1 2 A Monsieur le Docteur Axel CLOECKAERT, et Monsieur le Docteur Pascal SANDERS, Qui ont accepté d’être rapporteurs de cette thèse. Qu’ils trouvent ici le témoignage de notre respectueuse gratitude. A Monsieur le Professeur Antoine ANDREMONT, et Madame le Professeur Christine ROQUES, Qui nous ont fait l’honneur d’accepter de faire partie de notre jury de thèse. Qu’ils soient remerciés pour le temps consacré à lire et à juger ce travail. A Monsieur le Docteur Alain BOUSQUET-MELOU, et Monsieur le Professeur Pierre-Louis TOUTAIN, Qui m’ont accueillie comme doctorant, m’ont aidée et sans cesse guidée tout au long de ces années de thèse avec rigueur et optimisme. Qu’ils soient assurés de ma sincère reconnaissance. A Monsieur le Docteur Hubert BRUGERE, Qui m’a guidée et patiemment conseillée. Qu’il soit assuré de tout mon respect et de toute ma reconnaissance. A tous les membres de l’équipe « Antibiothérapie et Antibiorésistance » de l’UMR181 qui ont contribué à la réalisation de ce travail : Madame Nathalie ARPAILLANGE, Madame le Docteur Véronique DUPOUY, Monsieur le Docteur Jean-Pierre FERRE, et Madame Sylvie PUEL. Sincères remerciements. A Madame le Docteur Marie-Françoise PRERE, Qui nous a apporté une aide indispensable dans nos travaux. Sincères remerciements. A toute l’équipe zootechnique de l’UMR181 : Monsieur Sylvain BRUYAS, Monsieur Jean DENJEAN, Monsieur Jean-Pierre GAU, Monsieur Joseph MALIGOY, Monsieur Patrice ROUBY, Monsieur René SCHAN, Un grand merci pour leur soutien sans faille lors des phases animales. 3 4 A toute l’équipe des thésards, Julie ANTIC, Séverine COLLET (la relève est assurée !), Aude FERRAN (un grand merci pour toutes tes corrections éclairées...), Elizabeth JEUNESSE, Anne-Sylvie KESTEMAN, Julien LEGHAIT (compagnon de la première et de la dernière heure...) A tous les membres de l’UMR181, pour leur aide, leur soutien, leur bonne humeur et leurs encouragements, sans oublier Minet et Minette.... Un grand merci. A tous ceux qui me sont proches et chers, Alexis, mes parents, mon frère et ma sœur, mes tantes et mon oncle, ma grand-mère, pour leur amour et leur soutien toujours renouvelé. 5 6 AVANT-PROPOS Ces travaux de thèse ont fait l’objet, à l’heure actuelle, des publications et des communications suivantes : Articles Bibbal, D., Dupouy, V., Ferre, J.P., Toutain, P.L., Fayet, O., Prere, M.F., Bousquet-Melou, A. Impact of three ampicillin dosage regimens on selection of ampicillin resistance in Enterobacteriaceae and excretion of blaTEM genes in swine feces Appl Environ Microbiol, Aug 2007, 73 (15) : 4785-4790 Bibbal, D., Dupouy, V., Prere, M.F., Toutain, P.L., Bousquet-Melou, A. Relatedness of Escherichia coli strains with different susceptibility phenotypes isolated from swine feces during ampicillin treatment Appl Environ Microbiol, May 2009, 75 (10) : 2999-3006 Communications orales Bibbal, D., Fajadet, D., Dupouy, V., Bousquet-Melou, A., Toutain, P.L., Fayet, O., Prere, M.F. Evolution de la résistance aux antibiotiques des E. coli de la flore fécale au cours d'un traitement à l'ampicilline chez des porcelets In: Réunion Interdisciplinaire de Chimiothérapie Anti-Infectieuse, Paris, 2005 Bibbal, D., Bousquet-Melou, A., Dupouy, V., Prere, M.F., Fayet, O., Ferre, J.P., Toutain, P.L. Impact of ampicillin administration on excretion of blaTEM genes in swine feces In: 10th International Congress of the European Association for Veterinary Pharmacology and Toxicology, Turin, 2006 Bibbal, D., Dupouy, V., Prere, M.F., Toutain, P.L., Bousquet-Melou, A., Relatedness of ampicillin resistant Escherichia coli strains isolated from pigs during ampicillin treatment In: Fourth International Conference on Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine, Prague, 2008 7 Posters Bibbal, D., Bousquet-Melou, A., Dupouy, V., Ferre, J.P., Laroute, V., Toutain, P.L. Impact of ampicillin administration on blaTEM genes excretion in swine stool In: Third International Conference on Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine, Orlando, 2006 Dupouy, V., Bibbal, D., Bousquet-Melou, A., Prere, M.F., Fayet, O., Toutain, P.L. Quantification of blaTEM genes in swine stool by real-time PCR In: Third International Conference on Antimicrobial Agents in Veterinary Medicine, Orlando, 2006 8 TABLE DES MATIERES AVANT-PROPOS ................................................................................................................................. 7 TABLE DES ILLUSTRATIONS....................................................................................................... 11 LISTE DES ABREVIATIONS........................................................................................................... 13 INTRODUCTION ............................................................................................................................... 17 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................................................... 23 CHAPITRE 1 : PRESENTATION DES BETA-LACTAMINES ET UTILISATION CHEZ LE PORC.................................................................................................................................................... 23 11- LES DIFFERENTES FAMILLES DE BETA-LACTAMINES ET LES MECANISMES DE RESISTANCE MOLECULAIRE ................................................................................................................................... 23 111- Présentation générale des bêta-lactamines.......................................................................... 23 112- Les différentes familles de bêta-lactamines.......................................................................... 25 113- Résistance aux bêta-lactamines par production de bêta-lactamases ................................... 27 12-UTILISATION DES BETA-LACTAMINES CHEZ LE PORC .................................................................. 32 121- Utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire ......................................................... 32 122- Utilisation des bêta-lactamines en élevage porcin............................................................... 34 CHAPITRE 2 - IMPACT DE L’ADMINISTRATION DES BETA-LACTAMINES SUR LA FLORE DIGESTIVE ET STRATEGIES DE PREVENTION ....................................................... 41 21- ECOSYSTEME INTESTINAL ET ANTIBIOTHERAPIE ........................................................................ 41 211- Description de la flore commensale digestive...................................................................... 41 212- Impact de l’antibiothérapie sur la flore digestive ................................................................ 42 213- Mesure du niveau de résistance de la flore digestive........................................................... 45 22- ANTIBIOTHERAPIE ET RESISTANCE DES ENTEROBACTERIES DANS L’ESPECE PORCINE............... 48 221- Etudes descriptives de la résistance des entérobactéries de la flore digestive .................... 48 222- Analyse de l’impact de l’usage des antibiotiques sur le niveau de résistance de la flore digestive ........................................................................................................................................ 50 223- Facteurs autres que l’antibiothérapie gouvernant le niveau de résistance des bactéries de la flore digestive ............................................................................................................................... 51 224- Dynamique populationnelle des souches d’E. coli résistantes de la flore commensale...... 52 23- IMPACT DES BETA-LACTAMINES SUR L’ECOSYSTEME INTESTINAL ET ACTIVITE BETALACTAMASE FECALE ......................................................................................................................... 53 231- Etude chez le porc ................................................................................................................ 53 232- Etude chez l’homme ............................................................................................................. 53 24- STRATEGIES THERAPEUTIQUES DE PREVENTION DE L’EMERGENCE DE RESISTANCE DANS LA FLORE DIGESTIVE LORS D’ADMINISTRATION DE BETA-LACTAMINES................................................ 54 241- Optimisation de schémas thérapeutiques visant à limiter l’exposition de la flore digestive à l’antibiotique ................................................................................................................................ 54 242- Destruction enzymatique des résidus d’antibiotiques dans le tube digestif ......................... 55 ETUDE EXPERIMENTALE............................................................................................................. 61 OBJECTIFS......................................................................................................................................... 61 CHAPITRE 3 : EVALUATION DE L’IMPACT DE TROIS MODALITES D’ADMINISTRATION DE L’AMPICILLINE SUR LE NIVEAU DE RESISTANCE DE LA FLORE DIGESTIVE DU PORC ET ETUDE DE LA DYNAMIQUE DE L’EMERGENCE DE LA RESISTANCE............................................................................................................................... 65 31- INTRODUCTION ........................................................................................................................... 65 32- ETUDE DE LA BIODISPONIBILITE DE L’AMPICILLINE PAR VOIE ORALE CHEZ LE PORC ................ 67 321- Problématique ...................................................................................................................... 67 322- Objectif ................................................................................................................................. 67 9 323- Matériels et méthodes........................................................................................................... 67 324- Résultats ............................................................................................................................... 69 325- Discussion ............................................................................................................................ 70 33- IMPACT DE TROIS MODALITES D’ADMINISTRATION DE L’AMPICILLINE SUR LE NIVEAU DE RESISTANCE DES ENTEROBACTERIES DIGESTIVES DU PORC .............................................................. 73 331- Problématique ...................................................................................................................... 73 332- Objectif ................................................................................................................................. 73 333- Etude de l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur l’excrétion d’entérobactéries résistantes et de gènes blaTEM dans les fèces de porc ...................................... 74 334- Etude pharmacocinétique des trois modalités d’administration de l’ampicilline................ 79 335- Discussion générale ............................................................................................................. 81 ARTICLE 1 ........................................................................................................................................ 85 34- ETUDE DE LA PARENTE PAR ELECTROPHORESE EN CHAMP PULSE DES SOUCHES D’E. COLI ISOLEES DE FECES DE PORC DURANT L’ADMINISTRATION D’AMPICILLINE ....................................... 93 341- Problématique ...................................................................................................................... 93 342- Objectif ................................................................................................................................. 93 343- Matériels et méthodes........................................................................................................... 93 344- Résultats présentés dans l’article 2...................................................................................... 94 345- Résultats complémentaires : profils de résistance et pulsotypes des souches provenant des animaux témoins ......................................................................................................................... 100 346- Discussion générale ........................................................................................................... 102 ARTICLE 2 ...................................................................................................................................... 107 CHAPITRE 4 : STRATEGIE THERAPEUTIQUE DESTINEE A PREVENIR L’EMERGENCE DE BACTERIES DIGESTIVES RESISTANTES LORS D’ADMINISTRATION DE BETA-LACTAMINES : ETUDES PRELIMINAIRES................. 119 41- INTRODUCTION ......................................................................................................................... 119 42- ETUDE COMPAREE DES BIODISPONIBILITES ABSOLUES DE LA PIVAMPICILLINE ET DE L’AMPICILLINE PAR VOIE ORALE CHEZ LE PORC ............................................................................. 121 421- Problématique .................................................................................................................... 121 422- Objectif ............................................................................................................................... 121 423- Matériels et méthodes......................................................................................................... 121 424- Résultats ............................................................................................................................. 123 425- Résultat complémentaire: biodisponibilité absolue de l’amoxicilline par voie orale chez le porc à jeun .................................................................................................................................. 124 426- Discussion .......................................................................................................................... 125 43- ETUDE DE L’ABSORPTION DE CAFEINE ENROBEE AVEC L’EUDRAGIT® FS30D CHEZ LE PORC 127 431- Problématique .................................................................................................................... 127 432- Objectif ............................................................................................................................... 127 433- Matériels et méthodes......................................................................................................... 128 434- Résultats ............................................................................................................................. 129 435- Discussion .......................................................................................................................... 131 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES .......................................................................................... 135 REFERENCES .................................................................................................................................. 143 TITRE ET RESUME EN ANGLAIS .............................................................................................. 151 10 TABLE DES ILLUSTRATIONS Tableaux Tableau 1 : Mécanismes de résistance pour chaque famille de bêta-lactamine ....................... 24 Tableau 2 : Antibiotiques représentatifs de chaque famille de bêta-lactamine........................ 25 Tableau 3 : Classification des bêta-lactamases selon Ambler et Bush-Jacoby-Meideros........ 30 Tableau 4 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (1) ............................................ 36 Tableau 5 : Paramètres pharmacocinétiques de l’amoxicilline (1) .......................................... 37 Tableau 6 : Pourcentage de résistance des souches d’E. coli isolées de porcs à l’abattoir ...... 49 Tableau 7 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (2) ............................................ 70 Tableau 8 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (3) ............................................ 80 Tableau 9 : Pourcentage de souches d’E. coli résistantes ........................................................ 95 Tableau 10 : Pourcentages des phénotypes résistants à l’ampicilline...................................... 96 Tableau 11 : Principaux phénotypes résistants à l’ampicilline et pulsotypes associés ............ 99 Tableau 12 : Pourcentage de pulsotypes associés à chaque profil de résistance...................... 99 Tableau 13 : Distribution des gènes de résistance.................................................................. 100 Tableau 14 : Principaux profils de résistance et pulsotypes associés .................................... 101 Tableau 15 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (4) ........................................ 124 Tableau 16 : Paramètres pharmacocinétiques de l’amoxicilline (2) ...................................... 125 Tableau 17 : Paramètres pharmacocinétiques de la caféine................................................... 130 Figures Figure 1 : Relations entre l’administration d’antibiotique par voie orale et l’exposition des flores bactériennes chez l’animal. .................................................................................... 17 Figure 2 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (1) ....................................................... 69 Figure 3 : Pourcentages d’entérobactéries et de souches d’E. coli résistantes......................... 76 Figure 4 : Nombre de copies de gènes blaTEM/g de fèces......................................................... 77 Figure 5 : Comparaison entre le log du nombre de copies de gènes blaTEM/g de fèces et le log des dénombrements d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline/g de fèces .................. 77 Figure 6 : Distribution des CMI des souches d’E. coli aux jours 0, 1, 4 et 7........................... 78 Figure 7 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (2) ....................................................... 80 Figure 8 : Pourcentage des groupes phylogénétiques .............................................................. 96 Figure 9 : Dendrogramme et profil des pulsotypes .................................................................. 97 Figure 10 : Distribution des pulsotypes (1).............................................................................. 98 Figure 11 : Distribution des pulsotypes (2)............................................................................ 102 Figure 12 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (3) ................................................... 123 Figure 13 : pH des contenus digestifs de porc ....................................................................... 129 Figure 14 : Concentrations plasmatiques de caféine.............................................................. 130 11 12 LISTE DES ABREVIATIONS AFSSA AUC AUMC BLSE Cmax CcrA Cl CLSI CMI CMY CTX-M DGAL E. coli ENVT EDTA EFSA EUCAST F Frelative FEC HPLC INRA IRT KPC L1 λz MIR OXA PC1 PCR PLP PSE SME SHV t1/2 TEM Tmax UMR UV Vss Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments Aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps Aire sous la courbe du premier moment statistique Bêta-lactamase à Spectre Elargi Concentration plasmatique maximale Bêta-lactamase, « cefotaxin and carbapenem resistant » Clairance plasmatique « Clinical and Laboratory Standards Institute » Concentration Minimale Inhibitrice Bêta-lactamase, « active on cephamycins » Bêta-lactamase, « active on cefotaxime, first isolated at Munich » Direction Générale de l’ALimentation Escherichia coli Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse Acide éthylène-diamine-tétraacétique « European Food Safety Authority » « EUropean Comitee on Antimicrobial Susceptibility Testing » Biodisponibilité absolue Biodisponibilité relative Bêta-lactamase, « fecal Escherichia coli » Chromatographie en phase liquide à haute performance Institut National de la Recherche Agronomique Bêta-lactamase, « inhibitor resistant TEM beta-lactamase » Bêta-lactamase, « Klebsiella pneumoniae carbapenemase » Bêta-lactamase, « labile enzyme from Stenotrophomonas maltophilia » Pente de la phase terminale Bêta-lactamase, « discovered at Miriam Hospital » Bêta-lactamase, « active on oxacillin » Bêta-lactamase, « from Staphylococcus aureus strain PC1 » « Polymerase Chain Reaction » Protéines de Liaison à la Pénicilline Bêta-lactamase, « Pseudomonas-specific enzyme » Bêta-lactamase, « Serratia marcescens enzyme » Bêta-lactamase, « sulfhydryl reagent variable » Temps de demi-vie Bêta-lactamase, d’après le nom du patient Temoneira chez qui elle a été identifiée pour la première fois Temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale Unité Mixte de Recherche Ultraviolet Volume de distribution à l’équilibre 13 14 INTRODUCTION 15 16 Introduction INTRODUCTION Les travaux de recherche présentés dans ce document ont été réalisés dans l’UMR181 de Physiopathologie et Toxicologie Expérimentales INRA, ENVT, située à l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse. Au sein de l’UMR181, l’équipe «Antibiothérapie et Antibiorésistance », animée par le Docteur A. Bousquet-Mélou étudie la problématique de l’antibiorésistance chez les animaux à deux niveaux : - l’émergence de résistance chez les pathogènes cibles d’une antibiothérapie, dont les enjeux concernent la santé animale, et - l’émergence de résistance dans la flore commensale digestive, avec ses conséquences potentielles en santé humaine via la contamination de la chaîne alimentaire et/ou l’environnement. Les enjeux touchent ici à la santé publique et à la sécurité sanitaire des aliments. La figure 1 illustre les enjeux liés au contrôle simultané de la résistance au niveau d’un foyer infectieux et de la flore commensale digestive. Mon travail de thèse s’est intégré dans la thématique de recherche relative à la résistance des bactéries de la flore commensale digestive, sous la direction du Docteur A. Bousquet-Mélou et du Professeur P.L. Toutain. Tube digestif AB: Voie orale Proximal Biodisponibilité incomplète Distal • Pathogènes zoonotiques resistants (salmonelles, campylobacters spp) • Flore commensale (gènes de résistance) Contact Chaîne alimentaire Environnement Sang Biophase Pathogène d'intérêt vétérinaire SANTE ANIMALE Pathogènes zoonotiques Flux de gènes Résistance Echecs thérapeutiques HOMME SANTE PUBLIQUE Figure 1 : Relations entre l’administration d’antibiotique par voie orale et l’exposition des flores bactériennes chez l’animal. Le développement de la résistance aux antibiotiques au niveau des flores cibles (foyers infectieux) et non cibles (flore commensale digestive) aura un impact sur la santé animale et la santé publique. L’antibiotique administré par voie orale est partiellement absorbé au niveau du tube digestif proximal, et la fraction non absorbée exerce une pression de sélection importante sur les bactéries de l’écosystème du tube digestif distal. 