Figure 11 : Distribution des pulsotypes (2)............................................................................ 102
Figure 12 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (3) ................................................... 123
Figure 13 : pH des contenus digestifs de porc ....................................................................... 129
Figure 14 : Concentrations plasmatiques de caféine.............................................................. 130
11
12
LISTE DES ABREVIATIONS
AFSSA
AUC
AUMC
BLSE
Cmax
CcrA
Cl
CLSI
CMI
CMY
CTX-M
DGAL
E. coli
ENVT
EDTA
EFSA
EUCAST
F
Frelative
FEC
HPLC
INRA
IRT
KPC
L1
λz
MIR
OXA
PC1
PCR
PLP
PSE
SME
SHV
t1/2
TEM
Tmax
UMR
UV
Vss
Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments
Aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps
Aire sous la courbe du premier moment statistique
Bêta-lactamase à Spectre Elargi
Concentration plasmatique maximale
Bêta-lactamase, « cefotaxin and carbapenem resistant »
Clairance plasmatique
« Clinical and Laboratory Standards Institute »
Concentration Minimale Inhibitrice
Bêta-lactamase, « active on cephamycins »
Bêta-lactamase, « active on cefotaxime, first isolated at Munich »
Direction Générale de l’ALimentation
Escherichia coli
Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse
Acide éthylène-diamine-tétraacétique
« European Food Safety Authority »
« EUropean Comitee on Antimicrobial Susceptibility Testing »
Biodisponibilité absolue
Biodisponibilité relative
Bêta-lactamase, « fecal Escherichia coli »
Chromatographie en phase liquide à haute performance
Institut National de la Recherche Agronomique
Bêta-lactamase, « inhibitor resistant TEM beta-lactamase »
Bêta-lactamase, « Klebsiella pneumoniae carbapenemase »
Bêta-lactamase, « labile enzyme from Stenotrophomonas maltophilia »
Pente de la phase terminale
Bêta-lactamase, « discovered at Miriam Hospital »
Bêta-lactamase, « active on oxacillin »
Bêta-lactamase, « from Staphylococcus aureus strain PC1 »
« Polymerase Chain Reaction »
Protéines de Liaison à la Pénicilline
Bêta-lactamase, « Pseudomonas-specific enzyme »
Bêta-lactamase, « Serratia marcescens enzyme »
Bêta-lactamase, « sulfhydryl reagent variable »
Temps de demi-vie
Bêta-lactamase, d’après le nom du patient Temoneira chez qui elle a été
identifiée pour la première fois
Temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale
Unité Mixte de Recherche
Ultraviolet
Volume de distribution à l’équilibre
13
14
INTRODUCTION
15
16
Introduction
INTRODUCTION
Les travaux de recherche présentés dans ce document ont été réalisés dans
l’UMR181 de Physiopathologie et Toxicologie Expérimentales INRA, ENVT, située à l’Ecole
Nationale Vétérinaire de Toulouse. Au sein de l’UMR181, l’équipe «Antibiothérapie et
Antibiorésistance », animée par le Docteur A. Bousquet-Mélou étudie la problématique de
l’antibiorésistance chez les animaux à deux niveaux :
- l’émergence de résistance chez les pathogènes cibles d’une antibiothérapie, dont les
enjeux concernent la santé animale, et
- l’émergence de résistance dans la flore commensale digestive, avec ses conséquences
potentielles en santé humaine via la contamination de la chaîne alimentaire et/ou
l’environnement. Les enjeux touchent ici à la santé publique et à la sécurité sanitaire des
aliments.
La figure 1 illustre les enjeux liés au contrôle simultané de la résistance au niveau
d’un foyer infectieux et de la flore commensale digestive. Mon travail de thèse s’est intégré
dans la thématique de recherche relative à la résistance des bactéries de la flore
commensale digestive, sous la direction du Docteur A. Bousquet-Mélou et du Professeur P.L. Toutain.
Tube digestif
AB: Voie orale
Proximal
Biodisponibilité
incomplète
Distal
• Pathogènes zoonotiques resistants
(salmonelles, campylobacters spp)
• Flore commensale (gènes de résistance)
Contact
Chaîne alimentaire
Environnement
Sang
Biophase
Pathogène d'intérêt vétérinaire
SANTE ANIMALE
Pathogènes zoonotiques
Flux de gènes
Résistance
Echecs
thérapeutiques
HOMME
SANTE PUBLIQUE
Figure 1 : Relations entre l’administration d’antibiotique par voie orale et l’exposition
des flores bactériennes chez l’animal.
Le développement de la résistance aux antibiotiques au niveau des flores cibles (foyers
infectieux) et non cibles (flore commensale digestive) aura un impact sur la santé animale et
la santé publique. L’antibiotique administré par voie orale est partiellement absorbé au
niveau du tube digestif proximal, et la fraction non absorbée exerce une pression de
sélection importante sur les bactéries de l’écosystème du tube digestif distal.
17
Introduction
Il est actuellement reconnu que l’usage des antibiotiques en production animale
exerce une pression de sélection qui favorise l’émergence et la diffusion de bactéries
résistantes. Cette pression de sélection peut s’exercer au niveau de la flore bactérienne
commensale des animaux, en particulier celle du tube digestif (127). Au niveau du tube
digestif des animaux, cette pression de sélection peut contribuer à la sélection de bactéries
zoonotiques résistantes (Salmonella, Campylobacter, E. coli), pathogènes chez l’homme, et
à la sélection de bactéries commensales résistantes. L’ensemble de ces bactéries
commensales résistantes constitue alors un réservoir de gènes de résistance pouvant être
transférés à des bactéries zoonotiques. De plus, lorsque ces bactéries digestives résistantes
d’origine animale sont transmises à l’homme, elles peuvent également transférer leurs gènes
de résistance à des bactéries de la flore commensale du tube digestif de l’homme (107,
115). La flore digestive commensale de l’homme constitue alors elle-même un réservoir de
gènes de résistance, potentiellement transférables à des bactéries pathogènes.
Compte-tenu des conséquences réelles et potentielles pour la santé publique, il nous
a paru pertinent de s’intéresser à la caractérisation de la résistance aux antibiotiques
des bactéries du tube digestif des animaux domestiques, et à la compréhension des
mécanismes de l’émergence de résistance lors d’administration d’antibiotiques chez
les animaux. Parallèlement, le développement de stratégies thérapeutiques visant à
diminuer l’excrétion par les animaux de bactéries porteuses de gènes de résistance au
cours d’un traitement antibiotique constitue un véritable enjeu pour la médecine vétérinaire.
Les bêta-lactamines représentent la classe thérapeutique la plus utilisée en
médecine humaine. Cette classe thérapeutique regroupe de nombreuses molécules qui
possèdent toutes un noyau bêta-lactame, associé à des cycles et des chaînes latérales
variables, qui expliquent les propriétés pharmacocinétiques et le spectre d’activité des
différentes molécules. Le noyau bêta-lactame est la cible des bêta-lactamases qui
l’hydrolysent, et qui rendent l’antibiotique inactif. Les bêta-lactamases représentent le
principal mécanisme de résistance aux bêta-lactamines chez les entérobactéries (84).
Les bêta-lactamines sont également largement utilisées en médecine vétérinaire, et
les bêta-lactamases identifiées chez les entérobactéries d’origine animale sont identiques à
celles identifiées chez les entérobactéries d’origine humaine (81). L’usage des antibiotiques
a été particulièrement critiqué dans la filière porcine car cette filière consomme une grande
quantité d’antibiotiques, et principalement par voie orale. En 2006, 51% des antibiotiques
vendus en médecine vétérinaire ont été vendus dans la filière porcine (3).
18
Introduction
C’est dans ce contexte que nous avons choisi de travailler sur un modèle porcin.
Dans une première partie du travail de thèse (chapitre 3), nous avons étudié l’impact sur la
flore intestinale de l’administration d’ampicilline chez le porc, en nous intéressant plus
particulièrement à l’émergence de souches d’entérobactéries résistantes, et à leur
caractérisation phénotypique et génotypique. Dans une deuxième partie (chapitre 4), nous
avons utilisé le modèle porcin pour évaluer les bases d’une stratégie thérapeutique destinée
à diminuer l’impact de l’antibiothérapie sur la flore commensale.
19
20
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre 1 : Présentation des bêta-lactamines et
utilisation chez le porc
21
22
Etude bibliographique - chapitre 1
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre 1 : Présentation des bêta-lactamines et
utilisation chez le porc
11- Les différentes familles de bêta-lactamines et les
mécanismes de résistance moléculaire
111- Présentation générale des bêta-lactamines
L’ensemble des bêta-lactamines forme une large classe d’antibiotiques qui comprend
les dérivés de la pénicilline, les céphalosporines, les monobactames, les carbapénèmes et
les inhibiteurs de bêta-lactamase. Ces molécules contiennent toutes un noyau bêta-lactame
dans leur structure moléculaire, et ce noyau bêta-lactame confère à la molécule son activité
antibiotique.
(a) Mode d’action des bêta-lactamines
Les bêta-lactamines inhibent la synthèse de la paroi bactérienne. Les cibles des bêtalactamines sont les PLP (protéines de liaison à la pénicilline). Les PLP interviennent dans la
synthèse et le remodelage du peptidoglycane, constituant principal de la paroi bactérienne
(129). Les bêta-lactamines possèdent un effet bactéricide (76).
Les bêta-lactamines sont des antibiotiques temps-dépendant avec un effet post antibiotique
court (bactéries à Gram positif) voire inexistant (bactéries à Gram négatif). Le but d’un
schéma thérapeutique est de maximiser le temps d’exposition des bactéries pathogènes à
l’antibiotique (87).
(b) Développement de bêta-lactamines en réponse à l’émergence de
résistance
Avant l’utilisation des bêta-lactamines en médecine, certaines bactéries produisaient
déjà des bêta-lactamases. Ces bêta-lactamases avaient peut être un rôle mineur dans le
métabolisme de la paroi de la cellule, ou devaient protéger les bactéries contre les bêtalactamines produites par les champignons dans l’environnement. Quelque soit leur fonction,
c’est l’utilisation humaine des antibiotiques qui a favorisé l’émergence des bactéries
porteuses de bêta-lactamases (83). Au fur et à mesure que la résistance s’est étendue, les
23
Etude bibliographique - chapitre 1
chimistes des laboratoires pharmaceutiques ont répondu en développant des composés
avec une stabilité accrue aux bêta-lactamases, et des agents protecteurs pour inhiber ces
bêta-lactamases (111). Ces nouvelles bêta-lactamines ont à leur tour sélectionné des
nouvelles formes de résistance. Le tableau 1 illustre le développement de nouvelles classes
de bêta-lactamines en réponse à l’émergence de nouveaux mécanismes de résistance.
La course engagée entre apparition de résistance et mise au point de nouvelles
molécules est inégale. La découverte de nouveaux antibiotiques ne suit pas le rythme
d’émergence et de diffusion des résistances bactériennes (94). Dans ce contexte, il apparaît
crucial de ralentir l’émergence et la dissémination de ces résistances afin de conserver le
plus longtemps possible l’utilité thérapeutique des bêta-lactamines existantes.
Tableau 1 : Mécanismes de résistance pour chaque famille de bêta-lactamine
qui ont poussé à développer de nouvelle familles (adapté à partir de (51)).
Famille de bêtalactamines
Mécanismes responsables de résistance
benzylpénicillines
pénicillinases staphylococciques
isoxazolyl-pénicillines
modification des PLP
amino-pénicillines
TEM-1 et SHV-1 chez les entérobactéries
PSE-1 chez Pseudomonas aeruginosa
uréido-pénicillines
Idem amino-pénicillines
céphalosporines de
première génération
TEM-1
hyperproduction de céphalosporinases de classe C
céphalosporines de
deuxième génération
hyperproduction de bêta-lactamase de classe A par Klebsiella oxytoca
hyperproduction de bêta-lactamases TEM et SHV par les
entérobactéries
hyperproduction de bêta-lactamases de classe C
céphalosporines de
troisième génération
BLSE (bêta-lactamase à spectre élargi)
hyperproduction de bêta-lactamase de classe A par Klebsiella oxytoca
hyperproduction de bêta-lactamases de classe C
céphalosporines de
quatrième génération
BLSE
hyperproduction spécifique de SHV-5
hyperproduction de bêta-lactamases de classe C
monobactames
BLSE
bêta-lactamases de classe A de Klebsiella oxytoca
bêta-lactamases de classe C
carbapénèmes
métallo-bêta-lactamases
24
Etude bibliographique - chapitre 1
112- Les différentes familles de bêta-lactamines
Les
bêta-lactamines
sont
classées
dans
quatre
familles :
pénicillines,
céphalosporines, monobactames et carbapénèmes (20). Le tableau 2 indique les
antibiotiques représentatifs pour chaque famille.
Tableau 2 : Antibiotiques représentatifs de chaque famille de bêta-lactamine
Famille de bêtalactamines
Antibiotiques représentatifs
Pénicillines
benzyl-pénicillines
benzylpénicilline
isoxazolyl-pénicillines
méticilline, oxacilline, cloxacilline
amino-pénicillines
ampicilline, pivampicilline, amoxicilline, épicilline
uréido-pénicillines
azlocilline, mézlocilline, pipéracilline
carboxy-pénicillines
carbenicilline, ticarcilline
amidino-pénicillines
mécillinam, pivmécillinam
Céphalosporines
première génération
céfalexine, céfatrizine, céfalotine, céfazoline
deuxième génération
céfoxitine, céfamandole, céfotétan, céfuroxime
troisième génération
céfotaxime, céfopérazone, ceftazidime, ceftriaxone, céfixime
quatrième génération
céfépime, cefpirome
Monobactames
aztreonam
Carbapénèmes
ertapénem, imipénem, méropénem
Inhibiteurs de bêtalactamases
acide clavulanique, sulbactam, tazobactam
(a) Pénicillines
La benzylpénicilline a été la première pénicilline utilisée. Cette bêta-lactamine et ses
dérivés (pénicilline du groupe G) possèdent un spectre antibactérien qui couvre les cocci à
Gram positif et négatif et les bacilles à Gram positif. L’apparition de souches de
Staphylococcus aureus productrices de pénicillinases a nécessité la synthèse de molécules
stables à l’hydrolyse par cette enzyme.
Les isoxazolyl-pénicillines (pénicilline du groupe M) possèdent des modifications
structurales qui permettent une augmentation de la stabilité à l’hydrolyse par les
pénicillinases mais qui entraînent souvent une diminution de l’activité antibactérienne.
25
Etude bibliographique - chapitre 1
Les amino-pénicillines (pénicilline du groupe A) possèdent une activité sur les
bacilles à Gram négatif. L’ampicilline et l’amoxicilline appartiennent à ce groupe.
L’amoxicilline ne diffère de l’ampicilline que par un groupement hydroxyle qui lui confère une
meilleure biodisponibilité par voie orale que l’ampicilline. La pivampicilline fait partie d’un
groupe d’ester de l’ampicilline qui libère l’ampicilline suite à l’action des estérases digestives
extra- et intracellulaires. Ces prodrogues ont été développées pour améliorer la
biodisponibilité de l’ampicilline par voie orale (53).
Les uréido-pénicillines et les carboxy-pénicillines possèdent un spectre élargi à
certains bacilles à Gram-négatif. Elles sont actives sur Pseudomonas aeruginosa et sur
certaines souches productrices de céphalosporinases. Elles sont réservées à la médecine
humaine.
Les amidino-pénicillines présentent un spectre limité aux bacilles à Gram négatif.
(b) Céphalosporines
Ces bêta-lactamines sont toutes à large spectre et leur intérêt réside surtout dans
leur activité sur les bacilles à Gram négatif. Les céphalosporines sont traditionnellement
divisées en quatre générations sur la base de leur spectre antibactérien, et surtout de leur
comportement vis-à-vis des céphalosporinases.
Les céphalosporines de première génération possèdent un spectre qui couvre les
cocci à Gram positif ainsi que quelques bactéries à Gram négatif. Ce sont les moins stables
vis-à-vis de l’hydrolyse par les bêta-lactamases.
Les céphalosporines de deuxième génération possèdent une activité accrue
contre les bactéries à Gram négatif. Elles sont stables à l’hydrolyse par les bêta-lactamases
d’origine plasmidique (non BLSE), mais pas à l’hydrolyse par les céphalosporinases d’origine
chromosomique AmpC.
Les céphalosporines de troisième génération possèdent une couverture plus large
contre les bactéries à Gram négatif mais parfois au dépend d’une bonne couverture contre
les cocci à Gram positif. De plus, leur stabilité en présence de bêta-lactamase d’origine
chromosomique AmpC est nettement supérieure à celles des céphalosporines de première
et deuxième générations. La découverte des BLSE (Bêta-lactamase à Spectre Elargi) en
1983 marquera le début d’une nouvelle ère dans l’histoire de la résistance de la résistance
aux bêta-lactamines (75). Ces enzymes sont capables d’hydrolyser les céphalosporines de
troisième génération et les monobactames (24).
Les céphalosporines de quatrième génération possèdent une stabilité accrue
contre certains types de bêta-lactamases produites par Pseudomonas aeruginosa et d’autres
bactéries entériques.
26
Etude bibliographique - chapitre 1
(c) Monobactames
Cette classe de bêta-lactamine ne contient qu’un seul agent antibiotique :
l’aztréonam. Son spectre couvre uniquement les bacilles à Gram négatif, y compris
Pseudomonas aeruginosa. Il n’est pas utilisé en médecine vétérinaire.
(d) Carbapénèmes
Ces bêta-lactamines ont le spectre antibactérien le plus large et sont stables à la
plupart des bêta-lactamases. Elles sont réservées à la médecine humaine.
(e) Inhibiteurs de bêta-lactamases
Ce sont des inhibiteurs suicides de bêta-lactamases qui associés avec une bêtalactamine lui permettent de conserver son activité vis à vis des souches productrices de
bêta-lactamases. Ils inhibent la majorité des bêta-lactamases excepté les céphalosporinases
et les métallo-bêta-lactamases. Ces molécules inhibitrices possèdent par ailleurs une activité
antibactérienne, mais à des concentrations trop élevées, et non compatibles avec un usage
thérapeutique.
113- Résistance aux bêta-lactamines par production de bêtalactamases
(a) Mécanismes moléculaires de résistance aux bêta-lactamines
Les bactéries ont développé différents mécanismes pour contrecarrer l’action des
bêta-lactamines (109) :
* Production de bêta-lactamases :
Les bêta-lactamases sont des enzymes bactériennes qui hydrolysent le noyau bêtalactame et qui rendent l’antibiotique inactif avant qu’il n’atteigne sa cible : les « protéines de
liaison à la pénicilline » (PLP). La parenté structurale que les bêta-lactamases partagent
avec les PLP leur permet de lier, acétyler et hydrolyser donc inactiver les bêta-lactamines
(89). Les bêta-lactamases sont exportées dans le milieu extracellulaire (bactéries à Gram
positif telles que Staphylococcus aureus) ou périplasmiques (bactéries à Gram négatif). Plus
de 500 bêta-lactamases ont été répertoriées (11). La destruction des bêta-lactamines par les
bêta-lactamases est le mécanisme de résistance majeur des bactéries à Gram négatif.
27
Etude bibliographique - chapitre 1
* Modification des « protéines de liaison à la pénicilline » (PLP) :
Ces PLP modifiées présentent une affinité plus faible pour les bêta-lactamines. Elles
sont relativement résistantes à l’inactivation par les pénicillines et sont capables de remplir
les fonctions des PLP lorsque ces dernières sont inactivées. Ce mécanisme de résistance
est majeur pour les bactéries pathogènes telles que Staphylococcus aureus, Streptococcus
pneumoniae et les entérocoques (140).
* Diminution de la perméabilité de la membrane externe :
Chez les bactéries à Gram négatif, la perte ou la diminution de l’expression des
porines limite l’entrée de certaines bêta-lactamines dans l’espace périplasmique et donc
l’accès à la membrane interne où sont situées les PLP. Cette diminution de la perméabilité
contribue au développement de résistance aux bêta-lactamines, d’autant plus si elle est
associée à d’autres mécanismes de résistance (88).
* Protéines d’efflux :
L’acquisition ou la surproduction de pompes à efflux peuvent expulser les bêtalactamines hors de la bactérie même contre le gradient de concentration (108).
(b) Support génétique des gènes codant pour les bêta-lactamases
Les gènes qui codent pour les bêta-lactamases sont situés soit sur des plasmides,
soit sur le chromosome. Ils peuvent être intégrés dans des éléments génétiques mobiles
(de type transposon, intégron, îlot génomique). Les déterminants génétiques de la résistance
peuvent être transmis par transfert horizontal y compris entre espèces phylogénétiquement
éloignées (84).
La résistance à certaines bêta-lactamines par production de bêta-lactamase peut être
naturelle. Ceci sous-entend qu’une forte proportion des bactéries d’une espèce bactérienne
donnée ont manifesté d’emblée un phénomène de résistance, avant toute pression de
sélection.
Par opposition à la résistance naturelle, la résistance acquise se manifeste sous
l’effet d’une pression de sélection. L’exemple de la propagation de TEM-1, la première bêtalactamase portée par un plasmide identifiée chez une bactérie à Gram négatif est illustratif.
Cette enzyme a été isolée pour la première fois dans une culture de sang d’un patient
nommé Temoneira en Grèce (34). Le transfert de TEM-1 a été facilité vers d’autres espèces
de bactéries car le gène qui code pour l’enzyme TEM-1 : blaTEM-1 est présent sur des
28
Etude bibliographique - chapitre 1
plasmides et des transposons. Quelques années après sa première identification, l’enzyme
TEM-1 a été propagée dans le monde entier, et est maintenant présente dans diverses
espèces de membres de la famille Enterobacteriaceae, et dans Pseudomonas aeruginosa,
Haemophilus influenzae et Neisseria gonorrhoeae (18).
(c) Classification des bêta-lactamases
Une classification moléculaire des bêta-lactamases, impliquant la connaissance de la
structure primaire des bêta-lactamines a été proposée par Ambler (7). Une classification
fonctionnelle a été proposée par Bush et al. (25), dans laquelle les auteurs tiennent compte
de la fonctionnalité des bêta-lactamases (substrat, profil d’inhibition) et divisent ces enzymes
en quatre groupes (1 à 4) avec plusieurs sous-groupes.
La classification moléculaire proposée par Ambler divise aussi les bêta-lactamases
en quatre groupes (A à D), qui présentent des différences sur le plan phylogénétique. Les
bêta-lactamases des classes A, C et D font partie des enzymes à sérine active, c'est-à-dire
qui possèdent dans leur site actif une sérine qui intervient dans le mécanisme d’acétylation
au cours de l’hydrolyse des bêta-lactamines. Par contre la classe B inclut les métallo-bêtalactamases dont l’activité nécessite la présence d’ions métalliques.
La classification comparée des bêta-lactamases selon Ambler et Bush-JacobyMeideros est présentée dans le tableau 3. La nomenclature des bêta-lactamases est
détaillée dans la liste des abréviations (page 13).