17 Introduction Il est actuellement reconnu que l’usage des antibiotiques en production animale exerce une pression de sélection qui favorise l’émergence et la diffusion de bactéries résistantes. Cette pression de sélection peut s’exercer au niveau de la flore bactérienne commensale des animaux, en particulier celle du tube digestif (127). Au niveau du tube digestif des animaux, cette pression de sélection peut contribuer à la sélection de bactéries zoonotiques résistantes (Salmonella, Campylobacter, E. coli), pathogènes chez l’homme, et à la sélection de bactéries commensales résistantes. L’ensemble de ces bactéries commensales résistantes constitue alors un réservoir de gènes de résistance pouvant être transférés à des bactéries zoonotiques. De plus, lorsque ces bactéries digestives résistantes d’origine animale sont transmises à l’homme, elles peuvent également transférer leurs gènes de résistance à des bactéries de la flore commensale du tube digestif de l’homme (107, 115). La flore digestive commensale de l’homme constitue alors elle-même un réservoir de gènes de résistance, potentiellement transférables à des bactéries pathogènes. Compte-tenu des conséquences réelles et potentielles pour la santé publique, il nous a paru pertinent de s’intéresser à la caractérisation de la résistance aux antibiotiques des bactéries du tube digestif des animaux domestiques, et à la compréhension des mécanismes de l’émergence de résistance lors d’administration d’antibiotiques chez les animaux. Parallèlement, le développement de stratégies thérapeutiques visant à diminuer l’excrétion par les animaux de bactéries porteuses de gènes de résistance au cours d’un traitement antibiotique constitue un véritable enjeu pour la médecine vétérinaire. Les bêta-lactamines représentent la classe thérapeutique la plus utilisée en médecine humaine. Cette classe thérapeutique regroupe de nombreuses molécules qui possèdent toutes un noyau bêta-lactame, associé à des cycles et des chaînes latérales variables, qui expliquent les propriétés pharmacocinétiques et le spectre d’activité des différentes molécules. Le noyau bêta-lactame est la cible des bêta-lactamases qui l’hydrolysent, et qui rendent l’antibiotique inactif. Les bêta-lactamases représentent le principal mécanisme de résistance aux bêta-lactamines chez les entérobactéries (84). Les bêta-lactamines sont également largement utilisées en médecine vétérinaire, et les bêta-lactamases identifiées chez les entérobactéries d’origine animale sont identiques à celles identifiées chez les entérobactéries d’origine humaine (81). L’usage des antibiotiques a été particulièrement critiqué dans la filière porcine car cette filière consomme une grande quantité d’antibiotiques, et principalement par voie orale. En 2006, 51% des antibiotiques vendus en médecine vétérinaire ont été vendus dans la filière porcine (3). 18 Introduction C’est dans ce contexte que nous avons choisi de travailler sur un modèle porcin. Dans une première partie du travail de thèse (chapitre 3), nous avons étudié l’impact sur la flore intestinale de l’administration d’ampicilline chez le porc, en nous intéressant plus particulièrement à l’émergence de souches d’entérobactéries résistantes, et à leur caractérisation phénotypique et génotypique. Dans une deuxième partie (chapitre 4), nous avons utilisé le modèle porcin pour évaluer les bases d’une stratégie thérapeutique destinée à diminuer l’impact de l’antibiothérapie sur la flore commensale. 19 20 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre 1 : Présentation des bêta-lactamines et utilisation chez le porc 21 22 Etude bibliographique - chapitre 1 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre 1 : Présentation des bêta-lactamines et utilisation chez le porc 11- Les différentes familles de bêta-lactamines et les mécanismes de résistance moléculaire 111- Présentation générale des bêta-lactamines L’ensemble des bêta-lactamines forme une large classe d’antibiotiques qui comprend les dérivés de la pénicilline, les céphalosporines, les monobactames, les carbapénèmes et les inhibiteurs de bêta-lactamase. Ces molécules contiennent toutes un noyau bêta-lactame dans leur structure moléculaire, et ce noyau bêta-lactame confère à la molécule son activité antibiotique. (a) Mode d’action des bêta-lactamines Les bêta-lactamines inhibent la synthèse de la paroi bactérienne. Les cibles des bêtalactamines sont les PLP (protéines de liaison à la pénicilline). Les PLP interviennent dans la synthèse et le remodelage du peptidoglycane, constituant principal de la paroi bactérienne (129). Les bêta-lactamines possèdent un effet bactéricide (76). Les bêta-lactamines sont des antibiotiques temps-dépendant avec un effet post antibiotique court (bactéries à Gram positif) voire inexistant (bactéries à Gram négatif). Le but d’un schéma thérapeutique est de maximiser le temps d’exposition des bactéries pathogènes à l’antibiotique (87). (b) Développement de bêta-lactamines en réponse à l’émergence de résistance Avant l’utilisation des bêta-lactamines en médecine, certaines bactéries produisaient déjà des bêta-lactamases. Ces bêta-lactamases avaient peut être un rôle mineur dans le métabolisme de la paroi de la cellule, ou devaient protéger les bactéries contre les bêtalactamines produites par les champignons dans l’environnement. Quelque soit leur fonction, c’est l’utilisation humaine des antibiotiques qui a favorisé l’émergence des bactéries porteuses de bêta-lactamases (83). Au fur et à mesure que la résistance s’est étendue, les 23 Etude bibliographique - chapitre 1 chimistes des laboratoires pharmaceutiques ont répondu en développant des composés avec une stabilité accrue aux bêta-lactamases, et des agents protecteurs pour inhiber ces bêta-lactamases (111). Ces nouvelles bêta-lactamines ont à leur tour sélectionné des nouvelles formes de résistance. Le tableau 1 illustre le développement de nouvelles classes de bêta-lactamines en réponse à l’émergence de nouveaux mécanismes de résistance. La course engagée entre apparition de résistance et mise au point de nouvelles molécules est inégale. La découverte de nouveaux antibiotiques ne suit pas le rythme d’émergence et de diffusion des résistances bactériennes (94). Dans ce contexte, il apparaît crucial de ralentir l’émergence et la dissémination de ces résistances afin de conserver le plus longtemps possible l’utilité thérapeutique des bêta-lactamines existantes. Tableau 1 : Mécanismes de résistance pour chaque famille de bêta-lactamine qui ont poussé à développer de nouvelle familles (adapté à partir de (51)). Famille de bêtalactamines Mécanismes responsables de résistance benzylpénicillines pénicillinases staphylococciques isoxazolyl-pénicillines modification des PLP amino-pénicillines TEM-1 et SHV-1 chez les entérobactéries PSE-1 chez Pseudomonas aeruginosa uréido-pénicillines Idem amino-pénicillines céphalosporines de première génération TEM-1 hyperproduction de céphalosporinases de classe C céphalosporines de deuxième génération hyperproduction de bêta-lactamase de classe A par Klebsiella oxytoca hyperproduction de bêta-lactamases TEM et SHV par les entérobactéries hyperproduction de bêta-lactamases de classe C céphalosporines de troisième génération BLSE (bêta-lactamase à spectre élargi) hyperproduction de bêta-lactamase de classe A par Klebsiella oxytoca hyperproduction de bêta-lactamases de classe C céphalosporines de quatrième génération BLSE hyperproduction spécifique de SHV-5 hyperproduction de bêta-lactamases de classe C monobactames BLSE bêta-lactamases de classe A de Klebsiella oxytoca bêta-lactamases de classe C carbapénèmes métallo-bêta-lactamases 24 Etude bibliographique - chapitre 1 112- Les différentes familles de bêta-lactamines Les bêta-lactamines sont classées dans quatre familles : pénicillines, céphalosporines, monobactames et carbapénèmes (20). Le tableau 2 indique les antibiotiques représentatifs pour chaque famille. Tableau 2 : Antibiotiques représentatifs de chaque famille de bêta-lactamine Famille de bêtalactamines Antibiotiques représentatifs Pénicillines benzyl-pénicillines benzylpénicilline isoxazolyl-pénicillines méticilline, oxacilline, cloxacilline amino-pénicillines ampicilline, pivampicilline, amoxicilline, épicilline uréido-pénicillines azlocilline, mézlocilline, pipéracilline carboxy-pénicillines carbenicilline, ticarcilline amidino-pénicillines mécillinam, pivmécillinam Céphalosporines première génération céfalexine, céfatrizine, céfalotine, céfazoline deuxième génération céfoxitine, céfamandole, céfotétan, céfuroxime troisième génération céfotaxime, céfopérazone, ceftazidime, ceftriaxone, céfixime quatrième génération céfépime, cefpirome Monobactames aztreonam Carbapénèmes ertapénem, imipénem, méropénem Inhibiteurs de bêtalactamases acide clavulanique, sulbactam, tazobactam (a) Pénicillines La benzylpénicilline a été la première pénicilline utilisée. Cette bêta-lactamine et ses dérivés (pénicilline du groupe G) possèdent un spectre antibactérien qui couvre les cocci à Gram positif et négatif et les bacilles à Gram positif. L’apparition de souches de Staphylococcus aureus productrices de pénicillinases a nécessité la synthèse de molécules stables à l’hydrolyse par cette enzyme. Les isoxazolyl-pénicillines (pénicilline du groupe M) possèdent des modifications structurales qui permettent une augmentation de la stabilité à l’hydrolyse par les pénicillinases mais qui entraînent souvent une diminution de l’activité antibactérienne. 25 Etude bibliographique - chapitre 1 Les amino-pénicillines (pénicilline du groupe A) possèdent une activité sur les bacilles à Gram négatif. L’ampicilline et l’amoxicilline appartiennent à ce groupe. L’amoxicilline ne diffère de l’ampicilline que par un groupement hydroxyle qui lui confère une meilleure biodisponibilité par voie orale que l’ampicilline. La pivampicilline fait partie d’un groupe d’ester de l’ampicilline qui libère l’ampicilline suite à l’action des estérases digestives extra- et intracellulaires. Ces prodrogues ont été développées pour améliorer la biodisponibilité de l’ampicilline par voie orale (53). Les uréido-pénicillines et les carboxy-pénicillines possèdent un spectre élargi à certains bacilles à Gram-négatif. Elles sont actives sur Pseudomonas aeruginosa et sur certaines souches productrices de céphalosporinases. Elles sont réservées à la médecine humaine. Les amidino-pénicillines présentent un spectre limité aux bacilles à Gram négatif. (b) Céphalosporines Ces bêta-lactamines sont toutes à large spectre et leur intérêt réside surtout dans leur activité sur les bacilles à Gram négatif. Les céphalosporines sont traditionnellement divisées en quatre générations sur la base de leur spectre antibactérien, et surtout de leur comportement vis-à-vis des céphalosporinases. Les céphalosporines de première génération possèdent un spectre qui couvre les cocci à Gram positif ainsi que quelques bactéries à Gram négatif. Ce sont les moins stables vis-à-vis de l’hydrolyse par les bêta-lactamases. Les céphalosporines de deuxième génération possèdent une activité accrue contre les bactéries à Gram négatif. Elles sont stables à l’hydrolyse par les bêta-lactamases d’origine plasmidique (non BLSE), mais pas à l’hydrolyse par les céphalosporinases d’origine chromosomique AmpC. Les céphalosporines de troisième génération possèdent une couverture plus large contre les bactéries à Gram négatif mais parfois au dépend d’une bonne couverture contre les cocci à Gram positif. De plus, leur stabilité en présence de bêta-lactamase d’origine chromosomique AmpC est nettement supérieure à celles des céphalosporines de première et deuxième générations. La découverte des BLSE (Bêta-lactamase à Spectre Elargi) en 1983 marquera le début d’une nouvelle ère dans l’histoire de la résistance de la résistance aux bêta-lactamines (75). Ces enzymes sont capables d’hydrolyser les céphalosporines de troisième génération et les monobactames (24). Les céphalosporines de quatrième génération possèdent une stabilité accrue contre certains types de bêta-lactamases produites par Pseudomonas aeruginosa et d’autres bactéries entériques. 26 Etude bibliographique - chapitre 1 (c) Monobactames Cette classe de bêta-lactamine ne contient qu’un seul agent antibiotique : l’aztréonam. Son spectre couvre uniquement les bacilles à Gram négatif, y compris Pseudomonas aeruginosa. Il n’est pas utilisé en médecine vétérinaire. (d) Carbapénèmes Ces bêta-lactamines ont le spectre antibactérien le plus large et sont stables à la plupart des bêta-lactamases. Elles sont réservées à la médecine humaine. (e) Inhibiteurs de bêta-lactamases Ce sont des inhibiteurs suicides de bêta-lactamases qui associés avec une bêtalactamine lui permettent de conserver son activité vis à vis des souches productrices de bêta-lactamases. Ils inhibent la majorité des bêta-lactamases excepté les céphalosporinases et les métallo-bêta-lactamases. Ces molécules inhibitrices possèdent par ailleurs une activité antibactérienne, mais à des concentrations trop élevées, et non compatibles avec un usage thérapeutique. 113- Résistance aux bêta-lactamines par production de bêtalactamases (a) Mécanismes moléculaires de résistance aux bêta-lactamines Les bactéries ont développé différents mécanismes pour contrecarrer l’action des bêta-lactamines (109) : * Production de bêta-lactamases : Les bêta-lactamases sont des enzymes bactériennes qui hydrolysent le noyau bêtalactame et qui rendent l’antibiotique inactif avant qu’il n’atteigne sa cible : les « protéines de liaison à la pénicilline » (PLP). La parenté structurale que les bêta-lactamases partagent avec les PLP leur permet de lier, acétyler et hydrolyser donc inactiver les bêta-lactamines (89). Les bêta-lactamases sont exportées dans le milieu extracellulaire (bactéries à Gram positif telles que Staphylococcus aureus) ou périplasmiques (bactéries à Gram négatif). Plus de 500 bêta-lactamases ont été répertoriées (11). La destruction des bêta-lactamines par les bêta-lactamases est le mécanisme de résistance majeur des bactéries à Gram négatif. 27 Etude bibliographique - chapitre 1 * Modification des « protéines de liaison à la pénicilline » (PLP) : Ces PLP modifiées présentent une affinité plus faible pour les bêta-lactamines. Elles sont relativement résistantes à l’inactivation par les pénicillines et sont capables de remplir les fonctions des PLP lorsque ces dernières sont inactivées. Ce mécanisme de résistance est majeur pour les bactéries pathogènes telles que Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae et les entérocoques (140). * Diminution de la perméabilité de la membrane externe : Chez les bactéries à Gram négatif, la perte ou la diminution de l’expression des porines limite l’entrée de certaines bêta-lactamines dans l’espace périplasmique et donc l’accès à la membrane interne où sont situées les PLP. Cette diminution de la perméabilité contribue au développement de résistance aux bêta-lactamines, d’autant plus si elle est associée à d’autres mécanismes de résistance (88). * Protéines d’efflux : L’acquisition ou la surproduction de pompes à efflux peuvent expulser les bêtalactamines hors de la bactérie même contre le gradient de concentration (108). (b) Support génétique des gènes codant pour les bêta-lactamases Les gènes qui codent pour les bêta-lactamases sont situés soit sur des plasmides, soit sur le chromosome. Ils peuvent être intégrés dans des éléments génétiques mobiles (de type transposon, intégron, îlot génomique). Les déterminants génétiques de la résistance peuvent être transmis par transfert horizontal y compris entre espèces phylogénétiquement éloignées (84). La résistance à certaines bêta-lactamines par production de bêta-lactamase peut être naturelle. Ceci sous-entend qu’une forte proportion des bactéries d’une espèce bactérienne donnée ont manifesté d’emblée un phénomène de résistance, avant toute pression de sélection. Par opposition à la résistance naturelle, la résistance acquise se manifeste sous l’effet d’une pression de sélection. L’exemple de la propagation de TEM-1, la première bêtalactamase portée par un plasmide identifiée chez une bactérie à Gram négatif est illustratif. Cette enzyme a été isolée pour la première fois dans une culture de sang d’un patient nommé Temoneira en Grèce (34). Le transfert de TEM-1 a été facilité vers d’autres espèces de bactéries car le gène qui code pour l’enzyme TEM-1 : blaTEM-1 est présent sur des 28 Etude bibliographique - chapitre 1 plasmides et des transposons. Quelques années après sa première identification, l’enzyme TEM-1 a été propagée dans le monde entier, et est maintenant présente dans diverses espèces de membres de la famille Enterobacteriaceae, et dans Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae et Neisseria gonorrhoeae (18). (c) Classification des bêta-lactamases Une classification moléculaire des bêta-lactamases, impliquant la connaissance de la structure primaire des bêta-lactamines a été proposée par Ambler (7). Une classification fonctionnelle a été proposée par Bush et al. (25), dans laquelle les auteurs tiennent compte de la fonctionnalité des bêta-lactamases (substrat, profil d’inhibition) et divisent ces enzymes en quatre groupes (1 à 4) avec plusieurs sous-groupes. La classification moléculaire proposée par Ambler divise aussi les bêta-lactamases en quatre groupes (A à D), qui présentent des différences sur le plan phylogénétique. Les bêta-lactamases des classes A, C et D font partie des enzymes à sérine active, c'est-à-dire qui possèdent dans leur site actif une sérine qui intervient dans le mécanisme d’acétylation au cours de l’hydrolyse des bêta-lactamines. Par contre la classe B inclut les métallo-bêtalactamases dont l’activité nécessite la présence d’ions métalliques. La classification comparée des bêta-lactamases selon Ambler et Bush-JacobyMeideros est présentée dans le tableau 3. La nomenclature des bêta-lactamases est détaillée dans la liste des abréviations (page 13). 29 Etude bibliographique - chapitre 1 Tableau 3 : Classification des bêta-lactamases selon Ambler et Bush-Jacoby-Meideros (25) Substrats préférentiels Inhibition par : a EDTA AC - Enzymes représentatives Bush Ambler 1 C céphalosporines 2a A pénicillines + - PC1 2b A pénicillines, céphalosporines + - TEM-1, TEM-2, SHV-1 2be A pénicillines, céphalosporines à large spectre, monobacatames + - BLSE TEMs, SHVs, CTX-Ms 2br A pénicillines +/- - IRT TEMs 2c A pénicillines, carbenicilline + - PSE-1 2d D pénicilline, cloxacilline +/- - OXAs 2e A céphalosporines + - FEC-1 2f A pénicillines, céphalosporines, carbapénèmes + - KPC-1, SME-1 3 B la plupart des bêtalactamines - + L1, CcrA AmpC, CMY-2, MIR-1 4b a acide clavulanique La classe 4 regroupe les bêta-lactamases qui ne peuvent être classées dans les autres classes. b * Classe A La classe A est la plus diversifiée. Historiquement, elle était principalement représentée par les pénicillinases. Comme leur nom l’indique, ces enzymes sont principalement actives sur les pénicillines (bêta-lactamase PC1 de Staphylococcus aureus), mais aussi, à un moindre degré sur les céphalosporines de première génération. La majorité de ces enzymes est sensible aux inhibiteurs suicides utilisés en médecine (acide clavulanique, sulbactam et tazobactam). Les principaux représentants de ce groupe sont les bêta-lactamases du type PC1, TEM, SHV et récemment le type CTX-M. Les séquences aminées des enzymes de type TEM, SHV et OXA sont répertoriées sur le site internet suivant : www.lahey.org/studies/inc_webt.html. ** Bêta-lactamases de type TEM TEM-1 est l’enzyme la plus fréquemment rencontrée chez E. coli, mais elle est aussi présente chez de nombreuses espèces telles que Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp., 30 Etude bibliographique - chapitre 1 Haemophilus influenzae et Neisseria gonorrhoeae. Jusqu’à 90% de la résistance à l’ampicilline chez E. coli est due à la production de TEM-1 (84). TEM-1 est capable d’hydrolyser l’ampicilline, et à un degré moindre l’oxacilline ou la céfalotine, et a une activité négligeable vis-à-vis des céphalosporines à spectre étendu. L’enzyme TEM-2 diffère de TEM-1 par un seul acide aminé. Les gènes qui codent pour ces enzymes sont situés sur des plasmides, souvent transférable in vitro à des souches réceptrices de laboratoire. Le dissémination de ces gènes est aussi facilité par le fait qu’ils fassent partie des transposons Tn1, Tn2 ou Tn3 (104). La première BLSE de type TEM (TEM-3) a été découverte en 1989 (121). Depuis lors, plus de 100 dérivés de TEM ont émergé par substitution d’un ou plusieurs acides aminés à partir de TEM-1 (105). Certains dérivés sont des IRT (Inhibitor-Resistant TEM bêta-lactamase) principalement mis en évidence dans des isolats cliniques et résistants à l’action de l’acide clavulanique (27), mais la majorité de ces nouveaux dérivés sont des BLSE. Bien que les BLSE de type TEM soient le plus souvent produites par E. coli et Klebsiella pneumoniae, ces enzymes ont été aussi mises en évidence chez les autres espèces d’entérobactéries, et chez d’autres bactéries à Gram négatif (18). ** Bêta-lactamases de type SHV Ces enzymes se retrouvent plus fréquemment mais pas exclusivement, dans l’espèce Klebsiella. L’enzyme SHV-1 est la plus fréquemment rencontrée. Le gène codant pour SHV-1 se situe sur le chromosome pour la majorité des souches de Klebsiella pneumoniae, mais est habituellement porté par un plasmide chez E. coli. Une centaine de BLSE dérivent des pénicillinases de SHV-1 par substitution d’un ou de plusieurs acides aminés (18). ** Bêta-lactamases de type CTX-M Ces dernières années, une nouvelle famille de BLSE est apparue, qui hydrolyse préférentiellement le céfotaxime : les bêta-lactamases de type CTX-M. Ces enzymes se sont rapidement propagées au niveau mondial et elles sont les BLSE majoritaires chez les entérobactéries dans certaines zones géographiques (112). * Classe B : métallo-bêta-lactamases L’importance clinique des métallo-bêta-lactamases est liée au fait qu’elles hydrolysent les carbapenèmes, composés qui échappent à l’activité des bêta-lactamases à sérine active. La plupart des métallo-bêta-lactamases hydrolysent une variété de pénicillines et de céphalosporines, et sont insensibles aux inhibiteurs suicides classiques (15). 31 Etude bibliographique - chapitre 1 * Class C : Céphalosporinases Dans la classe C, on retrouve les céphalosporinases AmpC qui sont codées par des gènes qui étaient primitivement situés sur le chromosome de nombreuses bactéries à Gram négatif telles que Citrobacter freundii, Serratia marcescens et Enterobacter spp.. Chez ces bactéries, l’expression de AmpC est inductible. Les gènes codant pour ces enzymes sont aussi présents chez E. coli, où ils ne sont pas inductibles. Ces enzymes sont résistantes à l’acide clavulanique (106). * Class D : Oxacillinases La classe D regroupe les bêta-lactamases qui hydrolysent l’oxacilline et ses dérivés et qui sont faiblement inhibées par l’acide clavulanique. Ces enzymes sont le plus souvent retrouvées chez Pseudomonas aeruginosa, mais elles ont aussi été retrouvées chez d’autres bactéries à Gram négatif (105). 12-Utilisation des bêta-lactamines chez le porc 121- Utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire (a) Usage des antibiotiques en médecine vétérinaire Les antibiotiques peuvent être utilisés en médecine vétérinaire de quatre façons avec des objectifs différents (118) : * usage thérapeutique : l’objectif majeur est d’obtenir la guérison des animaux cliniquement malades et d’éviter la mortalité. * usage métaphylactique : lorsqu’une infection collective et contagieuse se déclare chez quelques animaux dans des élevages avec de grands effectifs, l’ensemble du groupe des animaux est traité. Cet usage permet de traiter les animaux soumis à la pression infectieuse alors qu’ils sont encore en incubation ou lorsque les manifestations cliniques sont très discrètes, ce qui permet un traitement collectif par voie orale. La méthaphylaxie est généralement mise en œuvre à partir d’un seuil d’atteinte des animaux au sein du lot de 1015% de l’effectif. 32 Etude bibliographique - chapitre 1 * usage prophylactique : les antibiotiques peuvent parfois être administrés à des périodes critiques de la vie des animaux soumis à une pression de contamination régulière et bien connue. Dans la filière porcine, des antibiotiques peuvent être donné à titre préventif au moment du sevrage qui constitue un stress important pour les animaux. L’antibioprophylaxie est aussi utilisée lors d’opérations chirurgicales pour prévenir les infections bactériennes. * facteurs de croissance : les antibiotiques peuvent être utilisés dans l’aliment à titre d’additifs en vue d’améliorer la croissance et les performances des animaux, sans que les mécanismes à l’origine de l’amélioration de ces performances aient été clairement élucidés (39). Cet usage a fait l’objet de nombreuses critiques et il est interdit au sein de l’Union Européenne depuis 2006 (122). (b) Modalités d’usage des antibiotiques chez les animaux de rente Des traitements individuels sont généralement mis en œuvre pour les animaux de grande taille selon des modalités comparables à celle de la médecine humaine. Ces traitements individuels sont inadaptés pour des larges effectifs d’animaux, comme c’est le cas en filière porcine ou aviaire. En effet, d’un point de vue pratique, il est impossible de traiter individuellement un lot de 20 000 poulets de chair ou une bande de 150 porcs. Dans ce cas, le traitement ne peut être que collectif. La voie d’administration est choisie en fonction des aspects pharmacologiques, des aspects microbiologiques, du statut monogastrique-polygastrique de l’animal ainsi que du nombre d’animaux à traiter (13). La voie parentérale est réservée à des traitements individuels. La voie orale sera privilégiée pour les traitements collectifs. Elle peut se faire par administration dans l’eau de boisson ou dans l’aliment. Une enquête épidémiologique réalisée auprès de vétérinaires réalisant des prescriptions d’antibiotiques en élevage porcin en France en 2000 a révélé que la voie orale était la voie d’administration prescrite dans 93% des cas, soit dans la nourriture (63%), soit dans l’eau (37%) (29). (c) Antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire Les antibiotiques utilisés en médecine humaine et vétérinaire appartiennent aux mêmes familles, à l’exception d’une sous famille propre à la médecine vétérinaire (pleuromutilines) et de quelques sous-familles utilisées exclusivement en médecine humaine. Les carboxy-pénicillines, les uréido-pénicillines, les carbapénèmes et les monobactames sont notamment réservés à la médecine humaine. 33 Etude bibliographique - chapitre 1 Entre 1999 et 2005, en France, les antibiotiques les plus utilisés en médecine humaine ont été les bêta-lactamines qui représentaient plus de la moitié du tonnage total vendu. Au cours de la même période, en médecine vétérinaire, les tétracyclines représentaient presque la moitié du tonnage total vendu. Près de la moitié des ventes d’antibiotique vétérinaires a été réalisée dans la filière porcine (4). Le suivi des ventes de médicaments vétérinaires contenant des antibiotiques en France en 2006 a montré que dans la filière porcine la vente de tétracycline a représenté 58% des ventes. Les bêta-lactamines arrivent en cinquième position avec 5% du tonnage derrière les tétracyclines, les sulfonamides, les macrolides et les polypeptides. Les céphalosporines ne représentent que 0.02% des ventes (3). 122- Utilisation des bêta-lactamines en élevage porcin (a) Bêta-lactamines possédant une Autorisation de Mise sur le Marché dans l’espèce porcine Les bêta-lactamines utilisables dans l’espèce porcine en France sont les suivantes : la pénicilline G, l’ampicilline, l’amoxicilline, une céphalosporine de troisième génération : le ceftiofur, et une de quatrième génération : la cefquinome. Toutes ces molécules peuvent être utilisées par voie injectable. Seules l’ampicilline et l’amoxicilline peuvent être administrées par voie orale. L’utilisation de l’association amoxicilline-acide clavulanique n’est pas autorisée en France dans l’espèce porcine. Les bêta-lactamines sont utilisées seules ou dans des formulations où elles sont associés avec d’autres antibiotiques. (source : Dictionnaire des Médicaments Vétérinaires, 2007) (b) Indications des bêta-lactamines dans l’espèce porcine - Truies : l’indication principale est le traitement des cystites. Les truies sont traitées de manière individuelle par voie orale avec de l’amoxicilline ou par voie injectable avec le ceftiofur ou la cefquinome. - Porcelets en maternité : les traitements sont toujours individuels. La prévention des arthrites est réalisée par injection de pénicilline G, d’amoxicilline ou de céphalosporines. Les colibacilloses peuvent être traitées par voie orale avec les associations amoxicilline-colistine ou ampicilline-colistine. - Porcelets au sevrage : l’amoxicilline permet de contrôler les infections à Streptococcus suis par voie orale et les infections respiratoires par voie injectable. 34 Etude bibliographique - chapitre 1 - Porcs en engraissement : l’amoxicilline et l’association pénicilline-dihydrostreptomycine peuvent être utilisés par voie injectable pour contrôler les infections respiratoires. En cas d’infection aiguë, l’ensemble des porcs peut être traité avec de l’amoxicilline par voie orale. (source : (23)) (c) Propriétés pharmacocinétiques des bêta-lactamines chez l’animal Les propriétés pharmacocinétiques des bêta-lactamines chez le porc sont présentées dans cette section car lors de notre étude expérimentale, nous avons testé l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur la flore digestive. Les profils des concentrations plasmatiques de l’ampicilline ont alors été étudiés afin d’estimer de manière indirecte l’exposition du tube digestif à l’ampicilline (chapitre 3). * Propriétés pharmacocinétiques de l’ampicilline par voie parentérale chez le porc Le tableau 4 présente la synthèse des résultats des paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline, administrée par voie intraveineuse et intramusculaire, mesurés au cours de trois études. 35 Etude bibliographique - chapitre 1 Tableau 4 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (1) (moyennes ± écart-type) après administration par voie intraveineuse et intramusculaire chez le porc. Galtier et al., 1979 (55) Yuan et al., 1997 (139) Apley et al., 2007 (9) mg/kg 20 10 17.6 kg 36-49 28-36 6-15 µg.h/mL 36.3 19 ± 2.7 28.87 ± 2.01 0.51 ± 0.02 0.86 ± 0.33 Référence Dose Voie intraveineuse Poids des porcs a AUC Vss b L/kg c L/h/kg 0.55 0.52 ± 0.07 0.62 ± 0.04 h 0.59 0.69 ± 0.08 0.92 ± 0.05 kg 36-49 30-48 6-15 AUC µg.h/mL 32 17 ± 5 25.07 ± 3.09 Cmaxe Tmaxf g µg/mL 12 ± 5 7.39 ± 0.9 h 0.34 ± 0.18 1 (étendue : 0.5-1.5) Cl t1/2d Voie intramusculaire Poids des porcs a F 88 86± 23 83 ± 29 % AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, b Vss : volume de distribution à l’équilibre, c Cl : clairance plasmatique, d t1/2 : temps de demi-vie, e Cmax : concentration plasmatique maximale, f Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, g F : biodisponibilité absolue a * Propriétés pharmacocinétiques de l’amoxicilline par voie orale chez le porc et impact du statut digestif Il n’existe pas à notre connaissance de données dans la littérature concernant les paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline chez le porc par voie orale. Par contre, de nombreuses études ont été publiées pour l’amoxicilline. L’amoxicilline ne diffère de l’ampicilline que par un groupement hydroxyle qui lui confère une meilleure biodisponibilité par voie orale que l’ampicilline. Les résultats de deux études étudiant la biodisponibilité absolue de l’amoxicilline, et l’impact du statut digestif sur l’absorption chez le porc sont résumés dans le tableau 5. L’absorption de l’amoxicilline par voie orale chez le porc est lente et incomplète. De plus, il apparaît que la présence d’aliment dans le tractus digestif serait responsable d’une diminution de la biodisponibilité par voie orale de l’amoxicilline. 36 Etude bibliographique - chapitre 1 Tableau 5 : Paramètres pharmacocinétiques de l’amoxicilline (1) (moyennes ± écart-type) après administration chez le porc à jeun et le porc nourri. Référence Agerso et al., 1998 (5) Del Castillo et al., 1998 (36) Poids kg 30-50 24 jours (environ 8 kg) Dose mg/kg 10 15 Statut digestif Cmaxa µg/mL b Tmax h c F % A jeun 1.6 ± 0.9 1.9 ± 0.9 33 ± 14 Nourri 0.8 ± 0.3 3.6 ± 1.5 28 ± 8 A jeun 4.7 ± 1.5 0.9 ± 0.1 36 ± 6 Nourri 2.1 ± 1.3 0.8 ± 0.3 23 ± 15 a Cmax : concentration plasmatique maximale, b Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, c F : biodisponibilité absolue * Propriétés pharmacocinétiques de la pivampicilline Les propriétés pharmacocinétiques de la pivampicilline sont présentées dans cette section. Elles ont motivé le choix de cette bêta-lactamine dans le cadre d’une stratégie thérapeutique que nous proposons. Cette stratégie est destinée à prévenir l’émergence de résistance au sein de la flore digestive commensale lors d’administration de bêta-lactamines. Nous présentons cette stratégie dans le chapitre 4. La pivampicilline (C-3 pivaloyloxyméthyl ampicilline) est un ester de l’ampicilline. Cette prodrogue de l’ampicilline a été développée afin d’améliorer la biodisponibilité de l’ampicilline par voie orale chez l’homme (133). La pivampicilline est hydrolysée par des estérases, présentes au niveau de la lumière intestinale et à l’intérieur des entérocytes. La pivampicilline est plus liposoluble que l’ampicilline et elle pénètre plus facilement dans les cellules intestinales. Lorsque la pivampicilline est à l’intérieur des entérocytes, l’ampicilline formée suite à son hydrolyse intracellulaire est majoritairement prise en charge par des transporteurs situés sur le pôle basal, et se retrouve dans la circulation sanguine. Ces mécanismes expliquent la plus grande biodisponibilité observée (53). De plus, les esters sont inactifs sur le plan bactériologique car le groupement carboxylique en C-3 est indispensable pour l’expression de l’activité antibactérienne (21). Chez l’animal, les paramètres pharmacocinétiques de la pivampicilline ont été étudiés chez le veau et le cheval (48, 141). Dans ces deux espèces, la biodisponibilité de la pivampicilline est de l’ordre de 30% alors que celle de l’ampicilline est de l’ordre de 10%. De plus, le statut digestif ne semble pas avoir d’effet sur l’absorption à la différence de l’ampicilline ou de l’amoxicilline. 37 38 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE Chapitre 2 : Impact de l’administration des bêtalactamines sur la flore digestive et stratégies de prévention 39 40 Etude bibliographique - chapitre 2 Chapitre 2 - Impact de l’administration des bêtalactamines sur la flore digestive et stratégies de prévention Ce chapitre présente les conséquences de l’antibiothérapie sur l’écosystème intestinal des animaux, et les conséquences qui en découlent en terme de santé publique. Il est centré sur l’étude de la résistance des bactéries de la flore digestive du porc, sur l’impact écologique des bêta-lactamines, et sur les stratégies thérapeutiques de prévention des modifications de cet écosystème au cours d’une antibiothérapie. 21- Ecosystème intestinal et antibiothérapie 211- Description de la flore commensale digestive (a) Composition de la flore commensale du tube digestif L’anatomie du tube digestif et les flores intestinales qui y résident, sont variables d’une espèce animale à l’autre (73). Chez le porc, comme dans les autres espèces, la flore varie en fonction des stades physiologiques (74) et de l’alimentation (62). La flore intestinale forme un écosystème complexe dont la composition varie en fonction de la localisation dans le tube digestif et en fonction de l’individu. Chez le porc, il a été montré qu’il existait des différences dans la composition de la flore entre des animaux de même origine génétique, et qui étaient hébergés dans des conditions identiques (65). L’estomac, le duodénum et l’intestin grêle proximal contiennent peu de bactéries pour la plupart des lactobacilles et des streptocoques (73). Le côlon abrite la densité microbienne la plus forte avec 109-1011 bactéries/mL et une majorité de bactéries anaérobies strictes, composées de nombreuses espèces. Les principaux genres bactériens sont les suivants : Streptococcus, Lactobacillus, Eubacterium, Fusobacterium et Bacteroides. L’ensemble de ces bactéries compose la flore dominante. La flore sous-dominante regroupent des espèces bactériennes anaérobies strictes mais aussi des espèces aérobie-anaérobie facultatives : les entérobactéries et les entérocoques. Chez le porc, les souches d’E. coli représentent environ 2% des bactéries fécales (98). A côté de cette flore résidente, il peut exister une flore transitoire, qui ne s’implante pas dans le tube digestif, sauf dans des circonstances pathologiques ou lors d’une antibiothérapie. 41 Etude bibliographique - chapitre 2 (b) Résistance à la colonisation La flore du tube digestif établit des relations multiples avec l’hôte, créant un équilibre dynamique dont la stabilité est maintenue par des interactions partiellement connues. La composition de la flore du tube digestif est relativement stable pour un individu au cours du temps. La flore digestive agit comme une barrière en s’opposant à l’implantation et à la multiplication des micro-organismes d’origine exogène (135). Cet effet de barrière prévient aussi la colonisation du tube digestif par des micro-organismes déjà présent tels que les levures ou Clostridium difficile. Cette résistance à la colonisation est principalement assurée par la flore anaérobie, mais aussi par des facteurs anatomiques et physiologiques (péristaltisme, sécrétion de salive, acidité gastrique...) et par le système immunitaire. 212- Impact de l’antibiothérapie sur la flore digestive Dans le cas d’une antibiothérapie, une fraction de la dose administrée peut être excrétée sous forme active par voie biliaire ou sécrétée par la muqueuse intestinale, à laquelle s’ajoute en cas d’administration orale la fraction non absorbée. Les quantités d’antibiotiques qui sont alors présentes dans le tube digestif peuvent altérer l’équilibre microbien de la flore intestinale. Les effets observés chez l’hôte peuvent être alors (43): - l’élimination des bactéries sensibles aux concentrations actives de l’antibiotique, - la sélection et la prolifération de bactéries résistantes au sein de la flore endogène. L’antibiothérapie modifie donc la stabilité de l’écosystème bactérien et altère la composition de la flore responsable de la résistance à la colonisation. Plusieurs facteurs interviennent sur l’intensité des modifications de l’écosystème intestinal au cours d’un traitement antibiotique, notamment la concentration active qui atteint la lumière intestinale, l’activité intrinsèque de la molécule sur les bactéries qui composent l’écosystème, de sa fixation à des composants du bol alimentaire (protéines, cellulose) et son inactivation éventuelle dans le contenu intestinal (125). (a) Emergence de micro-organismes pathogènes dans la flore digestive La disparition de l’effet de barrière peut entraîner l’émergence de bactéries pathogènes. Chez l’homme, les colites pseudomembraneuses, liées au développement de Clostridium difficile producteur de toxines, et la pullulation de levures saprophytes telles que Candida albicans sont l’illustration de l’effet des antibiotiques sur la flore intestinale (125). La 42 Etude bibliographique - chapitre 2 prise d’antibiotique est également un facteur de risque de survenue d’une infection à salmonelles (41). En médecine vétérinaire, l’ampicilline ne doit pas être administrée ni aux rongeurs, ni au lapins car elle perturbe leur écosystème digestif et être l’origine de colites (Clostridium difficile chez les rongeurs et Clostridium spirofome chez le lapin) (110). Les aminopénicillines ne doivent pas non plus être administrées par voie orale chez le cheval car elles sont très peu absorbées dans cette espèce, et induisent des entérocolites à Clostridium difficile (116). (b) Emergence de bactéries résistantes dans la flore digestive chez l’animal et conséquences en terme de santé publique * Emergence de bactéries zoonotiques résistantes Chez l’animal, le traitement antibiotique peut permettre l’émergence ou la sélection de bactéries zoonotiques résistantes dans le tube digestif des animaux. Ces bactéries peuvent être transmises à l’homme par les aliments qu’il consomme et être responsable de toxi-infections alimentaires. Ces bactéries peuvent être également transmises par contact avec les animaux ou indirectement par d’autres voies. Les bactéries du genre Campylobacter et Salmonella sont les principales bactéries responsables de gastroentérites d’origine infectieuse et la viande de porc fait partie des sources de contamination de l’homme. Le fait que ces bactéries zoonotiques soient résistantes aux antibiotiques peut avoir plusieurs conséquences (96): - En général, les diarrhées bactériennes zoonotiques de gravité faible ou modérée ne sont habituellement pas traitées avec des antibiotiques. Les patients âgés, les patients bactériémiques ou les malades à risque de complication peuvent cependant être traités avec des antibiotiques. Si les bactéries zoonotiques sont résistantes, on peut assister à un échec thérapeutique. - Les bactéries zoonotiques résistantes seraient à l’origine d’infections plus invasives et d’une augmentation de la mortalité des patients. - Si des bactéries zoonotiques résistantes contaminent un individu soumis préalablement à une antibiothérapie, elles auront un avantage sélectif pour coloniser le tube digestif de cet individu. En terme de santé publique, le premier enjeu de l’utilisation des antibiotiques chez les animaux est donc de limiter leur impact sur l’émergence et la sélection de bactéries 43 Etude bibliographique - chapitre 2 zoonotiques résistantes dans le tube digestif des animaux car la diffusion de bactéries zoonotiques résistantes de l’animal à l’homme est possible, et de nombreux arguments attestent de sa réalité (45). * Emergence de bactéries commensales résistantes Le traitement antibiotique peut aussi permettre l’émergence ou la sélection de bactéries commensales résistantes dans le tube digestif. La dissémination des déterminants génétiques de la résistance portés par une bactérie commensale peut être considérable puisque ces gènes peuvent être transférés verticalement (à la descendance) ou horizontalement (aux autres lignées bactériennes) s’ils sont situés sur des éléments génétiques mobiles. Ces échanges peuvent survenir entre souches résidentes de la flore intestinale provenant d’espèces identiques, différentes voire éloignées (132). Le tube digestif des animaux devient un réservoir de gènes de résistance à l’antibiotique administré. Les bactéries commensales sont transmises à l’homme par les mêmes voies que les bactéries zoonotiques. Les bactéries commensales d’origine animale peuvent donc potentiellement se retrouver dans le tube digestif de l’homme et même si elles n’y sont que de façon transitoire, elles peuvent alors éventuellement transférer des gènes aux bactéries commensales humaines. L’écosystème intestinal humain se trouverait donc enrichi de déterminants génétiques de résistance d’origine animale, potentiellement transmissibles à des bactéries pathogènes (115). L’étude de ces flux de gènes potentiels entre le monde animal et humain est encouragée par l’AFSSA (Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments) et l’EFSA (European Food Safety Authority) afin de mieux cerner son importance (4). Les bactéries isolées chez les animaux et chez l’homme partagent les mêmes mécanismes de résistance, ceci est un argument en faveur de l’absence d’étanchéité entre les populations bactériennes d’origine humaine et animale. Les flux de gènes de résistance peuvent a priori s’effectuer dans les deux sens, et l’évaluation des flux de gènes entre les populations bactériennes humaines et animales nécessite de développer des marqueurs qui permettent de reconnaître l’écosystème d’origine de la bactérie ou du mécanisme de résistance. Ces marqueurs sont particulièrement difficiles à définir car les populations bactériennes d’origine humaine et animale peuvent être relativement proches. En effet, une étude récente vient de montrer qu’en Ouganda les populations humaines rurales et le cheptel partageaient des souches de E. coli identiques sur le plan génétique (113). Un deuxième enjeu de l’utilisation des antibiotiques en médecine vétérinaire est donc de limiter l’excrétion de bactéries digestives résistantes car ces bactéries peuvent 44 Etude bibliographique - chapitre 2 potentiellement transmettre leurs gènes de résistance à des bactéries qui font partie de l’écosystème intestinal de l’homme. Le travail expérimental que nous avons mené s’inscrit dans cette problématique. Nous avons voulu décrire les mécanismes qui concourent à l’émergence de résistance lors d’administration d’ampicilline chez le porc, et proposer une stratégie thérapeutique destinée à limiter l’impact de l’administration d’ampicilline sur la sélection de bactéries résistantes d’origine digestive. 