29
Etude bibliographique - chapitre 1
Tableau 3 : Classification des bêta-lactamases selon Ambler et Bush-Jacoby-Meideros
(25)
Substrats
préférentiels
Inhibition
par :
a
EDTA
AC
-
Enzymes
représentatives
Bush
Ambler
1
C
céphalosporines
2a
A
pénicillines
+
-
PC1
2b
A
pénicillines,
céphalosporines
+
-
TEM-1, TEM-2, SHV-1
2be
A
pénicillines,
céphalosporines à
large spectre,
monobacatames
+
-
BLSE TEMs, SHVs,
CTX-Ms
2br
A
pénicillines
+/-
-
IRT TEMs
2c
A
pénicillines,
carbenicilline
+
-
PSE-1
2d
D
pénicilline, cloxacilline
+/-
-
OXAs
2e
A
céphalosporines
+
-
FEC-1
2f
A
pénicillines,
céphalosporines,
carbapénèmes
+
-
KPC-1, SME-1
3
B
la plupart des bêtalactamines
-
+
L1, CcrA
AmpC, CMY-2, MIR-1
4b
a
acide clavulanique
La classe 4 regroupe les bêta-lactamases qui ne peuvent être classées dans les autres
classes.
b
* Classe A
La classe A est la plus diversifiée. Historiquement, elle était principalement
représentée par les pénicillinases. Comme leur nom l’indique, ces enzymes sont
principalement actives sur les pénicillines (bêta-lactamase PC1 de Staphylococcus aureus),
mais aussi, à un moindre degré sur les céphalosporines de première génération. La majorité
de ces enzymes est sensible aux inhibiteurs suicides utilisés en médecine (acide
clavulanique, sulbactam et tazobactam). Les principaux représentants de ce groupe sont les
bêta-lactamases du type PC1, TEM, SHV et récemment le type CTX-M. Les séquences
aminées des enzymes de type TEM, SHV et OXA sont répertoriées sur le site internet
suivant : www.lahey.org/studies/inc_webt.html.
** Bêta-lactamases de type TEM
TEM-1 est l’enzyme la plus fréquemment rencontrée chez E. coli, mais elle est aussi
présente chez de nombreuses espèces telles que Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp.,
30
Etude bibliographique - chapitre 1
Haemophilus influenzae et Neisseria gonorrhoeae. Jusqu’à 90% de la résistance à
l’ampicilline chez E. coli est due à la production de TEM-1 (84). TEM-1 est capable
d’hydrolyser l’ampicilline, et à un degré moindre l’oxacilline ou la céfalotine, et a une activité
négligeable vis-à-vis des céphalosporines à spectre étendu. L’enzyme TEM-2 diffère de
TEM-1 par un seul acide aminé. Les gènes qui codent pour ces enzymes sont situés sur des
plasmides, souvent transférable in vitro à des souches réceptrices de laboratoire. Le
dissémination de ces gènes est aussi facilité par le fait qu’ils fassent partie des transposons
Tn1, Tn2 ou Tn3 (104).
La première BLSE de type TEM (TEM-3) a été découverte en 1989 (121). Depuis
lors, plus de 100 dérivés de TEM ont émergé par substitution d’un ou plusieurs acides
aminés à partir de TEM-1 (105). Certains dérivés sont des IRT (Inhibitor-Resistant TEM
bêta-lactamase) principalement mis en évidence dans des isolats cliniques et résistants à
l’action de l’acide clavulanique (27), mais la majorité de ces nouveaux dérivés sont des
BLSE. Bien que les BLSE de type TEM soient le plus souvent produites par E. coli et
Klebsiella pneumoniae, ces enzymes ont été aussi mises en évidence chez les autres
espèces d’entérobactéries, et chez d’autres bactéries à Gram négatif (18).
** Bêta-lactamases de type SHV
Ces enzymes se retrouvent plus fréquemment mais pas exclusivement, dans
l’espèce Klebsiella. L’enzyme SHV-1 est la plus fréquemment rencontrée. Le gène codant
pour SHV-1 se situe sur le chromosome pour la majorité des souches de Klebsiella
pneumoniae, mais est habituellement porté par un plasmide chez E. coli. Une centaine de
BLSE dérivent des pénicillinases de SHV-1 par substitution d’un ou de plusieurs acides
aminés (18).
** Bêta-lactamases de type CTX-M
Ces dernières années, une nouvelle famille de BLSE est apparue, qui hydrolyse
préférentiellement le céfotaxime : les bêta-lactamases de type CTX-M. Ces enzymes se sont
rapidement propagées au niveau mondial et elles sont les BLSE majoritaires chez les
entérobactéries dans certaines zones géographiques (112).
* Classe B : métallo-bêta-lactamases
L’importance clinique des métallo-bêta-lactamases est liée au fait qu’elles hydrolysent
les carbapenèmes, composés qui échappent à l’activité des bêta-lactamases à sérine active.
La plupart des métallo-bêta-lactamases hydrolysent une variété de pénicillines et de
céphalosporines, et sont insensibles aux inhibiteurs suicides classiques (15).
31
Etude bibliographique - chapitre 1
* Class C : Céphalosporinases
Dans la classe C, on retrouve les céphalosporinases AmpC qui sont codées par des
gènes qui étaient primitivement situés sur le chromosome de nombreuses bactéries à Gram
négatif telles que Citrobacter freundii, Serratia marcescens et Enterobacter spp.. Chez ces
bactéries, l’expression de AmpC est inductible. Les gènes codant pour ces enzymes sont
aussi présents chez E. coli, où ils ne sont pas inductibles. Ces enzymes sont résistantes à
l’acide clavulanique (106).
* Class D : Oxacillinases
La classe D regroupe les bêta-lactamases qui hydrolysent l’oxacilline et ses dérivés
et qui sont faiblement inhibées par l’acide clavulanique. Ces enzymes sont le plus souvent
retrouvées chez Pseudomonas aeruginosa, mais elles ont aussi été retrouvées chez
d’autres bactéries à Gram négatif (105).
12-Utilisation des bêta-lactamines chez le porc
121- Utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire
(a) Usage des antibiotiques en médecine vétérinaire
Les antibiotiques peuvent être utilisés en médecine vétérinaire de quatre façons avec des
objectifs différents (118) :
* usage thérapeutique : l’objectif majeur est d’obtenir la guérison des animaux
cliniquement malades et d’éviter la mortalité.
* usage métaphylactique : lorsqu’une infection collective et contagieuse se déclare
chez quelques animaux dans des élevages avec de grands effectifs, l’ensemble du groupe
des animaux est traité. Cet usage permet de traiter les animaux soumis à la pression
infectieuse alors qu’ils sont encore en incubation ou lorsque les manifestations cliniques sont
très discrètes, ce qui permet un traitement collectif par voie orale. La méthaphylaxie est
généralement mise en œuvre à partir d’un seuil d’atteinte des animaux au sein du lot de 1015% de l’effectif.
32
Etude bibliographique - chapitre 1
* usage prophylactique : les antibiotiques peuvent parfois être administrés à des
périodes critiques de la vie des animaux soumis à une pression de contamination régulière
et bien connue. Dans la filière porcine, des antibiotiques peuvent être donné à titre préventif
au
moment
du
sevrage
qui
constitue
un
stress
important
pour
les
animaux.
L’antibioprophylaxie est aussi utilisée lors d’opérations chirurgicales pour prévenir les
infections bactériennes.
* facteurs de croissance : les antibiotiques peuvent être utilisés dans l’aliment à titre
d’additifs en vue d’améliorer la croissance et les performances des animaux, sans que les
mécanismes à l’origine de l’amélioration de ces performances aient été clairement élucidés
(39). Cet usage a fait l’objet de nombreuses critiques et il est interdit au sein de l’Union
Européenne depuis 2006 (122).
(b) Modalités d’usage des antibiotiques chez les animaux de rente
Des traitements individuels sont généralement mis en œuvre pour les animaux de
grande taille selon des modalités comparables à celle de la médecine humaine. Ces
traitements individuels sont inadaptés pour des larges effectifs d’animaux, comme c’est le
cas en filière porcine ou aviaire. En effet, d’un point de vue pratique, il est impossible de
traiter individuellement un lot de 20 000 poulets de chair ou une bande de 150 porcs. Dans
ce cas, le traitement ne peut être que collectif.
La voie d’administration est choisie en fonction des aspects pharmacologiques, des
aspects microbiologiques, du statut monogastrique-polygastrique de l’animal ainsi que du
nombre d’animaux à traiter (13). La voie parentérale est réservée à des traitements
individuels. La voie orale sera privilégiée pour les traitements collectifs. Elle peut se faire par
administration dans l’eau de boisson ou dans l’aliment. Une enquête épidémiologique
réalisée auprès de vétérinaires réalisant des prescriptions d’antibiotiques en élevage porcin
en France en 2000 a révélé que la voie orale était la voie d’administration prescrite dans
93% des cas, soit dans la nourriture (63%), soit dans l’eau (37%) (29).
(c) Antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire
Les antibiotiques utilisés en médecine humaine et vétérinaire appartiennent aux
mêmes familles, à l’exception d’une sous famille propre à la médecine vétérinaire
(pleuromutilines) et de quelques sous-familles utilisées exclusivement en médecine
humaine. Les carboxy-pénicillines, les uréido-pénicillines, les carbapénèmes et les
monobactames sont notamment réservés à la médecine humaine.
33
Etude bibliographique - chapitre 1
Entre 1999 et 2005, en France, les antibiotiques les plus utilisés en médecine
humaine ont été les bêta-lactamines qui représentaient plus de la moitié du tonnage total
vendu. Au cours de la même période, en médecine vétérinaire, les tétracyclines
représentaient presque la moitié du tonnage total vendu. Près de la moitié des ventes
d’antibiotique vétérinaires a été réalisée dans la filière porcine (4).
Le suivi des ventes de médicaments vétérinaires contenant des antibiotiques en
France en 2006 a montré que dans la filière porcine la vente de tétracycline a représenté
58% des ventes. Les bêta-lactamines arrivent en cinquième position avec 5% du tonnage
derrière les tétracyclines, les sulfonamides, les macrolides et les polypeptides. Les
céphalosporines ne représentent que 0.02% des ventes (3).
122- Utilisation des bêta-lactamines en élevage porcin
(a) Bêta-lactamines possédant une Autorisation de Mise sur le
Marché dans l’espèce porcine
Les bêta-lactamines utilisables dans l’espèce porcine en France sont les suivantes :
la pénicilline G, l’ampicilline, l’amoxicilline, une céphalosporine de troisième génération : le
ceftiofur, et une de quatrième génération : la cefquinome. Toutes ces molécules peuvent être
utilisées par voie injectable. Seules l’ampicilline et l’amoxicilline peuvent être administrées
par voie orale. L’utilisation de l’association amoxicilline-acide clavulanique n’est pas
autorisée en France dans l’espèce porcine. Les bêta-lactamines sont utilisées seules ou
dans des formulations où elles sont associés avec d’autres antibiotiques.
(source : Dictionnaire des Médicaments Vétérinaires, 2007)
(b) Indications des bêta-lactamines dans l’espèce porcine
- Truies : l’indication principale est le traitement des cystites. Les truies sont traitées de
manière individuelle par voie orale avec de l’amoxicilline ou par voie injectable avec le
ceftiofur ou la cefquinome.
- Porcelets en maternité : les traitements sont toujours individuels. La prévention des
arthrites est réalisée par injection de pénicilline G, d’amoxicilline ou de céphalosporines. Les
colibacilloses peuvent être traitées par voie orale avec les associations amoxicilline-colistine
ou ampicilline-colistine.
- Porcelets au sevrage : l’amoxicilline permet de contrôler les infections à Streptococcus suis
par voie orale et les infections respiratoires par voie injectable.
34
Etude bibliographique - chapitre 1
- Porcs en engraissement : l’amoxicilline et l’association pénicilline-dihydrostreptomycine
peuvent être utilisés par voie injectable pour contrôler les infections respiratoires. En cas
d’infection aiguë, l’ensemble des porcs peut être traité avec de l’amoxicilline par voie orale.
(source : (23))
(c) Propriétés pharmacocinétiques des bêta-lactamines chez l’animal
Les propriétés pharmacocinétiques des bêta-lactamines chez le porc sont présentées
dans cette section car lors de notre étude expérimentale, nous avons testé l’impact de trois
modalités d’administration de l’ampicilline sur la flore digestive. Les profils des
concentrations plasmatiques de l’ampicilline ont alors été étudiés afin d’estimer de manière
indirecte l’exposition du tube digestif à l’ampicilline (chapitre 3).
* Propriétés pharmacocinétiques de l’ampicilline par voie parentérale
chez le porc
Le tableau 4 présente la synthèse des résultats des paramètres pharmacocinétiques
de l’ampicilline, administrée par voie intraveineuse et intramusculaire, mesurés au cours de
trois études.
35
Etude bibliographique - chapitre 1
Tableau 4 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (1)
(moyennes ± écart-type) après administration par voie intraveineuse et intramusculaire chez
le porc.
Galtier et al.,
1979 (55)
Yuan et al.,
1997 (139)
Apley et al., 2007
(9)
mg/kg
20
10
17.6
kg
36-49
28-36
6-15
µg.h/mL
36.3
19 ± 2.7
28.87 ± 2.01
0.51 ± 0.02
0.86 ± 0.33
Référence
Dose
Voie intraveineuse
Poids des porcs
a
AUC
Vss
b
L/kg
c
L/h/kg
0.55
0.52 ± 0.07
0.62 ± 0.04
h
0.59
0.69 ± 0.08
0.92 ± 0.05
kg
36-49
30-48
6-15
AUC
µg.h/mL
32
17 ± 5
25.07 ± 3.09
Cmaxe
Tmaxf
g
µg/mL
12 ± 5
7.39 ± 0.9
h
0.34 ± 0.18
1 (étendue : 0.5-1.5)
Cl
t1/2d
Voie intramusculaire
Poids des porcs
a
F
88
86± 23
83 ± 29
%
AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, b Vss :
volume de distribution à l’équilibre, c Cl : clairance plasmatique, d t1/2 : temps de demi-vie,
e
Cmax : concentration plasmatique maximale, f Tmax : temps d’occurrence de la concentration
plasmatique maximale, g F : biodisponibilité absolue
a
* Propriétés pharmacocinétiques de l’amoxicilline par voie orale chez le
porc et impact du statut digestif
Il n’existe pas à notre connaissance de données dans la littérature concernant les
paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline chez le porc par voie orale. Par contre, de
nombreuses études ont été publiées pour l’amoxicilline. L’amoxicilline ne diffère de
l’ampicilline que par un groupement hydroxyle qui lui confère une meilleure biodisponibilité
par voie orale que l’ampicilline. Les résultats de deux études étudiant la biodisponibilité
absolue de l’amoxicilline, et l’impact du statut digestif sur l’absorption chez le porc sont
résumés dans le tableau 5. L’absorption de l’amoxicilline par voie orale chez le porc est lente
et incomplète. De plus, il apparaît que la présence d’aliment dans le tractus digestif serait
responsable d’une diminution de la biodisponibilité par voie orale de l’amoxicilline.
36
Etude bibliographique - chapitre 1
Tableau 5 : Paramètres pharmacocinétiques de l’amoxicilline (1)
(moyennes ± écart-type) après administration chez le porc à jeun et le porc nourri.
Référence
Agerso et al., 1998 (5)
Del Castillo et al., 1998 (36)
Poids
kg
30-50
24 jours (environ 8 kg)
Dose
mg/kg
10
15
Statut digestif
Cmaxa
µg/mL
b
Tmax
h
c
F
%
A jeun
1.6 ± 0.9
1.9 ± 0.9
33 ± 14
Nourri
0.8 ± 0.3
3.6 ± 1.5
28 ± 8
A jeun
4.7 ± 1.5
0.9 ± 0.1
36 ± 6
Nourri
2.1 ± 1.3
0.8 ± 0.3
23 ± 15
a
Cmax : concentration plasmatique maximale, b Tmax : temps d’occurrence de la concentration
plasmatique maximale, c F : biodisponibilité absolue
* Propriétés pharmacocinétiques de la pivampicilline
Les propriétés pharmacocinétiques de la pivampicilline sont présentées dans cette
section. Elles ont motivé le choix de cette bêta-lactamine dans le cadre d’une stratégie
thérapeutique que nous proposons. Cette stratégie est destinée à prévenir l’émergence de
résistance au sein de la flore digestive commensale lors d’administration de bêta-lactamines.
Nous présentons cette stratégie dans le chapitre 4.
La pivampicilline (C-3 pivaloyloxyméthyl ampicilline) est un ester de l’ampicilline.
Cette prodrogue de l’ampicilline a été développée afin d’améliorer la biodisponibilité de
l’ampicilline par voie orale chez l’homme (133). La pivampicilline est hydrolysée par des
estérases, présentes au niveau de la lumière intestinale et à l’intérieur des entérocytes. La
pivampicilline est plus liposoluble que l’ampicilline et elle pénètre plus facilement dans les
cellules intestinales. Lorsque la pivampicilline est à l’intérieur des entérocytes, l’ampicilline
formée suite à son hydrolyse intracellulaire est majoritairement prise en charge par des
transporteurs situés sur le pôle basal, et se retrouve dans la circulation sanguine. Ces
mécanismes expliquent la plus grande biodisponibilité observée (53). De plus, les esters
sont inactifs sur le plan bactériologique car le groupement carboxylique en C-3 est
indispensable pour l’expression de l’activité antibactérienne (21).
Chez l’animal, les paramètres pharmacocinétiques de la pivampicilline ont été étudiés
chez le veau et le cheval (48, 141). Dans ces deux espèces, la biodisponibilité de la
pivampicilline est de l’ordre de 30% alors que celle de l’ampicilline est de l’ordre de 10%. De
plus, le statut digestif ne semble pas avoir d’effet sur l’absorption à la différence de
l’ampicilline ou de l’amoxicilline.
37
38
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre 2 : Impact de l’administration des bêtalactamines sur la flore digestive et stratégies de
prévention
39
40
Etude bibliographique - chapitre 2
Chapitre 2 - Impact de l’administration des bêtalactamines sur la flore digestive et stratégies de
prévention
Ce chapitre présente les conséquences de l’antibiothérapie sur l’écosystème
intestinal des animaux, et les conséquences qui en découlent en terme de santé publique. Il
est centré sur l’étude de la résistance des bactéries de la flore digestive du porc, sur l’impact
écologique des bêta-lactamines, et sur les stratégies thérapeutiques de prévention des
modifications de cet écosystème au cours d’une antibiothérapie.
21- Ecosystème intestinal et antibiothérapie
211- Description de la flore commensale digestive
(a) Composition de la flore commensale du tube digestif
L’anatomie du tube digestif et les flores intestinales qui y résident, sont variables
d’une espèce animale à l’autre (73). Chez le porc, comme dans les autres espèces, la flore
varie en fonction des stades physiologiques (74) et de l’alimentation (62). La flore intestinale
forme un écosystème complexe dont la composition varie en fonction de la localisation dans
le tube digestif et en fonction de l’individu. Chez le porc, il a été montré qu’il existait des
différences dans la composition de la flore entre des animaux de même origine génétique, et
qui étaient hébergés dans des conditions identiques (65).
L’estomac, le duodénum et l’intestin grêle proximal contiennent peu de bactéries pour
la plupart des lactobacilles et des streptocoques (73). Le côlon abrite la densité microbienne
la plus forte avec 109-1011 bactéries/mL et une majorité de bactéries anaérobies strictes,
composées de nombreuses espèces. Les principaux genres bactériens sont les suivants :
Streptococcus, Lactobacillus, Eubacterium, Fusobacterium et Bacteroides. L’ensemble de
ces bactéries compose la flore dominante. La flore sous-dominante regroupent des
espèces bactériennes anaérobies strictes mais aussi des espèces aérobie-anaérobie
facultatives : les entérobactéries et les entérocoques. Chez le porc, les souches d’E. coli
représentent environ 2% des bactéries fécales (98). A côté de cette flore résidente, il peut
exister une flore transitoire, qui ne s’implante pas dans le tube digestif, sauf dans des
circonstances pathologiques ou lors d’une antibiothérapie.
41
Etude bibliographique - chapitre 2
(b) Résistance à la colonisation
La flore du tube digestif établit des relations multiples avec l’hôte, créant un équilibre
dynamique dont la stabilité est maintenue par des interactions partiellement connues. La
composition de la flore du tube digestif est relativement stable pour un individu au cours du
temps. La flore digestive agit comme une barrière en s’opposant à l’implantation et à la
multiplication des micro-organismes d’origine exogène (135). Cet effet de barrière prévient
aussi la colonisation du tube digestif par des micro-organismes déjà présent tels que les
levures ou Clostridium difficile. Cette résistance à la colonisation est principalement assurée
par la flore anaérobie, mais aussi par des facteurs anatomiques et physiologiques
(péristaltisme, sécrétion de salive, acidité gastrique...) et par le système immunitaire.
212- Impact de l’antibiothérapie sur la flore digestive
Dans le cas d’une antibiothérapie, une fraction de la dose administrée peut être
excrétée sous forme active par voie biliaire ou sécrétée par la muqueuse intestinale, à
laquelle s’ajoute en cas d’administration orale la fraction non absorbée. Les quantités
d’antibiotiques qui sont alors présentes dans le tube digestif peuvent altérer l’équilibre
microbien de la flore intestinale. Les effets observés chez l’hôte peuvent être alors (43):
- l’élimination des bactéries sensibles aux concentrations actives de l’antibiotique,
- la sélection et la prolifération de bactéries résistantes au sein de la flore endogène.
L’antibiothérapie modifie donc la stabilité de l’écosystème bactérien et altère la composition
de la flore responsable de la résistance à la colonisation.
Plusieurs facteurs interviennent sur l’intensité des modifications de l’écosystème
intestinal au cours d’un traitement antibiotique, notamment la concentration active qui atteint
la lumière intestinale, l’activité intrinsèque de la molécule sur les bactéries qui composent
l’écosystème, de sa fixation à des composants du bol alimentaire (protéines, cellulose) et
son inactivation éventuelle dans le contenu intestinal (125).
(a) Emergence de micro-organismes pathogènes dans la flore
digestive
La disparition de l’effet de barrière peut entraîner l’émergence de bactéries
pathogènes. Chez l’homme, les colites pseudomembraneuses, liées au développement de
Clostridium difficile producteur de toxines, et la pullulation de levures saprophytes telles que
Candida albicans sont l’illustration de l’effet des antibiotiques sur la flore intestinale (125). La
42
Etude bibliographique - chapitre 2
prise d’antibiotique est également un facteur de risque de survenue d’une infection à
salmonelles (41).
En médecine vétérinaire, l’ampicilline ne doit pas être administrée ni aux rongeurs, ni
au lapins car elle perturbe leur écosystème digestif et être l’origine de colites (Clostridium
difficile chez les rongeurs et Clostridium spirofome chez le lapin) (110). Les aminopénicillines ne doivent pas non plus être administrées par voie orale chez le cheval car elles
sont très peu absorbées dans cette espèce, et induisent des entérocolites à Clostridium
difficile (116).
(b) Emergence de bactéries résistantes dans la flore digestive chez
l’animal et conséquences en terme de santé publique
* Emergence de bactéries zoonotiques résistantes
Chez l’animal, le traitement antibiotique peut permettre l’émergence ou la sélection
de bactéries zoonotiques résistantes dans le tube digestif des animaux. Ces bactéries
peuvent être transmises à l’homme par les aliments qu’il consomme et être responsable de
toxi-infections alimentaires. Ces bactéries peuvent être également transmises par contact
avec les animaux ou indirectement par d’autres voies. Les bactéries du genre
Campylobacter et Salmonella sont les principales bactéries responsables de gastroentérites d’origine infectieuse et la viande de porc fait partie des sources de contamination
de l’homme. Le fait que ces bactéries zoonotiques soient résistantes aux antibiotiques peut
avoir plusieurs conséquences (96):
- En général, les diarrhées bactériennes zoonotiques de gravité faible ou modérée ne
sont habituellement pas traitées avec des antibiotiques. Les patients âgés, les patients
bactériémiques ou les malades à risque de complication peuvent cependant être traités avec
des antibiotiques. Si les bactéries zoonotiques sont résistantes, on peut assister à un échec
thérapeutique.