213- Mesure du niveau de résistance de la flore digestive Dans l’optique de comparer le niveau d’excrétion fécale de bactéries résistantes suite à l’administration d’antibiotique selon différents schémas thérapeutiques, il est indispensable de quantifier le niveau de résistance de la flore commensale. Cette section présente les méthodologies utilisées pour quantifier ce niveau de résistance. Quant à l’étude des mécanismes populationnels qui concourent à l’émergence de cette résistance, elle nécessite le recours à des techniques d’épidémiologie moléculaire (a) Détection de la résistance bactérienne *Définition de la résistance La méthode de référence pour déterminer l’efficacité d’un antibiotique sur une souche bactérienne est la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) par les méthodes de dilution in vitro. La valeur de la CMI permet de définir si une souche bactérienne est résistante. La notion de résistance peut être définie selon différents points de vue (35): - pour le microbiologiste, une souche bactérienne est résistante à un antibiotique si elle dispose d’un mécanisme de résistance augmentant la valeur de la CMI, - pour l’épidémiologiste, une souche bactérienne est résistante à un antibiotique si elle a une CMI significativement différente de celle de la population sauvage, - pour le pharmacologue, une souche bactérienne est résistante à un antibiotique si les concentrations atteintes au site d’action, sont inférieures à la CMI, - pour le clinicien, une souche bactérienne est résistante à un antibiotique si le traitement n’est pas efficace. Afin de prédire la sensibilité d’une souche en terme d’activité clinique afin de réaliser le meilleur choix thérapeutique, des valeurs critiques ont été définies par des comités d’experts. Elles permettent de déterminer la catégorie clinique d’une souche (sensible, 45 Etude bibliographique - chapitre 2 intermédiaire, résistante). La détermination de ces valeurs critiques a pris en compte la distribution de CMI dans la population bactérienne considérée, les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de l’antibiotique et les résultats des études cliniques (130). Pour que l’interprétation d’une valeur de CMI soit correcte, la détermination de la CMI doit suivre les recommandations techniques des différents comités d’experts. Au niveau européen, le comité d’experts est l’EUCAST (European Comitee on Antimicrobial Susceptibility Testing) et aux Etats-Unis le CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute). Ces comités ont déterminé des valeurs critiques pour les pathogènes d’intérêt vétérinaire dans certaines espèces. *Méthodologie de détection de la résistance Lorsque l’on veut définir la catégorie clinique d’une souche, la méthode de référence est la détermination de la CMI. Des valeurs critiques sont aussi disponibles pour interpréter les résultats de l’antibiogramme. Il est cependant possible d’identifier l’existence d’un mécanisme de résistance par d’autres méthodes phénotypiques : détection directe d’enzymes de dégradation (test de recherche de bêta-lactamases), recherche sélective sur des géloses contenant l’antibiotique à des concentrations supérieures aux valeurs critiques, modification du milieu ou des conditions d’incubation pour augmenter l’expression de la résistance, confirmation de la présence de bêta-lactamase par l’utilisation d’inhibiteurs tels que l’acide clavulanique ou l’EDTA.... Les méthodes génotypiques permettent de détecter les déterminants génétiques de la résistance. La PCR (Polymerase Chain Reaction) est classiquement utilisée. Le développement des techniques de biologie moléculaire a permis de développer des puces à ADN qui peuvent détecter un large panel de gènes de résistance (102). (b) Quantification du niveau de résistance au sein de la flore commensale La quantification de la résistance au sein de la flore commensale est nécessaire pour le suivi des niveaux de résistance dans les enquêtes épidémiologiques, pour étudier l’impact d’administration d’antibiotiques sur la sélection ou l’émergence de résistance dans la flore digestive. Il n’existe pas de recommandations sur les méthodes pour mesurer quantitativement la résistance dans ces populations. Evaluer la résistance de manière 46 Etude bibliographique - chapitre 2 quantitative représente un véritable challenge en terme de méthodologie et d’échantillonnage (35). La mesure de la résistance à un antibiotique au sein de la flore commensale peut se faire grâce à bactéries indicatrices. E. coli et Enterococcus faecium sont classiquement utilisées parce que leur mise en culture est facile et qu’elles ont une importance en pathologie animale et humaine. Le pourcentage de souches d’E. coli résistantes est couramment utilisé chez le porc pour mesurer le niveau de résistance de la flore commensale (120). Une autre façon d’estimer quantitativement la résistance est de calculer le rapport entre le dénombrement de bactéries poussant sur milieu supplémenté en antibiotique (à une concentration qui inhibe les bactéries sensibles), et le dénombrement total. Les entérobactéries, coliformes ou E. coli ont été utilisés à cet escient chez le porc (16, 38). Dans ces études, l’estimation de la résistance dépend d’une mesure sur des isolats provenant de populations contenant des millions de bactéries. Dans l’optique de quantifier le réservoir digestif de gènes de résistance au niveau de la biomasse bactérienne totale, les gènes peuvent être quantifiés par PCR en temps réel. Cette approche a déjà été utilisée chez l’animal afin d’évaluer l’impact sur la flore commensale de différents schémas d’administration de bêta-lactamines. Chez le chien, la quantification des gènes blaTEM dans les fèces par PCR en temps réel a permis d’évaluer l’impact d’une nouvelle stratégie thérapeutique destinée à limiter les effets de l’ampicilline sur l’écosystème digestif (63). Chez les bovins, les gènes blaCMY2 ont été quantifiés afin d’évaluer l’impact de différents schémas posologiques du ceftiofur (6). Au cours de notre travail expérimental, nous avons développé et validé une technique de quantification des gènes blaTEM dans les fèces de porc. Nous avons comparé cet outil aux indicateurs phénotypiques classiquement utilisés : le pourcentage d’entérobactéries résistantes (calculé à l’aide des dénombrements réalisés sur gélose supplémentée ou non en ampicilline) et le pourcentage de souches d’E. coli résistantes (calculé après la détermination de la CMI de 20 isolées par animal) (cf. Article 1). (c) Epidémiologie moléculaire au sein de la flore commensale Les méthodes moléculaires se sont beaucoup développées ces dernières années notamment pour l’investigation épidémiologique et la comparaison de souches bactériennes. Ces méthodes permettent d’apprécier la diffusion d’un clone résistant au sein d’une population donnée ou bien de mettre en évidence des transferts horizontaux de gènes (1). 47 Etude bibliographique - chapitre 2 Le pouvoir de discrimination des souches est variable selon les méthodes et l’espèce bactérienne analysée. Ces méthodes reposent sur deux grands principes : soit l’amplification par PCR de séquences données, soit la restriction de l’ADN bactérien (123). L’électrophorèse en champ pulsé repose sur la restriction de l’ADN bactérien. Nous avons utilisé cette technique au cours de notre travail expérimental pour typer des souches fécales d’E. coli, sélectionnées par l’administration d’ampicilline, et évaluer leur parenté génétique (cf. Article 2). L’électrophorèse en champ pulsé est une technique de référence pour différencier les souches pathogènes et pour suivre leur dissémination (54, 59). Elle peut également permettre d’évaluer la dissémination d’un clone résistant au sein de l’écosystème digestif (93). 22- Antibiothérapie et résistance des entérobactéries dans l’espèce porcine 221- Etudes descriptives de la résistance des entérobactéries de la flore digestive (a) Programme national de surveillance de la résistance des bactéries de la flore commensale en filière porcine En France, la surveillance de la résistance des bactéries de la flore commensale pour la filière porcine a été initiée en 2002. Cette surveillance est réalisée dans le cadre d’un plan de surveillance mis en place par la DGAL (Direction Générale de l’ALimentation), en collaboration avec l’AFFSA. Le programme actuel a pour objectif de fournir une évaluation annuelle du taux de résistance pour les bactéries indicatrices E. coli et Enterococcus faecium. Le tableau 6 donne les pourcentages de résistance des souches de E. coli isolées de porcs à l’abattoir en 2003 et 2004. 48 Etude bibliographique - chapitre 2 Tableau 6 : Pourcentage de résistance des souches d’E. coli isolées de porcs à l’abattoir moyennes (intervalle de confiance) en 2003 et 2004 (à partir de (2)). Antibiotique Pourcentages de souches d’E. coli résistantes 2003 2004 7.1 (2.0-12.1) 3 (0-6.3) Ampicilline 26.5 (17.8-35.3) 22 (13.9-30.1) Apramycine 9.1 (3.4-14.8) 4 (0.2-7.8) 21.4 (13.3-29.6) 14 (7.2-20.8) Ciprofloxacine 0 (0-2.9) 1 (0-3.0) Florfénicol 2 (0-4.7) 1 (0-3.0) 3.1 (0-6.5) 0 (0-3.0) Néomycine 5.9 (1.3-10.6) 5 (0.7-9.3) Streptomycine 67 (57.8-76.2) 62 (52.5-71.5) 81.2 (73.6-88.8) 86 (79.2-92.8) 48 (38.2-57.8) 44 (34.3-53.7) Acide nalidixique Chloramphénicol Gentamicine Tétracycline Triméthoprime + Sulfonamides Les souches d’E. coli étaient majoritairement résistantes à la tétracycline et à la streptomycine. Environ la moitié des souches était résistante à l’association triméthoprimesulfonamides, et environ 25 % des souches étaient résistantes à l’ampicilline. Au niveau européen, une enquête épidémiologique sur le niveau de résistance chez l’animal a été réalisée par le CEESA (Centre Européen d’Etudes pour la Santé Animale) (26). Les prélèvements ont été réalisés à l’abattoir entre 1999 et 2000 pour la filière porcine. Les résultats montrent que le pourcentage de souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline était différent entre les pays. Il était relativement bas au Danemark, aux Pays-Bas, en Suède avec respectivement 10.5%, 17% et 3.4% des souches résistantes à l’ampicilline. Par contre, en Espagne, 52.1% des souches étaient résistantes à l’ampicilline. (b) Déterminants génétiques de la résistance aux bêta-lactamines chez les animaux Une étude a été réalisée en Espagne par Brinas et al. afin d’identifier les déterminants génétiques de la résistance dans des souches d’E. coli isolées à partir d’aliments d’origine animale, et de fèces d’humains et d’animaux sains (19). Les résultats ont montré que le mécanisme de résistance à l’ampicilline dans les souches d’E. coli était la production de bêta-lactamase TEM à 83%. Parmi les gènes blaTEM, le gène blaTEM-1b a été identifié dans 69% des cas. Le même type d’étude réalisée au Danemark sur des souches 49 Etude bibliographique - chapitre 2 d’E. coli isolées à partir de fèces d’animaux sains et malades a montré les mêmes résultats (103). Cette prédominance des gènes blaTEM a été retrouvée dans des souches d’E. coli pathogènes isolées chez le porc (92) au Canada, et dans des souches d’E. coli commensales isolées de bovins, porcins et poulets en Allemagne (61). Les gènes blaTEM sont responsables de la résistance à l’ampicilline des souches d’E. coli isolées du tube digestif des animaux. Le tube digestif des animaux représente un réservoir de gènes blaTEM que nous avons quantifié par PCR en temps réel lors de notre étude expérimentale afin d’évaluer les quantités de gènes excrétés au cours d’une antibiothérapie. En ce qui concerne la résistance aux céphalosporines de troisième génération, des BLSE de type CTX-M-1 ont été mises en évidence dans des souches d’E. coli isolées dans la filière porcine en France (95). 222- Analyse de l’impact de l’usage des antibiotiques sur le niveau de résistance de la flore digestive Plusieurs études ont montré que chez le porc, comme chez les autres espèces animales, l’administration d’antibiotique augmente la prévalence de la résistance au sein des bactéries de la flore commensale. Lorsque les antibiotiques sont administrés, en majorité par la voie orale chez le porc, les bactéries digestives qui sont résistantes à l’antibiotique sont sélectionnées, et ces bactéries résistantes peuvent alors coloniser le tube digestif (120). Sunde et al. ont recherché la prévalence de la résistance au sein de souches fécales d’E. coli isolées de porcs provenant de 10 fermes avec un historique d’utilisation antibiotique à but thérapeutique différent (127). Ils ont montré que pourcentage le plus important de bactéries résistantes a été retrouvé dans les fermes où l’utilisation d’antibiotiques était considérée comme élevée. Il ont de plus mis en évidence que le tube digestif des porcs était un véritable réservoir de gènes de résistance, situés dans des éléments génétiques mobiles facilement transmissibles à d’autres bactéries par transfert horizontal (128). Belloc et al. ont montré que l’administration de fluméquine chez la truie entraînait une augmentation du pourcentage de bactéries résistantes aux fluoroquinolones (16). Ils ont aussi constaté que les dénombrements des souches d’E. coli totaux et résistants présentaient une grande variabilité entre les individus au cours du traitement. 50 Etude bibliographique - chapitre 2 D’autres auteurs ont aussi mis en évidence une relation entre une utilisation élevée d’antibiotique et une plus forte prévalence d’entérobactéries résistantes dans la flore digestive du porc (37, 58, 91). 223- Facteurs autres que l’antibiothérapie gouvernant le niveau de résistance des bactéries de la flore digestive (a) Persistance de souches antibiorésistantes dans le tube digestif des animaux En l’absence de pression de sélection exercée par l’antibiotique, des entérobactéries résistantes ont été retrouvées dans le tube digestif des hommes et dans l’environnement (114). Chez le porc, il a été mis en évidence que l’arrêt de l’utilisation d’antibiotiques n’entraînait pas la disparition des souches résistantes du tube digestif (22, 78). Chez des animaux sauvages, qui n’ont jamais été exposés a priori aux antibiotiques, les gènes codant pour des BLSE variées de type CTX-M, TEM et SHV ont été détectés dans les fèces (32). Ces exemples montrent que dans l’environnement, des facteurs autres que les antibiotiques, doivent donc contribuer à la distribution et au maintien des déterminants génétiques de la résistance dans la flore digestive normale des animaux (8, 126). (b) Facteurs autres que l’antibiothérapie ayant un impact sur le niveau de résistance des bactéries de la flore commensale L’antibiothérapie n’est pas le seul facteur qui contribue à l’augmentation du nombre de bactéries résistantes dans la flore fécale. L’impact de plusieurs facteurs sur le niveau de résistance a été étudié dans l’espèce porcine. Moro et al. ont montré que des stress thermiques, qu’ils soient froids au chauds, conduisaient à une excrétion plus importante de bactéries résistantes dans la flore fécale (99, 100). Le stress provoqué par un transport long et un temps d’attente important avant l’abattage a aussi conduit à une augmentation de bactéries résistantes dans les fèces (97). Les conditions d’hébergement, d’hygiène et l’âge des animaux pourraient aussi influencer le développement et la maintenance de bactéries résistantes dans la flore commensale du porc (38, 79). 51 Etude bibliographique - chapitre 2 En conclusion, le niveau de résistance des bactéries du tube digestif dépend non seulement de la pression de sélection exercée par l’antibiotique; mais il est aussi gouverné par d’autres facteurs. L’excrétion de bactéries résistantes est d’ailleurs très variable chez un même animal au cours du temps. L’étude de la dynamique populationnelle des souches d’E. coli résistantes dans la flore commensale permettrait de mieux cerner les mécanismes qui gouvernent l’excrétion des souches résistantes. 224- Dynamique populationnelle des souches d’E. coli résistantes de la flore commensale Une équipe anglaise a montré que le tube digestif des veaux, en l’absence de pression de sélection exercée par des antibiotiques, était colonisé par des souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline très rapidement après leur naissance. Ces souches appartenaient à des pulsotypes variés. L’analyse temporelle des résultats a montré que le tube digestif était colonisé par des « vagues » successives de pulsotypes résistants à l’ampicilline différents, qui avaient probablement une origine environnementale (67). L’impact de l’administration d’ampicilline sur la diversité des souches commensales d’E. coli a été étudié chez le chien au cours d’une étude expérimentale. Les auteurs ont montré que l’ampicilline a sélectionné des souches résistantes à l’ampicilline qui étaient éloignées génétiquement, et que les souches qui étaient sensibles avant l’administration d’ampicilline ne sont pas devenues résistantes (93). Peu d’études ont donc été menées pour appréhender les mécanismes populationnels qui concourent à l’émergence de résistance. La compréhension de ces mécanismes pourrait pourtant permettre de mieux cerner l’émergence de résistance et d’envisager des stratégies pour la prévenir. Dans le cadre de notre étude expérimentale, nous avons donc voulu caractériser la dynamique de l’émergence de la résistance au sein des populations digestives d’E. coli. Par rapport à l’étude qui a été réalisée chez le chien, nous avons sélectionné des souches résistantes à l’ampicilline avant traitement, afin d’évaluer si les souches sélectionnées par le traitement existaient déjà dans le tube digestif avant le traitement (Article 2). 52 Etude bibliographique - chapitre 2 23- Impact des bêta-lactamines sur l’écosystème intestinal et activité bêta-lactamase fécale 231- Etude chez le porc Après administration d’ampicilline par voie orale à des porcs, Esoula et al. ont étudié les concentrations et l’efficacité in situ de l’ampicilline au niveau du caecum (50). Après la première administration, les concentrations en ampicilline, mesurées par dosage microbiologique, ont atteint un pic dans le caecum au bout d’environ 5 heures. Entre 5 et 8 heures après l’administration, le nombre de colibacilles a diminué. A 24 heures, ils avaient retrouvé leur niveau initial et chez la majorité des porcs, et ils étaient devenus résistants à l’ampicilline. Chez ces porcs, lors de la deuxième et troisième administrations, le dosage microbiologique de l’ampicilline a montré que l’ampicilline avait été inactivée au niveau du caecum. Les auteurs suggèrent que l’ampicilline a été inactivée par des bactéries porteuses de plasmide conférant une résistance à l’ampicilline. Cette hypothèse a été confirmée par les mêmes auteurs (33). Ils ont administré de l’ampicilline à des agneaux axéniques, à des agneaux gnotoxéniques hébergeant une flore contenant des E. coli soit sensibles soit résistants, et à des agneaux conventionnels. Chez les agneaux axéniques ou hébergeant une flore sensible, une grande quantité d’ampicilline a été mesurée au niveau du côlon. Par contre, chez les agneaux conventionnels ou hébergeant une flore résistante, l’ampicilline a été inactivée. 232- Etude chez l’homme Sullivan et al. ont réalisé la synthèse de diverses études étudiant l’impact de l’administration des bêta-lactamines sur la microflore du tube digestif de l’homme (125). (a) Administration d’ampicilline ou d’amoxicilline L’administration d’ampicilline ou d’amoxicilline chez l’homme entraîne une importante croissance d’entérobactéries résistantes. Les effets sur la flore aérobie à Gram positif (cocci) et sur les bactéries anaérobies sont modérés. Il n’y a pas d’émergence de résistance chez les entérocoques et chez les Bacteroides. Chez certains sujets, une colonisation par Clostridium difficile ou Candida a pu être mise en évidence. 53 Etude bibliographique - chapitre 2 (b) Administration de céphalopsorines L’administration de céphalosporines par voie orale ou parentérale entraîne une chute importante du nombre d’entérobactéries, une augmentation du nombre des bactéries aérobies à Gram positif (cocci) et un effet modéré sur les bactéries anaérobies. L’émergence de résistance est absente parmi les entérocoques, les entérobactéries et les Bacteroides. Par contre, le tube digestif des sujets est plus fréquemment colonisé par Clostridium difficile. Lorsque des céphalosporines ont été administrées par voie orale ou parentérale, il a été mis en évidence une relation inverse entre la production de bêta-lactamase (pouvant hydrolyser les céphalosporines) et les concentrations en antibiotique dans les fèces (44, 80). Une hypothèse était que les bêta-lactamases lorsqu’elles sont produites par des bactéries du tube digestif doivent détruire les résidus de céphalosporines. Les effets de l’administration de céphalosporines chez les sujets dont la flore produisait des bêta-lactamases ont ainsi été réduits au minimum (28). 24- Stratégies thérapeutiques de prévention de l’émergence de résistance dans la flore digestive lors d’administration de bêta-lactamines 241- Optimisation de schémas thérapeutiques visant à limiter l’exposition de la flore digestive à l’antibiotique Le développement de la résistance à un antibiotique est fonction des concentrations auxquelles les bactéries sont exposées et de la durée de cette exposition. Des schémas thérapeutiques différents conduisent à des expositions différentes du tube digestif, qui peuvent avoir des impacts différents sur l’émergence de résistance au sein de la flore commensale (138). Des exemples d’études chez le porc de l’impact d’administration d’antibiotiques, selon divers schémas thérapeutiques, sur le niveau de résistance des bactéries digestives, sont donnés dans cette section. (a) Etudes descriptives et étiologiques L’impact des modalités d’usage des antibiotiques a été approfondi dans le cadre d’une étude de cohorte (42). Une des conclusions de cette étude est la mise en évidence d’un risque plus important de sélection de souches résistantes d’E.coli lorsque les 54 Etude bibliographique - chapitre 2 antibiotiques sont dispensés à dose subthérapeutique dans l’aliment par rapport à des traitements individuels. Dans le cadre d’une étude visant à évaluer les relations entre les niveaux de résistance de souches d’E. coli commensales et pathogènes et la consommation d’antibiotique, Jensen et al. ont montré qu’au niveau national la résistance à l’apramycine des souches d’E. coli pathogènes était significativement corrélée à la quantité et la durée de l’administration d’apramycine (71). (b) Eudes expérimentales Mathew et al. ont démontré qu’entre différentes conditions d’administrations d’apramycine, celle qui correspondait à une exposition orale, répétée, ponctuelle, à dose maximale, conduisait aux taux de résistance les moins importants (90). Wiuff et al. ont étudié l’effet de différents schémas posologiques d’administration d’enrofloxacine sur le développement de résistance au niveau de souches de Salmonella et d’E. coli du tube digestif. Ils ont montré que la résistance aux fluroquinolones au niveau de la flore coliforme se développe très rapidement quelle que soit la voie d’administration et la dose. A contrario, la sélection des salmonelles résistantes introduites au niveau du tube digestif était diminuée lors de l’utilisation de la voie intramusculaire et en fractionnant la dose (137). Les études réalisées chez le porc indiquent que des schémas thérapeutiques différents peuvent conduire à des impacts différents sur la sélection de souches résistantes dans le tube digestif des animaux. C’est pourquoi, dans le cadre de notre étude expérimentale, nous avons voulu évaluer si l’administration d’ampicilline selon des modalités différentes pouvait avoir un impact différent sur la sélection d’entérobactéries résistantes (Article 1). 