- Les bactéries zoonotiques résistantes seraient à l’origine d’infections plus invasives
et d’une augmentation de la mortalité des patients.
- Si des bactéries zoonotiques résistantes contaminent un individu soumis
préalablement à une antibiothérapie, elles auront un avantage sélectif pour coloniser le tube
digestif de cet individu.
En terme de santé publique, le premier enjeu de l’utilisation des antibiotiques chez les
animaux est donc de limiter leur impact sur l’émergence et la sélection de bactéries
43
Etude bibliographique - chapitre 2
zoonotiques résistantes dans le tube digestif des animaux car la diffusion de bactéries
zoonotiques résistantes de l’animal à l’homme est possible, et de nombreux arguments
attestent de sa réalité (45).
* Emergence de bactéries commensales résistantes
Le traitement antibiotique peut aussi permettre l’émergence ou la sélection de
bactéries commensales résistantes dans le tube digestif. La dissémination des
déterminants génétiques de la résistance portés par une bactérie commensale peut être
considérable puisque ces gènes peuvent être transférés verticalement (à la descendance)
ou horizontalement (aux autres lignées bactériennes) s’ils sont situés sur des éléments
génétiques mobiles. Ces échanges peuvent survenir entre souches résidentes de la flore
intestinale provenant d’espèces identiques, différentes voire éloignées (132). Le tube digestif
des animaux devient un réservoir de gènes de résistance à l’antibiotique administré. Les
bactéries commensales sont transmises à l’homme par les mêmes voies que les bactéries
zoonotiques. Les bactéries commensales d’origine animale peuvent donc potentiellement se
retrouver dans le tube digestif de l’homme et même si elles n’y sont que de façon transitoire,
elles peuvent alors éventuellement transférer des gènes aux bactéries commensales
humaines. L’écosystème intestinal humain se trouverait donc enrichi de déterminants
génétiques de résistance d’origine animale, potentiellement transmissibles à des bactéries
pathogènes (115). L’étude de ces flux de gènes potentiels entre le monde animal et humain
est encouragée par l’AFSSA (Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments) et
l’EFSA (European Food Safety Authority) afin de mieux cerner son importance (4).
Les bactéries isolées chez les animaux et chez l’homme partagent les mêmes
mécanismes de résistance, ceci est un argument en faveur de l’absence d’étanchéité entre
les populations bactériennes d’origine humaine et animale. Les flux de gènes de résistance
peuvent a priori s’effectuer dans les deux sens, et l’évaluation des flux de gènes entre les
populations bactériennes humaines et animales nécessite de développer des marqueurs qui
permettent de reconnaître l’écosystème d’origine de la bactérie ou du mécanisme de
résistance. Ces marqueurs sont particulièrement difficiles à définir car les populations
bactériennes d’origine humaine et animale peuvent être relativement proches. En effet, une
étude récente vient de montrer qu’en Ouganda les populations humaines rurales et le
cheptel partageaient des souches de E. coli identiques sur le plan génétique (113).
Un deuxième enjeu de l’utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire est donc
de limiter l’excrétion de bactéries digestives résistantes car ces bactéries peuvent
44
Etude bibliographique - chapitre 2
potentiellement transmettre leurs gènes de résistance à des bactéries qui font partie de
l’écosystème intestinal de l’homme. Le travail expérimental que nous avons mené s’inscrit
dans cette problématique. Nous avons voulu décrire les mécanismes qui concourent à
l’émergence de résistance lors d’administration d’ampicilline chez le porc, et proposer une
stratégie thérapeutique destinée à limiter l’impact de l’administration d’ampicilline sur la
sélection de bactéries résistantes d’origine digestive.
213- Mesure du niveau de résistance de la flore digestive
Dans l’optique de comparer le niveau d’excrétion fécale de bactéries résistantes suite
à l’administration d’antibiotique selon différents schémas thérapeutiques, il est indispensable
de quantifier le niveau de résistance de la flore commensale. Cette section présente les
méthodologies utilisées pour quantifier ce niveau de résistance. Quant à l’étude des
mécanismes populationnels qui concourent à l’émergence de cette résistance, elle nécessite
le recours à des techniques d’épidémiologie moléculaire
(a) Détection de la résistance bactérienne
*Définition de la résistance
La méthode de référence pour déterminer l’efficacité d’un antibiotique sur une souche
bactérienne est la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) par les
méthodes de dilution in vitro.
La valeur de la CMI permet de définir si une souche bactérienne est résistante. La
notion de résistance peut être définie selon différents points de vue (35):
- pour le microbiologiste, une souche bactérienne est résistante à un antibiotique si
elle dispose d’un mécanisme de résistance augmentant la valeur de la CMI,
- pour l’épidémiologiste, une souche bactérienne est résistante à un antibiotique si
elle a une CMI significativement différente de celle de la population sauvage,
- pour le pharmacologue, une souche bactérienne est résistante à un antibiotique si
les concentrations atteintes au site d’action, sont inférieures à la CMI,
- pour le clinicien, une souche bactérienne est résistante à un antibiotique si le
traitement n’est pas efficace.
Afin de prédire la sensibilité d’une souche en terme d’activité clinique afin de réaliser
le meilleur choix thérapeutique, des valeurs critiques ont été définies par des comités
d’experts. Elles permettent de déterminer la catégorie clinique d’une souche (sensible,
45
Etude bibliographique - chapitre 2
intermédiaire, résistante). La détermination de ces valeurs critiques a pris en compte la
distribution
de
CMI
dans
la
population
bactérienne
considérée,
les
propriétés
pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de l’antibiotique et les résultats des études
cliniques (130). Pour que l’interprétation d’une valeur de CMI soit correcte, la détermination
de la CMI doit suivre les recommandations techniques des différents comités d’experts. Au
niveau européen, le comité d’experts est l’EUCAST (European Comitee on Antimicrobial
Susceptibility Testing) et aux Etats-Unis le CLSI (Clinical and Laboratory Standards
Institute). Ces comités ont déterminé des valeurs critiques pour les pathogènes d’intérêt
vétérinaire dans certaines espèces.
*Méthodologie de détection de la résistance
Lorsque l’on veut définir la catégorie clinique d’une souche, la méthode de référence
est la détermination de la CMI. Des valeurs critiques sont aussi disponibles pour interpréter
les résultats de l’antibiogramme.
Il est cependant possible d’identifier l’existence d’un mécanisme de résistance par
d’autres méthodes phénotypiques : détection directe d’enzymes de dégradation (test de
recherche de bêta-lactamases), recherche sélective sur des géloses contenant l’antibiotique
à des concentrations supérieures aux valeurs critiques, modification du milieu ou des
conditions d’incubation pour augmenter l’expression de la résistance, confirmation de la
présence de bêta-lactamase par l’utilisation d’inhibiteurs tels que l’acide clavulanique ou
l’EDTA....
Les méthodes génotypiques permettent de détecter les déterminants génétiques de
la résistance. La PCR (Polymerase Chain Reaction) est classiquement utilisée. Le
développement des techniques de biologie moléculaire a permis de développer des puces à
ADN qui peuvent détecter un large panel de gènes de résistance (102).
(b) Quantification du niveau de résistance au sein de la flore
commensale
La quantification de la résistance au sein de la flore commensale est nécessaire pour
le suivi des niveaux de résistance dans les enquêtes épidémiologiques, pour étudier l’impact
d’administration d’antibiotiques sur la sélection ou l’émergence de résistance dans la flore
digestive. Il n’existe pas de recommandations sur les méthodes pour mesurer
quantitativement la résistance dans ces populations. Evaluer la résistance de manière
46
Etude bibliographique - chapitre 2
quantitative
représente
un
véritable
challenge
en
terme
de
méthodologie
et
d’échantillonnage (35).
La mesure de la résistance à un antibiotique au sein de la flore commensale peut se
faire grâce à bactéries indicatrices. E. coli et Enterococcus faecium sont classiquement
utilisées parce que leur mise en culture est facile et qu’elles ont une importance en
pathologie animale et humaine. Le pourcentage de souches d’E. coli résistantes est
couramment utilisé chez le porc pour mesurer le niveau de résistance de la flore
commensale (120).
Une autre façon d’estimer quantitativement la résistance est de calculer le rapport
entre le dénombrement de bactéries poussant sur milieu supplémenté en antibiotique (à une
concentration qui inhibe les bactéries sensibles), et le dénombrement total. Les
entérobactéries, coliformes ou E. coli ont été utilisés à cet escient chez le porc (16, 38).
Dans ces études, l’estimation de la résistance dépend d’une mesure sur des isolats
provenant de populations contenant des millions de bactéries. Dans l’optique de quantifier
le réservoir digestif de gènes de résistance au niveau de la biomasse bactérienne totale,
les gènes peuvent être quantifiés par PCR en temps réel. Cette approche a déjà été utilisée
chez l’animal afin d’évaluer l’impact sur la flore commensale de différents schémas
d’administration de bêta-lactamines. Chez le chien, la quantification des gènes blaTEM dans
les fèces par PCR en temps réel a permis d’évaluer l’impact d’une nouvelle stratégie
thérapeutique destinée à limiter les effets de l’ampicilline sur l’écosystème digestif (63). Chez
les bovins, les gènes blaCMY2 ont été quantifiés afin d’évaluer l’impact de différents schémas
posologiques du ceftiofur (6).
Au cours de notre travail expérimental, nous avons développé et validé une technique
de quantification des gènes blaTEM dans les fèces de porc. Nous avons comparé cet outil
aux indicateurs phénotypiques classiquement utilisés : le pourcentage d’entérobactéries
résistantes (calculé à l’aide des dénombrements réalisés sur gélose supplémentée ou non
en ampicilline) et le pourcentage de souches d’E. coli résistantes (calculé après la
détermination de la CMI de 20 isolées par animal) (cf. Article 1).
(c) Epidémiologie moléculaire au sein de la flore commensale
Les méthodes moléculaires se sont beaucoup développées ces dernières années
notamment pour l’investigation épidémiologique et la comparaison de souches bactériennes.
Ces méthodes permettent d’apprécier la diffusion d’un clone résistant au sein d’une
population donnée ou bien de mettre en évidence des transferts horizontaux de gènes (1).
47
Etude bibliographique - chapitre 2
Le pouvoir de discrimination des souches est variable selon les méthodes et l’espèce
bactérienne analysée. Ces méthodes reposent sur deux grands principes : soit l’amplification
par PCR de séquences données, soit la restriction de l’ADN bactérien (123).
L’électrophorèse en champ pulsé repose sur la restriction de l’ADN bactérien. Nous
avons utilisé cette technique au cours de notre travail expérimental pour typer des souches
fécales d’E. coli, sélectionnées par l’administration d’ampicilline, et évaluer leur parenté
génétique (cf. Article 2). L’électrophorèse en champ pulsé est une technique de référence
pour différencier les souches pathogènes et pour suivre leur dissémination (54, 59). Elle peut
également permettre d’évaluer la dissémination d’un clone résistant au sein de l’écosystème
digestif (93).
22- Antibiothérapie et résistance des entérobactéries
dans l’espèce porcine
221- Etudes descriptives de la résistance des entérobactéries
de la flore digestive
(a) Programme national de surveillance de la résistance des bactéries
de la flore commensale en filière porcine
En France, la surveillance de la résistance des bactéries de la flore commensale pour
la filière porcine a été initiée en 2002. Cette surveillance est réalisée dans le cadre d’un plan
de surveillance mis en place par la DGAL (Direction Générale de l’ALimentation), en
collaboration avec l’AFFSA. Le programme actuel a pour objectif de fournir une évaluation
annuelle du taux de résistance pour les bactéries indicatrices E. coli et Enterococcus
faecium. Le tableau 6 donne les pourcentages de résistance des souches de E. coli isolées
de porcs à l’abattoir en 2003 et 2004.
48
Etude bibliographique - chapitre 2
Tableau 6 : Pourcentage de résistance des souches d’E. coli isolées de porcs à
l’abattoir
moyennes (intervalle de confiance) en 2003 et 2004 (à partir de (2)).
Antibiotique
Pourcentages de souches d’E. coli résistantes
2003
2004
7.1 (2.0-12.1)
3 (0-6.3)
Ampicilline
26.5 (17.8-35.3)
22 (13.9-30.1)
Apramycine
9.1 (3.4-14.8)
4 (0.2-7.8)
21.4 (13.3-29.6)
14 (7.2-20.8)
Ciprofloxacine
0 (0-2.9)
1 (0-3.0)
Florfénicol
2 (0-4.7)
1 (0-3.0)
3.1 (0-6.5)
0 (0-3.0)
Néomycine
5.9 (1.3-10.6)
5 (0.7-9.3)
Streptomycine
67 (57.8-76.2)
62 (52.5-71.5)
81.2 (73.6-88.8)
86 (79.2-92.8)
48 (38.2-57.8)
44 (34.3-53.7)
Acide nalidixique
Chloramphénicol
Gentamicine
Tétracycline
Triméthoprime +
Sulfonamides
Les souches d’E. coli étaient majoritairement résistantes à la tétracycline et à la
streptomycine. Environ la moitié des souches était résistante à l’association triméthoprimesulfonamides, et environ 25 % des souches étaient résistantes à l’ampicilline.
Au niveau européen, une enquête épidémiologique sur le niveau de résistance chez
l’animal a été réalisée par le CEESA (Centre Européen d’Etudes pour la Santé Animale)
(26). Les prélèvements ont été réalisés à l’abattoir entre 1999 et 2000 pour la filière porcine.
Les résultats montrent que le pourcentage de souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline
était différent entre les pays. Il était relativement bas au Danemark, aux Pays-Bas, en Suède
avec respectivement 10.5%, 17% et 3.4% des souches résistantes à l’ampicilline. Par contre,
en Espagne, 52.1% des souches étaient résistantes à l’ampicilline.
(b) Déterminants génétiques de la résistance aux bêta-lactamines chez
les animaux
Une étude a été réalisée en Espagne par Brinas et al. afin d’identifier les
déterminants génétiques de la résistance dans des souches d’E. coli isolées à partir
d’aliments d’origine animale, et de fèces d’humains et d’animaux sains (19). Les résultats ont
montré que le mécanisme de résistance à l’ampicilline dans les souches d’E. coli était la
production de bêta-lactamase TEM à 83%. Parmi les gènes blaTEM, le gène blaTEM-1b a été
identifié dans 69% des cas. Le même type d’étude réalisée au Danemark sur des souches
49
Etude bibliographique - chapitre 2
d’E. coli isolées à partir de fèces d’animaux sains et malades a montré les mêmes résultats
(103). Cette prédominance des gènes blaTEM a été retrouvée dans des souches d’E. coli
pathogènes isolées chez le porc (92) au Canada, et dans des souches d’E. coli
commensales isolées de bovins, porcins et poulets en Allemagne (61).
Les gènes blaTEM sont responsables de la résistance à l’ampicilline des souches
d’E. coli isolées du tube digestif des animaux. Le tube digestif des animaux représente
un réservoir de gènes blaTEM que nous avons quantifié par PCR en temps réel lors de notre
étude expérimentale afin d’évaluer les quantités de gènes excrétés au cours d’une
antibiothérapie.
En ce qui concerne la résistance aux céphalosporines de troisième génération, des
BLSE de type CTX-M-1 ont été mises en évidence dans des souches d’E. coli isolées dans
la filière porcine en France (95).
222- Analyse de l’impact de l’usage des antibiotiques sur le
niveau de résistance de la flore digestive
Plusieurs études ont montré que chez le porc, comme chez les autres espèces
animales, l’administration d’antibiotique augmente la prévalence de la résistance au sein des
bactéries de la flore commensale. Lorsque les antibiotiques sont administrés, en majorité par
la voie orale chez le porc, les bactéries digestives qui sont résistantes à l’antibiotique sont
sélectionnées, et ces bactéries résistantes peuvent alors coloniser le tube digestif (120).
Sunde et al. ont recherché la prévalence de la résistance au sein de souches fécales
d’E. coli isolées de porcs provenant de 10 fermes avec un historique d’utilisation antibiotique
à but thérapeutique différent (127). Ils ont montré que pourcentage le plus important de
bactéries résistantes a été retrouvé dans les fermes où l’utilisation d’antibiotiques était
considérée comme élevée. Il ont de plus mis en évidence que le tube digestif des porcs était
un véritable réservoir de gènes de résistance, situés dans des éléments génétiques mobiles
facilement transmissibles à d’autres bactéries par transfert horizontal (128).
Belloc et al. ont montré que l’administration de fluméquine chez la truie entraînait une
augmentation du pourcentage de bactéries résistantes aux fluoroquinolones (16). Ils ont
aussi constaté que les dénombrements des souches d’E. coli totaux et résistants
présentaient une grande variabilité entre les individus au cours du traitement.
50
Etude bibliographique - chapitre 2
D’autres auteurs ont aussi mis en évidence une relation entre une utilisation élevée
d’antibiotique et une plus forte prévalence d’entérobactéries résistantes dans la flore
digestive du porc (37, 58, 91).
223- Facteurs autres que l’antibiothérapie gouvernant le
niveau de résistance des bactéries de la flore digestive
(a) Persistance de souches antibiorésistantes dans le tube digestif des
animaux
En l’absence de pression de sélection exercée par l’antibiotique, des entérobactéries
résistantes ont été retrouvées dans le tube digestif des hommes et dans l’environnement
(114).
Chez le porc, il a été mis en évidence que l’arrêt de l’utilisation d’antibiotiques
n’entraînait pas la disparition des souches résistantes du tube digestif (22, 78).
Chez des animaux sauvages, qui n’ont jamais été exposés a priori aux antibiotiques,
les gènes codant pour des BLSE variées de type CTX-M, TEM et SHV ont été détectés dans
les fèces (32).
Ces exemples montrent que dans l’environnement, des facteurs autres que les
antibiotiques, doivent donc contribuer à la distribution et au maintien des déterminants
génétiques de la résistance dans la flore digestive normale des animaux (8, 126).
(b) Facteurs autres que l’antibiothérapie ayant un impact sur le
niveau de résistance des bactéries de la flore commensale
L’antibiothérapie n’est pas le seul facteur qui contribue à l’augmentation du nombre
de bactéries résistantes dans la flore fécale. L’impact de plusieurs facteurs sur le niveau de
résistance a été étudié dans l’espèce porcine.
Moro et al. ont montré que des stress thermiques, qu’ils soient froids au chauds,
conduisaient à une excrétion plus importante de bactéries résistantes dans la flore fécale
(99, 100). Le stress provoqué par un transport long et un temps d’attente important avant
l’abattage a aussi conduit à une augmentation de bactéries résistantes dans les fèces (97).
Les conditions d’hébergement, d’hygiène et l’âge des animaux pourraient aussi influencer le
développement et la maintenance de bactéries résistantes dans la flore commensale du porc
(38, 79).
51
Etude bibliographique - chapitre 2
En conclusion, le niveau de résistance des bactéries du tube digestif dépend non
seulement de la pression de sélection exercée par l’antibiotique; mais il est aussi gouverné
par d’autres facteurs. L’excrétion de bactéries résistantes est d’ailleurs très variable chez un
même animal au cours du temps. L’étude de la dynamique populationnelle des souches d’E.
coli résistantes dans la flore commensale permettrait de mieux cerner les mécanismes qui
gouvernent l’excrétion des souches résistantes.
224- Dynamique populationnelle des souches d’E. coli
résistantes de la flore commensale
Une équipe anglaise a montré que le tube digestif des veaux, en l’absence de
pression de sélection exercée par des antibiotiques, était colonisé par des souches d’E. coli
résistantes à l’ampicilline très rapidement après leur naissance. Ces souches appartenaient
à des pulsotypes variés. L’analyse temporelle des résultats a montré que le tube digestif
était colonisé par des « vagues » successives de pulsotypes résistants à l’ampicilline
différents, qui avaient probablement une origine environnementale (67).
L’impact de l’administration d’ampicilline sur la diversité des souches commensales
d’E. coli a été étudié chez le chien au cours d’une étude expérimentale. Les auteurs ont
montré que l’ampicilline a sélectionné des souches résistantes à l’ampicilline qui étaient
éloignées génétiquement, et que les souches qui étaient sensibles avant l’administration
d’ampicilline ne sont pas devenues résistantes (93).
Peu
d’études
ont
donc
été
menées
pour
appréhender
les
mécanismes
populationnels qui concourent à l’émergence de résistance. La compréhension de ces
mécanismes pourrait pourtant permettre de mieux cerner l’émergence de résistance et
d’envisager des stratégies pour la prévenir. Dans le cadre de notre étude expérimentale,
nous avons donc voulu caractériser la dynamique de l’émergence de la résistance au sein
des populations digestives d’E. coli. Par rapport à l’étude qui a été réalisée chez le chien,
nous avons sélectionné des souches résistantes à l’ampicilline avant traitement, afin
d’évaluer si les souches sélectionnées par le traitement existaient déjà dans le tube
digestif avant le traitement (Article 2).
52
Etude bibliographique - chapitre 2
23- Impact des bêta-lactamines sur l’écosystème
intestinal et activité bêta-lactamase fécale
231- Etude chez le porc
Après administration d’ampicilline par voie orale à des porcs, Esoula et al. ont étudié
les concentrations et l’efficacité in situ de l’ampicilline au niveau du caecum (50). Après la
première administration, les concentrations en ampicilline, mesurées par dosage
microbiologique, ont atteint un pic dans le caecum au bout d’environ 5 heures. Entre 5 et 8
heures après l’administration, le nombre de colibacilles a diminué. A 24 heures, ils avaient
retrouvé leur niveau initial et chez la majorité des porcs, et ils étaient devenus résistants à
l’ampicilline. Chez ces porcs, lors de la deuxième et troisième administrations, le dosage
microbiologique de l’ampicilline a montré que l’ampicilline avait été inactivée au niveau du
caecum. Les auteurs suggèrent que l’ampicilline a été inactivée par des bactéries porteuses
de plasmide conférant une résistance à l’ampicilline.
Cette hypothèse a été confirmée par les mêmes auteurs (33). Ils ont administré de
l’ampicilline à des agneaux axéniques, à des agneaux gnotoxéniques hébergeant une flore
contenant des E. coli soit sensibles soit résistants, et à des agneaux conventionnels. Chez
les agneaux axéniques ou hébergeant une flore sensible, une grande quantité d’ampicilline a
été mesurée au niveau du côlon. Par contre, chez les agneaux conventionnels ou
hébergeant une flore résistante, l’ampicilline a été inactivée.
232- Etude chez l’homme
Sullivan et al. ont réalisé la synthèse de diverses études étudiant l’impact de
l’administration des bêta-lactamines sur la microflore du tube digestif de l’homme (125).
(a) Administration d’ampicilline ou d’amoxicilline
L’administration d’ampicilline ou d’amoxicilline chez l’homme entraîne une importante
croissance d’entérobactéries résistantes. Les effets sur la flore aérobie à Gram positif (cocci)
et sur les bactéries anaérobies sont modérés. Il n’y a pas d’émergence de résistance chez
les entérocoques et chez les Bacteroides. Chez certains sujets, une colonisation par
Clostridium difficile ou Candida a pu être mise en évidence.