242- Destruction enzymatique des résidus d’antibiotiques dans le tube digestif Afin de prévenir la colonisation du tube digestif par des micro-organismes opportunistes et des bactéries résistantes au cours d’une antibiothérapie, il faudrait obtenir une diminution de la pression de sélection exercée sur l’écosystème digestif qui permette le maintien de la flore barrière. Pour ce faire, une stratégie thérapeutique envisageable serait d’inactiver les résidus d’antibiotique qui exercent une pression de sélection sur les bactéries tout au long du tube digestif, et particulièrement au niveau du côlon, qui contient la population bactérienne la plus importante. Deux options peuvent être envisagées pour 55 Etude bibliographique - chapitre 2 inactiver l’antibiotique: l’adsorption par un agent chimique, ou la destruction par un mécanisme enzymatique (131). (a) Administration de bêta-lactamase dans le but d’inactiver les résidus digestifs de bêta-lactamines Nous avons vu dans la section 232 que l’inactivation des résidus de céphalosporines par des bêta-lactamases produites par des bactéries du tube digestif était associée avec des altérations moindres de l’écosystème intestinal. L’utilisation de bêta-lactamases pour détruire les résidus de bêta-lactamines dans le tube digestif apparaît ainsi naturellement comme une stratégie permettant de diminuer la pression de sélection sur les bactéries commensales. Pour tester cette hypothèse, Léonard et al. ont isolé des bactéries productrices de bêta-lactamases du genre Bacteroides et Clostridium dans des fèces d’individus traités avec de la ceftriaxone par voie intraveineuse et qui présentaient une activité bêta-lactamase (visà-vis de la ceftriaxone) dans leur fèces (80). Ils ont administré ces bactéries à des souris à flore humanisée qui ne contenait pas de bactéries anaérobies productrices de bêtalactamases. Ils ont mis en évidence que l’administration des souches sélectionnées prévenait des effets délétères de la ceftriaxone, c’est à dire la colonisation du tube digestif par une souche de Candida albicans et une souche d’Enterobacter cloacae résistante à la ceftriaxone. Une stratégie thérapeutique combinant l’utilisation concomitante de bêta-lactamine et de bêta-lactamase est donc envisageable. Cependant, il faut s’assurer que l’exposition systémique de l’individu à la bêta-lactamine ne soit pas modifiée. (b) Administration de bêta-lactamine par voie parentérale et de bêtalactamase par voie orale Lorsque les bêta-lactamines sont administrées par voie parentérale, l’objectif est d’inactiver les résidus de bêta-lactamines excrétés dans le tube digestif par la bile. Harmoinen et al. ont validé cette approche chez le chien (64). Ils ont administré à des chiens de l’ampicilline par voie intraveineuse. Trois minutes avant, ils avaient administré à ces chiens des billes à enrobage gastro-résistant contenant une bêta-lactamase recombinante de classe A, qui a été libérée très précocement dans le tractus digestif car toute l’ampicilline présente dans le tube digestif devait être inactivée. Les résultats ont montré que l’augmentation de l’activité bêta-lactamase dans le jéjunum était corrélée à la diminution des concentrations en ampicilline dans le tube digestif. Par ailleurs, il n’y a aucune modification des paramètres pharmacocinétiques au niveau sanguin. De plus, chez les chiens traités à 56 Etude bibliographique - chapitre 2 l’ampicilline + bêta-lactamase, les auteurs n’ont pas observé d’impact sur la diversité bactérienne du tube digestif, ou de sélection d’entérobactéries résistantes. La même équipe a montré qu’une bêta-lactamase de classe B administrée en même temps que l’association piperacilline-tazobactam par voie sous-cutanée prévenait de la colonisation du tube digestif de souris par des entérocoques résistants à la vancomycine (124). (c) Administration de bêta-lactamine et de bêta-lactamase par voie orale Lorsque l’on administre la bêta-lactamine par voie orale, la stratégie est plus complexe. Si on veut administrer de façon concomitante la bêta-lactamine et la bêtalactamase, il faut que les bêta-lactamases soient vectorisées en dehors de la fenêtre d’absorption de la bêta-lactamine afin de ne pas diminuer l’exposition systémique de l’individu à l’antibiotique. Les antibiotiques sont majoritairement absorbés au niveau du tube digestif proximal. En ce qui concerne l’amoxicilline, il a été montré chez l’homme, que l’absorption était maximale dans le duodénum et le jéjunum. Elle est beaucoup moins importante et saturable au niveau de l’iléon, et elle n’est pas du tout absorbée au niveau du côlon (14). D’après ces données, les bêta-lactamases devraient être libérées au niveau de la région iléo-colique, afin de ne pas interférer avec l’absorption des bêta-lactamines. Cependant, il faut que les bêta-lactamases soient libérées avant que la bêtalactamine, administrée par voie orale, n’atteigne le caecum car la partie distale du tube digestif contient les populations bactériennes les plus denses, et serait le véritable amplificateur de bactéries résistantes. Récemment, une équipe a validé cette stratégie en administrant à des rats de l’amoxicilline par voie orale, et des bêta-lactamases (de classe B) in situ au niveau de l’iléon (66). L’inactivation de l’amoxicilline à ce niveau du tractus digestif a permis d’éviter la multiplication d’entérobactéries résistantes. Dans l’optique de développer une stratégie de co-administration de bêta-lactamines et de bêta-lactamases par voie orale, le développement d’un enrobage à délivrance optimale sera donc le point crucial. La délivrance colique a fait l’objet de nombreuses recherches afin de délivrer des médicaments in situ, par exemple pour le traiter la maladie de Crohn, les colites ulcéreuses, le cancer colorectal ou l’amibiase. Pour réussir la délivrance colique d’un médicament, il doit être protégé de l’absorption et de l’environnement du tube digestif proximal, et il doit être libéré uniquement au niveau du côlon proximal. Plusieurs stratégies peuvent être utilisées: des prodrogues, des systèmes pH-dépendant, des systèmes temps-dépendant, des 57 Etude bibliographique - chapitre 2 systèmes pression-dépendant et des systèmes contrôlés par l’activité microbienne du côlon (31). La vectorisation utilisant l’activité microbienne du côlon a été récemment utilisée pour développer des billes de bêta-lactamases à délivrance colique. Les billes de bêtalactamases ont été enrobées par de la pectine et protégées de la dégradation dans le tube digestif proximal (17). L’enrobage à base de pectine permet une vectorisation colique car la pectine est complètement dégradée par des pectinases qui ne sont présentes qu’au niveau du côlon. La co-administration de ces billes à des rats en même temps que l’amoxicilline n’a pas eu d’impact sur les paramètres pharmacocinétiques de l’antibiotique. Dans le cadre de notre étude expérimentale, nous avons évalué chez le porc, la libération d’un enrobage à dissolution pH-dépendante qui a été développé chez l’homme pour obtenir une vectorisation iléo-colique: l’Eudragit® FS 30 D. L’utilisation de cet enrobage s’inscrit dans une stratégie thérapeutique qui consiste à associer une prodrogue d’ampicilline avec des billes contenant des bêta-lactamases. Cette stratégie est développée dans le chapitre 4. 58 ETUDE EXPERIMENTALE Objectifs 59 60 Etude expérimentale - objectifs ETUDE EXPERIMENTALE OBJECTIFS La synthèse bibliographique a mis en évidence que la sélection de bactéries résistantes dans la flore commensale digestive des animaux pouvait avoir un impact en terme de santé publique lorsque ces bactéries sont transmises à l’homme. L’objectif de ce travail de thèse a donc été d’évaluer des stratégies visant à diminuer l’excrétion de bactéries résistantes d’origine digestive, lors d’antibiothérapie en médecine vétérinaire. Nous avons choisi de travailler avec le modèle porc car la filière porcine consomme la plus grande part des antibiotiques utilisés chez les animaux. De plus, l’utilisation majoritaire de la voie orale conduit à une exposition massive des bactéries du tube digestif. Nous nous sommes intéressés dans ce travail à l’impact des bêta-lactamines car ces molécules constituent la classe d’antibiotique la plus utilisée en médecine humaine, et elles sont également utilisées en médecine porcine. De plus, nous avons vu que le développement de nouvelles bêta-lactamines pour contrecarrer les mécanismes de résistance a toujours été suivi de l’émergence de nouveaux mécanismes de résistance (cf. tableau 1). Dans ce contexte, il serait judicieux de développer une stratégie qui permette de limiter l’excrétion et la dissémination de bactéries résistantes d’origine digestive lors d’administration de bêta-lactamines, afin de préserver l’efficacité des molécules existantes. En outre, une stratégie originale de destruction des résidus de bêta-lactamines dans le tube digestif par des bêta-lactamases a été décrite dans la littérature par plusieurs auteurs (17, 63, 66). Les objectifs de cette thèse ont été : - de caractériser la résistance bactérienne dans la flore digestive lors de l’administration d’ampicilline chez le porc et, - d’évaluer une stratégie thérapeutique visant à diminuer l’excrétion de bactéries résistantes digestives lors d’administration d’ampicilline. Nous avons vu précédemment que deux options étaient envisageables afin de diminuer la pression de sélection sur les bactéries digestives lors d’une antibiothérapie : - optimiser le schéma thérapeutique de façon à limiter l’exposition de la flore digestive à l’antibiothérapie et, 61 Etude expérimentale - objectifs - inactiver les résidus d’antibiotique qui n’ont pas été absorbés ou qui ont été sécrétés dans le tube digestif. Dans la première partie de ce travail de thèse (chapitre 3), nous avons tout d’abord évalué si trois modalités d’administration de l’ampicilline (voie intramusculaire, voie orale à jeun et voie orale avec l’aliment) réalisables sur le terrain conduisaient à des résultats différents en terme d’émergence de résistance. Nous avons également cherché à comprendre l’origine de la résistance afin de mieux cerner la dynamique de son émergence au sein de la population des souches d’E. coli digestives. Dans la deuxième partie de ce travail (chapitre 4), nous avons entrepris l’évaluation d’une stratégie consistant en la co-administration par voie orale d’un ester d’ampicilline (la pivampicilline) et de bêta-lactamase à vectorisation colique. Le chapitre 4 décrit les études préliminaires qui ont permis de déterminer les propriétés d’absorption de l’ester d’ampicilline, et de caractériser les propriétés de délivrance de l’enrobage sélectionné dans le tube digestif du porc. 62 ETUDE EXPERIMENTALE Chapitre 3 : Evaluation de l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur le niveau de résistance de la flore digestive du porc et étude de la dynamique de l’émergence de la résistance 63 64 Etude expérimentale - chapitre 3 Chapitre 3 : Evaluation de l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur le niveau de résistance de la flore digestive du porc et étude de la dynamique de l’émergence de la résistance 31- Introduction Dans ce chapitre, nous avons évalué si des modalités d’administration différentes de l’ampicilline conduisaient à un impact différent au niveau de l’émergence d’entérobactéries résistantes dans la flore digestive. Nous avons également décrit la dynamique de l’émergence de la résistance au sein des populations digestives d’E. coli. Au cours d’une première étude, nous avons déterminé les profils pharmacocinétiques de l’ampicilline par voie parentérale et par voie orale chez le porc, et nous en avons déduit de manière indirecte l’exposition digestive pour ces deux voies d’administration. Au cours d’une deuxième étude, nous avons mesuré le niveau de résistance de la flore digestive après administration d’ampicilline selon trois modalités (voie intramusculaire, voie orale à jeun et voie orale avec l’aliment). Dans l’optique de quantifier ce niveau de résistance de façon pertinente, nous l’avons mesuré à l’aide de trois indicateurs : deux indicateurs phénotypiques et un indicateur génotypique : la quantification des gènes blaTEM dans les fèces par PCR en temps réel. Nous avons en effet développé ce nouvel outil dans l’optique de quantifier les gènes blaTEM excrétés par les porcs lors d’administration d’ampicilline. Les résultats sont présentés dans l’article 1. Au cours d’une troisième étude, dont les résultats sont présentés dans l’article 2, nous avons caractérisé l’impact de l’administration d’ampicilline sur les populations digestives de souches d’E. coli. Pour ce faire, nous avons étudié par électrophorèse en champ pulsé, la parenté entre des souches d’E. coli, qui ont été sélectionnées par l’administration d’ampicilline, et qui présentaient des profils de résistance différents. 65 Etude expérimentale - chapitre 3 66 Etude expérimentale - chapitre 3 32- Etude de la biodisponibilité de l’ampicilline par voie orale chez le porc 321- Problématique Des expositions différentes des bactéries digestives à un antibiotique peuvent être à l’origine d’impact différent en terme d’émergence de résistance au sein de la flore commensale (cf. synthèse bibliographique). La voie orale conduit à une exposition digestive massive et aurait donc l’impact le plus négatif en terme d’émergence de résistance. Nous avons évalué la biodisponibilité absolue de l’ampicilline chez le porc afin d’estimer les quantités résiduelles dans le tube digestif après administration orale d’ampicilline. Cette étude a été conduite car il n’existe pas de données dans la littérature concernant la biodisponibilité de l’ampicilline par voie orale chez le porc. 322- Objectif Evaluer la biodisponibilité absolue de l’ampicilline par voie orale chez le porc. 323- Matériels et méthodes (a) Plan expérimental Quatre porcs ont été utilisés (13.3 kg à 17.9 kg). Des cathéters jugulaires ont été mis en place sous anesthésie générale dans la veine jugulaire droite. L’entretien des cathéters a été réalisé matin et soir. Le plan expérimental a été un cross-over à deux périodes avec un temps de washout de 3 jours. Une dose de 20 mg/kg a été administrée par voie intraveineuse et par voie orale. De l’ampicilline sodium (Ampicilline Cadril® 5G, Laboratoire Coophavet) a été administrée par voie intraveineuse grâce à un cathéter placé dans la veine auriculaire. Les prélèvements de sang ont été réalisés via le cathéter jugulaire et transvasés dans des tubes héparinés à 0, 1, 2, 4, 8, 15, 30, 45 minutes et 1,1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 24 heures après l’administration d’ampicilline. Pour les administrations orales, des boulettes ont été préparées avec de l’aliment, de l’eau, et le prémélange médicamenteux (Ampicilline 80 Porc Franvet®, Laboratoire Franvet). Les porcelets avaient été mis au préalable à jeun et ils ont rapidement consommé les boulettes proposées. Ils ont eu ensuite accès à leur repas 67 Etude expérimentale - chapitre 3 quotidien. Les échantillons de sang ont été prélevés de la même manière à 0, 15, 30, 45 minutes et 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 24 heures après l’administration d’ampicilline. Les échantillons ont été centrifugés (4 000 g, 10 min, 4°C) et le plasma stocké à -80°C. (b) Dosage plasmatique de l’ampicilline Les concentrations d’ampicilline dans le plasma ont été déterminées par HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance) couplée à un détecteur UV (ultraviolet) après extraction sur phase solide. Cinq cents microlitres de plasma et 50 µL de standard interne (3-acetamidophenol, 1µg/mL) ont été déposés sur une cartouche SPE (Bond Elut C8 Varian® 100mg) conditionnée avec 1 mL de méthanol et 1 mL d’eau ultrapure, et passés lentement sous vide. La cartouche a été lavée avec 500 µL d’eau ultrapure et les analytes ont été élués avec 1 mL de methanol / acide acétique (95:5, v/v). L’extrait a été alors évaporé à 40°C sous azote et reconstitué dans 100 µL d’eau ultrapure. Les tubes ont été vortexés et centrifugés à 20 000 g pendant 10 min. Cinquante microlitres de surnageant ont été injectés dans le système HPLC. Les analyses ont été effectuées par un système Agilent comprenant une pompe isocratique 1100, un passeur d’échantillon 1100 et un détecteur UV 1050. Les données ont été acquises et traitées par le logiciel ChenStation. La phase mobile était constituée d’un mélange de tampon acétate 5 mM pH 4 et d’acétonitrile (8:92, v/v), pompée à 0.7mL/min au travers d’une colonne (Inertsil ODS3® C18, 3µm, 150 x 4mm) équipée d’une précolonne (Inertsil ODS3 10x4mm) à 40°C. Les pics étaient visibles par absorbance UV à 230 nm de longueur d’onde. Les pourcentages d’extraction calculés pour le standard interne étaient compris entre 69 et 92%. Les données (rapport aire de la molécule / aire du standard interne vs concentration) sont obtenues avec une régression linéaire incluant une composante quadratique pondérée 1/X². La courbe de calibration a été établie pour des concentrations allant de 0.125 à 20 µg/mL. La validation de la méthode a été effectuée avec 4 points de contrôle qualité aux concentrations suivantes : 0.4, 1.25, 7.5 et 15 µg/mL. L’opération a été répétée 6 fois durant 3 jours. Les précisions intra- et inter-jour étaient inférieures à 12% et l’exactitude était comprise entre 95 et 104%. La limite de quantification a été établie à 0.125 µg/mL avec une précision de 4% et une exactitude de 96%. (c) Analyse des résultats Les concentrations plasmatiques d’ampicilline en fonction du temps ont été analysées à l’aide d’une approche non compartimentale avec le logiciel WinNonlin (WinNonlin 5.2, Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Les paramètres pharmacocinétiques ont été 68 Etude expérimentale - chapitre 3 calculés grâce aux équations classiques (60). L’aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps (AUC) a été calculée selon la méthode des trapèzes. La clairance plasmatique (Cl) a été calculée en divisant la dose administrée par l’AUC obtenue après administration par voie intraveineuse. Le temps de demi-vie (t1/2) a été calculé selon l’équation suivante : t1/2=ln2/ λz, où λz est la pente de la phase terminale, calculée par régression linéaire sur le logarithme des concentrations. Le volume de distribution à l’équilibre (Vss) a été calculé selon l’équation suivante : Vss=(Dose*AUMC)/AUC2, où l’AUMC est l’aire sous la courbe du premier moment statistique. Pour la voie orale, le pic des concentrations (Cmax) et le temps associé (Tmax) ont été obtenus directement à partir des données. La biodisponibilité absolue (F) a été calculée en divisant l’AUC individuelle obtenue après administration par voie orale par l’AUC individuelle obtenue après administration par voie intraveineuse. 324- Résultats Les résultats sont présentés dans la figure 2 et le tableau 7. Après administration par voie intraveineuse, l’ampicilline a été distribuée et éliminée rapidement. Après administration par voie orale, les concentrations plasmatiques ont atteint un pic de 0.43 µg/mL à 1.63 heures. L’ampicilline a été très peu absorbée car sa biodisponibilité absolue n’était que de 6.16%. Concentration d'ampicilline (µg/mL) Concentration d'ampicilline (µg/mL) a) 80 70 60 50 40 30 20 10 0 b) 100 10 1 0.1 0.01 0 100 200 300 400 Temps (min) Voie intraveineuse Voie orale porc nourri 0 100 200 300 400 Temps (min) Voie intraveineuse Voie orale porc nourri Figure 2 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (1) (moyennes ± écart-type) en fonction du temps (min) après administration d’ampicilline par voie intraveineuse et par voie orale à la dose de 20 mg/kg, n=4. L’échelle des concentrations est arithmétique a) et logarithmique b). 69 Etude expérimentale - chapitre 3 Tableau 7 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (2) (moyennes ± écart-type) après administration par voie intraveineuse et par voie orale à la dose de 20 mg/kg, n=4. mg.h/L Voie intraveineuse 24.5 ± 2.3 b L/kg 0.46 ± 0.07 c L/h/kg 0.23 ± 0.02 Unités AUCa Vss Cl Voie orale porc nourri 1.46 ± 0.58 Cmaxd µg/mL 0.43 ± 0.15 Tmaxe t1/2f g h 1.63 ± 0.43 F h % 0.77 6.16 ± 2.83 a AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, b Vss : volume de distribution à l’équilibre, c Cl : clairance plasmatique, d Cmax : concentration plasmatique maximale, e Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, f t1/2 : temps de demi-vie, g F : biodisponibilité absolue 325- Discussion Après administration par voie intraveineuse, l’ampicilline a été rapidement distribuée et éliminée. Les paramètres pharmacocinétiques que nous avons obtenus sont comparables à ceux décrits dans la littérature chez le porc (9, 139). D’autre part, nous avons évalué que la biodisponibilité absolue de l’ampicilline par voie orale chez le porc nourri était de 6.16%. L’absorption de l’ampicilline par voie orale est donc très faible chez le porc. Elle est comparable à celle du cheval à jeun : 2% (49) et à celle du veau respectivement nourri et à jeun : 4.53% et 12.08% (141). L’administration par voie intraveineuse devrait conduire à l’exposition la moins importante du tube digestif à l’ampicilline. Après administration par voie intraveineuse chez l’homme, l’ampicilline était présente dans la bile à des concentrations équivalentes aux concentrations plasmatiques (72). L’ampicilline est alors secrétée au niveau du tube digestif, ce qui explique qu’après un délai de 30 minutes, Galtier et Charpenteau ont mesuré des concentrations d’ampicilline de l’ordre de 4 µg/g dans les contenus digestifs de porc, après leur avoir administré 20 mg/kg d’ampicilline par voie intraveineuse (55). En ce qui concerne la voie orale, compte tenu de la biodisponibilité absolue très faible de l’ampicilline chez le porc, la majorité de la dose d’ampicilline administrée reste au niveau du compartiment digestif et pourrait donc exercer une pression de sélection importante sur les bactéries digestives. 70 Etude expérimentale - chapitre 3 L’administration d’ampicilline par voie intraveineuse et par voie orale devrait donc conduire à des concentrations d’ampicilline très différentes au niveau du tube digestif, l’administration par voie orale entraînant une exposition massive des bactéries du tube digestif. Par ailleurs, lors d’administration par voie orale, le statut digestif peut modifier l’exposition des bactéries à l’ampicilline. En effet, le contenu digestif peut être à l’origine de divers phénomènes de fixation qui rendent l’antibiotique inactif (69). Les concentrations libres d’antibiotique, mesurables par dosage microbiologique, peuvent dans ce cas être diminuées et l’exposition des bactéries digestives à l’antibiotique moins importante. Le contenu alimentaire peut aussi être à l’origine d’une diminution de l’absorption des bêtalactamines. L’absorption de l’amoxicilline est diminuée chez le porc lorsqu’elle est administrée par voie orale en même temps que l’aliment (5, 36). Dans le cas d’une diminution de la biodisponibilité de l’ampicilline liée à la prise de nourriture, l’exposition du tube digestif à l’antibiotique serait augmentée en terme de concentrations totales, alors que dans le même temps la présence de fibres dans la lumière intestinale pourrait provoquer une diminution des concentrations libres biologiquement actives. En conclusion, les données expérimentales obtenues dans cette étude associées aux données de la littérature concernant l’effet de l’alimentation sur la biodisponibilité des bêtalactamines suggèrent que la voie d’administration et le statut digestif conduisent à des expositions différentes du tractus intestinal. 71 Etude expérimentale - chapitre 3 72 Etude expérimentale - chapitre 3 33- Impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur le niveau de résistance des entérobactéries digestives du porc 331- Problématique Au regard des résultats de l’étude précédente et des données de la littérature concernant l’impact du statut digestif sur la biodisponibilité des bêta-lactamines, nous avons fait l’hypothèse que les trois modalités d’administration de l’ampicilline suivantes : la voie intramusculaire, la voie orale chez le porc à jeun et la voie orale chez le porc nourri pouvaient conduire à des expositions différentes du tube digestif. Nous avons voulu évaluer si ces modalités d’administration entraînaient un développement de résistance différent au niveau de la flore digestive. Nous avons vu dans la synthèse bibliographique, qu’il était difficile d’obtenir une mesure exacte du niveau de résistance de la flore commensale. C’est pourquoi nous avons utilisé trois méthodes pour évaluer ce niveau de résistance: deux indicateurs phénotypiques et un indicateur génotypique. Dans l’optique de quantifier le réservoir de gènes de résistance à l’ampicilline dans le tube digestif, et d’estimer les quantités de gènes excrétés par le porc au cours du traitement, nous avons en effet développé un nouvel outil: la quantification des gènes blaTEM par PCR en temps réel. 332- Objectif L’objectif de cette étude était triple : 1- Développer et valider une méthode de PCR en temps réel afin de quantifier les gènes blaTEM dans les fèces, et comparer cet indicateur génotypique à des indicateurs phénotypiques. 2- Evaluer l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline (voie intramusculaire, voie orale chez le porc à jeun, voie orale chez le porc nourri) grâce à ces trois indicateurs. 3- Déterminer les profils pharmacocinétiques de ces trois modalités d’administration. 73 Etude expérimentale - chapitre 3 333- Etude de l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur l’excrétion d’entérobactéries résistantes et de gènes blaTEM dans les fèces de porc La majorité des résultats de cette étude sont présentés dans l’article 1. (a) Matériels et méthodes Dix-huit porcs, âgés de 7 semaines à leur arrivée, ont été utilisés. L’ampicilline a été administrée pendant 7 jours à la dose de 20 mg/kg/jour* selon trois modalités (trois groupes de quatre porcs) : voie orale au cours du repas, voie orale à jeun et voie intramusculaire. Le quatrième groupe (6 porcs) a servi de groupe témoin. Le niveau de résistance à l’ampicilline a été mesuré grâce à trois méthodes: - deux méthodes phénotypiques : - le pourcentage d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline après dénombrement sur milieu Mac Conkey en absence et en présence d’ampicilline, - l’évaluation de la CMI de l’ampicilline sur 20 souches d’E. coli isolées. - une méthode génotypique : la quantification des gènes blaTEM dans les fèces de porc par PCR en temps réel utilisant le SYBR green. Les prélèvements de fèces ont été réalisés avant traitement et un, quatre et sept jours après le début du traitement pour les mesures phénotypiques, et tous les jours pour les mesures génotypiques. Un modèle linéaire généralisé à effets mixtes a été utilisé pour l’analyse statistique. Le plan expérimental, la méthodologie et les analyses statistiques sont détaillés de façon exhaustive dans l’article 1. * Nous avons administré 20 mg/kg/jour par voie orale et par voie intramusculaire. C’est la posologie recommandée dans le Dictionnaire des Médicaments Vétérinaires pour la voie orale. Concernant la voie intramusculaire, la posologie recommandée est de 7 mg à 14 mg/kg/12 heures. 