53
Etude bibliographique - chapitre 2
(b) Administration de céphalopsorines
L’administration de céphalosporines par voie orale ou parentérale entraîne une chute
importante du nombre d’entérobactéries, une augmentation du nombre des bactéries
aérobies à Gram positif (cocci) et un effet modéré sur les bactéries anaérobies. L’émergence
de résistance est absente parmi les entérocoques, les entérobactéries et les Bacteroides.
Par contre, le tube digestif des sujets est plus fréquemment colonisé par Clostridium difficile.
Lorsque des céphalosporines ont été administrées par voie orale ou parentérale, il a
été mis en évidence une relation inverse entre la production de bêta-lactamase (pouvant
hydrolyser les céphalosporines) et les concentrations en antibiotique dans les fèces (44, 80).
Une hypothèse était que les bêta-lactamases lorsqu’elles sont produites par des bactéries du
tube digestif doivent détruire les résidus de céphalosporines. Les effets de l’administration de
céphalosporines chez les sujets dont la flore produisait des bêta-lactamases ont ainsi été
réduits au minimum (28).
24- Stratégies thérapeutiques de prévention de
l’émergence de résistance dans la flore digestive lors
d’administration de bêta-lactamines
241- Optimisation de schémas thérapeutiques visant à limiter
l’exposition de la flore digestive à l’antibiotique
Le développement de la résistance à un antibiotique est fonction des concentrations
auxquelles les bactéries sont exposées et de la durée de cette exposition. Des schémas
thérapeutiques différents conduisent à des expositions différentes du tube digestif, qui
peuvent avoir des impacts différents sur l’émergence de résistance au sein de la flore
commensale (138). Des exemples d’études chez le porc de l’impact d’administration
d’antibiotiques, selon divers schémas thérapeutiques, sur le niveau de résistance des
bactéries digestives, sont donnés dans cette section.
(a) Etudes descriptives et étiologiques
L’impact des modalités d’usage des antibiotiques a été approfondi dans le cadre
d’une étude de cohorte (42). Une des conclusions de cette étude est la mise en évidence
d’un risque plus important de sélection de souches résistantes d’E.coli lorsque les
54
Etude bibliographique - chapitre 2
antibiotiques sont dispensés à dose subthérapeutique dans l’aliment par rapport à des
traitements individuels.
Dans le cadre d’une étude visant à évaluer les relations entre les niveaux de
résistance de souches d’E. coli commensales et pathogènes et la consommation
d’antibiotique, Jensen et al. ont montré qu’au niveau national la résistance à l’apramycine
des souches d’E. coli pathogènes était significativement corrélée à la quantité et la durée de
l’administration d’apramycine (71).
(b) Eudes expérimentales
Mathew et al. ont démontré qu’entre différentes conditions d’administrations
d’apramycine, celle qui correspondait à une exposition orale, répétée, ponctuelle, à dose
maximale, conduisait aux taux de résistance les moins importants (90).
Wiuff et al. ont étudié l’effet de différents schémas posologiques d’administration
d’enrofloxacine sur le développement de résistance au niveau de souches de Salmonella et
d’E. coli du tube digestif. Ils ont montré que la résistance aux fluroquinolones au niveau de la
flore coliforme se développe très rapidement quelle que soit la voie d’administration et la
dose. A contrario, la sélection des salmonelles résistantes introduites au niveau du tube
digestif était diminuée lors de l’utilisation de la voie intramusculaire et en fractionnant la dose
(137).
Les études réalisées chez le porc indiquent que des schémas thérapeutiques
différents peuvent conduire à des impacts différents sur la sélection de souches
résistantes dans le tube digestif des animaux. C’est pourquoi, dans le cadre de notre
étude expérimentale, nous avons voulu évaluer si l’administration d’ampicilline selon des
modalités
différentes
pouvait
avoir
un
impact
différent
sur
la
sélection
d’entérobactéries résistantes (Article 1).
242- Destruction enzymatique des résidus d’antibiotiques
dans le tube digestif
Afin de prévenir la colonisation du tube digestif par des micro-organismes
opportunistes et des bactéries résistantes au cours d’une antibiothérapie, il faudrait obtenir
une diminution de la pression de sélection exercée sur l’écosystème digestif qui permette le
maintien de la flore barrière. Pour ce faire, une stratégie thérapeutique envisageable serait
d’inactiver les résidus d’antibiotique qui exercent une pression de sélection sur les bactéries
tout au long du tube digestif, et particulièrement au niveau du côlon, qui contient la
population bactérienne la plus importante. Deux options peuvent être envisagées pour
55
Etude bibliographique - chapitre 2
inactiver l’antibiotique: l’adsorption par un agent chimique, ou la destruction par un
mécanisme enzymatique (131).
(a) Administration de bêta-lactamase dans le but d’inactiver les
résidus digestifs de bêta-lactamines
Nous avons vu dans la section 232 que l’inactivation des résidus de céphalosporines
par des bêta-lactamases produites par des bactéries du tube digestif était associée avec des
altérations moindres de l’écosystème intestinal. L’utilisation de bêta-lactamases pour détruire
les résidus de bêta-lactamines dans le tube digestif apparaît ainsi naturellement comme une
stratégie permettant de diminuer la pression de sélection sur les bactéries commensales.
Pour tester cette hypothèse, Léonard et al. ont isolé des bactéries productrices de
bêta-lactamases du genre Bacteroides et Clostridium dans des fèces d’individus traités avec
de la ceftriaxone par voie intraveineuse et qui présentaient une activité bêta-lactamase (visà-vis de la ceftriaxone) dans leur fèces (80). Ils ont administré ces bactéries à des souris à
flore humanisée qui ne contenait pas de bactéries anaérobies productrices de bêtalactamases. Ils ont mis en évidence que l’administration des souches sélectionnées
prévenait des effets délétères de la ceftriaxone, c’est à dire la colonisation du tube digestif
par une souche de Candida albicans et une souche d’Enterobacter cloacae résistante à la
ceftriaxone.
Une stratégie thérapeutique combinant l’utilisation concomitante de bêta-lactamine et
de bêta-lactamase est donc envisageable. Cependant, il faut s’assurer que l’exposition
systémique de l’individu à la bêta-lactamine ne soit pas modifiée.
(b) Administration de bêta-lactamine par voie parentérale et de bêtalactamase par voie orale
Lorsque les bêta-lactamines sont administrées par voie parentérale, l’objectif est
d’inactiver les résidus de bêta-lactamines excrétés dans le tube digestif par la bile.
Harmoinen et al. ont validé cette approche chez le chien (64). Ils ont administré à des chiens
de l’ampicilline par voie intraveineuse. Trois minutes avant, ils avaient administré à ces
chiens des billes à enrobage gastro-résistant contenant une bêta-lactamase recombinante
de classe A, qui a été libérée très précocement dans le tractus digestif car toute l’ampicilline
présente dans le tube digestif devait être inactivée. Les résultats ont montré que
l’augmentation de l’activité bêta-lactamase dans le jéjunum était corrélée à la diminution des
concentrations en ampicilline dans le tube digestif. Par ailleurs, il n’y a aucune modification
des paramètres pharmacocinétiques au niveau sanguin. De plus, chez les chiens traités à
56
Etude bibliographique - chapitre 2
l’ampicilline + bêta-lactamase, les auteurs n’ont pas observé d’impact sur la diversité
bactérienne du tube digestif, ou de sélection d’entérobactéries résistantes.
La même équipe a montré qu’une bêta-lactamase de classe B administrée en même
temps que l’association piperacilline-tazobactam par voie sous-cutanée prévenait de la
colonisation du tube digestif de souris par des entérocoques résistants à la vancomycine
(124).
(c) Administration de bêta-lactamine et de bêta-lactamase par voie
orale
Lorsque l’on administre la bêta-lactamine par voie orale, la stratégie est plus
complexe. Si on veut administrer de façon concomitante la bêta-lactamine et la bêtalactamase, il faut que les bêta-lactamases soient vectorisées en dehors de la fenêtre
d’absorption de la bêta-lactamine afin de ne pas diminuer l’exposition systémique de
l’individu à l’antibiotique. Les antibiotiques sont majoritairement absorbés au niveau du tube
digestif proximal. En ce qui concerne l’amoxicilline, il a été montré chez l’homme, que
l’absorption était maximale dans le duodénum et le jéjunum. Elle est beaucoup moins
importante et saturable au niveau de l’iléon, et elle n’est pas du tout absorbée au niveau du
côlon (14). D’après ces données, les bêta-lactamases devraient être libérées au niveau de la
région iléo-colique, afin de ne pas interférer avec l’absorption des bêta-lactamines.
Cependant, il faut que les bêta-lactamases soient libérées avant que la bêtalactamine, administrée par voie orale, n’atteigne le caecum car la partie distale du tube
digestif contient les populations bactériennes les plus denses, et serait le véritable
amplificateur de bactéries résistantes. Récemment, une équipe a validé cette stratégie en
administrant à des rats de l’amoxicilline par voie orale, et des bêta-lactamases (de classe B)
in situ au niveau de l’iléon (66). L’inactivation de l’amoxicilline à ce niveau du tractus digestif
a permis d’éviter la multiplication d’entérobactéries résistantes. Dans l’optique de développer
une stratégie de co-administration de bêta-lactamines et de bêta-lactamases par voie orale,
le développement d’un enrobage à délivrance optimale sera donc le point crucial.
La délivrance colique a fait l’objet de nombreuses recherches afin de délivrer des
médicaments in situ, par exemple pour le traiter la maladie de Crohn, les colites ulcéreuses,
le cancer colorectal ou l’amibiase. Pour réussir la délivrance colique d’un médicament, il doit
être protégé de l’absorption et de l’environnement du tube digestif proximal, et il doit être
libéré uniquement au niveau du côlon proximal. Plusieurs stratégies peuvent être utilisées:
des prodrogues, des systèmes pH-dépendant, des systèmes temps-dépendant, des
57
Etude bibliographique - chapitre 2
systèmes pression-dépendant et des systèmes contrôlés par l’activité microbienne du côlon
(31).
La vectorisation utilisant l’activité microbienne du côlon a été récemment utilisée pour
développer des billes de bêta-lactamases à délivrance colique. Les billes de bêtalactamases ont été enrobées par de la pectine et protégées de la dégradation dans le tube
digestif proximal (17). L’enrobage à base de pectine permet une vectorisation colique car la
pectine est complètement dégradée par des pectinases qui ne sont présentes qu’au niveau
du côlon. La co-administration de ces billes à des rats en même temps que l’amoxicilline n’a
pas eu d’impact sur les paramètres pharmacocinétiques de l’antibiotique.
Dans le cadre de notre étude expérimentale, nous avons évalué chez le porc, la
libération d’un enrobage à dissolution pH-dépendante qui a été développé chez l’homme
pour obtenir une vectorisation iléo-colique: l’Eudragit® FS 30 D. L’utilisation de cet enrobage
s’inscrit dans une stratégie thérapeutique qui consiste à associer une prodrogue
d’ampicilline avec des billes contenant des bêta-lactamases. Cette stratégie est
développée dans le chapitre 4.
58
ETUDE EXPERIMENTALE
Objectifs
59
60
Etude expérimentale - objectifs
ETUDE EXPERIMENTALE
OBJECTIFS
La synthèse bibliographique a mis en évidence que la sélection de bactéries
résistantes dans la flore commensale digestive des animaux pouvait avoir un impact en
terme de santé publique lorsque ces bactéries sont transmises à l’homme. L’objectif de ce
travail de thèse a donc été d’évaluer des stratégies visant à diminuer l’excrétion de bactéries
résistantes d’origine digestive, lors d’antibiothérapie en médecine vétérinaire. Nous avons
choisi de travailler avec le modèle porc car la filière porcine consomme la plus grande part
des antibiotiques utilisés chez les animaux. De plus, l’utilisation majoritaire de la voie orale
conduit à une exposition massive des bactéries du tube digestif.
Nous nous sommes intéressés dans ce travail à l’impact des bêta-lactamines car
ces molécules constituent la classe d’antibiotique la plus utilisée en médecine humaine, et
elles sont également utilisées en médecine porcine. De plus, nous avons vu que le
développement de nouvelles bêta-lactamines pour contrecarrer les mécanismes de
résistance a toujours été suivi de l’émergence de nouveaux mécanismes de résistance (cf.
tableau 1). Dans ce contexte, il serait judicieux de développer une stratégie qui permette de
limiter l’excrétion et la dissémination de bactéries résistantes d’origine digestive lors
d’administration de bêta-lactamines, afin de préserver l’efficacité des molécules existantes.
En outre, une stratégie originale de destruction des résidus de bêta-lactamines dans le tube
digestif par des bêta-lactamases a été décrite dans la littérature par plusieurs auteurs (17,
63, 66).
Les objectifs de cette thèse ont été :
- de caractériser la résistance bactérienne dans la flore digestive lors de
l’administration d’ampicilline chez le porc et,
- d’évaluer une stratégie thérapeutique visant à diminuer l’excrétion de bactéries
résistantes digestives lors d’administration d’ampicilline.
Nous avons vu précédemment que deux options étaient envisageables afin de
diminuer la pression de sélection sur les bactéries digestives lors d’une antibiothérapie :
- optimiser le schéma thérapeutique de façon à limiter l’exposition de la flore digestive à
l’antibiothérapie et,
61
Etude expérimentale - objectifs
- inactiver les résidus d’antibiotique qui n’ont pas été absorbés ou qui ont été sécrétés dans
le tube digestif.
Dans la première partie de ce travail de thèse (chapitre 3), nous avons tout d’abord
évalué si trois modalités d’administration de l’ampicilline (voie intramusculaire, voie orale à
jeun et voie orale avec l’aliment) réalisables sur le terrain conduisaient à des résultats
différents en terme d’émergence de résistance. Nous avons également cherché à
comprendre l’origine de la résistance afin de mieux cerner la dynamique de son émergence
au sein de la population des souches d’E. coli digestives.
Dans la deuxième partie de ce travail (chapitre 4), nous avons entrepris l’évaluation
d’une stratégie consistant en la co-administration par voie orale d’un ester d’ampicilline (la
pivampicilline) et de bêta-lactamase à vectorisation colique. Le chapitre 4 décrit les études
préliminaires qui ont permis de déterminer les propriétés d’absorption de l’ester d’ampicilline,
et de caractériser les propriétés de délivrance de l’enrobage sélectionné dans le tube digestif
du porc.
62
ETUDE EXPERIMENTALE
Chapitre 3 : Evaluation de l’impact de trois
modalités d’administration de l’ampicilline sur le
niveau de résistance de la flore digestive du porc
et étude de la dynamique de l’émergence de la
résistance
63
64
Etude expérimentale - chapitre 3
Chapitre 3 : Evaluation de l’impact de trois modalités
d’administration de l’ampicilline sur le niveau de
résistance de la flore digestive du porc et étude de la
dynamique de l’émergence de la résistance
31- Introduction
Dans ce chapitre, nous avons évalué si des modalités d’administration différentes de
l’ampicilline conduisaient à un impact différent au niveau de l’émergence d’entérobactéries
résistantes dans la flore digestive. Nous avons également décrit la dynamique de
l’émergence de la résistance au sein des populations digestives d’E. coli.
Au cours d’une première étude, nous avons déterminé les profils pharmacocinétiques
de l’ampicilline par voie parentérale et par voie orale chez le porc, et nous en avons déduit
de manière indirecte l’exposition digestive pour ces deux voies d’administration.
Au cours d’une deuxième étude, nous avons mesuré le niveau de résistance de la
flore digestive après administration d’ampicilline selon trois modalités (voie intramusculaire,
voie orale à jeun et voie orale avec l’aliment). Dans l’optique de quantifier ce niveau de
résistance de façon pertinente, nous l’avons mesuré à l’aide de trois indicateurs : deux
indicateurs phénotypiques et un indicateur génotypique : la quantification des gènes blaTEM
dans les fèces par PCR en temps réel. Nous avons en effet développé ce nouvel outil dans
l’optique de quantifier les gènes blaTEM excrétés par les porcs lors d’administration
d’ampicilline. Les résultats sont présentés dans l’article 1.
Au cours d’une troisième étude, dont les résultats sont présentés dans l’article 2,
nous avons caractérisé l’impact de l’administration d’ampicilline sur les populations
digestives de souches d’E. coli. Pour ce faire, nous avons étudié par électrophorèse en
champ pulsé, la parenté entre des souches d’E. coli, qui ont été sélectionnées par
l’administration d’ampicilline, et qui présentaient des profils de résistance différents.
65
Etude expérimentale - chapitre 3
66
Etude expérimentale - chapitre 3
32- Etude de la biodisponibilité de l’ampicilline par voie
orale chez le porc
321- Problématique
Des expositions différentes des bactéries digestives à un antibiotique peuvent être à
l’origine d’impact différent en terme d’émergence de résistance au sein de la flore
commensale (cf. synthèse bibliographique). La voie orale conduit à une exposition digestive
massive et aurait donc l’impact le plus négatif en terme d’émergence de résistance. Nous
avons évalué la biodisponibilité absolue de l’ampicilline chez le porc afin d’estimer les
quantités résiduelles dans le tube digestif après administration orale d’ampicilline. Cette
étude a été conduite car il n’existe pas de données dans la littérature concernant la
biodisponibilité de l’ampicilline par voie orale chez le porc.
322- Objectif
Evaluer la biodisponibilité absolue de l’ampicilline par voie orale chez le porc.
323- Matériels et méthodes
(a) Plan expérimental
Quatre porcs ont été utilisés (13.3 kg à 17.9 kg). Des cathéters jugulaires ont été mis
en place sous anesthésie générale dans la veine jugulaire droite. L’entretien des cathéters a
été réalisé matin et soir. Le plan expérimental a été un cross-over à deux périodes avec un
temps de washout de 3 jours. Une dose de 20 mg/kg a été administrée par voie
intraveineuse et par voie orale. De l’ampicilline sodium (Ampicilline Cadril® 5G, Laboratoire
Coophavet) a été administrée par voie intraveineuse grâce à un cathéter placé dans la veine
auriculaire. Les prélèvements de sang ont été réalisés via le cathéter jugulaire et transvasés
dans des tubes héparinés à 0, 1, 2, 4, 8, 15, 30, 45 minutes et 1,1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 24
heures après l’administration d’ampicilline. Pour les administrations orales, des boulettes ont
été préparées avec de l’aliment, de l’eau, et le prémélange médicamenteux (Ampicilline 80
Porc Franvet®, Laboratoire Franvet). Les porcelets avaient été mis au préalable à jeun et ils
ont rapidement consommé les boulettes proposées. Ils ont eu ensuite accès à leur repas
67
Etude expérimentale - chapitre 3
quotidien. Les échantillons de sang ont été prélevés de la même manière à 0, 15, 30, 45
minutes et 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 24 heures après l’administration d’ampicilline.
Les échantillons ont été centrifugés (4 000 g, 10 min, 4°C) et le plasma stocké à -80°C.
(b) Dosage plasmatique de l’ampicilline
Les concentrations d’ampicilline dans le plasma ont été déterminées par HPLC
(chromatographie en phase liquide à haute performance) couplée à un détecteur UV
(ultraviolet) après extraction sur phase solide. Cinq cents microlitres de plasma et 50 µL de
standard interne (3-acetamidophenol, 1µg/mL) ont été déposés sur une cartouche SPE
(Bond Elut C8 Varian® 100mg) conditionnée avec 1 mL de méthanol et 1 mL d’eau
ultrapure, et passés lentement sous vide. La cartouche a été lavée avec 500 µL d’eau
ultrapure et les analytes ont été élués avec 1 mL de methanol / acide acétique (95:5, v/v).
L’extrait a été alors évaporé à 40°C sous azote et reconstitué dans 100 µL d’eau ultrapure.
Les tubes ont été vortexés et centrifugés à 20 000 g pendant 10 min. Cinquante microlitres
de surnageant ont été injectés dans le système HPLC. Les analyses ont été effectuées par
un système Agilent comprenant une pompe isocratique 1100, un passeur d’échantillon 1100
et un détecteur UV 1050. Les données ont été acquises et traitées par le logiciel
ChenStation. La phase mobile était constituée d’un mélange de tampon acétate 5 mM pH 4
et d’acétonitrile (8:92, v/v), pompée à 0.7mL/min au travers d’une colonne (Inertsil ODS3®
C18, 3µm, 150 x 4mm) équipée d’une précolonne (Inertsil ODS3 10x4mm) à 40°C. Les pics
étaient visibles par absorbance UV à 230 nm de longueur d’onde.
Les pourcentages d’extraction calculés pour le standard interne étaient compris entre
69 et 92%. Les données (rapport aire de la molécule / aire du standard interne vs
concentration) sont obtenues avec une régression linéaire incluant une composante
quadratique pondérée 1/X². La courbe de calibration a été établie pour des concentrations
allant de 0.125 à 20 µg/mL. La validation de la méthode a été effectuée avec 4 points de
contrôle qualité aux concentrations suivantes : 0.4, 1.25, 7.5 et 15 µg/mL. L’opération a été
répétée 6 fois durant 3 jours. Les précisions intra- et inter-jour étaient inférieures à 12% et
l’exactitude était comprise entre 95 et 104%. La limite de quantification a été établie à 0.125
µg/mL avec une précision de 4% et une exactitude de 96%.
(c) Analyse des résultats
Les concentrations plasmatiques d’ampicilline en fonction du temps ont été analysées
à l’aide d’une approche non compartimentale avec le logiciel WinNonlin (WinNonlin 5.2,
Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Les paramètres pharmacocinétiques ont été
68
Etude expérimentale - chapitre 3
calculés grâce aux équations classiques (60). L’aire sous la courbe des concentrations
plasmatiques en fonction du temps (AUC) a été calculée selon la méthode des trapèzes. La
clairance plasmatique (Cl) a été calculée en divisant la dose administrée par l’AUC obtenue
après administration par voie intraveineuse. Le temps de demi-vie (t1/2) a été calculé selon
l’équation suivante : t1/2=ln2/ λz, où λz est la pente de la phase terminale, calculée par
régression linéaire sur le logarithme des concentrations. Le volume de distribution à
l’équilibre (Vss) a été calculé selon l’équation suivante : Vss=(Dose*AUMC)/AUC2, où l’AUMC
est l’aire sous la courbe du premier moment statistique. Pour la voie orale, le pic des
concentrations (Cmax) et le temps associé (Tmax) ont été obtenus directement à partir des
données. La biodisponibilité absolue (F) a été calculée en divisant l’AUC individuelle obtenue
après administration par voie orale par l’AUC individuelle obtenue après administration par
voie intraveineuse.
324- Résultats
Les résultats sont présentés dans la figure 2 et le tableau 7. Après administration par
voie intraveineuse, l’ampicilline a été distribuée et éliminée rapidement. Après administration
par voie orale, les concentrations plasmatiques ont atteint un pic de 0.43 µg/mL à 1.63
heures. L’ampicilline a été très peu absorbée car sa biodisponibilité absolue n’était que de
6.16%.