74 Etude expérimentale - chapitre 3 (b) Résultats présentés dans l’article 1 Indicateurs phénotypiques du niveau de résistance : figure 3 Pourcentage d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline : Avant traitement, le pourcentage d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline était compris entre 2.5% et 12% pour les quatre groupes de porcs. Aux quatrième et septième jours de traitement, ces pourcentages étaient supérieurs à 50% pour les 3 groupes traités et toujours inférieurs à 15% dans le groupe témoin. L’analyse statistique a indiqué une augmentation significative (p<0.05) du pourcentage d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline dans les trois groupes traités par rapport au groupe témoin, mais pas de différence significative entre les trois modalités d’administration. Pourcentage de souches d’ E. coli résistantes : La détermination de la fréquence des souches d’E. coli ayant une CMI d’ampicilline≥32 µg/mL (valeur critique proposée par le CLSI) a montré qu’avant traitement, selon les groupes de porc, 1% à 38% des souches d’E. coli étaient résistantes à l’ampicilline. Au quatrième et septième jour de traitement, la majorité des souches d’E. coli était résistante chez les porcs traités alors que seulement 36% étaient résistantes chez les porcs témoins. L’analyse statistique a pu mettre en évidence une différence significative (p<0.05) dans l’excrétion de souches d’E. coli résistantes entre la voie orale chez les porcs nourris et les porcs témoins. Les deux autres modalités d’administration n’ont pas montré de différence par rapport au groupe témoin probablement à cause d’une grande variabilité à l’intérieur du groupe témoin et de la faible puissance statistique de l’essai. 75 120 % E. coli résistants % entérobactéries résistantes Etude expérimentale - chapitre 3 100 80 60 40 20 0 120 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Temps (jours) 0 1 2 3 4 5 6 7 Temps (jours) Figure 3 : Pourcentages d’entérobactéries et de souches d’E. coli résistantes (moyennes ± écart-type) après administration d’ampicilline à la dose de 20 mg/kg par la voie intramusculaire (▲) (n=4), par la voie orale chez le porc à jeun (■) (n=4), et par la voie orale chez le porc nourri (□) (n=4). Six porcs ont été utilisés comme témoins (●). Quantification des gènes blaTEM : La spécificité de l’amplification par PCR en temps réel des gènes blaTEM, la qualité de la courbe standard, la qualité de l’extraction et l’absence d’inhibiteurs ont été contrôlées. La technique de PCR quantitative a été validée pour des quantités de gènes blaTEM comprises entre 104 et 109 copies/g de fèces (cf. résultats de validation présentés dans l’article 1). Avant traitement, les quantités de gènes blaTEM étaient au dessous de 107 copies/g de fèces (figure 4). Au cours du traitement, ces quantités ont fluctué entre 104-106 copies/g pour le groupe témoin, 107-109 copies/g pour les deux voies orales et 106-108 copies/g pour la voie intramusculaire (cf. résultats individuels présentés dans l’article 1). Les quantités de gènes blaTEM excrétées ont été significativement plus importantes pour les animaux traités que pour le groupe témoin (p<0.001), et plus élevées pour la voie orale au cours du repas que pour la voie intramusculaire (p<0.05). 76 copies de gènes bla TEM/ g de fèces Etude expérimentale - chapitre 3 1 E+10 1 E+9 1 E+8 1 E+7 1 E+6 1 E+5 1 E+4 0 1 2 3 4 5 6 7 Temps (jours) Figure 4 : Nombre de copies de gènes blaTEM/g de fèces (moyennes ± écart-type) après administration d’ampicilline à la dose de 20 mg/kg par la voie intramusculaire (▲) (n=4), par la voie orale chez le porc à jeun (■) (n=4), et par la voie orale chez le porc nourri (□) (n=4). Six porcs ont été utilisés comme témoins (●). Enfin, la comparaison entre les quantités de gènes blaTEM et les dénombrements des entérobactéries résistantes respectifs a montré une corrélation significative (r2=0.67) (figure Log (entérobactéries résistantes à l'ampicilline/g de fèces) 5). 12 2 R = 0.67 11 10 9 8 7 6 5 4 3 3 5 7 9 11 Log (bla TEM/g de fèces) Figure 5 : Comparaison entre le log du nombre de copies de gènes blaTEM/g de fèces et le log des dénombrements d’entérobactéries résistantes à l’ampicilline/g de fèces 77 Etude expérimentale - chapitre 3 (c) Résultats complémentaires à ceux présentés dans l’article 1 La distribution des CMI aux jours 0, 1, 4 et 7 pour les porcs témoins et traités est donnée dans la figure 6. Avant traitement, environ 20% de l’ensemble des souches d’E. coli étaient résistantes à l’ampicilline (c'est-à-dire ayant une CMI ≥ 32 µg/mL). Après 7 jours de traitement, pour les porcs traités la majorité des souches étaient résistantes avec des CMI supérieures à 256 µg/mL. Jour 1 20 Jour 4 CMI (µg/mL) >2 56 25 6 20 >2 56 25 6 12 8 64 32 16 0 8 25 6 >2 56 64 12 8 32 8 16 4 2 0 40 4 20 60 2 40 80 1 60 100 0. 5 % de souches de E. coli 80 1 12 8 Jour 7 100 0. 5 64 CMI (µg/mL) CMI (µg/mL) % de souches de E. coli 32 0 8 32 64 12 8 25 6 >2 56 8 16 4 2 1 0 40 16 20 4 40 60 2 60 80 1 80 100 0. 5 % de souches de E. coli 100 0. 5 % de souches de E. coli Jour 0 CMI (µg/mL) Figure 6 : Distribution des CMI des souches d’E. coli aux jours 0, 1, 4 et 7 pour les porcs témoins ( ) et pour les porcs ayant reçu l’ampicilline par voie intramusculaire ( ), par voie orale à jeun ( ), et par voie orale en même temps que l’aliment ( ), n=320 souches à chaque jour. 78 Etude expérimentale - chapitre 3 334- Etude pharmacocinétique des trois modalités d’administration de l’ampicilline Dans le but d’évaluer de manière indirecte l’exposition du tube digestif à l’ampicilline pour les trois modalités d’administration, une étude pharmacocinétique a été réalisée sur les porcs après les 7 jours de traitement pendant lesquels l’effet sur la flore de l’antibiothérapie a été évalué. (a) Matériels et méthodes Les prélèvements de sang ont été réalisés par ponction directe au niveau du sinus veineux jugulaire droit en utilisant des tubes héparinés. Les prélèvements de sang ont été réalisés avant et 15, 30 minutes et 1, 1.5, 2, 3, 4 et 6 heurs après l’administration par voie orale et 10, 15, 30 minutes et 1, 2, 3, 4 et 6 heures après l’administration par voie intramusculaire. Les échantillons ont été centrifugés (4 000 g, 10 min, 4°C) et le plasma stocké à -80°C. Le dosage plasmatique de l’ampicilline a été réalisé selon la méthode décrite la section 31. Les concentrations plasmatiques d’ampicilline en fonction du temps ont été analysées à l’aide d’une approche non compartimentale avec le logiciel WinNonlin (WinNonlin 5.2, Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Les paramètres pharmacocinétiques ont été calculés grâce aux équations classiques (60). L’aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps (AUC) a été calculée selon la méthode des trapèzes. Le pic des concentrations (Cmax) et le temps associé (Tmax) ont été obtenus directement à partir des données. La biodisponibilité relative (Frelative) a été calculée en divisant l’AUC moyenne obtenue après administration d’ampicilline par voie orale par l’AUC moyenne obtenue après administration par voie intramusculaire. Pour comparer les AUC un test de Tukey a été utilisé après une transformation logarithmique des données. (b) Résultats Les résultats sont présentés dans la figure 7 et le tableau 8. Suite à l’administration par voie intramusculaire, un pic des concentrations plasmatiques de 24.7 µg/mL a été atteint à 0.44 heures, puis les concentrations ont décliné rapidement. Pour les voies orales, le pic des concentrations plasmatiques était moins élevé et retardé chez les porcs nourris par rapport aux porcs à jeun : 0.49 µg/mL à 2.13 heures pour les porcs nourris contre 3.26 µg/mL à 0.75 heures pour les porcs à jeun. Les biodisponibilités relatives des voies orales 79 Etude expérimentale - chapitre 3 étaient basses et significativement différentes: 20.3% chez le porc à jeun et 7.5% chez le porc nourri. a) b) 100.0 30 Concentration d'ampicilline (µg/mL) Concentration d'ampicilline (µg/mL) 35 25 20 15 10 5 0 10.0 1.0 0.1 0.0 0 100 200 300 400 0 Temps (min) 100 200 300 400 Temps (min) Voie orale porc nourri Voie orale porc à jeun Voie intramusculaire Voie orale porc nourri Voie orale porc à jeun Voie intramusculaire Figure 7 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (2) (moyennes ± écart-type) en fonction du temps (min) après administration d’ampicilline par voie intramusculaire, par voie orale chez le porc nourri et le porc à jeun à la dose de 20 mg/kg, n=4. L’échelle des concentrations est arithmétique a) et logarithmique b). Tableau 8 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (3) (moyennes ± écart-type) après administration par voie intramusculaire et par voie orale chez le porc nourri et le porc à jeun à la dose de 20 mg/kg, n=4. Cmaxa Tmaxb AUCc Frelatived µg/mL h mg.h/L % Intramusculaire 24.7 ± 8.3 0.44 ± 0.13 30.7* ± 9.2 100 Orale porc à jeun 3.26 ± 1.9 0.75 ± 0.3 6.22* ± 2.74 20.3* Orale porc nourri 0.49 ± 0.2 2.13 ± 0.6 2.29* ± 0.9 7.5* Voie d’administration * Les valeurs sont significativement différentes entre les groupes (p<0.05). a Cmax : concentration plasmatique maximale, b Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, c AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, d Frelative : biodisponibilité relative 80 Etude expérimentale - chapitre 3 335- Discussion générale L’objectif de ce travail était d’évaluer l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur le niveau de résistance de la flore digestive au moyen de trois indicateurs : deux indicateurs phénotypiques et un indicateur génotypique que nous avons validé : la quantification des gènes blaTEM dans les fèces de porc. Les trois modalités d’administration testées étaient : la voie intramusculaire, la voie orale chez le porc à jeun et la voie orale chez le porc nourri. Les indicateurs phénotypiques ont révélé une augmentation massive d’entérobactéries et de souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline au cours du traitement, avec des CMI supérieures à 256 µg/mL. Des modifications marquées de l’écosystème digestif et notamment la sélection d’entérobactéries résistantes, ont été décrites lors d’administration de bêta-lactamines dans plusieurs espèces (50, 93, 125). L’analyse statistique a mis en évidence que les porcs traités excrétaient plus d’entérobactéries résistantes que les porcs témoins. Concernant le deuxième indicateur phénotypique: l’excrétion de souches d’E. coli résistantes, une différence significative a seulement pu être mise en évidence entre les porcs qui avaient reçu l’ampicilline par voie orale au cours du repas et les porcs témoins. L’absence de différence significative entre les deux autres modalités d’administration et les porcs témoins pour cet indicateur a probablement pour origine une grande variabilité dans le groupe témoin. Dans nos conditions expérimentales, la détermination de la fréquence des entérobactéries résistantes s’est révélée plus pertinente que l’évaluation du pourcentage de souches d’E. coli résistantes. La fréquence d’entérobactéries résistantes a été déterminée sur l’ensemble de la population des entérobactéries alors que le pourcentage de souches d’E. coli résistantes a été calculé à partir de 20 souches isolées. Dans la plupart des programmes de surveillance, la recherche de la résistance aux antibiotiques est effectuée sur une seule souche d’E. coli par prélèvement. Récemment une étude a comparé les résultats obtenus avec cette méthodologie aux résultats obtenus en déterminant la fréquence d’entérobactéries résistantes par prélèvement. Les auteurs ont conclu que l’estimation de la fréquence d’entérobactéries résistantes pouvait permettre d’obtenir des données quantitatives utiles dans l’analyse de l’association entre la consommation d’antibiotiques et le développement de résistance (134). Cette conclusion est à rapprocher de nos résultats qui ont montré que la détermination de la fréquence des entérobactéries résistantes nous a permis de quantifier de 81 Etude expérimentale - chapitre 3 manière pertinente le niveau de résistance de la flore digestive des porcs lors d’administration d’ampicilline. Par ailleurs, dans l’optique de quantifier la résistance à l’ampicilline au niveau de la biomasse bactérienne totale, nous avons développé un outil de quantification des gènes blaTEM dans les fèces par PCR en temps réel. En effet, nous avons vu dans la synthèse bibliographique que les gènes blaTEM codent pour les bêta-lactamases de type TEM qui sont majoritairement responsables de la résistance à l’ampicilline chez les entérobactéries. Nous avons quantifié ces gènes par PCR en temps réel car cette technique présente de nombreux avantages : elle est sensible, elle permet de quantifier grâce à une courbe de calibration des gènes provenant de matrices variées, et elle permet une quantification au niveau de la biomasse bactérienne totale sans mise en culture des bactéries. Cette technique a été utilisée pour ces avantages afin de quantifier des gènes de résistance provenant de matrices variées et complexes (30, 85, 86). La quantification des gènes blaTEM a permis, dans nos conditions expérimentales, de détecter des différences parmi trois modalités d’administration de l’ampicilline, alors que l’analyse phénotypique ne permettait pas de les distinguer. Afin de comparer cet indicateur génotypique aux indicateurs phénotypiques, nous avons comparé les dénombrements des entérobactéries résistantes à l’ampicilline par gramme de fèces et les quantités de gènes blaTEM par gramme de fèces. Il existe une corrélation significative entre les résultats obtenus avec ces deux techniques. Les divergences étant en partie dues probablement à l’imprécision des deux techniques, au fait que les gènes blaTEM peuvent être présents dans des bactéries autres que les entérobactéries, et qu’il existe d’autres mécanismes de résistance à l’ampicilline chez les entérobactéries (cf. synthèse bibliographique). Concernant l’impact des modalités de traitement, il est apparu que l’administration d’ampicilline par voie orale chez des porcs nourris conduisait à l’excrétion la plus importante de gènes blaTEM. Par ailleurs, les résultats pharmacocinétiques ont montré que parmi les deux voies orales, la modalité d’administration avec l’aliment avait la plus faible biodisponibilité. En effet, la prise de nourriture concomitante à la prise de bêta-lactamine par voie orale diminue l’absorption de l’antibiotique chez le porc (70), le chien (77) et l’homme (136). On peut supposer que parmi les trois modalités d’administration testées, la voie orale chez le porc nourri est celle qui a conduit à l’exposition la plus importante des bactéries du tube digestif. Cependant, la voie intramusculaire a conduit à une exposition suffisamment importante au niveau du tube digestif pour sélectionner les entérobactéries résistantes et éliminer les sensibles. 82 Etude expérimentale - chapitre 3 En conclusion, l’ensemble des résultats indique que notre technique de quantification des gènes blaTEM par PCR en temps réel apparaît comme étant un outil prometteur pour l’évaluation de l’impact des traitements antibiotiques chez l’animal. De plus, cet outil peut aussi être utilisé pour quantifier les gènes de résistance dans des environnements divers et pourrait permettre d’appréhender les flux de gènes de résistance entre les réservoirs animaux et humains. Grâce à cet indicateur génotypique et aux indicateurs phénotypiques, nous avons mis en évidence que des différences d’exposition peuvent conditionner des niveaux de résistance différents au niveau de la flore digestive. Cependant, les trois modalités d’administration testées ont toutes été à l’origine d’un impact négatif sur l’écosystème digestif, et de nouvelles stratégies thérapeutiques doivent être envisagées afin de prévenir l’émergence de résistance lors d’administration d’ampicilline. 83 Etude expérimentale - article 1 84 Etude expérimentale - article 1 Article 1 Impact of three ampicillin dosage regimens on selection of ampicillin resistance in Enterobacteriaceae and excretion of blaTEM genes in swine feces D. Bibbal, V. Dupouy, J.P. Ferré, P.L. Toutain, O. Fayet, M.F. Prère, and A. Bousquet-Mélou Applied and Environmental Microbiology, Aug 2007; 73(15) : 4785-90 85 Etude expérimentale - article 1 86 Etude expérimentale - article 1 87 Etude expérimentale - article 1 88 Etude expérimentale - article 1 89 Etude expérimentale - article 1 90 Etude expérimentale - article 1 91 Etude expérimentale - article 1 92 Etude expérimentale - chapitre 3 34- Etude de la parenté par électrophorèse en champ pulsé des souches d’E. coli isolées de fèces de porc durant l’administration d’ampicilline La majorité des résultats de cette étude sont présentés dans l’article 2. 341- Problématique Au cours de l’étude précédente, nous avons vu que l’administration d’ampicilline conduisait à l’émergence massive de souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline. Nous avons aussi mis en évidence que la résistance à l’ampicilline des entérobactéries d’origine digestive était significativement corrélée à la présence des gènes blaTEM. Les mécanismes populationnels qui concourent à l’émergence de résistance au cours d’une antibiothérapie ont été peu étudiés. Nous avons donc voulu explorer la dynamique de l’émergence de résistance au sein de la population digestive des souches d’E. coli au cours de ce traitement à l’ampicilline. Deux mécanismes peuvent contribuer à l’émergence de résistance au sein de la population digestive des E. coli lors d’une pression de sélection exercée par l’ampicilline : - des souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline préexistantes dans le tube digestif peuvent être sélectionnées, - les gènes blaTEM, qui sont situés sur des éléments génétiques mobiles (84, 104), peuvent être transmis par transfert horizontal à des souches d’E. coli, qui étaient au préalable sensibles à l’ampicilline. 342- Objectif L’objectif de cette étude a été de déterminer si l’ampicilline avait sélectionné des souches d'E. coli résistantes préexistantes dans le tube digestif ou si des souches préalablement sensibles avaient acquis un mécanisme de résistance à l’ampicilline. 343- Matériels et méthodes Nous avons réalisé cette étude à partir des prélèvements issus de la phase expérimentale décrite dans l’article 1. Les prélèvements de fèces provenaient des 12 porcs 93 Etude expérimentale - chapitre 3 qui ont été traités à l’ampicilline pendant 7 jours et de 4 porcs témoins. Les homogénats de fèces qui ont été recueillies avant traitement et un, quatre et sept jours après le début du traitement ont été ensemencés sur gélose Mac Conkey. De plus, afin de sélectionner des bactéries résistantes avant le traitement, les homogénats de fèces recueillies avant traitement ont été ensemencés sur gélose Mac Conkey contenant de l’ampicilline (Jour 0 AmpR). Pour chaque porc, à chaque temps de prélèvement, 5 colonies ont été prélevées et confirmées comme étant des souches d’E. coli à l’aide de galerie API 20E. Pour chaque souche, le profil de résistance à 13 antibiotiques a été déterminé par antibiogramme. Les 13 disques utilisés dans cette étude ont été les suivants : ampicilline, amoxicilline+acide clavulanique, céfalotine, ceftiofur, gentamicine, kanamycine, néomycine, acide nalidixique, ciprofloxacine, tétracycline, chloramphénicol, triméthoprime, sulfonamides. Le groupe phylogénétique de chaque souche a été défini ainsi que son pulsotype par électrophorèse en champ pulsé après digestion de son ADN par l’enzyme Xba1. Les déterminants génétiques de la résistance et les gènes codant pour les intégrases 1 et 2 ont été recherchés par PCR chez des souches appartenant aux phénotypes de résistance majoritaires. La méthodologie est détaillée de façon exhaustive dans l’article 2. 344- Résultats présentés dans l’article 2 (a) Résistances associées à l’ampicilline Le tableau 9 présente les pourcentages de souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline, à la céfalotine, au chloramphénicol, à la tétracycline, au triméthoprime, à la streptomycine et aux sulfonamides. Aucune souche d’E. coli n’a présenté de résistance visà-vis du ceftiofur. Trois souches étaient résistantes à l’association amoxicilline + acide clavulanique et deux souches étaient résistantes à la gentamicine, à la kanamycine, à la néomycine, à la ciprofloxacine et à l’acide nalidixique. Avant traitement, seulement 23% des souches d’E. coli étaient sensibles à tous les antibiotiques testés. La plupart des souches étaient résistantes à la tétracycline (69%). Avant traitement, seulement 6% des souches étaient résistantes à l’ampicilline. Aux quatrième et septième jours de traitement, ce pourcentage était au dessus de 90%, et le pourcentage de résistance au chloramphénicol, à la tétracycline, au triméthoprime, à la streptomycine et aux sulfonamides avait aussi augmenté. 94 Etude expérimentale - chapitre 3 Tableau 9 : Pourcentage de souches d’E. coli résistantes chez les porcs témoins et les porcs traités à l’ampicilline avant le traitement, et quatre et sept jours après le début du traitement. Jour 0 Antibiotique Ampicilline Céfalotine Chloramphénicol Tétracycline Triméthoprime Streptomycine Sulfonamides Sensible (n=78) 6 0 3 69 45 20 46 23 Jour 4 Traités Témoins (n=60) (n=20) 93 25 3 5 32 0 90 85 58 0 82 25 63 0 0 0 Jour 7 Traités Témoins (n=57) (n=20) 96 25 7 0 56 0 89 65 68 5 86 20 77 10 4 0 En effet, les souches résistantes à l’ampicilline qui sont apparues au cours du traitement sont majoritairement multirésistantes, c'est-à-dire qu’elles sont résistantes à au moins quatre antibiotiques (tableau 10). De plus, tous les profils de résistance sélectionnés par l’administration d’ampicilline étaient déjà présents avant traitement parmi les souches d’E. coli prélevées sur gélose supplémentée en ampicilline (Jour 0 AmpR). Le phénotype résistant à l’ampicilline majoritaire était résistant à cinq antibiotiques additionnels : chloramphénicol, sulfonamides, tétracycline, triméthoprime et streptomycine. Ce phénotype représentait 53% des souches après sept jours de traitement. Par ailleurs, il était majoritaire au sein des souches résistantes à l’ampicilline avant traitement car il représentait 48% des souches sélectionnées sur gélose supplémentée avec de l’ampicilline avant le début du traitement (Jour 0 AmpR). 95 Etude expérimentale - chapitre 3 Tableau 10 : Pourcentages des phénotypes résistants à l’ampicilline parmi les souches d’E. coli prélevées sur les porcs traités aux jours 0, 4 et 7, et parmi les souches sélectionnées sur gélose supplémentée en ampicilline avant traitement (Jour 0 AmpR) a. Jour 0 (n=78) Profil de résistance b Amp Te Amp Te Str Amp Sul Te Str Amp Chl Sul Trim Str Amp Sul Te Trim Str Amp Chl Sul Te Trim Str 5 5 Jour 4 (n=60) 7 8 15 2 18 32 Jour 7 (n=57) 5 9 9 5 4 53 Jour 0 AmpR (n=73) 2 11 2 20 4 48 a seuls les six phénotypes majoritaires sont présentés; b Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim : triméthoprime, Str : streptomycine (b) Composition génétique des populations d’E. coli La détermination de la fréquence des groupes phylogénétiques a mis en évidence un changement dans la composition des populations d’E. coli : avant traitement 75% des souches appartenaient au groupe B1, alors qu’après sept jours de traitement, 85% des souches appartenaient au groupe A (figure 8). 100 80 60 40 20 Jour 0 Jour 4 A B1 Contrôles Traités Contrôles Traités 0 Jour 7 B2 Jour 0 AmpR D Figure 8 : Pourcentage des groupes phylogénétiques A, B1, B2 et D des souches d’E. coli isolées chez les porcs traités à l’ampicilline et chez les porcs témoins, et des souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline avant le début du traitement (Jour 0 AmpR). 