Concentration d'ampicilline
(µg/mL)
Concentration d'ampicilline
(µg/mL)
a)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
b)
100
10
1
0.1
0.01
0
100
200
300
400
Temps (min)
Voie intraveineuse
Voie orale porc nourri
0
100
200
300
400
Temps (min)
Voie intraveineuse
Voie orale porc nourri
Figure 2 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (1)
(moyennes ± écart-type) en fonction du temps (min) après administration d’ampicilline par
voie intraveineuse et par voie orale à la dose de 20 mg/kg, n=4. L’échelle des concentrations
est arithmétique a) et logarithmique b).
69
Etude expérimentale - chapitre 3
Tableau 7 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (2)
(moyennes ± écart-type) après administration par voie intraveineuse et par voie orale à la
dose de 20 mg/kg, n=4.
mg.h/L
Voie
intraveineuse
24.5 ± 2.3
b
L/kg
0.46 ± 0.07
c
L/h/kg
0.23 ± 0.02
Unités
AUCa
Vss
Cl
Voie orale porc
nourri
1.46 ± 0.58
Cmaxd
µg/mL
0.43 ± 0.15
Tmaxe
t1/2f
g
h
1.63 ± 0.43
F
h
%
0.77
6.16 ± 2.83
a
AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, b Vss :
volume de distribution à l’équilibre, c Cl : clairance plasmatique, d Cmax : concentration
plasmatique maximale, e Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique
maximale, f t1/2 : temps de demi-vie, g F : biodisponibilité absolue
325- Discussion
Après administration par voie intraveineuse, l’ampicilline a été rapidement distribuée
et éliminée. Les paramètres pharmacocinétiques que nous avons obtenus sont comparables
à ceux décrits dans la littérature chez le porc (9, 139). D’autre part, nous avons évalué que la
biodisponibilité absolue de l’ampicilline par voie orale chez le porc nourri était de 6.16%.
L’absorption de l’ampicilline par voie orale est donc très faible chez le porc. Elle est
comparable à celle du cheval à jeun : 2% (49) et à celle du veau respectivement nourri et à
jeun : 4.53% et 12.08% (141).
L’administration par voie intraveineuse devrait conduire à l’exposition la moins
importante du tube digestif à l’ampicilline. Après administration par voie intraveineuse chez
l’homme, l’ampicilline était présente dans la bile à des concentrations équivalentes aux
concentrations plasmatiques (72). L’ampicilline est alors secrétée au niveau du tube digestif,
ce qui explique qu’après un délai de 30 minutes, Galtier et Charpenteau ont mesuré des
concentrations d’ampicilline de l’ordre de 4 µg/g dans les contenus digestifs de porc, après
leur avoir administré 20 mg/kg d’ampicilline par voie intraveineuse (55). En ce qui concerne
la voie orale, compte tenu de la biodisponibilité absolue très faible de l’ampicilline chez le
porc, la majorité de la dose d’ampicilline administrée reste au niveau du compartiment
digestif et pourrait donc exercer une pression de sélection importante sur les bactéries
digestives.
70
Etude expérimentale - chapitre 3
L’administration d’ampicilline par voie intraveineuse et par voie orale devrait donc
conduire à des concentrations d’ampicilline très différentes au niveau du tube digestif,
l’administration par voie orale entraînant une exposition massive des bactéries du tube
digestif. Par ailleurs, lors d’administration par voie orale, le statut digestif peut modifier
l’exposition des bactéries à l’ampicilline. En effet, le contenu digestif peut être à l’origine de
divers phénomènes de fixation qui rendent l’antibiotique inactif (69). Les concentrations
libres d’antibiotique, mesurables par dosage microbiologique, peuvent dans ce cas être
diminuées et l’exposition des bactéries digestives à l’antibiotique moins importante. Le
contenu alimentaire peut aussi être à l’origine d’une diminution de l’absorption des bêtalactamines. L’absorption de l’amoxicilline est diminuée chez le porc lorsqu’elle est
administrée par voie orale en même temps que l’aliment (5, 36). Dans le cas d’une
diminution de la biodisponibilité de l’ampicilline liée à la prise de nourriture, l’exposition du
tube digestif à l’antibiotique serait augmentée en terme de concentrations totales, alors que
dans le même temps la présence de fibres dans la lumière intestinale pourrait provoquer une
diminution des concentrations libres biologiquement actives.
En conclusion, les données expérimentales obtenues dans cette étude associées aux
données de la littérature concernant l’effet de l’alimentation sur la biodisponibilité des bêtalactamines suggèrent que la voie d’administration et le statut digestif conduisent à des
expositions différentes du tractus intestinal.
71
Etude expérimentale - chapitre 3
72
Etude expérimentale - chapitre 3
33- Impact de trois modalités d’administration de
l’ampicilline sur le niveau de résistance des
entérobactéries digestives du porc
331- Problématique
Au regard des résultats de l’étude précédente et des données de la littérature
concernant l’impact du statut digestif sur la biodisponibilité des bêta-lactamines, nous avons
fait l’hypothèse que les trois modalités d’administration de l’ampicilline suivantes : la voie
intramusculaire, la voie orale chez le porc à jeun et la voie orale chez le porc nourri
pouvaient conduire à des expositions différentes du tube digestif. Nous avons voulu évaluer
si ces modalités d’administration entraînaient un développement de résistance différent au
niveau de la flore digestive.
Nous avons vu dans la synthèse bibliographique, qu’il était difficile d’obtenir une
mesure exacte du niveau de résistance de la flore commensale. C’est pourquoi nous avons
utilisé trois méthodes pour évaluer ce niveau de résistance: deux indicateurs phénotypiques
et un indicateur génotypique. Dans l’optique de quantifier le réservoir de gènes de résistance
à l’ampicilline dans le tube digestif, et d’estimer les quantités de gènes excrétés par le porc
au cours du traitement, nous avons en effet développé un nouvel outil: la quantification des
gènes blaTEM par PCR en temps réel.
332- Objectif
L’objectif de cette étude était triple :
1- Développer et valider une méthode de PCR en temps réel afin de quantifier les
gènes blaTEM dans les fèces, et comparer cet indicateur génotypique à des indicateurs
phénotypiques.
2- Evaluer l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline (voie
intramusculaire, voie orale chez le porc à jeun, voie orale chez le porc nourri) grâce à ces
trois indicateurs.
3- Déterminer les profils pharmacocinétiques de ces trois modalités d’administration.
73
Etude expérimentale - chapitre 3
333- Etude de l’impact de trois modalités d’administration de
l’ampicilline sur l’excrétion d’entérobactéries résistantes et de
gènes blaTEM dans les fèces de porc
La majorité des résultats de cette étude sont présentés dans l’article 1.
(a) Matériels et méthodes
Dix-huit porcs, âgés de 7 semaines à leur arrivée, ont été utilisés. L’ampicilline a été
administrée pendant 7 jours à la dose de 20 mg/kg/jour* selon trois modalités (trois groupes
de quatre porcs) : voie orale au cours du repas, voie orale à jeun et voie intramusculaire. Le
quatrième groupe (6 porcs) a servi de groupe témoin. Le niveau de résistance à l’ampicilline
a été mesuré grâce à trois méthodes:
- deux méthodes phénotypiques :
- le pourcentage d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline après dénombrement
sur milieu Mac Conkey en absence et en présence d’ampicilline,
- l’évaluation de la CMI de l’ampicilline sur 20 souches d’E. coli isolées.
- une méthode génotypique : la quantification des gènes blaTEM dans les fèces de porc par
PCR en temps réel utilisant le SYBR green.
Les prélèvements de fèces ont été réalisés avant traitement et un, quatre et sept jours après
le début du traitement pour les mesures phénotypiques, et tous les jours pour les mesures
génotypiques. Un modèle linéaire généralisé à effets mixtes a été utilisé pour l’analyse
statistique.
Le plan expérimental, la méthodologie et les analyses statistiques sont détaillés de façon
exhaustive dans l’article 1.
* Nous avons administré 20 mg/kg/jour par voie orale et par voie intramusculaire. C’est la
posologie recommandée dans le Dictionnaire des Médicaments Vétérinaires pour la voie
orale. Concernant la voie intramusculaire, la posologie recommandée est de 7 mg à 14
mg/kg/12 heures.
74
Etude expérimentale - chapitre 3
(b) Résultats présentés dans l’article 1
Indicateurs phénotypiques du niveau de résistance : figure 3
Pourcentage d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline :
Avant traitement, le pourcentage d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline était
compris entre 2.5% et 12% pour les quatre groupes de porcs. Aux quatrième et septième
jours de traitement, ces pourcentages étaient supérieurs à 50% pour les 3 groupes traités et
toujours inférieurs à 15% dans le groupe témoin. L’analyse statistique a indiqué une
augmentation significative (p<0.05) du pourcentage d’entérobactéries résistantes à
l’ampicilline dans les trois groupes traités par rapport au groupe témoin, mais pas de
différence significative entre les trois modalités d’administration.
Pourcentage de souches d’ E. coli résistantes :
La détermination de la fréquence des souches d’E. coli ayant une CMI
d’ampicilline≥32 µg/mL (valeur critique proposée par le CLSI) a montré qu’avant traitement,
selon les groupes de porc, 1% à 38% des souches d’E. coli étaient résistantes à l’ampicilline.
Au quatrième et septième jour de traitement, la majorité des souches d’E. coli était résistante
chez les porcs traités alors que seulement 36% étaient résistantes chez les porcs témoins.
L’analyse statistique a pu mettre en évidence une différence significative (p<0.05) dans
l’excrétion de souches d’E. coli résistantes entre la voie orale chez les porcs nourris et les
porcs témoins. Les deux autres modalités d’administration n’ont pas montré de différence
par rapport au groupe témoin probablement à cause d’une grande variabilité à l’intérieur du
groupe témoin et de la faible puissance statistique de l’essai.
75
120
% E. coli résistants
% entérobactéries résistantes
Etude expérimentale - chapitre 3
100
80
60
40
20
0
120
100
80
60
40
20
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Temps (jours)
0
1
2
3
4
5
6
7
Temps (jours)
Figure 3 : Pourcentages d’entérobactéries et de souches d’E. coli résistantes
(moyennes ± écart-type) après administration d’ampicilline à la dose de 20 mg/kg par la voie
intramusculaire (▲) (n=4), par la voie orale chez le porc à jeun (■) (n=4), et par la voie orale
chez le porc nourri (□) (n=4). Six porcs ont été utilisés comme témoins (●).
Quantification des gènes blaTEM :
La spécificité de l’amplification par PCR en temps réel des gènes blaTEM, la qualité de
la courbe standard, la qualité de l’extraction et l’absence d’inhibiteurs ont été contrôlées. La
technique de PCR quantitative a été validée pour des quantités de gènes blaTEM comprises
entre 104 et 109 copies/g de fèces (cf. résultats de validation présentés dans l’article 1).
Avant traitement, les quantités de gènes blaTEM étaient au dessous de 107 copies/g de
fèces (figure 4). Au cours du traitement, ces quantités ont fluctué entre 104-106 copies/g pour
le groupe témoin, 107-109 copies/g pour les deux voies orales et 106-108 copies/g pour la
voie intramusculaire (cf. résultats individuels présentés dans l’article 1). Les quantités de
gènes blaTEM excrétées ont été significativement plus importantes pour les animaux traités
que pour le groupe témoin (p<0.001), et plus élevées pour la voie orale au cours du repas
que pour la voie intramusculaire (p<0.05).
76
copies de gènes bla TEM/ g de fèces
Etude expérimentale - chapitre 3
1 E+10
1 E+9
1 E+8
1 E+7
1 E+6
1 E+5
1 E+4
0
1
2
3
4
5
6
7
Temps (jours)
Figure 4 : Nombre de copies de gènes blaTEM/g de fèces
(moyennes ± écart-type) après administration d’ampicilline à la dose de 20 mg/kg par la voie
intramusculaire (▲) (n=4), par la voie orale chez le porc à jeun (■) (n=4), et par la voie orale
chez le porc nourri (□) (n=4). Six porcs ont été utilisés comme témoins (●).
Enfin, la comparaison entre les quantités de gènes blaTEM et les dénombrements des
entérobactéries résistantes respectifs a montré une corrélation significative (r2=0.67) (figure
Log (entérobactéries résistantes à
l'ampicilline/g de fèces)
5).
12
2
R = 0.67
11
10
9
8
7
6
5
4
3
3
5
7
9
11
Log (bla TEM/g de fèces)
Figure 5 : Comparaison entre le log du nombre de copies de gènes blaTEM/g de fèces et
le log des dénombrements d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline/g de fèces
77
Etude expérimentale - chapitre 3
(c) Résultats complémentaires à ceux présentés dans l’article 1
La distribution des CMI aux jours 0, 1, 4 et 7 pour les porcs témoins et traités est
donnée dans la figure 6. Avant traitement, environ 20% de l’ensemble des souches d’E. coli
étaient résistantes à l’ampicilline (c'est-à-dire ayant une CMI ≥ 32 µg/mL). Après 7 jours de
traitement, pour les porcs traités la majorité des souches étaient résistantes avec des CMI
supérieures à 256 µg/mL.
Jour 1
20
Jour 4
CMI (µg/mL)
>2
56
25
6
20
>2
56
25
6
12
8
64
32
16
0
8
25
6
>2
56
64
12
8
32
8
16
4
2
0
40
4
20
60
2
40
80
1
60
100
0.
5
% de souches de E. coli
80
1
12
8
Jour 7
100
0.
5
64
CMI (µg/mL)
CMI (µg/mL)
% de souches de E. coli
32
0
8
32
64
12
8
25
6
>2
56
8
16
4
2
1
0
40
16
20
4
40
60
2
60
80
1
80
100
0.
5
% de souches de E. coli
100
0.
5
% de souches de E. coli
Jour 0
CMI (µg/mL)
Figure 6 : Distribution des CMI des souches d’E. coli aux jours 0, 1, 4 et 7
pour les porcs témoins ( ) et pour les porcs ayant reçu l’ampicilline par voie intramusculaire
( ), par voie orale à jeun ( ), et par voie orale en même temps que l’aliment ( ), n=320
souches à chaque jour.
78
Etude expérimentale - chapitre 3
334- Etude pharmacocinétique des trois modalités
d’administration de l’ampicilline
Dans le but d’évaluer de manière indirecte l’exposition du tube digestif à l’ampicilline
pour les trois modalités d’administration, une étude pharmacocinétique a été réalisée sur les
porcs après les 7 jours de traitement pendant lesquels l’effet sur la flore de l’antibiothérapie a
été évalué.
(a) Matériels et méthodes
Les prélèvements de sang ont été réalisés par ponction directe au niveau du sinus
veineux jugulaire droit en utilisant des tubes héparinés. Les prélèvements de sang ont été
réalisés avant et 15, 30 minutes et 1, 1.5, 2, 3, 4 et 6 heurs après l’administration par voie
orale et 10, 15, 30 minutes et 1, 2, 3, 4 et 6
heures après l’administration par voie
intramusculaire. Les échantillons ont été centrifugés (4 000 g, 10 min, 4°C) et le plasma
stocké à -80°C.
Le dosage plasmatique de l’ampicilline a été réalisé selon la méthode décrite la
section 31.
Les concentrations plasmatiques d’ampicilline en fonction du temps ont été analysées
à l’aide d’une approche non compartimentale avec le logiciel WinNonlin (WinNonlin 5.2,
Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Les paramètres pharmacocinétiques ont été
calculés grâce aux équations classiques (60). L’aire sous la courbe des concentrations
plasmatiques en fonction du temps (AUC) a été calculée selon la méthode des trapèzes. Le
pic des concentrations (Cmax) et le temps associé (Tmax) ont été obtenus directement à partir
des données. La biodisponibilité relative (Frelative) a été calculée en divisant l’AUC moyenne
obtenue après administration d’ampicilline par voie orale par l’AUC moyenne obtenue après
administration par voie intramusculaire. Pour comparer les AUC un test de Tukey a été
utilisé après une transformation logarithmique des données.
(b) Résultats
Les résultats sont présentés dans la figure 7 et le tableau 8. Suite à l’administration
par voie intramusculaire, un pic des concentrations plasmatiques de 24.7 µg/mL a été atteint
à 0.44 heures, puis les concentrations ont décliné rapidement. Pour les voies orales, le pic
des concentrations plasmatiques était moins élevé et retardé chez les porcs nourris par
rapport aux porcs à jeun : 0.49 µg/mL à 2.13 heures pour les porcs nourris contre 3.26
µg/mL à 0.75 heures pour les porcs à jeun. Les biodisponibilités relatives des voies orales
79
Etude expérimentale - chapitre 3
étaient basses et significativement différentes: 20.3% chez le porc à jeun et 7.5% chez le
porc nourri.
a)
b)
100.0
30
Concentration
d'ampicilline (µg/mL)
Concentration
d'ampicilline (µg/mL)
35
25
20
15
10
5
0
10.0
1.0
0.1
0.0
0
100
200
300
400
0
Temps (min)
100
200
300
400
Temps (min)
Voie orale porc nourri
Voie orale porc à jeun
Voie intramusculaire
Voie orale porc nourri
Voie orale porc à jeun
Voie intramusculaire
Figure 7 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (2)
(moyennes ± écart-type) en fonction du temps (min) après administration d’ampicilline par
voie intramusculaire, par voie orale chez le porc nourri et le porc à jeun à la dose de 20
mg/kg, n=4. L’échelle des concentrations est arithmétique a) et logarithmique b).
Tableau 8 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (3)
(moyennes ± écart-type) après administration par voie intramusculaire et par voie orale chez
le porc nourri et le porc à jeun à la dose de 20 mg/kg, n=4.
Cmaxa
Tmaxb
AUCc
Frelatived
µg/mL
h
mg.h/L
%
Intramusculaire
24.7 ± 8.3
0.44 ± 0.13
30.7* ± 9.2
100
Orale porc à jeun
3.26 ± 1.9
0.75 ± 0.3
6.22* ± 2.74
20.3*
Orale porc nourri
0.49 ± 0.2
2.13 ± 0.6
2.29* ± 0.9
7.5*
Voie d’administration
* Les valeurs sont significativement différentes entre les groupes (p<0.05). a Cmax :
concentration plasmatique maximale, b Tmax : temps d’occurrence de la concentration
plasmatique maximale, c AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en
fonction du temps, d Frelative : biodisponibilité relative
80
Etude expérimentale - chapitre 3
335- Discussion générale
L’objectif de ce travail était d’évaluer l’impact de trois modalités d’administration de
l’ampicilline sur le niveau de résistance de la flore digestive au moyen de trois indicateurs :
deux indicateurs phénotypiques et un indicateur génotypique que nous avons validé : la
quantification des gènes blaTEM dans les fèces de porc. Les trois modalités d’administration
testées étaient : la voie intramusculaire, la voie orale chez le porc à jeun et la voie orale chez
le porc nourri.
Les
indicateurs
phénotypiques
ont
révélé
une
augmentation
massive
d’entérobactéries et de souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline au cours du traitement,
avec des CMI supérieures à 256 µg/mL. Des modifications marquées de l’écosystème
digestif et notamment la sélection d’entérobactéries résistantes, ont été décrites lors
d’administration de bêta-lactamines dans plusieurs espèces (50, 93, 125). L’analyse
statistique a mis en évidence que les porcs traités excrétaient plus d’entérobactéries
résistantes que les porcs témoins. Concernant le deuxième indicateur phénotypique:
l’excrétion de souches d’E. coli résistantes, une différence significative a seulement pu être
mise en évidence entre les porcs qui avaient reçu l’ampicilline par voie orale au cours du
repas et les porcs témoins. L’absence de différence significative entre les deux autres
modalités d’administration et les porcs témoins pour cet indicateur a probablement pour
origine une grande variabilité dans le groupe témoin. Dans nos conditions expérimentales, la
détermination de la fréquence des entérobactéries résistantes s’est révélée plus pertinente
que l’évaluation du pourcentage de souches d’E. coli résistantes.
La fréquence d’entérobactéries résistantes a été déterminée sur l’ensemble de la
population des entérobactéries alors que le pourcentage de souches d’E. coli résistantes a
été calculé à partir de 20 souches isolées. Dans la plupart des programmes de surveillance,
la recherche de la résistance aux antibiotiques est effectuée sur une seule souche d’E. coli
par prélèvement. Récemment une étude a comparé les résultats obtenus avec cette
méthodologie aux résultats obtenus en déterminant la fréquence d’entérobactéries
résistantes par prélèvement. Les auteurs ont conclu que l’estimation de la fréquence
d’entérobactéries résistantes pouvait permettre d’obtenir des données quantitatives utiles
dans l’analyse de l’association entre la consommation d’antibiotiques et le développement de
résistance (134). Cette conclusion est à rapprocher de nos résultats qui ont montré que la
détermination de la fréquence des entérobactéries résistantes nous a permis de quantifier de
81
Etude expérimentale - chapitre 3
manière pertinente le niveau de résistance de la flore digestive des porcs lors
d’administration d’ampicilline.
Par ailleurs, dans l’optique de quantifier la résistance à l’ampicilline au niveau de la
biomasse bactérienne totale, nous avons développé un outil de quantification des gènes
blaTEM dans les fèces par PCR en temps réel. En effet, nous avons vu dans la synthèse
bibliographique que les gènes blaTEM codent pour les bêta-lactamases de type TEM qui sont
majoritairement responsables de la résistance à l’ampicilline chez les entérobactéries. Nous
avons quantifié ces gènes par PCR en temps réel car cette technique présente de nombreux
avantages : elle est sensible, elle permet de quantifier grâce à une courbe de calibration des
gènes provenant de matrices variées, et elle permet une quantification au niveau de la
biomasse bactérienne totale sans mise en culture des bactéries. Cette technique a été
utilisée pour ces avantages afin de quantifier des gènes de résistance provenant de matrices
variées et complexes (30, 85, 86).
La quantification des gènes blaTEM a permis, dans nos conditions expérimentales, de
détecter des différences parmi trois modalités d’administration de l’ampicilline, alors que
l’analyse phénotypique ne permettait pas de les distinguer. Afin de comparer cet indicateur
génotypique aux indicateurs phénotypiques, nous avons comparé les dénombrements des
entérobactéries résistantes à l’ampicilline par gramme de fèces et les quantités de gènes
blaTEM par gramme de fèces. Il existe une corrélation significative entre les résultats obtenus
avec ces deux techniques. Les divergences étant en partie dues probablement à
l’imprécision des deux techniques, au fait que les gènes blaTEM peuvent être présents dans
des bactéries autres que les entérobactéries, et qu’il existe d’autres mécanismes de
résistance à l’ampicilline chez les entérobactéries (cf. synthèse bibliographique).
Concernant l’impact des modalités de traitement, il est apparu que l’administration
d’ampicilline par voie orale chez des porcs nourris conduisait à l’excrétion la plus importante
de gènes blaTEM. Par ailleurs, les résultats pharmacocinétiques ont montré que parmi les
deux voies orales, la modalité d’administration avec l’aliment avait la plus faible
biodisponibilité. En effet, la prise de nourriture concomitante à la prise de bêta-lactamine par
voie orale diminue l’absorption de l’antibiotique chez le porc (70), le chien (77) et l’homme
(136). On peut supposer que parmi les trois modalités d’administration testées, la voie orale
chez le porc nourri est celle qui a conduit à l’exposition la plus importante des bactéries du
tube digestif. Cependant, la voie intramusculaire a conduit à une exposition suffisamment
importante au niveau du tube digestif pour sélectionner les entérobactéries résistantes et
éliminer les sensibles.