96 Etude expérimentale - chapitre 3 (c) Parenté des souches sélectionnées par le traitement Caractéristiques et distribution des pulsotypes : L’électrophorèse en champ pulsé des 308 souches d’E. coli a permis de définir 18 groupes contenant chacun plus de deux souches non différentiables. Ces groupes ont été identifiés par une lettre. Le dendrogramme ainsi que les profil des pulsotypes pour une souche de chaque groupe sont présentés dans la figure 9. Dix groupes de deux souches non différentiables et 18 pulsotypes uniques ont aussi été identifiés. Par la suite, les pulsotypes associés avec deux souches ont été regroupés sous le terme ‘Pr’ et les pulsotypes uniques 100% 70% 40% 10% sous le terme ‘Uq’. A B J K E M D F N G O L I C H P Q Figure 9 : Dendrogramme et profil des pulsotypes pour une souche d’E. coli représentative de chaque groupe de pulsotype. Lors de l’étude de la distribution des pulsotypes dans les trois séries temporelles de porcs utilisées au cours de l’étude, nous avons remarqué que les animaux avaient en commun de nombreux pulsotypes même s’ils provenaient de générations différentes (voir discussion). La distribution des pulsotypes avant traitement et au cours du traitement est présentée dans la figure 10. Avant administration d’ampicilline, trois groupes de pulsotypes 97 Etude expérimentale - chapitre 3 étaient associés avec le phénotype de résistance à l’ampicilline parmi les souches d’E. coli prélevées sur les géloses ne contenant pas d’ampicilline : A, K et E (figure 10, Jour 0). Les pulsotypes A et K sont apparus majoritaires parmi les souches résistantes à l’ampicilline sélectionnées avant traitement sur gélose supplémentée en ampicilline (figure 10, Jour 0 AmpR). Aux quatrième et septième jours de traitement l’administration d’ampicilline a sélectionné des souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline associées à des pulsotypes qui étaient déjà présents dans le tube digestif avant traitement (figure 10, Jour 4 et Jour 7). Au septième jour de traitement, 53% des souches étaient associées avec le pulsotype A. 60 Jour 0 50 % de souches de E. coli % de souches de E. coli 60 40 30 20 10 0 I 30 20 10 N P Q O R C H A K M B Pr G Uq F L E J D I Pulsotypes Jour 4 60 50 % de souches de E. coli % de souches de E. coli 40 0 A K M B Pr G Uq F L E J D Pulsotypes 60 Jour 0 AmpR 50 40 30 20 10 0 A K M B Pr G Uq F L E J D Pulsotypes I N P Q O R C H N P Q O R C H Jour 7 50 40 30 20 10 0 A K M B Pr G Uq F L E J D Pulsotypes I N P Q O R C H Figure 10 : Distribution des pulsotypes (1) pour les souches d’E. coli prélevées avant traitement sur gélose ne contenant pas d’ampicilline (Jour 0) et sur gélose supplémentée en ampicilline (Jour 0 AmpR), et aux quatrième et septième jours d’administration d’ampicilline (Jour 4 et Jour 7). Les lettres identifient les groupes de pulsotypes, le terme ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec seulement deux souches et le terme ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques. Les souches sensibles à l’ampicilline sont indiquées en blanc et les résistantes en noir. Comparaison des pulsotypes et des phénotypes résistants à l’ampicilline : Le tableau 11 établit la comparaison entre les profils de résistance et les pulsotypes qui leur ont été associés avant et au cours du traitement. Le tableau 12 présente les pourcentages de pulsotypes associés à chaque phénotype de résistance. Un pulsotype pouvait être associé avec des phénotypes de résistance variés, et inversement un même phénotype pouvait être associé avec des pulsotypes différents. Néanmoins, le tableau 12 met en évidence qu’un phénotype de résistance a été majoritairement associé à un pulsotype et le tableau 11 montre que cette association a été stable au cours du temps. Le 98 Etude expérimentale - chapitre 3 phénotype résistant à six antibiotiques a été associé avec 7 pulsotypes mais 76% des souches qui présentaient ce phénotype appartenaient au pulsotype A. Enfin, aucun des pulsotypes associé avec un statut sensible à l’ampicilline avant traitement n’a été retrouvé associé à la résistance à l’ampicilline au cours du traitement (figure 10). Tableau 11 : Principaux phénotypes résistants à l’ampicilline et pulsotypes associés pour les souches d’E. coli prélevées avant traitement sur gélose ne contenant pas d’ampicilline (Jour 0) et sur gélose supplémentée en ampicilline (Jour 0 AmpR), et aux quatrième et septième jours d’administration d’ampicilline (Jour 4 et Jour 7). Pulsotypes associésb Profil de résistancea Jour 0 Jour 4 Jour 7 Jour 0 AmpR (n=78) (n=60) (n=57) (n=73) Amp Te L, Uq L, A L, F Amp Te Str F, Pr F, Pr F B B B, Pr K K, A K, A, Uq, Pr E, B, A, K E H, E, A, Uq A, Uq A, J, K A, J, K, H, O Amp Sul Te Str Amp Chl Sul Trim Str K, Pr Amp Sul Te Trim Str Amp Chl Sul Te Trim Str A, K a Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim : triméthoprime, Str : streptomycine; b les lettres identifient des groupes de pulsotypes, ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec seulement 2 souches et ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques Tableau 12 : Pourcentage de pulsotypes associés à chaque profil de résistance les résultats obtenus à Jour 0, Jour 0 AmpR, Jour 4 et Jour 7 ont été regroupés par profil de résistance. Profil de résistancea Nbb Pulsotypes associés (pourcentage)c Amp Te 9 L (67), A (11), F (11), Uq (11) Amp Te Str 16 F (88), Pr (12) Amp Sul Te Str 20 B (90), Pr (10) Amp Chl Sul Trim Str 18 K (70), A (12), Pr (12), Uq (6) Amp Sul Te Trim Str 18 E (56), A (12), B (10), H (10), K (6), Uq (6) Amp Chl Sul Te Trim Str 83 A (76), J (11), K (9), Uq (2), H (1), O (1) a Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim : triméthoprime, Str : streptomycine ; b Nombre de souches de E. coli par phénotype de résistance, c les lettres identifient les groupes de pulsotypes, ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec seulement 2 souches et ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques 99 Etude expérimentale - chapitre 3 (d) Recherche des déterminants génétiques de la résistance Les déterminants génétiques de la résistance et les gènes codant pour les intégrases 1 et 2 ont été recherchés dans les souches qui présentaient le phénotype de résistance à six antibiotiques. Les résultats sont présentés dans le tableau 13. Le gène blaTEM a été détecté dans 98 % des souches testées. Les souches associées au pulsotype A hébergeaient une combinaison spécifique de gènes: blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(B), strA-strB et intI1. Cinq autres combinaisons ont été détectées pour le même phénotype de résistance. Tableau 13 : Distribution des gènes de résistance détectés dans les souches associées avec le profil de résistance Amp Chl Sul Te Trim Stra Pulsotypeb Groupe phylo.c Nbd A A 29 blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(B), strA-strB, intI1 A B1 1 blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI1 J B1 7 blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI1 J A 1 blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI1 J A 1 blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(B), strA-strB, intI1 K B1 6 blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI1 K A 1 tet(A), strA-strB, aadA1, intI2 O B1 1 blaTEM, cmlA, sulI, sulIII, tet(A), aadA1, intI1 H D 1 blaTEM, sulI, sulII, tet(A), strA-strB, aadA1, intI1 Uqa B1 1 blaTEM, catI, sulI, sulII, tet(A), strA-strB, aadA1, intI1 Uqb A 1 blaTEM, tet(A) Gènes de résistance détectés a Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim : triméthoprime, Str : streptomycine; b les groupes sont identifiés par leur lettre, le pulsotype unique x par ‘Uqx’; c groupe phylogénétique; d pour chaque génotype pulsotype/groupe phylogénétique, les gènes de résistance ont été recherchés sur toutes les souches appartenant à ce génotype, sauf pour le génotype pulsotype A/groupe phylogénétique A où les gènes de résistance ont été recherchés sur 50% des souches. 345- Résultats complémentaires : profils de résistance et pulsotypes des souches provenant des animaux témoins Le tableau 14 présente les principaux profils de résistance et les pulsotypes associés, et la figure 11 présente la distribution des pulsotypes pour les souches d’E. coli prélevées chez les porcs témoins. Au jour 0, 24% des souches étaient sensibles à tous les antibiotiques testés (tableau 9) et étaient associées avec des pulsotypes variés. Deux profils de résistance étaient majoritaires. Le premier était résistant à la tétracycline, et était associé en majorité au pulsotype M. La recherche des déterminants génétiques de la résistance a 100 Etude expérimentale - chapitre 3 révélé que les souches appartenant au pulsotype M portaient le gène tet(A), alors que celles qui appartenaient au pulsotype minoritaire portaient le gène tet(B). Le deuxième profil était résistant aux sulfonamides, à la tétracycline et au triméthoprime, trois pulsotypes étant associés avec ce profil de résistance. Les même gènes de résistance : sulI, tet(A) et le gène codant pour l’intégrase 1 : intI1 ont été détectés chez les souches appartenant aux différents pulsotypes. Le pulsotype M est resté majoritaire aux jours 4 (10/20) et 7 (8/20), et des souches résistantes à l’ampicilline et à la tétracycline, associées au pulsotype M, sont apparues. Tableau 14 : Principaux profils de résistance et pulsotypes associés pour les souches d’E. coli prélevées chez les porcs témoins aux jours 0, 4 et 7. Jour 0 (n=78) Profil de résistance a Nbb Pulsotypesc Sensible 19 Te Str Te Str Sul Te Trim Sul Trim Str Amp Te Amp Chl Sul Trim Str Amp Chl Sul Te Trim Str 17 3 6 23 1 Uq, N, Q, Pr, D M, Pr Q, N Jour 4 (n =20) Nbb 10 3 2 M P, Uq G, I, K 3 3 3 Pulsotypesc L Jour 7 (n =20) Nbb Pulsotypesc 1 D 8 4 M P, Pr 1 G 5 L K, Pr A, K a Amp : ampicilline, Chl : chloramphénicol, Sul : sulfonamides, Te : tétracycline, Trim : triméthoprime, Str : streptomycine ; b Nombre de souches par profils de résistance ; c les lettres identifient les groupes de pulsotypes, ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec seulement 2 souches et ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques 101 Etude expérimentale - chapitre 3 % de souches de E. coli Jour 0 60 50 40 30 20 10 0 A K M B Pr G Uq F L E J D I N P Q O R C H Pulsotypes Jour 7 % de souches de E. coli % de souches de E. coli Jour 4 60 50 40 30 20 10 0 A K M B Pr G Uq F L E J D I N P Q O R C H 60 50 40 30 20 10 0 A K M B Pr G Uq F Pulsotypes L E J D I N P Q O R C H Pulsotypes Figure 11 : Distribution des pulsotypes (2) pour les souches d’E. coli prélevées chez les porcs témoins aux jours 0, 4 et 7. Les lettres identifient les groupes de pulsotypes, ‘Pr’ regroupe les pulsotypes associés avec seulement deux souches et ‘Uq’ regroupe les pulsotypes uniques. Les souches sensibles à l’ampicilline sont indiquées en blanc et les résistantes en noir. 346- Discussion générale L’objectif de ce travail était d’étudier la dynamique de la résistance à l’ampicilline dans la population digestive des E. coli lors d’administration d’ampicilline chez le porc. Les souches d’E. coli ont été caractérisées par leur profil de résistance, leur groupe phylogénétique et leur pulsotype obtenu après électrophorèse en champ pulsé. L’étude des souches d’E. coli prélevées sur les porcs témoins a révélé que peu de souches étaient sensibles à tous les antibiotiques testés, et que ces souches étaient associées avec des pulsotypes variés. En l’absence de pression de sélection, le tube digestif des porcs était principalement colonisé par des souches résistantes à la tétracycline (cf. tableau 9, le pourcentage de souches d’E. coli chez les porcs témoins était toujours supérieur à 65 %), associées à un nombre restreint de pulsotypes, et cette résistance était associée majoritairement à la présence du gène tet(A). Avant traitement, seulement 6% des souches étaient résistantes à l’ampicilline. C’est à cause de cette faible fréquence que nous avons sélectionné des souches résistantes à l’ampicilline sur gélose supplémentée en ampicilline avant de traiter les animaux, afin de décrire les phénotypes et les pulsotypes qui 102 Etude expérimentale - chapitre 3 étaient associés avec la résistance à l’ampicilline. Les profils des souches résistantes à l’ampicilline étaient majoritairement multirésistants et le profil principal était résistant à l’ampicilline, au chloramphénicol, aux sulfonamides, à la tétracycline, au triméthoprime et à la streptomycine. Le plan expérimental de l’étude a utilisé 3 séries de porcs, échelonnées sur 6 mois, les porcs provenant du même élevage avec un fonctionnement classique de conduite en bandes. Nous avons remarqué que les souches d’E. coli prélevées sur des porcs provenant de bandes espacées dans le temps partageaient de nombreux profils de résistance et de nombreux pulsotypes. Cette observation suggère qu’il existe un réservoir de souches d’E. coli résistantes dans l’environnement des porcs. Chez les bovins, il a été montré au cours d’une étude évaluant le niveau de résistance de la flore commensale dans plusieurs fermes, que chaque ferme possédait un réservoir de souches d’E. coli résistantes à la tétracycline et que ces souches circulaient entre les animaux d’une même ferme (117). Chez les poulets, le typage de souches résistantes a montré que les mêmes génotypes persistaient dans l’environnement de la ferme et contaminaient les nouvelles bandes (119). L’ensemble de ces résultats indique que des animaux élevés dans le même environnement partagent un écosystème bactérien, composé de souches porteuses de gènes de résistance, qui se transmet entre animaux contemporains et entre générations successives. Nos résultats suggèrent que l’ampicilline a éliminé les souches d’E. coli sensibles et a sélectionné des souches résistantes qui étaient déjà présentes à un faible niveau dans le tube digestif avant traitement. La composition de la population des E. coli a ainsi été profondément modifiée. La fréquence des groupes phylogénétiques a mis en évidence ce profond changement : l’ampicilline a sélectionné des souches qui appartenaient en majorité au groupe phylogénétique A alors qu’avant traitement, les souches du tube digestif appartenaient en majorité au groupe B1. Grâce aux résultats de l’électrophorèse en champ pulsé, nous avons mis en évidence que les pulsotypes majoritaires observés avant traitement ont disparu au cours du traitement, et ont été remplacés par des pulsotypes minoritaires associés avec la résistance à l’ampicilline, qui existaient avant le traitement mais à faible niveau. Sous la pression de sélection exercée par l’ampicilline ces pulsotypes sont devenus majoritaires. Au final, la distribution des profils de résistance et des pulsotypes observée dans la population des E. coli au cours du traitement se révèle relativement proche de celle que nous avons observée avant le traitement dans la population des souches d’E. coli prélevées sur gélose supplémentée en ampicilline. 103 Etude expérimentale - chapitre 3 La comparaison entre les phénotypes de résistance et les pulsotypes a révélé qu’un pulsotype pouvait être associé avec différents phénotypes de résistance et qu’inversement, un phénotype de résistance pouvait être associé avec différents pulsotypes. Ces résultats sont compatibles avec un transfert horizontal de gènes de résistance dans les populations digestives d’E. coli. Le transfert de gènes de résistance permet la dissémination de la résistance au sein des bactéries de l’écosystème intestinal. Lors de l’administration d’ampicilline, c’est par contre une multiplication clonale des souches, qui possédaient déjà des mécanismes de résistance, qui a permis l’amplification de ces gènes de résistance. Mentula et al. ont aussi montré que lors d’administration d’ampicilline chez le chien, l’émergence de résistance était liée à la multiplication de souches d’E. coli résistantes à l’ampicilline, plutôt qu’au transfert d’éléments de résistance à des souches qui étaient au préalable sensibles (93). Nous pouvons supposer en outre, qu’au moment où la pression de sélection par l’antibiotique s’exerce, le transfert de gènes de résistance est défavorisé par la disparition des souches sensibles, potentiellement receveuses. Les souches résistantes à l’ampicilline, sélectionnées par le traitement, étaient associées avec plusieurs pulsotypes; mais elles appartenaient en grande majorité au pulsotype A (cf. figure 10 Jour 4 et Jour 7). Ce pulsotype était aussi prépondérant parmi les souches résistantes à l’ampicilline avant le traitement (cf. figure 10 Jour 0 AmpR). Il était majoritairement associé avec le profil de résistance à six antibiotiques car 76% des souches qui présentaient le phénotype de résistance à six antibiotiques étaient associées avec le pulsotype A. De manière intéressante, il est à noter que, parmi les sept pulsotypes associés avec le profil de résistance à six antibiotiques, les souches appartenant au pulsotype A présentaient une combinaison spécifique de gènes de résistance. Compte-tenu du rôle du pulsotype A dans l’émergence de la résistance à l’ampicilline chez les animaux étudiés, il serait intéressant d’identifier les mécanismes qui permettent aux souches appartenant à ce pulsotype de persister dans le tube digestif en l’absence de pression de sélection et de devenir majoritaires dès que l’ampicilline exerce une pression de sélection. Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer la persistance des gènes de résistance dans le tube digestif : lien avec des gènes conférant un avantage pour coloniser le tube digestif, système d’addiction permettant le maintien du plasmide, faible coût biologique des déterminants génétiques de la résistance, voire même apport d’un avantage par la présence de ces gènes de résistance (46, 47, 126). Le fait que cette souche soit prépondérante parmi les souches résistantes à l’ampicilline et qu’elle ait accumulé la résistance à six antibiotiques suggère que cette souche doit être particulièrement bien 104 Etude expérimentale - chapitre 3 adaptée à son environnement qu’est le tube digestif et que les déterminants génétiques de la résistance lui imposent un faible coût biologique (82). En conclusion, lors d’administration d’ampicilline, l’émergence de résistance dans la population des souches d’E. coli digestives était due à la sélection clonale de souches résistantes à l’ampicilline qui étaient déjà présentes dans le tube digestif avant traitement à faible niveau. Parmi les souches sélectionnées par le traitement, les souches appartenant à un pulsotype particulier ont largement contribué à l’émergence de la résistance. Ces souches étaient multirésistantes, et hébergeaient une combinaison spécifique de déterminants génétiques de la résistance. Dans l’optique de prévenir l’émergence et la diffusion de la résistance, il serait pertinent d’identifier par quels mécanismes ces souches peuvent persister à faible niveau dans le tube digestif, et coloniser majoritairement le tube digestif lors de pression de sélection exercée par l’ampicilline. 105 Etude expérimentale - article 2 106 Etude expérimentale - article 2 Article 2 Relatedness of Escherichia coli strains with different susceptibility phenotypes isolated from swine feces during ampicillin treatment D. Bibbal, V. Dupouy, M.F. Prère, P.L. Toutain, and A. Bousquet-Mélou Applied and Environmental Microbiology, May 2009; 75(10) : 2999-3006 107 Etude expérimentale - article 2 108 Etude expérimentale - article 2 109 Etude expérimentale - article 2 110 Etude expérimentale - article 2 111 Etude expérimentale - article 2 112 Etude expérimentale - article 2 113 Etude expérimentale - article 2 114 Etude expérimentale - article 2 115 Etude expérimentale - article 2 116 ETUDE EXPERIMENTALE Chapitre 4 : Stratégie thérapeutique destinée à prévenir l’émergence de bactéries digestives résistantes lors d’administration de bêtalactamines : études préliminaires 117 Etude expérimentale - chapitre 4 118 Etude expérimentale - chapitre 4 Chapitre 4 : Stratégie thérapeutique destinée à prévenir l’émergence de bactéries digestives résistantes lors d’administration de bêtalactamines : études préliminaires 41- Introduction Les résultats des études précédentes ont mis en évidence qu’aussi bien les quantités d’ampicilline sécrétées dans le tube digestif après administration par voie parentérale que celles qui ne sont pas absorbées au cours d’une administration par voie orale exercent une pression de sélection sur la flore digestive qui favorise l’émergence rapide et massive d’entérobactéries résistantes. Ainsi, il apparaît que la prévention de l’émergence de résistances bactériennes dans le tube digestif lors d’administration d’ampicilline ne peut être obtenue que par l’inactivation des résidus de bêta-lactamines dans la lumière intestinale. Dans ce contexte, nous avons entrepris l’étude d’une stratégie de prévention de l’émergence de bactéries digestives résistantes consistant en la co-administration par voie orale d’un ester de bêta-lactamine, la pivampicilline, avec des billes contenant des bêta-lactamases à vectorisation iléo-colique. Nous avons vu dans la synthèse bibliographique que la stratégie d’utilisation de bêtalactamase pour inactiver l’ampicilline dans les segments distaux du tube digestif, lors d’administration de bêta-lactamines par voie orale, impose une vectorisation qui libère la bêta-lactamase en aval de la fenêtre d’absorption de l’antibiotique. Une libération trop précoce au niveau du jéjunum provoquerait une destruction de l’antibiotique dans la lumière intestinale, une diminution de sa biodisponibilité et par conséquent de son action thérapeutique. Une libération trop tardive, c'est-à-dire en aval de la zone iléo-colique, ne préviendrait pas de l’émergence de bactéries résistantes. Pour enrober les billes de bêta-lactamase, une stratégie pH-dépendante a été choisie car ce type enrobage a déjà fait l’objet de nombreux développements chez l’homme. Nous avons choisi l’Eudragit® FS 30 D car cet enrobage a récemment été développé pour obtenir une vectorisation iléo-colique optimale chez l’homme (68). L’utilisation de l’Eudragit® FS 30 D afin de cibler une délivrance iléo-colique chez le porc doit être au préalable validée, car il n’existe pas de données dans la littérature à ce sujet. 119 Etude expérimentale - chapitre 4 Nous avons aussi vu dans la synthèse bibliographique que la biodisponibilité de la pivampicilline par voie orale était plus importante que celle de l’ampicilline chez les espèces testées. Nous avons alors formulé l’hypothèse qu’une absorption plus massive et plus précoce de l’ampicilline administrée sous forme d’un ester permettrait d’éviter les effets de la libération éventuelle de la bêta-lactamase (par fuite ou délivrance précoce) dans la fenêtre d’absorption de l’antibiotique, l’objectif étant de compenser, par un décalage temporel (absorption rapide), un éventuel déficit de décalage anatomique (vectorisation distale de la bêta-lactamase). Pour valider la stratégie associant pivampicilline+ bêta-lactamase, il faudra montrer qu’elle est supérieure à l’ampicilline selon les indicateurs suivants : - une dose de pivampicilline + bêta-lactamase conduit à une biodisponibilité systémique de l’ampicilline supérieure ou égale à une dose équimolaire d’ampicilline seule, - l’action de la bêta-lactamase sur l’ampicilline ou la pivampicilline non absorbée conduit à une destruction totale de l’antibiotique au niveau de l’iléon ou du caecum et à une absence d’impact sur la flore bactérienne digestive. Le chapitre 4 présente les résultats des études préliminaires visant à valider la stratégie pivampicilline + bêta-lactamase chez le porc. Il s’articule autour de deux sections. La première section présente les résultats de l’étude comparée des biodisponibilités absolues par voie orale de la pivampicilline et de l’ampicilline chez le porc. La deuxième section présente les résultats de l’étude de la libération de l’Eudragit® FS 30 D chez le porc. 120 Etude expérimentale - chapitre 4 42- Etude comparée des biodisponibilités absolues de la pivampicilline et de l’ampicilline par voie orale chez le porc 421- Problématique Dans l’optique d’associer une bêta-lactamine à une bêta-lactamase par voie orale, la pivampicilline présenterait un intérêt car il a été montré que son absorption était rapide et importante chez toutes les espèces testées. Cet avantage permettrait de limiter l’impact d’une fuite ou d’une libération précoce de bêta-lactamase sur la biodisponibilité. Une étude préliminaire in vitro a été réalisée en collaboration avec l’Equipe Cinétique des Xénobiotiques (Arellano C, Gandia P, Houin G et Woodley J ; Faculté des Sciences Pharmaceutiques, Toulouse) grâce à un modèle de sacs intestinaux éversés de rat adapté au porc. Cette étude a mis en évidence que : - la pivampicilline était rapidement hydrolysée en présence de tissu intestinal de porc, - les quantités d’ampicilline mesurées dans le tissu intestinal et l’intérieur du sac (c'est-à-dire la quantité absorbée) étaient plus importantes après incubation dans un milieu contenant de la pivampicilline qu’après incubation dans un milieu contenant de l’ampicilline. 