82
Etude expérimentale - chapitre 3
En conclusion, l’ensemble des résultats indique que notre technique de quantification
des gènes blaTEM par PCR en temps réel apparaît comme étant un outil prometteur pour
l’évaluation de l’impact des traitements antibiotiques chez l’animal. De plus, cet outil peut
aussi être utilisé pour quantifier les gènes de résistance dans des environnements divers et
pourrait permettre d’appréhender les flux de gènes de résistance entre les réservoirs
animaux et humains.
Grâce à cet indicateur génotypique et aux indicateurs phénotypiques, nous avons mis
en évidence que des différences d’exposition peuvent conditionner des niveaux de
résistance différents au niveau de la flore digestive. Cependant, les trois modalités
d’administration testées ont toutes été à l’origine d’un impact négatif sur l’écosystème
digestif, et de nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être envisagées afin de prévenir
l’émergence de résistance lors d’administration d’ampicilline.
83
Etude expérimentale - article 1
84
Etude expérimentale - article 1
Article 1
Impact of three ampicillin dosage regimens on selection of ampicillin
resistance in Enterobacteriaceae and excretion of blaTEM genes in swine
feces
D. Bibbal, V. Dupouy, J.P. Ferré, P.L. Toutain, O. Fayet, M.F. Prère, and A.
Bousquet-Mélou
Applied and Environmental Microbiology, Aug 2007; 73(15) : 4785-90
85
Etude expérimentale - article 1
86
Etude expérimentale - article 1
87
Etude expérimentale - article 1
88
Etude expérimentale - article 1
89
Etude expérimentale - article 1
90
Etude expérimentale - article 1
91
Etude expérimentale - article 1
92
Etude expérimentale - chapitre 3
34- Etude de la parenté par électrophorèse en champ
pulsé des souches d’E. coli isolées de fèces de porc
durant l’administration d’ampicilline
La majorité des résultats de cette étude sont présentés dans l’article 2.
341- Problématique
Au cours de l’étude précédente, nous avons vu que l’administration d’ampicilline
conduisait à l’émergence massive de souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline. Nous
avons aussi mis en évidence que la résistance à l’ampicilline des entérobactéries d’origine
digestive était significativement corrélée à la présence des gènes blaTEM.
Les mécanismes populationnels qui concourent à l’émergence de résistance au cours
d’une antibiothérapie ont été peu étudiés. Nous avons donc voulu explorer la dynamique de
l’émergence de résistance au sein de la population digestive des souches d’E. coli au cours
de ce traitement à l’ampicilline. Deux mécanismes peuvent contribuer à l’émergence de
résistance au sein de la population digestive des E. coli lors d’une pression de sélection
exercée par l’ampicilline :
- des souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline préexistantes dans le tube digestif
peuvent être sélectionnées,
- les gènes blaTEM, qui sont situés sur des éléments génétiques mobiles (84, 104),
peuvent être transmis par transfert horizontal à des souches d’E. coli, qui étaient au
préalable sensibles à l’ampicilline.
342- Objectif
L’objectif de cette étude a été de déterminer si l’ampicilline avait sélectionné des
souches d'E. coli résistantes préexistantes dans le tube digestif ou si des souches
préalablement sensibles avaient acquis un mécanisme de résistance à l’ampicilline.
343- Matériels et méthodes
Nous avons réalisé cette étude à partir des prélèvements issus de la phase
expérimentale décrite dans l’article 1. Les prélèvements de fèces provenaient des 12 porcs
93
Etude expérimentale - chapitre 3
qui ont été traités à l’ampicilline pendant 7 jours et de 4 porcs témoins. Les homogénats de
fèces qui ont été recueillies avant traitement et un, quatre et sept jours après le début du
traitement ont été ensemencés sur gélose Mac Conkey. De plus, afin de sélectionner des
bactéries résistantes avant le traitement, les homogénats de fèces recueillies avant
traitement ont été ensemencés sur gélose Mac Conkey contenant de l’ampicilline (Jour 0
AmpR). Pour chaque porc, à chaque temps de prélèvement, 5 colonies ont été prélevées et
confirmées comme étant des souches d’E. coli à l’aide de galerie API 20E. Pour chaque
souche, le profil de résistance à 13 antibiotiques a été déterminé par antibiogramme. Les 13
disques utilisés dans cette étude ont été les suivants : ampicilline, amoxicilline+acide
clavulanique, céfalotine, ceftiofur, gentamicine, kanamycine, néomycine, acide nalidixique,
ciprofloxacine, tétracycline, chloramphénicol, triméthoprime, sulfonamides. Le groupe
phylogénétique de chaque souche a été défini ainsi que son pulsotype par électrophorèse en
champ pulsé après digestion de son ADN par l’enzyme Xba1. Les déterminants génétiques
de la résistance et les gènes codant pour les intégrases 1 et 2 ont été recherchés par PCR
chez des souches appartenant aux phénotypes de résistance majoritaires.
La méthodologie est détaillée de façon exhaustive dans l’article 2.
344- Résultats présentés dans l’article 2
(a) Résistances associées à l’ampicilline
Le tableau 9 présente les pourcentages de souches d’E. coli résistantes à
l’ampicilline, à la céfalotine, au chloramphénicol, à la tétracycline, au triméthoprime, à la
streptomycine et aux sulfonamides. Aucune souche d’E. coli n’a présenté de résistance visà-vis du ceftiofur. Trois souches étaient résistantes à l’association amoxicilline + acide
clavulanique et deux souches étaient résistantes à la gentamicine, à la kanamycine, à la
néomycine, à la ciprofloxacine et à l’acide nalidixique. Avant traitement, seulement 23% des
souches d’E. coli étaient sensibles à tous les antibiotiques testés. La plupart des souches
étaient résistantes à la tétracycline (69%). Avant traitement, seulement 6% des souches
étaient résistantes à l’ampicilline. Aux quatrième et septième jours de traitement, ce
pourcentage était au dessus de 90%, et le pourcentage de résistance au chloramphénicol, à
la tétracycline, au triméthoprime, à la streptomycine et aux sulfonamides avait aussi
augmenté.
94
Etude expérimentale - chapitre 3
Tableau 9 : Pourcentage de souches d’E. coli résistantes
chez les porcs témoins et les porcs traités à l’ampicilline avant le traitement, et quatre et sept
jours après le début du traitement.
Jour 0
Antibiotique
Ampicilline
Céfalotine
Chloramphénicol
Tétracycline
Triméthoprime
Streptomycine
Sulfonamides
Sensible
(n=78)
6
0
3
69
45
20
46
23
Jour 4
Traités
Témoins
(n=60)
(n=20)
93
25
3
5
32
0
90
85
58
0
82
25
63
0
0
0
Jour 7
Traités
Témoins
(n=57)
(n=20)
96
25
7
0
56
0
89
65
68
5
86
20
77
10
4
0
En effet, les souches résistantes à l’ampicilline qui sont apparues au cours du
traitement sont majoritairement multirésistantes, c'est-à-dire qu’elles sont résistantes à au
moins quatre antibiotiques (tableau 10). De plus, tous les profils de résistance sélectionnés
par l’administration d’ampicilline étaient déjà présents avant traitement parmi les souches
d’E. coli prélevées sur gélose supplémentée en ampicilline (Jour 0 AmpR). Le phénotype
résistant à l’ampicilline majoritaire était résistant à cinq antibiotiques additionnels :
chloramphénicol, sulfonamides, tétracycline, triméthoprime et streptomycine. Ce phénotype
représentait 53% des souches après sept jours de traitement. Par ailleurs, il était majoritaire
au sein des souches résistantes à l’ampicilline avant traitement car il représentait 48% des
souches sélectionnées sur gélose supplémentée avec de l’ampicilline avant le début du
traitement (Jour 0 AmpR).
95
Etude expérimentale - chapitre 3
Tableau 10 : Pourcentages des phénotypes résistants à l’ampicilline
parmi les souches d’E. coli prélevées sur les porcs traités aux jours 0, 4 et 7, et parmi les
souches sélectionnées sur gélose supplémentée en ampicilline avant traitement (Jour 0
AmpR) a.
Jour 0
(n=78)
Profil de résistance b
Amp Te
Amp Te Str
Amp Sul Te Str
Amp Chl Sul Trim Str
Amp Sul Te Trim Str
Amp Chl Sul Te Trim Str
5
5
Jour 4
(n=60)
7
8
15
2
18
32
Jour 7
(n=57)
5
9
9
5
4
53
Jour 0 AmpR
(n=73)
2
11
2
20
4
48
a
seuls les six phénotypes majoritaires sont présentés; b Amp : ampicilline, Chl :
chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim : triméthoprime, Str :
streptomycine
(b) Composition génétique des populations d’E. coli
La détermination de la fréquence des groupes phylogénétiques a mis en évidence un
changement dans la composition des populations d’E. coli : avant traitement 75% des
souches appartenaient au groupe B1, alors qu’après sept jours de traitement, 85% des
souches appartenaient au groupe A (figure 8).
100
80
60
40
20
Jour 0
Jour 4
A
B1
Contrôles
Traités
Contrôles
Traités
0
Jour 7
B2
Jour 0
AmpR
D
Figure 8 : Pourcentage des groupes phylogénétiques
A, B1, B2 et D des souches d’E. coli isolées chez les porcs traités à l’ampicilline et chez les
porcs témoins, et des souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline avant le début du
traitement (Jour 0 AmpR).
96
Etude expérimentale - chapitre 3
(c) Parenté des souches sélectionnées par le traitement
Caractéristiques et distribution des pulsotypes :
L’électrophorèse en champ pulsé des 308 souches d’E. coli a permis de définir 18
groupes contenant chacun plus de deux souches non différentiables. Ces groupes ont été
identifiés par une lettre. Le dendrogramme ainsi que les profil des pulsotypes pour une
souche de chaque groupe sont présentés dans la figure 9. Dix groupes de deux souches non
différentiables et 18 pulsotypes uniques ont aussi été identifiés. Par la suite, les pulsotypes
associés avec deux souches ont été regroupés sous le terme ‘Pr’ et les pulsotypes uniques
100%
70%
40%
10%
sous le terme ‘Uq’.
A
B
J
K
E
M
D
F
N
G
O
L
I
C
H
P
Q
Figure 9 : Dendrogramme et profil des pulsotypes
pour une souche d’E. coli représentative de chaque groupe de pulsotype.
Lors de l’étude de la distribution des pulsotypes dans les trois séries temporelles de
porcs utilisées au cours de l’étude, nous avons remarqué que les animaux avaient en
commun de nombreux pulsotypes même s’ils provenaient de générations différentes (voir
discussion).
La distribution des pulsotypes avant traitement et au cours du traitement est
présentée dans la figure 10. Avant administration d’ampicilline, trois groupes de pulsotypes
97
Etude expérimentale - chapitre 3
étaient associés avec le phénotype de résistance à l’ampicilline parmi les souches d’E. coli
prélevées sur les géloses ne contenant pas d’ampicilline : A, K et E (figure 10, Jour 0). Les
pulsotypes A et K sont apparus majoritaires parmi les souches résistantes à l’ampicilline
sélectionnées avant traitement sur gélose supplémentée en ampicilline (figure 10, Jour 0
AmpR). Aux quatrième et septième jours de traitement l’administration d’ampicilline a
sélectionné des souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline associées à des pulsotypes qui
étaient déjà présents dans le tube digestif avant traitement (figure 10, Jour 4 et Jour 7). Au
septième jour de traitement, 53% des souches étaient associées avec le pulsotype A.
60
Jour 0
50
% de souches de E.
coli
% de souches de E.
coli
60
40
30
20
10
0
I
30
20
10
N P Q O R C H
A K M B Pr G Uq F L E J D I
Pulsotypes
Jour 4
60
50
% de souches de E.
coli
% de souches de E.
coli
40
0
A K M B Pr G Uq F L E J D
Pulsotypes
60
Jour 0 AmpR
50
40
30
20
10
0
A K M B Pr G Uq F L E J D
Pulsotypes
I
N P Q O R C H
N P Q O R C H
Jour 7
50
40
30
20
10
0
A K M B Pr G Uq F L E J D
Pulsotypes
I
N P Q O R C H
Figure 10 : Distribution des pulsotypes (1)
pour les souches d’E. coli prélevées avant traitement sur gélose ne contenant pas
d’ampicilline (Jour 0) et sur gélose supplémentée en ampicilline (Jour 0 AmpR), et aux
quatrième et septième jours d’administration d’ampicilline (Jour 4 et Jour 7). Les lettres
identifient les groupes de pulsotypes, le terme ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec
seulement deux souches et le terme ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques. Les souches
sensibles à l’ampicilline sont indiquées en blanc et les résistantes en noir.
Comparaison des pulsotypes et des phénotypes résistants à l’ampicilline :
Le tableau 11 établit la comparaison entre les profils de résistance et les pulsotypes
qui leur ont été associés avant et au cours du traitement. Le tableau 12 présente les
pourcentages de pulsotypes associés à chaque phénotype de résistance. Un pulsotype
pouvait être associé avec des phénotypes de résistance variés, et inversement un même
phénotype pouvait être associé avec des pulsotypes différents. Néanmoins, le tableau 12
met en évidence qu’un phénotype de résistance a été majoritairement associé à un
pulsotype et le tableau 11 montre que cette association a été stable au cours du temps. Le
98
Etude expérimentale - chapitre 3
phénotype résistant à six antibiotiques a été associé avec 7 pulsotypes mais 76% des
souches qui présentaient ce phénotype appartenaient au pulsotype A. Enfin, aucun des
pulsotypes associé avec un statut sensible à l’ampicilline avant traitement n’a été retrouvé
associé à la résistance à l’ampicilline au cours du traitement (figure 10).
Tableau 11 : Principaux phénotypes résistants à l’ampicilline et pulsotypes associés
pour les souches d’E. coli prélevées avant traitement sur gélose ne contenant pas
d’ampicilline (Jour 0) et sur gélose supplémentée en ampicilline (Jour 0 AmpR), et aux
quatrième et septième jours d’administration d’ampicilline (Jour 4 et Jour 7).
Pulsotypes associésb
Profil de résistancea
Jour 0
Jour 4
Jour 7
Jour 0 AmpR
(n=78)
(n=60)
(n=57)
(n=73)
Amp Te
L, Uq
L, A
L, F
Amp Te Str
F, Pr
F, Pr
F
B
B
B, Pr
K
K, A
K, A, Uq, Pr
E, B, A, K
E
H, E, A, Uq
A, Uq
A, J, K
A, J, K, H, O
Amp Sul Te Str
Amp Chl Sul Trim Str
K, Pr
Amp Sul Te Trim Str
Amp Chl Sul Te Trim Str
A, K
a
Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim :
triméthoprime, Str : streptomycine; b les lettres identifient des groupes de pulsotypes, ‘Pr’
regroupe les pulsotypes associés avec seulement 2 souches et ‘Uq’ regroupe les pulsotypes
uniques
Tableau 12 : Pourcentage de pulsotypes associés à chaque profil de résistance
les résultats obtenus à Jour 0, Jour 0 AmpR, Jour 4 et Jour 7 ont été regroupés par profil de
résistance.
Profil de résistancea
Nbb
Pulsotypes associés (pourcentage)c
Amp Te
9
L (67), A (11), F (11), Uq (11)
Amp Te Str
16
F (88), Pr (12)
Amp Sul Te Str
20
B (90), Pr (10)
Amp Chl Sul Trim Str
18
K (70), A (12), Pr (12), Uq (6)
Amp Sul Te Trim Str
18
E (56), A (12), B (10), H (10), K (6), Uq (6)
Amp Chl Sul Te Trim Str
83
A (76), J (11), K (9), Uq (2), H (1), O (1)
a
Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim :
triméthoprime, Str : streptomycine ; b Nombre de souches de E. coli par phénotype de
résistance, c les lettres identifient les groupes de pulsotypes, ‘Pr’ regroupe les pulsotypes
associés avec seulement 2 souches et ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques
99
Etude expérimentale - chapitre 3
(d) Recherche des déterminants génétiques de la résistance
Les déterminants génétiques de la résistance et les gènes codant pour les intégrases
1 et 2 ont été recherchés dans les souches qui présentaient le phénotype de résistance à six
antibiotiques. Les résultats sont présentés dans le tableau 13. Le gène blaTEM a été détecté
dans 98 % des souches testées. Les souches associées au pulsotype A hébergeaient une
combinaison spécifique de gènes: blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(B), strA-strB et intI1. Cinq autres
combinaisons ont été détectées pour le même phénotype de résistance.
Tableau 13 : Distribution des gènes de résistance
détectés dans les souches associées avec le profil de résistance Amp Chl Sul Te Trim Stra
Pulsotypeb
Groupe
phylo.c
Nbd
A
A
29
blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(B), strA-strB, intI1
A
B1
1
blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI1
J
B1
7
blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI1
J
A
1
blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI1
J
A
1
blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(B), strA-strB, intI1
K
B1
6
blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI1
K
A
1
tet(A), strA-strB, aadA1, intI2
O
B1
1
blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI1
H
D
1
blaTEM, sulI, sulII, tet(A), strA-strB, aadA1, intI1
Uqa
B1
1
blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(A), strA-strB, aadA1, intI1
Uqb
A
1
blaTEM, tet(A)
Gènes de résistance détectés
a Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim :
triméthoprime, Str : streptomycine; b les groupes sont identifiés par leur lettre, le pulsotype
unique x par ‘Uqx’; c groupe phylogénétique; d pour chaque génotype pulsotype/groupe
phylogénétique, les gènes de résistance ont été recherchés sur toutes les souches
appartenant à ce génotype, sauf pour le génotype pulsotype A/groupe phylogénétique A où
les gènes de résistance ont été recherchés sur 50% des souches.
345- Résultats complémentaires : profils de résistance et
pulsotypes des souches provenant des animaux témoins
Le tableau 14 présente les principaux profils de résistance et les pulsotypes associés,
et la figure 11 présente la distribution des pulsotypes pour les souches d’E. coli prélevées
chez les porcs témoins. Au jour 0, 24% des souches étaient sensibles à tous les
antibiotiques testés (tableau 9) et étaient associées avec des pulsotypes variés. Deux profils
de résistance étaient majoritaires. Le premier était résistant à la tétracycline, et était associé
en majorité au pulsotype M. La recherche des déterminants génétiques de la résistance a
100
Etude expérimentale - chapitre 3
révélé que les souches appartenant au pulsotype M portaient le gène tet(A), alors que celles
qui appartenaient au pulsotype minoritaire portaient le gène tet(B). Le deuxième profil était
résistant aux sulfonamides, à la tétracycline et au triméthoprime, trois pulsotypes étant
associés avec ce profil de résistance. Les même gènes de résistance : sulI, tet(A) et le gène
codant pour l’intégrase 1 : intI1 ont été détectés chez les souches appartenant aux différents
pulsotypes. Le pulsotype M est resté majoritaire aux jours 4 (10/20) et 7 (8/20), et des
souches résistantes à l’ampicilline et à la tétracycline, associées au pulsotype M, sont
apparues.
Tableau 14 : Principaux profils de résistance et pulsotypes associés
pour les souches d’E. coli prélevées chez les porcs témoins aux jours 0, 4 et 7.
Jour 0
(n=78)
Profil de résistance a
Nbb
Pulsotypesc
Sensible
19
Te
Str
Te Str
Sul Te Trim
Sul Trim Str
Amp Te
Amp Chl Sul Trim Str
Amp Chl Sul Te Trim Str
17
3
6
23
1
Uq, N, Q,
Pr, D
M, Pr
Q, N
Jour 4
(n =20)
Nbb
10
3
2
M
P, Uq
G, I, K
3
3
3
Pulsotypesc
L
Jour 7
(n =20)
Nbb
Pulsotypesc
1
D
8
4
M
P, Pr
1
G
5
L
K, Pr
A, K
a
Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim :
triméthoprime, Str : streptomycine ; b Nombre de souches par profils de résistance ; c les
lettres identifient les groupes de pulsotypes, ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec
seulement 2 souches et ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques
101
Etude expérimentale - chapitre 3
% de souches de E. coli
Jour 0
60
50
40
30
20
10
0
A K M B Pr G Uq F
L E
J
D
I
N P Q O R C H
Pulsotypes
Jour 7
% de souches de E. coli
% de souches de E. coli
Jour 4
60
50
40
30
20
10
0
A K M B Pr G Uq F
L E J
D
I
N P Q O R C H
60
50
40
30
20
10
0
A K M B Pr G Uq F
Pulsotypes
L E J
D
I
N P Q O R C H
Pulsotypes
Figure 11 : Distribution des pulsotypes (2)
pour les souches d’E. coli prélevées chez les porcs témoins aux jours 0, 4 et 7. Les lettres
identifient les groupes de pulsotypes, ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec seulement
deux souches et ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques. Les souches sensibles à l’ampicilline
sont indiquées en blanc et les résistantes en noir.
346- Discussion générale
L’objectif de ce travail était d’étudier la dynamique de la résistance à l’ampicilline
dans la population digestive des E. coli lors d’administration d’ampicilline chez le porc. Les
souches d’E. coli ont été caractérisées par leur profil de résistance, leur groupe
phylogénétique et leur pulsotype obtenu après électrophorèse en champ pulsé.
L’étude des souches d’E. coli prélevées sur les porcs témoins a révélé que peu de
souches étaient sensibles à tous les antibiotiques testés, et que ces souches étaient
associées avec des pulsotypes variés. En l’absence de pression de sélection, le tube digestif
des porcs était principalement colonisé par des souches résistantes à la tétracycline (cf.
tableau 9, le pourcentage de souches d’E. coli chez les porcs témoins était toujours
supérieur à 65 %), associées à un nombre restreint de pulsotypes, et cette résistance était
associée majoritairement à la présence du gène tet(A). Avant traitement, seulement 6% des
souches étaient résistantes à l’ampicilline. C’est à cause de cette faible fréquence que nous
avons sélectionné des souches résistantes à l’ampicilline sur gélose supplémentée en
ampicilline avant de traiter les animaux, afin de décrire les phénotypes et les pulsotypes qui
102
Etude expérimentale - chapitre 3
étaient associés avec la résistance à l’ampicilline. Les profils des souches résistantes à
l’ampicilline étaient majoritairement multirésistants et le profil principal était résistant à
l’ampicilline, au chloramphénicol, aux sulfonamides, à la tétracycline, au triméthoprime et à
la streptomycine.
Le plan expérimental de l’étude a utilisé 3 séries de porcs, échelonnées sur 6 mois,
les porcs provenant du même élevage avec un fonctionnement classique de conduite en
bandes. Nous avons remarqué que les souches d’E. coli prélevées sur des porcs provenant
de bandes espacées dans le temps partageaient de nombreux profils de résistance et de
nombreux pulsotypes. Cette observation suggère qu’il existe un réservoir de souches d’E.
coli résistantes dans l’environnement des porcs. Chez les bovins, il a été montré au cours
d’une étude évaluant le niveau de résistance de la flore commensale dans plusieurs fermes,
que chaque ferme possédait un réservoir de souches d’E. coli résistantes à la tétracycline et
que ces souches circulaient entre les animaux d’une même ferme (117). Chez les poulets, le
typage de souches résistantes a montré que les mêmes génotypes persistaient dans
l’environnement de la ferme et contaminaient les nouvelles bandes (119). L’ensemble de ces
résultats indique que des animaux élevés dans le même environnement partagent un
écosystème bactérien, composé de souches porteuses de gènes de résistance, qui se
transmet entre animaux contemporains et entre générations successives.
Nos résultats suggèrent que l’ampicilline a éliminé les souches d’E. coli sensibles et a
sélectionné des souches résistantes qui étaient déjà présentes à un faible niveau dans le
tube digestif avant traitement. La composition de la population des E. coli a ainsi été
profondément modifiée. La fréquence des groupes phylogénétiques a mis en évidence ce
profond changement : l’ampicilline a sélectionné des souches qui appartenaient en majorité
au groupe phylogénétique A alors qu’avant traitement, les souches du tube digestif
appartenaient en majorité au groupe B1. Grâce aux résultats de l’électrophorèse en champ
pulsé, nous avons mis en évidence que les pulsotypes majoritaires observés avant
traitement ont disparu au cours du traitement, et ont été remplacés par des pulsotypes
minoritaires associés avec la résistance à l’ampicilline, qui existaient avant le traitement mais
à faible niveau. Sous la pression de sélection exercée par l’ampicilline ces pulsotypes sont
devenus majoritaires. Au final, la distribution des profils de résistance et des pulsotypes
observée dans la population des E. coli au cours du traitement se révèle relativement proche
de celle que nous avons observée avant le traitement dans la population des souches d’E.
coli prélevées sur gélose supplémentée en ampicilline.
103
Etude expérimentale - chapitre 3
La comparaison entre les phénotypes de résistance et les pulsotypes a révélé qu’un
pulsotype pouvait être associé avec différents phénotypes de résistance et qu’inversement,
un phénotype de résistance pouvait être associé avec différents pulsotypes. Ces résultats
sont compatibles avec un transfert horizontal de gènes de résistance dans les populations
digestives d’E. coli. Le transfert de gènes de résistance permet la dissémination de la
résistance au sein des bactéries de l’écosystème intestinal.
Lors de l’administration d’ampicilline, c’est par contre une multiplication clonale des
souches, qui possédaient déjà des mécanismes de résistance, qui a permis l’amplification de
ces gènes de résistance. Mentula et al. ont aussi montré que lors d’administration
d’ampicilline chez le chien, l’émergence de résistance était liée à la multiplication de souches
d’E. coli résistantes à l’ampicilline, plutôt qu’au transfert d’éléments de résistance à des
souches qui étaient au préalable sensibles (93). Nous pouvons supposer en outre, qu’au
moment où la pression de sélection par l’antibiotique s’exerce, le transfert de gènes de
résistance est défavorisé par la disparition des souches sensibles, potentiellement
receveuses.
Les souches résistantes à l’ampicilline, sélectionnées par le traitement, étaient
associées avec plusieurs pulsotypes; mais elles appartenaient en grande majorité au
pulsotype A (cf. figure 10 Jour 4 et Jour 7). Ce pulsotype était aussi prépondérant parmi les
souches résistantes à l’ampicilline avant le traitement (cf. figure 10 Jour 0 AmpR). Il était
majoritairement associé avec le profil de résistance à six antibiotiques car 76% des souches
qui présentaient le phénotype de résistance à six antibiotiques étaient associées avec le
pulsotype A. De manière intéressante, il est à noter que, parmi les sept pulsotypes associés
avec le profil de résistance à six antibiotiques, les souches appartenant au pulsotype A
présentaient une combinaison spécifique de gènes de résistance.
Compte-tenu du rôle du pulsotype A dans l’émergence de la résistance à l’ampicilline
chez les animaux étudiés, il serait intéressant d’identifier les mécanismes qui permettent aux
souches appartenant à ce pulsotype de persister dans le tube digestif en l’absence de
pression de sélection et de devenir majoritaires dès que l’ampicilline exerce une pression de
sélection. Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer la persistance des
gènes de résistance dans le tube digestif : lien avec des gènes conférant un avantage pour
coloniser le tube digestif, système d’addiction permettant le maintien du plasmide, faible coût
biologique des déterminants génétiques de la résistance, voire même apport d’un avantage
par la présence de ces gènes de résistance (46, 47, 126). Le fait que cette souche soit
prépondérante parmi les souches résistantes à l’ampicilline et qu’elle ait accumulé la
résistance à six antibiotiques suggère que cette souche doit être particulièrement bien
104
Etude expérimentale - chapitre 3
adaptée à son environnement qu’est le tube digestif et que les déterminants génétiques de la
résistance lui imposent un faible coût biologique (82).
En conclusion, lors d’administration d’ampicilline, l’émergence de résistance dans la
population des souches d’E. coli digestives était due à la sélection clonale de souches
résistantes à l’ampicilline qui étaient déjà présentes dans le tube digestif avant traitement à
faible niveau. Parmi les souches sélectionnées par le traitement, les souches appartenant à
un pulsotype particulier ont largement contribué à l’émergence de la résistance. Ces
souches étaient multirésistantes, et hébergeaient une combinaison spécifique de
déterminants génétiques de la résistance. Dans l’optique de prévenir l’émergence et la
diffusion de la résistance, il serait pertinent d’identifier par quels mécanismes ces souches
peuvent persister à faible niveau dans le tube digestif, et coloniser majoritairement le tube
digestif lors de pression de sélection exercée par l’ampicilline.
105
Etude expérimentale - article 2
106
Etude expérimentale - article 2
Article 2
Relatedness of Escherichia coli strains with different susceptibility
phenotypes isolated from swine feces during ampicillin treatment
D. Bibbal, V. Dupouy, M.F. Prère, P.L. Toutain, and A. Bousquet-Mélou
Applied and Environmental Microbiology, May 2009; 75(10) : 2999-3006
107
Etude expérimentale - article 2
108
Etude expérimentale - article 2
109
Etude expérimentale - article 2
110
Etude expérimentale - article 2
111
Etude expérimentale - article 2
112
Etude expérimentale - article 2
113
Etude expérimentale - article 2
114
Etude expérimentale - article 2
115
Etude expérimentale - article 2
116
ETUDE EXPERIMENTALE
Chapitre 4 : Stratégie thérapeutique destinée à
prévenir l’émergence de bactéries digestives
résistantes lors d’administration de bêtalactamines : études préliminaires
117
Etude expérimentale - chapitre 4
118
Etude expérimentale - chapitre 4
Chapitre 4 : Stratégie thérapeutique destinée à
prévenir l’émergence de bactéries digestives
résistantes lors d’administration de bêtalactamines : études préliminaires
41- Introduction
Les résultats des études précédentes ont mis en évidence qu’aussi bien les quantités
d’ampicilline sécrétées dans le tube digestif après administration par voie parentérale que
celles qui ne sont pas absorbées au cours d’une administration par voie orale exercent une
pression de sélection sur la flore digestive qui favorise l’émergence rapide et massive
d’entérobactéries résistantes. Ainsi, il apparaît que la prévention de l’émergence de
résistances bactériennes dans le tube digestif lors d’administration d’ampicilline ne peut être
obtenue que par l’inactivation des résidus de bêta-lactamines dans la lumière intestinale.
Dans ce contexte, nous avons entrepris l’étude d’une stratégie de prévention de l’émergence
de bactéries digestives résistantes consistant en la co-administration par voie orale d’un
ester de bêta-lactamine, la pivampicilline, avec des billes contenant des bêta-lactamases à
vectorisation iléo-colique.
Nous avons vu dans la synthèse bibliographique que la stratégie d’utilisation de bêtalactamase pour inactiver l’ampicilline dans les segments distaux du tube digestif, lors
d’administration de bêta-lactamines par voie orale, impose une vectorisation qui libère la
bêta-lactamase en aval de la fenêtre d’absorption de l’antibiotique. Une libération trop
précoce au niveau du jéjunum provoquerait une destruction de l’antibiotique dans la lumière
intestinale, une diminution de sa biodisponibilité et par conséquent de son action
thérapeutique. Une libération trop tardive, c'est-à-dire en aval de la zone iléo-colique, ne
préviendrait pas de l’émergence de bactéries résistantes.
Pour enrober les billes de bêta-lactamase, une stratégie pH-dépendante a été choisie
car ce type enrobage a déjà fait l’objet de nombreux développements chez l’homme. Nous
avons choisi l’Eudragit® FS 30 D car cet enrobage a récemment été développé pour obtenir
une vectorisation iléo-colique optimale chez l’homme (68). L’utilisation de l’Eudragit® FS 30
D afin de cibler une délivrance iléo-colique chez le porc doit être au préalable validée, car il
n’existe pas de données dans la littérature à ce sujet.
119
Etude expérimentale - chapitre 4
Nous avons aussi vu dans la synthèse bibliographique que la biodisponibilité de la
pivampicilline par voie orale était plus importante que celle de l’ampicilline chez les espèces
testées. Nous avons alors formulé l’hypothèse qu’une absorption plus massive et plus
précoce de l’ampicilline administrée sous forme d’un ester permettrait d’éviter les effets de la
libération éventuelle de la bêta-lactamase (par fuite ou délivrance précoce) dans la fenêtre
d’absorption de l’antibiotique, l’objectif étant de compenser, par un décalage temporel
(absorption rapide), un éventuel déficit de décalage anatomique (vectorisation distale de la
bêta-lactamase).
Pour valider la stratégie associant pivampicilline+ bêta-lactamase, il faudra montrer
qu’elle est supérieure à l’ampicilline selon les indicateurs suivants :
- une dose de pivampicilline + bêta-lactamase conduit à une biodisponibilité
systémique de l’ampicilline supérieure ou égale à une dose équimolaire d’ampicilline
seule,
- l’action de la bêta-lactamase sur l’ampicilline ou la pivampicilline non absorbée
conduit à une destruction totale de l’antibiotique au niveau de l’iléon ou du caecum et à
une absence d’impact sur la flore bactérienne digestive.
Le chapitre 4 présente les résultats des études préliminaires visant à valider la
stratégie pivampicilline + bêta-lactamase chez le porc. Il s’articule autour de deux sections.
La première section présente les résultats de l’étude comparée des biodisponibilités
absolues par voie orale de la pivampicilline et de l’ampicilline chez le porc. La deuxième
section présente les résultats de l’étude de la libération de l’Eudragit® FS 30 D chez le porc.
120
Etude expérimentale - chapitre 4
42- Etude comparée des biodisponibilités absolues de la
pivampicilline et de l’ampicilline par voie orale chez le
porc
421- Problématique
Dans l’optique d’associer une bêta-lactamine à une bêta-lactamase par voie orale, la
pivampicilline présenterait un intérêt car il a été montré que son absorption était rapide et
importante chez toutes les espèces testées. Cet avantage permettrait de limiter l’impact
d’une fuite ou d’une libération précoce de bêta-lactamase sur la biodisponibilité.
Une étude préliminaire in vitro a été réalisée en collaboration avec l’Equipe Cinétique
des Xénobiotiques (Arellano C, Gandia P, Houin G et Woodley J ; Faculté des Sciences
Pharmaceutiques, Toulouse) grâce à un modèle de sacs intestinaux éversés de rat adapté
au porc. Cette étude a mis en évidence que :
- la pivampicilline était rapidement hydrolysée en présence de tissu intestinal de porc,
- les quantités d’ampicilline mesurées dans le tissu intestinal et l’intérieur du sac (c'est-à-dire
la quantité absorbée) étaient plus importantes après incubation dans un milieu contenant de
la pivampicilline qu’après incubation dans un milieu contenant de l’ampicilline.
422- Objectif
L’objectif de cette étude a été de caractériser les paramètres de l’absorption de la
pivampicilline et de les comparer à ceux de l’ampicilline, afin d’évaluer si les caractéristiques
de la pivampicilline permettraient son utilisation en association avec une bêta-lactamase.
423- Matériels et méthodes
(a) Plan expérimental
Huit porcs, âgés de 8 semaines à leur arrivée, ont été utilisés. Le plan expérimental a
été un plan parallèle à 3 périodes avec un temps de washout d’au moins 3 jours entre les
périodes. L’ampicilline sodique a été administrée par voie intraveineuse, puis l’ampicilline
trihydrate par voie orale et enfin la pivampicilline par voie orale. Une dose équimolaire de 15
121
Etude expérimentale - chapitre 4
mg/kg d’ampicilline a été administrée à chaque période. De l’ampicilline sodium (sel de
sodium d’ampicilline, Sigma) a été administrée par voie intraveineuse au moyen d’un
cathéter placé dans la veine auriculaire. Les prélèvements de sang ont été réalisés par
ponction directe et récoltés dans des tubes héparinés à 0, 5, 15, 30 et 45 minutes et 1, 1.5,
2, 3, 4, 6, 8, 10 et 24 heures après l’administration d’ampicilline. Pour les administrations
orales, la pivampicilline (ProAmpi® 500 mg, GlaxoSmithKline Santé Grand Public) et
l’ampicilline trihydrate (Totapen® 500 mg, Bristol-Myers Squibb) ont été administrées par
gavage juste après le repas. Les échantillons de sang ont été prélevés de la même manière
à 0, 15, et 45 minutes et 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8, 10 et 24 heures après l’administration. Les
échantillons ont été centrifugés (4 000 g, 10 min, 4°C) et le plasma stocké à -80°C.
(b) Dosage plasmatique de l’ampicilline
Le dosage de l’ampicilline a été réalisé selon la méthode décrite dans la section 32.
Seule l’ampicilline a été dosée car la pivampicilline est totalement hydrolysée en ampicilline
au niveau de la muqueuse digestive de porc (résultats obtenus par le Laboratoire Cinétique
des Xénobiotiques, Toulouse).
(c) Analyse des résultats
Les concentrations plasmatiques d’ampicilline en fonction du temps ont été analysées
à l’aide d’une approche non compartimentale avec le logiciel WinNonlin (WinNonlin 5.2,
Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Les paramètres pharmacocinétiques ont été
calculés grâce aux équations classiques (60). L’aire sous la courbe des concentrations
plasmatiques en fonction du temps (AUC) a été calculée selon la méthode des trapèzes. La
clairance plasmatique (Cl) a été calculée en divisant la dose administrée par l’AUC obtenue
après administration par voie intraveineuse. Le temps de demi-vie (t1/2) a été calculé selon
l’équation suivante : t1/2=ln2/ λz, où λz est la pente de la phase terminale, calculée par
régression linéaire sur le logarithme des concentrations. Le volume de distribution à
l’équilibre (Vss) a été calculé selon l’équation suivante : Vss=(Dose*AUMC)/AUC2, où l’AUMC
est l’aire sous la courbe du premier moment statistique. Pour la voie orale, le pic des
concentrations (Cmax) et le temps associé (Tmax) ont été obtenus directement à partir des
données. La biodisponibilité absolue (F) a été calculée en divisant l’AUC individuelle obtenue
après administration par voie orale par l’AUC individuelle obtenue après administration par
voie intraveineuse. Pour comparer les valeurs des AUC et des Cmax un test de Student pour
122
Etude expérimentale - chapitre 4
séries appariées a été utilisé après une transformation logarithmique des données. Pour
comparer les valeurs des Tmax, un test de Wilcoxon pour séries appariées a été utilisé.
424- Résultats
Les résultats sont présentés dans la figure 12 et le tableau 15. Suite à l’administration
intraveineuse, l’ampicilline a été rapidement distribuée et éliminée. En ce qui concerne les
administrations par voie orale d’ampicilline et de pivampicilline, le pic des concentrations
plasmatiques était significativement plus élevé pour les porcs ayant reçu la pivampicilline:
3.25 µg/mL versus 0.92 µg/mL pour les porcs ayant reçu l’ampicilline. De plus, il était plus
rapidement atteint chez les porcs ayant reçu la pivampicilline que pour l’ampicilline : 0.67
heures versus 2.13 heures pour les porcs ayant reçu l’ampicilline. La biodisponibilité absolue
de la pivampicilline par voie orale était significativement plus élevée que celle de
l’ampicilline.
a)
10
1
0
0
b)
5
Concentration
d'ampicilline (µg/mL)
Concentration
d'ampicilline (µg/mL)
100
2
4
6
8
Temps (heures)
Ampicilline par voie intraveineuse
Ampicilline par voie orale
Pivampicilline par voie orale
10
4
3
2
1
0
0
2
4
6
8
10
Temps (heures)
Ampicilline par voie orale
Pivampicilline par voie orale
Figure 12 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (3)
(moyennes ± écart-type) en fonction du temps (heures) après administration d’ampicilline par
voie intraveineuse et par voie orale, et de pivampicilline par voie orale, à la dose équimolaire
de 15 mg/kg d’ampicilline, n=8. L’échelle des concentrations est logarithmique a) et
arithmétique b).
123
Etude expérimentale - chapitre 4
Tableau 15 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (4)
(moyennes ± écart-type) après administration d’ampicilline par voie intraveineuse et par voie
orale, et de pivampicilline par voie orale, à la dose équimolaire de 15 mg/kg d’ampicilline,
n=8.
mg.h/L
Ampicilline par voie
intraveineuse
25.89 ± 2.5
b
L/kg
0.37 ± 0.07
c
L/h/kg
0.59 ± 0.07
Unités
AUCa
Vss
Cl
Ampicilline par voie
orale
4.56* ± 1.42
Pivampicilline par
voie orale
8.40* ± 2.47
Cmaxd
µg/mL
0.92* ± 0.19
3.25* ± 1.11
Tmaxe
h
2.13* ± 0.70
0.67* ± 0.12
t1/2f
h
g
%
18.18* ± 8.11
32.79* ± 9.72
F
0.65
*
Les valeurs sont significativement différentes entre les groupes (p<0.05). a AUC : aire sous
la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, b Vss : volume de
distribution à l’équilibre, c Cl : clairance plasmatique, d Cmax : concentration plasmatique
maximale, e Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, f t1/2 :
temps de demi-vie, g F : biodisponibilité absolue
425- Résultat complémentaire: biodisponibilité absolue de
l’amoxicilline par voie orale chez le porc à jeun
Douze porcs, âgés de 8 semaines à leur arrivée ont été utilisés. Le plan expérimental
a été un cross-over à deux périodes. L’amoxicilline a été administrée à la dose de 7 mg/kg
par voie intraveineuse (Clamoxyl®) et de 20 mg/kg par voie orale (Amodex®Gé) chez le porc
à jeun. Les paramètres pharmacocinétiques sont donnés dans le tableau 16.
124
Etude expérimentale - chapitre 4
Tableau 16 : Paramètres pharmacocinétiques de l’amoxicilline (2)
(moyennes ± écart-type) après administration par voie intraveineuse à 7 mg/kg et par voie
orale à 20 mg/kg, n=12.
mg.h/L
Amoxicilline par
voie intraveineuse
15 ± 5.3
b
L/kg
0.90 ± 0.61
c
L/h/kg
0.54 ± 0.25
Unités
AUCa
Vss
Cl
Amoxicilline par
voie orale
10.3 ± 4.92
Cmaxd
µg/mL
4.52 ± 3.46
Tmaxe
t1/2f
g
h
1.33 ± 0.39
F
h
0.33
%
24.19 ± 7.16
a
AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, b Vss :
volume de distribution à l’équilibre, c Cl : clairance plasmatique, d Cmax : concentration
plasmatique maximale, e Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique
maximale, f t1/2 : temps de demi-vie, g F : biodisponibilité absolue
426- Discussion
Les paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline après administration par voie
intraveineuse et voie orale chez le porc nourri avaient déjà été estimés au cours de l’étude
présentée dans la section 32. Pour la voie intraveineuse, les résultats sont sensiblement les
mêmes. En ce qui concerne la voie orale, dans l’étude présentée dans la section 32, nous
avions évalué cette biodisponibilité à 6.16% alors que nous l’avons estimé à 18.18% dans la
présente étude. La différence entre les deux valeurs peut en partie s’expliquer par des
conditions expérimentales différentes (gavage de Totapen® versus prise spontanée
d’Ampicilline 80 Porc Franvet® dans boulettes). De plus, comme l’ampicilline a une
absorption très faible, cette absorption présente une plus grande variabilité. Cette variabilité
importante dans l’absorption de l’ampicilline par voie orale a d’ailleurs aussi été relevée chez
le cheval (49).
Concernant la pivampicilline, nous avons montré que sa biodisponibilité absolue par
voie orale était significativement plus élevée que celle de l’ampicilline. Cette biodisponibilité
était de l’ordre de 30% comme chez le veau (141) et le cheval (48). De plus, le pic des
concentrations plasmatiques était significativement plus élevé et plus rapidement atteint
après administration de pivampicilline que d’ampicilline.
En comparant les paramètres pharmacocinétiques de la pivampicilline mesurés chez
le porc nourri à ceux de l’amoxicilline mesurés chez le porc à jeun au cours d’une autre
125
Etude expérimentale - chapitre 4
étude (tableau 16), nous avons pu mettre en évidence que la biodisponibilité absolue par
voie orale de la pivampicilline était comparable à celle de l’amoxicilline, et que le pic des
concentrations plasmatiques semblait plus rapidement atteint après administration de
pivampicilline chez le porc nourri qu’après administration d’amoxicilline chez le porc à jeun.
Dans l’optique d’associer une bêta-lactamine à une bêta-lactamase par voie orale
chez le porc, la pivampicilline présente un intérêt par rapport à l’amoxicilline et à l’ampicilline
car :
- nous avons mis en évidence que l’absorption de la pivampicilline est plus rapide que
celle de l’ampicilline ou celle de l’amoxicilline,
- nous avons montré que la pivampicilline présente une biodisponibilité absolue
supérieure à celle de l’ampicilline, et comparable à celle de l’amoxicilline,
- il a été montré chez l’homme (133) et le cheval (49) que la prise de nourriture n’avait
pas d’impact sur l’absorption de la pivampicilline, à la différence de l’ampicilline ou de
l’amoxicilline.
126
Etude expérimentale - chapitre 4
43- Etude de l’absorption de caféine enrobée avec
l’Eudragit® FS30D chez le porc
Cette étude a été menée en collaboration avec la société Da Volterra (Faculté de
Médecine Xavier Bichat, Paris) qui a fourni les billes de caféine et qui a pris en charge les
dosages plasmatiques de la caféine.
431- Problématique
L’Eudragit® FS 30 D est un enrobage qui se dissout à un pH de 7.5 et qui a été
développé chez l’homme pour viser une délivrance iléo-colique. Chez l’homme, il existe un
gradient de pH dans le tractus digestif : 1.2 dans l’estomac, 6.6 dans l’intestin grêle proximal,
7.5 au niveau de l’iléon, 6.4 au niveau du côlon (52). La délivrance de l’Eudragit® FS 30 D a
été étudiée chez le chien (56). Dans cette étude, les chiens ont été au préalable traités avec
de la pentagastrine (afin de stimuler la libération de HCl), pour simuler les conditions du
tube digestif de l’homme. En effet, chez le chien, le pH de l’estomac peut atteindre des
valeurs de 6.8, ce qui pourrait entraîner une délivrance anticipée du contenu des billes
enrobées par l’Eudragit® FS 30 D. Chez le porc, les pH digestifs seraient aussi différents de
ceux observés chez l’homme: le pH atteint au niveau de l’iléon ne dépasserait pas la valeur
de 7 (10, 12). L’utilisation de l’Eudragit® FS 30 D pour cibler une délivrance iléo-colique chez
le porc doit donc être au préalable validée.
432- Objectif
L’objectif de cette étude était double :
1- Evaluer l’absorption de caféine enrobée d’Eudragit® FS 30 D et la comparer à celle de la
caféine non enrobée. La caféine a été utilisée car son absorption est possible tout le long du
tractus digestif (101).
2- Mesurer le pH des contenus digestifs du porc.
127
Etude expérimentale - chapitre 4
433- Matériels et méthodes
(a) Plan expérimental
Six porcs, âgés de 7 semaines à leur arrivée, ont été utilisés. Le plan expérimental
était un cross-over à deux périodes avec un washout de 8 jours. La caféine (Merck,
Allemagne) a été administrée à la dose de 10 mg/kg dans des billes non enrobées et dans
des billes enrobées avec 20% d’Eudragit® FS 30 D (Röhm Pharma Polymers, Allemagne)
chez le porc à jeun. Les billes ont été élaborées par la société Degussa (Allemagne). Une
gélule de taille 1 a été remplie avec la dose de billes pour chaque porc et administrée par
voie orale. Les prélèvements de sang ont été réalisés par ponction directe au niveau de la
veine jugulaire et récoltés dans des tubes héparinés aux temps suivant: 0, 0.33, 0.66, 1, 1.5,
2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 et 24 heures pour les billes non enrobées et 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12,
14, 24, 34 et 48 heures pour les billes enrobées. Les échantillons ont été centrifugés (4 000
g, 10 min, 4°C) et le plasma stocké à -20°C.
(b) Dosage plasmatique de la caféine
Les dosages de caféine ont été réalisés par ADME Bioanalyses (Vergèze) par une
méthode HPLC/UV. La méthode a été validée pour le plasma de porc pour des
concentrations allant de 0.15 µg/mL à 20 µg/mL.
(c) Mesure du pH dans les contenus digestifs
Afin d’évaluer l’impact du statut digestif sur le pH des contenus digestifs, 3 porcs ont
été sacrifiés à jeun et 3 ont été sacrifiés 4 à 5 heures après leur dernier repas. Le pH a été
mesuré au niveau de 13 sections : duodénum, jéjunum (2 sections), iléon (3 sections),
caecum, côlon centripète (3 sections), côlon centrifuge (2 sections) et rectum. Un pH-mètre
MP 230 (Mettler Toledo, Suisse) a été utilisé.
(d) Analyse des résultats
Les concentrations plasmatiques de caféine en fonction du temps ont été analysées à
l’aide d’une approche non compartimentale avec le logiciel WinNonlin (WinNonlin 5.2,
128
Etude expérimentale - chapitre 4
Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Les paramètres pharmacocinétiques ont été
calculés grâce aux équations classiques (60). L’aire sous la courbe des concentrations
plasmatiques en fonction du temps (AUC) a été calculée selon la méthode des trapèzes. Le
pic des concentrations (Cmax) et le temps associé (Tmax) ont été obtenus directement à partir
des données. Pour comparer les AUC et les Cmax un test de Student pour séries appariées a
été utilisé après une transformation logarithmique des données. Pour comparer les Tmax, un
test de Wilcoxon pour séries appariées a été utilisé.
434- Résultats
(a) pH des contenus digestifs
Les résultats des mesures de pH sont présentés dans la figure 13. Le pH se situe aux
alentours de 6 pour les porcs nourris et 6.5 pour les porcs à jeun au niveau du duodénum. Il
est compris entre 6.5 (porcs nourris) et 7 (porcs à jeun) au niveau de l’iléon mais ne dépasse
pas 7. Il chute au niveau du caecum à 6 pour remonter le long du côlon distal entre 6.5
(porcs à jeun) et 7 (porcs nourris).
8.0
7.5
pH
7.0
6.5
6.0
5.5
D
uo
de
nu
m
Je
ju
nu
m
Je
1
ju
nu
m
2
Il e
um
1
Il e
um
2
Il e
um
3
C
Pr
ae
ox
cu
im
m
al
Pr
C
ol
ox
on
im
al
1
Pr
C
ol
ox
on
im
al
2
C
ol
D
o
is
n
ta
3
lC
ol
D
on
is
ta
lC 1
ol
on
2
R
ec
tu
m
5.0
Porcs à jeun
Porcs nourris
Figure 13 : pH des contenus digestifs de porc
(moyennes ± écart-type) les porcs étant à jeun (n=3) et nourris (n=3).
129
Etude expérimentale - chapitre 4
(b) Profils cinétiques de la caféine enrobée et non enrobée avec
l’Eudragit® FS 30 D
Les résultats sont donnés dans le tableau 17 et la figure 14. Les profils des
concentrations plasmatiques de caféine présentent de grande variabilité entre les porcs
quelque soit le type d’enrobage. Après administration par voie orale de billes non enrobées
contenant de la caféine, un pic des concentrations plasmatiques de caféine de 11.6 µg/mL
est atteint au bout de 4.2 heures. En ce qui concerne les billes enrobées avec l’Eudragit® FS
30 D, le pic est significativement moins élevé et est atteint au bout de 7.7 heures. Les AUC
des deux types de billes ne présentent pas de différence significative.
a)
b)
100
Concentration de
caféine (µg/mL)
Concentration de
caféine (µg/mL)
16
10
1
14
12
10
8
6
4
2
0
0
0
10
20
30
40
50
0
Temps (heures)
Pas d'enrobage
10
20
30
40
50
Temps (heures)
Eudragit FS 30 D
Pas d'enrobage
Eudragit FS 30 D
Figure 14 : Concentrations plasmatiques de caféine
(moyennes ± écart-type) en fonction du temps (heures) après administration de caféine à 10
mg/kg par voie orale dans des billes enrobées d’Eudragit® FS 30 D et non enrobées (n=6).
L’échelle des concentrations est logarithmique a) et arithmétique b).
Tableau 17 : Paramètres pharmacocinétiques de la caféine
(moyennes ± écart-type) après administration à 10 mg/kg par voie orale dans des billes
enrobées d’Eudragit® FS 30 D et non enrobées (n=6).
Enrobage
Sans enrobage
Eudragit® FS 30 D
Cmaxa
Tmaxb
AUCc
µg/mL
h
µg.h/mL
11.6* ± 4.9
4.2 ± 2.8
207 ± 124
7. 7 ± 2.3
159 ± 49
*
6.04 ± 1.4
*
il existe une différence significative entre les groupes (p<0.05) ; a Cmax : concentration
plasmatique maximale, b Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique
maximale, c AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps
130
Etude expérimentale - chapitre 4
435- Discussion
Les pH que nous avons mesurés au niveau du tractus digestif du porc sont
semblables à ceux décrits dans la littérature (10). Ils sont aussi semblables à ceux observés
chez l’homme sauf au niveau de l’iléon. Chez l’homme, des pH de 7.5 ont été mesurés (52),
alors que dans nos conditions expérimentales chez le porc, le pH des contenus digestifs au
niveau de l’iléon ne dépassait pas la valeur de 7.
La libération de la caféine enrobée avec l’Eudragit® FS 30 D est néanmoins massive
car l’exposition systémique des animaux (AUC) représente environ 77% de celle obtenue
avec la caféine non enrobée. L’analyse statistique n’a cependant pas permis de mettre en
évidence de différence entre les AUC moyennes, du fait d’une grande variabilité interindividuelle observée dans le groupe avec caféine non enrobée, alors que le pic des
concentrations plasmatiques est significativement plus élevé dans ce groupe. Parallèlement,
bien que la différence ne soit pas statistiquement significative dans nos conditions
expérimentales, les résultats suggèrent l’existence d’un décalage entre les temps
d’occurrence des pics de concentration (Tmax). De manière intéressante, ce décalage
d’environ 3 heures est du même ordre de grandeur que le temps de transit oro-caecal chez
le porc (40).
La variabilité de l’absorption de la caféine (non enrobée ou enrobée) peut être
associée à plusieurs facteurs physiologiques : la vidange gastrique, le temps de transit, des
variations de pH des contenus digestifs. Chez le porc, une grande variabilité inter et intraindividuelle a été mise en évidence lors de la mesure du temps de transit oro-caecal (40, 57).
Les résultats de cette étude suggèrent que chez le porc, l’Eudragit® FS 30 D permet
une libération massive de la caféine, et que cette libération serait retardée d’environ 3
heures par rapport aux billes non enrobées. Le pic des concentrations plasmatiques de
caféine a été atteint à 7.7 ± 2.3 heures lorsque la caféine était enrobée d’Eudragit® FS 30 D.
Par ailleurs, nous avons montré dans l’étude précédente que le pic des concentrations
plasmatiques d’ampicilline après administration de pivampicilline était atteint au bout de 0.67
± 0.12 heures. La comparaison de ces résultats suggèrent que la fenêtre d’absorption de la
pivampicilline et celle de la caféine enrobée d’Eudragit® FS 30 D pourraient être fortement
décalées dans le temps.
En conclusion, les résultats concernant les caractéristiques pharmacocinétiques de
l’ester d’ampicilline, et la libération d’un principe actif par un enrobage à base d’Eudragit® FS
30 D chez le porc nous semblent compatibles avec la stratégie envisagée.
131
132
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
133
Conclusions et perspectives
134
Conclusions et perspectives
CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
La maîtrise de la qualité sanitaire des élevages nécessite le contrôle des infections
bactériennes, qui fait largement appel aux antibiotiques dont l’utilisation, à l’instar de la
médecine humaine, s’accompagne du développement de résistances bactériennes aux antiinfectieux. Une des voies de réduction des impacts négatifs de l’antibiothérapie animale sur
la santé humaine passe par la promotion d’une antibiothérapie animale raisonnée, capable
d’assurer un objectif thérapeutique tout en minimisant les risques d’émergence et de
diffusion de l’antibiorésistance.
En terme de santé publique, un des enjeux de l’antibiothérapie en médecine
vétérinaire est de diminuer la sélection de bactéries résistantes dans le tube digestif des
animaux. Un premier objectif de ce travail de thèse a été de caractériser sur les plans
phénotypique et génotypique, la résistance bactérienne dans la flore digestive lors
d’administration d’ampicilline chez le porc, afin de mieux cerner les mécanismes de
l’émergence de cette résistance. Parallèlement, un deuxième objectif de ce travail a été
d’évaluer les bases d’une stratégie thérapeutique visant à diminuer l’excrétion de bactéries
résistantes digestives lors d’administration d’une bêta-lactamine par voie orale chez le porc.
Caractérisation phénotypique et génotypique de l’émergence
d’entérobactéries digestives résistantes lors d’administration
d’ampicilline chez le porc
Au cours de la première partie de notre travail de thèse, nous avons évalué chez le
porc l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur l’émergence
d’entérobactéries résistantes. Ces trois modalités étaient les suivantes : la voie
intramusculaire, la voie orale chez le porc nourri et la voie orale chez le porc à jeun. Nous
avons choisi de comparer ces schémas thérapeutiques car les études pharmacocinétiques
que nous avons réalisées, et les données de la littérature suggéraient qu’ils pouvaient
conduire à des expositions différentes du tube digestif. Il s’agissait ici d’évaluer si des
schémas thérapeutiques correspondant au cadre d’une autorisation de mise sur le marché
pouvaient être distingués en terme d’émergence de résistance bactérienne au niveau de la
flore commensale digestive.
135
Conclusions et perspectives
Dans l’optique d’obtenir une mesure quantitative du niveau de résistance de la flore
digestive, nous avons utilisé trois indicateurs de résistance dont nous avons comparé les
résultats. Il s’agissait de deux indicateurs phénotypiques (le pourcentage d’entérobactéries
résistantes obtenu après dénombrement, et le pourcentage de souches isolées d’E. coli
résistantes) et d’un indicateur génotypique (la quantification des gènes blaTEM par PCR en
temps réel). Cette dernière méthode a été développée au sein du laboratoire, afin d’être en
mesure de quantifier les gènes de résistance au niveau de la biomasse bactérienne totale.
Les résultats de cette étude ont été présentés dans l’article 1.
Les résultats ont montré que dans nos conditions expérimentales, parmi les
indicateurs phénotypiques, la détermination du pourcentage d’entérobactéries résistantes
était un indicateur plus robuste que la détermination du pourcentage de souches d’E. coli
résistantes. En ce qui concerne l’indicateur génotypique, nous avons mis en évidence que la
quantification des gènes blaTEM dans les fèces de porc pouvait être un outil prometteur pour
apprécier l’impact d’une antibiothérapie sur la flore digestive. Nous avons en outre montré
que les quantités de gènes blaTEM étaient corrélées aux dénombrements d’entérobactéries
résistantes. Cet indicateur génotypique nous a permis de mettre en évidence que des
modalités d’administration différentes de l’ampicilline pouvaient avoir un impact différent
quant à l’excrétion de gènes de résistance. Cependant, les trois modalités d’administration
de l’ampicilline testées ont toutes eu un impact négatif quant à l’émergence de résistance
dans l’écosystème digestif du porc.
Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons approfondi la caractérisation de
l’émergence de résistance lors d’administration d’ampicilline chez le porc en étudiant la
dynamique du développement de cette résistance au sein des populations d’E. coli d’origine
digestive. Nous avons voulu évaluer dans quelle mesure le développement de la résistance
bactérienne au cours du traitement à l’ampicilline pouvait être attribué à la sélection clonale
de souches minoritaires résistantes à l’ampicilline, et/ou à l’acquisition de cette résistance
par des souches préalablement sensibles, après transfert horizontal des supports
génétiques. Nous avons caractérisé sur le plan phénotypique et génotypique les profils de
résistance qui ont émergé sous la pression de sélection de l’ampicilline, ainsi que la parenté
génétique des souches porteuses de ces résistances. Pour ce faire, nous avons typé, avant
et pendant le traitement, par électrophorèse en champ pulsé, des souches d’E. coli qui
présentaient des profils de résistance différents. Les résultats de cette étude ont été
présentés dans l’article 2.
136
Conclusions et perspectives
Nous avons observé qu’avant l’administration d’ampicilline, les animaux hébergeaient
un réservoir de souches d’E. coli résistantes dans leur tube digestif. Ces souches étaient
majoritairement multirésistantes et l’analyse génotypique a montré que les pulsotypes
associés à ces souches étaient partagés par des porcs non contemporains mais provenant
du même élevage (issus d’une conduite en bandes classique en élevage porcin). Ces
observations renforcent des données de la littérature suggérant l’importance de
l’environnement dans la transmission et la pérennisation des réservoirs de bactéries
résistantes au sein de la flore commensale digestive. Lors de l’administration d’ampicilline,
nous avons mis en évidence que le traitement avait sélectionné majoritairement les souches
résidantes résistantes à l’ampicilline. Ainsi, nos observations suggèrent que l’émergence de
la résistance lors d’administration d’ampicilline était essentiellement due à la multiplication
clonale de souches résistantes appartenant à des pulsotypes variés.
Parmi les souches sélectionnées par l’administration d’ampicilline, celles qui étaient
associées à un pulsotype particulier (le pulsotype A) ont majoritairement colonisé le tube
digestif. Par la suite, il serait pertinent d’identifier les avantages que possèdent les souches
appartenant à ce pulsotype leur permettant de coloniser majoritairement le tube digestif sous
la pression de sélection exercée par l’ampicilline. Afin de mettre en évidence ces propriétés,
plusieurs hypothèses mériteraient d’être explorées. Entre autres, il serait intéressant
d’évaluer si la réussite des souches appartenant au pulsotype A est associée à la
combinaison spécifique des gènes de résistance qu’elles hébergent.
Nous n’avons pas mis en évidence au cours de cette étude l’existence d’un transfert
de gènes de résistance à l’ampicilline à des souches préalablement sensibles, le
développement de la résistance bactérienne observé au cours du traitement pouvant être
attribué à la seule sélection clonale de souches résistantes. Cependant le fait que des
souches appartenant à des pulsotypes variés et éloignés génétiquement soient associées
avec la résistance à l’ampicilline semble être un indicateur de l’existence du phénomène de
transfert horizontal de gènes dans le tube digestif. Le fait que nous n’ayons pas pu mettre en
évidence cet événement au cours du traitement peut être mis en relation avec le phénomène
d’élimination rapide des souches sensibles et potentiellement receveuses. Au contraire, ce
même transfert pourrait être favorisé après la fin du traitement, au moment où la pression de
sélection exercée par l’antibiotique diminue et où les souches sensibles ré-émergent. Il serait
intéressant de tester cette hypothèse par un suivi au cours du temps en phase posttraitement de la parenté génétique et de la sensibilité à l’ampicilline des souches d’E. coli.
137
Conclusions et perspectives
Pour finir, dans l’optique d’étudier les potentiels flux de gènes entre les souches
digestives d’origine humaine et animale, il serait pertinent d’évaluer la capacité de transfert
des gènes de résistance hébergés par les souches appartenant au pulsotype A à des
souches d’origine humaine, dans des conditions proches de celles du tube digestif de
l’homme. Par ailleurs, à l’échelle de l’environnement, la technique de quantification des
gènes blaTEM dans les fèces par PCR en temps réel semble être un outil prometteur pour
quantifier les gènes de résistance dans des environnements divers, et pourrait permettre
d’appréhender les flux de gènes de résistance entre les réservoirs animaux et humains.
Evaluation des bases d’une stratégie thérapeutique de prévention de
l’émergence de résistance dans la flore digestive lors d’administration
de bêta-lactamines par voie orale
L’ensemble des résultats obtenus au cours de la première partie de notre travail de
thèse ont montré que l’administration d’ampicilline chez le porc conduisait à l’émergence
rapide et massive d’entérobactéries résistantes, et ce quelle que soit la modalité
d’administration testée. Dans l’optique de prévenir l’émergence d’entérobactéries résistantes
lors d’administration d’ampicilline, il apparaît donc que les résidus de la bêta-lactamine
présents dans la lumière intestinale doivent être inactivés. Au cours de la deuxième partie de
notre travail de thèse, nous avons évalué les bases d’une stratégie de prévention de
l’émergence de résistance dans la flore digestive, qui consiste en la co-administration par
voie orale d’un ester d’ampicilline (la pivampicilline) et de bêta-lactamase à vectorisation
colique.
Une étude pharmacocinétique nous a permis de mettre en évidence les avantages de
la pivampicilline par rapport à l’ampicilline dans le cadre d’une association future avec des
bêta-lactamases. Chez le porc, l’ampicilline administrée sous forme de pivampicilline
présente une absorption supérieure et surtout plus précoce que l’ampicilline sous forme de
sel. Ces caractéristiques pharmacocinétiques de la forme ester de l’antibiotique
permettraient d’éviter, dans le cas de délivrance précoce ou de fuite de la bêta-lactamase
vectorisée, une hydrolyse au niveau de la fenêtre d’absorption qui conduirait à une sousexposition systémique du porc à l’antibiotique. Par ailleurs, nous avons montré que
l’enrobage sélectionné pour obtenir une vectorisation iléo-colique de la bêta-lactamase
(l’Eudragit® FS 30 D) permettait une libération retardée du composé enrobé (la caféine)
dans le tube digestif du porc.
138
Conclusions et perspectives
En
l’état
de
nos
investigations,
les
caractéristiques
combinées
de
la
pharmacocinétique de la pivampicilline et de libération de l’enrobage Eudragit® FS 30 D
dans le tube digestif de porcs semblent favorables à une dissociation temporelle des
processus d’absorption de l’ampicilline (plus précoce) et de libération (avec retard) de
l’enzyme capable de détruire cet antibiotique. Ces résultats nous incitent à poursuivre les
investigations des propriétés de l’association pivampicilline + billes de bêta-lactamase
enrobées d’Eudragit® FS 30 D. L’étape suivante consisterait à développer une formulation à
base de bêta-lactamases enrobées d’Eudragit® FS 30 D. Cette formulation pourrait être
testée in vitro afin de s’assurer que le processus de fabrication n’altère pas les propriétés de
la bêta-lactamase, et que la formulation libère l’enzyme au pH iléo-caecal. Par la suite,
l’étude in vivo de la formulation validée permettrait d’évaluer à la fois l’impact de la bêtalactamase sur la biodisponibilité de l’ampicilline administrée sous forme d’ester et sur la
prévention de l’émergence de résistance au niveau de la flore digestive.
Parmi les étapes ultérieures du développement de ce type de formulation, le choix de
la bêta-lactamase est une étape importante. Nous avons vu, dans la synthèse
bibliographique, qu’une équipe avait validé cette approche chez la souris en utilisant la
combinaison pipéracilline-tazobactam par voie sous-cutanée avec une bêta-lactamase de
classe B, qui est insensible à l’inhibiteur tazobactam (124). Le choix d’une bêta-lactamase de
classe B semble judicieux dans la perspective d’étendre cette stratégie à l’ensemble des
bêta-lactamines, notamment à celles qui sont associées à des inhibiteurs tels que le
tazobactam chez l’homme.
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TITRE ET RESUME EN ANGLAIS
Title : Impact of beta-lactam antibiotics on the emergence of resistant enterobacteria
in the digestive flora of swine : characterization and strategy of prevention
Abstract : Antibiotic administration in animals is involved in the selection of antibiotic
resistant bacteria in the digestive tract, potentially transferable to humans.
Phenotypic and genotypic characterization of the emergence of resistant digestive
enterobacteria, under selective pressure by a beta-lactam antibiotic, was performed
in pig. Multiresistant E. coli isolates were mainly selected, and the analysis of the
relatedness of these isolates suggested the selection of clones, which were already
present at low level in the digestive tract before any treatment. A therapeutic strategy
aiming at preventing the emergence of digestive resistant bacteria, during betalactam antibiotic administration by the oral route in pigs, was proposed. It consists of
the association of an ester of beta-lactam antibiotic with coated beads which release
beta-lactamase at the ileocaecal junction. The characteristics of the absorption of the
ester and the characteristics of the delivery of the selected coating encourage us to
follow the exploration of this strategy.
Keywords : pig, beta-lactam antibiotics, beta-lactamase, antibiotic resistance, E. coli,
commensal digestive flora
151
AUTEUR : BIBBAL Delphine
TITRE : Impact des bêta-lactamines sur l’émergence d’entérobactéries
résistantes dans la flore digestive chez le porc : caractérisation et stratégie de
prévention
DIRECTEURS DE THESE : Monsieur le Docteur Alain BOUSQUET-MELOU
Monsieur le Professeur Pierre-Louis TOUTAIN
LIEU ET DATE DE SOUTENANCE :
le 10 Décembre 2008 à l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse
RESUME : L’antibiothérapie chez les animaux contribue à la sélection de résistances
bactériennes au niveau du tube digestif, potentiellement transmissibles à l’homme.
La caractérisation phénotypique et génotypique de l’émergence d’entérobactéries
digestives résistantes, lors de pression de sélection par une bêta-lactamine, a été
réalisée chez le porc. Des souches d’E. coli majoritairement multirésistantes ont été
sélectionnées, et l’analyse des pulsotypes de ces souches suggère une sélection de
clones déjà présents mais minoritaires dans le tube digestif. Une stratégie
thérapeutique visant à prévenir l’émergence de bactéries digestives résistantes lors
d’administration orale de bêta-lactamines chez le porc a été proposée. Elle consiste
en l’association d’un ester de bêta-lactamine avec des billes à vectorisation iléocolique contenant des bêta-lactamases. Les caractéristiques d’absorption de l’ester
et de libération par l’enrobage sélectionné encouragent à poursuivre l’exploration de
cette stratégie.
MOTS-CLES : porc, bêta-lactamines, bêta-lactamase, résistance bactérienne, E.
coli, flore digestive commensale
DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Pharmacologie
INTITULE ET ADRESSE DU LABORATOIRE :
UMR181 Physiopathologie et Toxicologie Expérimentales, INRA, ENVT
Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse
23, chemin des Capelles
BP 87614
31076 Toulouse Cedex 3
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