422- Objectif L’objectif de cette étude a été de caractériser les paramètres de l’absorption de la pivampicilline et de les comparer à ceux de l’ampicilline, afin d’évaluer si les caractéristiques de la pivampicilline permettraient son utilisation en association avec une bêta-lactamase. 423- Matériels et méthodes (a) Plan expérimental Huit porcs, âgés de 8 semaines à leur arrivée, ont été utilisés. Le plan expérimental a été un plan parallèle à 3 périodes avec un temps de washout d’au moins 3 jours entre les périodes. L’ampicilline sodique a été administrée par voie intraveineuse, puis l’ampicilline trihydrate par voie orale et enfin la pivampicilline par voie orale. Une dose équimolaire de 15 121 Etude expérimentale - chapitre 4 mg/kg d’ampicilline a été administrée à chaque période. De l’ampicilline sodium (sel de sodium d’ampicilline, Sigma) a été administrée par voie intraveineuse au moyen d’un cathéter placé dans la veine auriculaire. Les prélèvements de sang ont été réalisés par ponction directe et récoltés dans des tubes héparinés à 0, 5, 15, 30 et 45 minutes et 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10 et 24 heures après l’administration d’ampicilline. Pour les administrations orales, la pivampicilline (ProAmpi® 500 mg, GlaxoSmithKline Santé Grand Public) et l’ampicilline trihydrate (Totapen® 500 mg, Bristol-Myers Squibb) ont été administrées par gavage juste après le repas. Les échantillons de sang ont été prélevés de la même manière à 0, 15, et 45 minutes et 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8, 10 et 24 heures après l’administration. Les échantillons ont été centrifugés (4 000 g, 10 min, 4°C) et le plasma stocké à -80°C. (b) Dosage plasmatique de l’ampicilline Le dosage de l’ampicilline a été réalisé selon la méthode décrite dans la section 32. Seule l’ampicilline a été dosée car la pivampicilline est totalement hydrolysée en ampicilline au niveau de la muqueuse digestive de porc (résultats obtenus par le Laboratoire Cinétique des Xénobiotiques, Toulouse). (c) Analyse des résultats Les concentrations plasmatiques d’ampicilline en fonction du temps ont été analysées à l’aide d’une approche non compartimentale avec le logiciel WinNonlin (WinNonlin 5.2, Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Les paramètres pharmacocinétiques ont été calculés grâce aux équations classiques (60). L’aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps (AUC) a été calculée selon la méthode des trapèzes. La clairance plasmatique (Cl) a été calculée en divisant la dose administrée par l’AUC obtenue après administration par voie intraveineuse. Le temps de demi-vie (t1/2) a été calculé selon l’équation suivante : t1/2=ln2/ λz, où λz est la pente de la phase terminale, calculée par régression linéaire sur le logarithme des concentrations. Le volume de distribution à l’équilibre (Vss) a été calculé selon l’équation suivante : Vss=(Dose*AUMC)/AUC2, où l’AUMC est l’aire sous la courbe du premier moment statistique. Pour la voie orale, le pic des concentrations (Cmax) et le temps associé (Tmax) ont été obtenus directement à partir des données. La biodisponibilité absolue (F) a été calculée en divisant l’AUC individuelle obtenue après administration par voie orale par l’AUC individuelle obtenue après administration par voie intraveineuse. Pour comparer les valeurs des AUC et des Cmax un test de Student pour 122 Etude expérimentale - chapitre 4 séries appariées a été utilisé après une transformation logarithmique des données. Pour comparer les valeurs des Tmax, un test de Wilcoxon pour séries appariées a été utilisé. 424- Résultats Les résultats sont présentés dans la figure 12 et le tableau 15. Suite à l’administration intraveineuse, l’ampicilline a été rapidement distribuée et éliminée. En ce qui concerne les administrations par voie orale d’ampicilline et de pivampicilline, le pic des concentrations plasmatiques était significativement plus élevé pour les porcs ayant reçu la pivampicilline: 3.25 µg/mL versus 0.92 µg/mL pour les porcs ayant reçu l’ampicilline. De plus, il était plus rapidement atteint chez les porcs ayant reçu la pivampicilline que pour l’ampicilline : 0.67 heures versus 2.13 heures pour les porcs ayant reçu l’ampicilline. La biodisponibilité absolue de la pivampicilline par voie orale était significativement plus élevée que celle de l’ampicilline. a) 10 1 0 0 b) 5 Concentration d'ampicilline (µg/mL) Concentration d'ampicilline (µg/mL) 100 2 4 6 8 Temps (heures) Ampicilline par voie intraveineuse Ampicilline par voie orale Pivampicilline par voie orale 10 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 Temps (heures) Ampicilline par voie orale Pivampicilline par voie orale Figure 12 : Concentrations plasmatiques d’ampicilline (3) (moyennes ± écart-type) en fonction du temps (heures) après administration d’ampicilline par voie intraveineuse et par voie orale, et de pivampicilline par voie orale, à la dose équimolaire de 15 mg/kg d’ampicilline, n=8. L’échelle des concentrations est logarithmique a) et arithmétique b). 123 Etude expérimentale - chapitre 4 Tableau 15 : Paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline (4) (moyennes ± écart-type) après administration d’ampicilline par voie intraveineuse et par voie orale, et de pivampicilline par voie orale, à la dose équimolaire de 15 mg/kg d’ampicilline, n=8. mg.h/L Ampicilline par voie intraveineuse 25.89 ± 2.5 b L/kg 0.37 ± 0.07 c L/h/kg 0.59 ± 0.07 Unités AUCa Vss Cl Ampicilline par voie orale 4.56* ± 1.42 Pivampicilline par voie orale 8.40* ± 2.47 Cmaxd µg/mL 0.92* ± 0.19 3.25* ± 1.11 Tmaxe h 2.13* ± 0.70 0.67* ± 0.12 t1/2f h g % 18.18* ± 8.11 32.79* ± 9.72 F 0.65 * Les valeurs sont significativement différentes entre les groupes (p<0.05). a AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, b Vss : volume de distribution à l’équilibre, c Cl : clairance plasmatique, d Cmax : concentration plasmatique maximale, e Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, f t1/2 : temps de demi-vie, g F : biodisponibilité absolue 425- Résultat complémentaire: biodisponibilité absolue de l’amoxicilline par voie orale chez le porc à jeun Douze porcs, âgés de 8 semaines à leur arrivée ont été utilisés. Le plan expérimental a été un cross-over à deux périodes. L’amoxicilline a été administrée à la dose de 7 mg/kg par voie intraveineuse (Clamoxyl®) et de 20 mg/kg par voie orale (Amodex®Gé) chez le porc à jeun. Les paramètres pharmacocinétiques sont donnés dans le tableau 16. 124 Etude expérimentale - chapitre 4 Tableau 16 : Paramètres pharmacocinétiques de l’amoxicilline (2) (moyennes ± écart-type) après administration par voie intraveineuse à 7 mg/kg et par voie orale à 20 mg/kg, n=12. mg.h/L Amoxicilline par voie intraveineuse 15 ± 5.3 b L/kg 0.90 ± 0.61 c L/h/kg 0.54 ± 0.25 Unités AUCa Vss Cl Amoxicilline par voie orale 10.3 ± 4.92 Cmaxd µg/mL 4.52 ± 3.46 Tmaxe t1/2f g h 1.33 ± 0.39 F h 0.33 % 24.19 ± 7.16 a AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps, b Vss : volume de distribution à l’équilibre, c Cl : clairance plasmatique, d Cmax : concentration plasmatique maximale, e Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, f t1/2 : temps de demi-vie, g F : biodisponibilité absolue 426- Discussion Les paramètres pharmacocinétiques de l’ampicilline après administration par voie intraveineuse et voie orale chez le porc nourri avaient déjà été estimés au cours de l’étude présentée dans la section 32. Pour la voie intraveineuse, les résultats sont sensiblement les mêmes. En ce qui concerne la voie orale, dans l’étude présentée dans la section 32, nous avions évalué cette biodisponibilité à 6.16% alors que nous l’avons estimé à 18.18% dans la présente étude. La différence entre les deux valeurs peut en partie s’expliquer par des conditions expérimentales différentes (gavage de Totapen® versus prise spontanée d’Ampicilline 80 Porc Franvet® dans boulettes). De plus, comme l’ampicilline a une absorption très faible, cette absorption présente une plus grande variabilité. Cette variabilité importante dans l’absorption de l’ampicilline par voie orale a d’ailleurs aussi été relevée chez le cheval (49). Concernant la pivampicilline, nous avons montré que sa biodisponibilité absolue par voie orale était significativement plus élevée que celle de l’ampicilline. Cette biodisponibilité était de l’ordre de 30% comme chez le veau (141) et le cheval (48). De plus, le pic des concentrations plasmatiques était significativement plus élevé et plus rapidement atteint après administration de pivampicilline que d’ampicilline. En comparant les paramètres pharmacocinétiques de la pivampicilline mesurés chez le porc nourri à ceux de l’amoxicilline mesurés chez le porc à jeun au cours d’une autre 125 Etude expérimentale - chapitre 4 étude (tableau 16), nous avons pu mettre en évidence que la biodisponibilité absolue par voie orale de la pivampicilline était comparable à celle de l’amoxicilline, et que le pic des concentrations plasmatiques semblait plus rapidement atteint après administration de pivampicilline chez le porc nourri qu’après administration d’amoxicilline chez le porc à jeun. Dans l’optique d’associer une bêta-lactamine à une bêta-lactamase par voie orale chez le porc, la pivampicilline présente un intérêt par rapport à l’amoxicilline et à l’ampicilline car : - nous avons mis en évidence que l’absorption de la pivampicilline est plus rapide que celle de l’ampicilline ou celle de l’amoxicilline, - nous avons montré que la pivampicilline présente une biodisponibilité absolue supérieure à celle de l’ampicilline, et comparable à celle de l’amoxicilline, - il a été montré chez l’homme (133) et le cheval (49) que la prise de nourriture n’avait pas d’impact sur l’absorption de la pivampicilline, à la différence de l’ampicilline ou de l’amoxicilline. 126 Etude expérimentale - chapitre 4 43- Etude de l’absorption de caféine enrobée avec l’Eudragit® FS30D chez le porc Cette étude a été menée en collaboration avec la société Da Volterra (Faculté de Médecine Xavier Bichat, Paris) qui a fourni les billes de caféine et qui a pris en charge les dosages plasmatiques de la caféine. 431- Problématique L’Eudragit® FS 30 D est un enrobage qui se dissout à un pH de 7.5 et qui a été développé chez l’homme pour viser une délivrance iléo-colique. Chez l’homme, il existe un gradient de pH dans le tractus digestif : 1.2 dans l’estomac, 6.6 dans l’intestin grêle proximal, 7.5 au niveau de l’iléon, 6.4 au niveau du côlon (52). La délivrance de l’Eudragit® FS 30 D a été étudiée chez le chien (56). Dans cette étude, les chiens ont été au préalable traités avec de la pentagastrine (afin de stimuler la libération de HCl), pour simuler les conditions du tube digestif de l’homme. En effet, chez le chien, le pH de l’estomac peut atteindre des valeurs de 6.8, ce qui pourrait entraîner une délivrance anticipée du contenu des billes enrobées par l’Eudragit® FS 30 D. Chez le porc, les pH digestifs seraient aussi différents de ceux observés chez l’homme: le pH atteint au niveau de l’iléon ne dépasserait pas la valeur de 7 (10, 12). L’utilisation de l’Eudragit® FS 30 D pour cibler une délivrance iléo-colique chez le porc doit donc être au préalable validée. 432- Objectif L’objectif de cette étude était double : 1- Evaluer l’absorption de caféine enrobée d’Eudragit® FS 30 D et la comparer à celle de la caféine non enrobée. La caféine a été utilisée car son absorption est possible tout le long du tractus digestif (101). 2- Mesurer le pH des contenus digestifs du porc. 127 Etude expérimentale - chapitre 4 433- Matériels et méthodes (a) Plan expérimental Six porcs, âgés de 7 semaines à leur arrivée, ont été utilisés. Le plan expérimental était un cross-over à deux périodes avec un washout de 8 jours. La caféine (Merck, Allemagne) a été administrée à la dose de 10 mg/kg dans des billes non enrobées et dans des billes enrobées avec 20% d’Eudragit® FS 30 D (Röhm Pharma Polymers, Allemagne) chez le porc à jeun. Les billes ont été élaborées par la société Degussa (Allemagne). Une gélule de taille 1 a été remplie avec la dose de billes pour chaque porc et administrée par voie orale. Les prélèvements de sang ont été réalisés par ponction directe au niveau de la veine jugulaire et récoltés dans des tubes héparinés aux temps suivant: 0, 0.33, 0.66, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 et 24 heures pour les billes non enrobées et 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 24, 34 et 48 heures pour les billes enrobées. Les échantillons ont été centrifugés (4 000 g, 10 min, 4°C) et le plasma stocké à -20°C. (b) Dosage plasmatique de la caféine Les dosages de caféine ont été réalisés par ADME Bioanalyses (Vergèze) par une méthode HPLC/UV. La méthode a été validée pour le plasma de porc pour des concentrations allant de 0.15 µg/mL à 20 µg/mL. (c) Mesure du pH dans les contenus digestifs Afin d’évaluer l’impact du statut digestif sur le pH des contenus digestifs, 3 porcs ont été sacrifiés à jeun et 3 ont été sacrifiés 4 à 5 heures après leur dernier repas. Le pH a été mesuré au niveau de 13 sections : duodénum, jéjunum (2 sections), iléon (3 sections), caecum, côlon centripète (3 sections), côlon centrifuge (2 sections) et rectum. Un pH-mètre MP 230 (Mettler Toledo, Suisse) a été utilisé. (d) Analyse des résultats Les concentrations plasmatiques de caféine en fonction du temps ont été analysées à l’aide d’une approche non compartimentale avec le logiciel WinNonlin (WinNonlin 5.2, 128 Etude expérimentale - chapitre 4 Pharsight Corporation, Mountain View, CA). Les paramètres pharmacocinétiques ont été calculés grâce aux équations classiques (60). L’aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps (AUC) a été calculée selon la méthode des trapèzes. Le pic des concentrations (Cmax) et le temps associé (Tmax) ont été obtenus directement à partir des données. Pour comparer les AUC et les Cmax un test de Student pour séries appariées a été utilisé après une transformation logarithmique des données. Pour comparer les Tmax, un test de Wilcoxon pour séries appariées a été utilisé. 434- Résultats (a) pH des contenus digestifs Les résultats des mesures de pH sont présentés dans la figure 13. Le pH se situe aux alentours de 6 pour les porcs nourris et 6.5 pour les porcs à jeun au niveau du duodénum. Il est compris entre 6.5 (porcs nourris) et 7 (porcs à jeun) au niveau de l’iléon mais ne dépasse pas 7. Il chute au niveau du caecum à 6 pour remonter le long du côlon distal entre 6.5 (porcs à jeun) et 7 (porcs nourris). 8.0 7.5 pH 7.0 6.5 6.0 5.5 D uo de nu m Je ju nu m Je 1 ju nu m 2 Il e um 1 Il e um 2 Il e um 3 C Pr ae ox cu im m al Pr C ol ox on im al 1 Pr C ol ox on im al 2 C ol D o is n ta 3 lC ol D on is ta lC 1 ol on 2 R ec tu m 5.0 Porcs à jeun Porcs nourris Figure 13 : pH des contenus digestifs de porc (moyennes ± écart-type) les porcs étant à jeun (n=3) et nourris (n=3). 129 Etude expérimentale - chapitre 4 (b) Profils cinétiques de la caféine enrobée et non enrobée avec l’Eudragit® FS 30 D Les résultats sont donnés dans le tableau 17 et la figure 14. Les profils des concentrations plasmatiques de caféine présentent de grande variabilité entre les porcs quelque soit le type d’enrobage. Après administration par voie orale de billes non enrobées contenant de la caféine, un pic des concentrations plasmatiques de caféine de 11.6 µg/mL est atteint au bout de 4.2 heures. En ce qui concerne les billes enrobées avec l’Eudragit® FS 30 D, le pic est significativement moins élevé et est atteint au bout de 7.7 heures. Les AUC des deux types de billes ne présentent pas de différence significative. a) b) 100 Concentration de caféine (µg/mL) Concentration de caféine (µg/mL) 16 10 1 14 12 10 8 6 4 2 0 0 0 10 20 30 40 50 0 Temps (heures) Pas d'enrobage 10 20 30 40 50 Temps (heures) Eudragit FS 30 D Pas d'enrobage Eudragit FS 30 D Figure 14 : Concentrations plasmatiques de caféine (moyennes ± écart-type) en fonction du temps (heures) après administration de caféine à 10 mg/kg par voie orale dans des billes enrobées d’Eudragit® FS 30 D et non enrobées (n=6). L’échelle des concentrations est logarithmique a) et arithmétique b). Tableau 17 : Paramètres pharmacocinétiques de la caféine (moyennes ± écart-type) après administration à 10 mg/kg par voie orale dans des billes enrobées d’Eudragit® FS 30 D et non enrobées (n=6). Enrobage Sans enrobage Eudragit® FS 30 D Cmaxa Tmaxb AUCc µg/mL h µg.h/mL 11.6* ± 4.9 4.2 ± 2.8 207 ± 124 7. 7 ± 2.3 159 ± 49 * 6.04 ± 1.4 * il existe une différence significative entre les groupes (p<0.05) ; a Cmax : concentration plasmatique maximale, b Tmax : temps d’occurrence de la concentration plasmatique maximale, c AUC : aire sous la courbe des concentrations plasmatiques en fonction du temps 130 Etude expérimentale - chapitre 4 435- Discussion Les pH que nous avons mesurés au niveau du tractus digestif du porc sont semblables à ceux décrits dans la littérature (10). Ils sont aussi semblables à ceux observés chez l’homme sauf au niveau de l’iléon. Chez l’homme, des pH de 7.5 ont été mesurés (52), alors que dans nos conditions expérimentales chez le porc, le pH des contenus digestifs au niveau de l’iléon ne dépassait pas la valeur de 7. La libération de la caféine enrobée avec l’Eudragit® FS 30 D est néanmoins massive car l’exposition systémique des animaux (AUC) représente environ 77% de celle obtenue avec la caféine non enrobée. L’analyse statistique n’a cependant pas permis de mettre en évidence de différence entre les AUC moyennes, du fait d’une grande variabilité interindividuelle observée dans le groupe avec caféine non enrobée, alors que le pic des concentrations plasmatiques est significativement plus élevé dans ce groupe. Parallèlement, bien que la différence ne soit pas statistiquement significative dans nos conditions expérimentales, les résultats suggèrent l’existence d’un décalage entre les temps d’occurrence des pics de concentration (Tmax). De manière intéressante, ce décalage d’environ 3 heures est du même ordre de grandeur que le temps de transit oro-caecal chez le porc (40). La variabilité de l’absorption de la caféine (non enrobée ou enrobée) peut être associée à plusieurs facteurs physiologiques : la vidange gastrique, le temps de transit, des variations de pH des contenus digestifs. Chez le porc, une grande variabilité inter et intraindividuelle a été mise en évidence lors de la mesure du temps de transit oro-caecal (40, 57). Les résultats de cette étude suggèrent que chez le porc, l’Eudragit® FS 30 D permet une libération massive de la caféine, et que cette libération serait retardée d’environ 3 heures par rapport aux billes non enrobées. Le pic des concentrations plasmatiques de caféine a été atteint à 7.7 ± 2.3 heures lorsque la caféine était enrobée d’Eudragit® FS 30 D. Par ailleurs, nous avons montré dans l’étude précédente que le pic des concentrations plasmatiques d’ampicilline après administration de pivampicilline était atteint au bout de 0.67 ± 0.12 heures. La comparaison de ces résultats suggèrent que la fenêtre d’absorption de la pivampicilline et celle de la caféine enrobée d’Eudragit® FS 30 D pourraient être fortement décalées dans le temps. En conclusion, les résultats concernant les caractéristiques pharmacocinétiques de l’ester d’ampicilline, et la libération d’un principe actif par un enrobage à base d’Eudragit® FS 30 D chez le porc nous semblent compatibles avec la stratégie envisagée. 131 132 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES 133 Conclusions et perspectives 134 Conclusions et perspectives CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES La maîtrise de la qualité sanitaire des élevages nécessite le contrôle des infections bactériennes, qui fait largement appel aux antibiotiques dont l’utilisation, à l’instar de la médecine humaine, s’accompagne du développement de résistances bactériennes aux antiinfectieux. Une des voies de réduction des impacts négatifs de l’antibiothérapie animale sur la santé humaine passe par la promotion d’une antibiothérapie animale raisonnée, capable d’assurer un objectif thérapeutique tout en minimisant les risques d’émergence et de diffusion de l’antibiorésistance. En terme de santé publique, un des enjeux de l’antibiothérapie en médecine vétérinaire est de diminuer la sélection de bactéries résistantes dans le tube digestif des animaux. Un premier objectif de ce travail de thèse a été de caractériser sur les plans phénotypique et génotypique, la résistance bactérienne dans la flore digestive lors d’administration d’ampicilline chez le porc, afin de mieux cerner les mécanismes de l’émergence de cette résistance. Parallèlement, un deuxième objectif de ce travail a été d’évaluer les bases d’une stratégie thérapeutique visant à diminuer l’excrétion de bactéries résistantes digestives lors d’administration d’une bêta-lactamine par voie orale chez le porc. Caractérisation phénotypique et génotypique de l’émergence d’entérobactéries digestives résistantes lors d’administration d’ampicilline chez le porc Au cours de la première partie de notre travail de thèse, nous avons évalué chez le porc l’impact de trois modalités d’administration de l’ampicilline sur l’émergence d’entérobactéries résistantes. Ces trois modalités étaient les suivantes : la voie intramusculaire, la voie orale chez le porc nourri et la voie orale chez le porc à jeun. Nous avons choisi de comparer ces schémas thérapeutiques car les études pharmacocinétiques que nous avons réalisées, et les données de la littérature suggéraient qu’ils pouvaient conduire à des expositions différentes du tube digestif. Il s’agissait ici d’évaluer si des schémas thérapeutiques correspondant au cadre d’une autorisation de mise sur le marché pouvaient être distingués en terme d’émergence de résistance bactérienne au niveau de la flore commensale digestive. 135 Conclusions et perspectives Dans l’optique d’obtenir une mesure quantitative du niveau de résistance de la flore digestive, nous avons utilisé trois indicateurs de résistance dont nous avons comparé les résultats. Il s’agissait de deux indicateurs phénotypiques (le pourcentage d’entérobactéries résistantes obtenu après dénombrement, et le pourcentage de souches isolées d’E. coli résistantes) et d’un indicateur génotypique (la quantification des gènes blaTEM par PCR en temps réel). Cette dernière méthode a été développée au sein du laboratoire, afin d’être en mesure de quantifier les gènes de résistance au niveau de la biomasse bactérienne totale. Les résultats de cette étude ont été présentés dans l’article 1. Les résultats ont montré que dans nos conditions expérimentales, parmi les indicateurs phénotypiques, la détermination du pourcentage d’entérobactéries résistantes était un indicateur plus robuste que la détermination du pourcentage de souches d’E. coli résistantes. En ce qui concerne l’indicateur génotypique, nous avons mis en évidence que la quantification des gènes blaTEM dans les fèces de porc pouvait être un outil prometteur pour apprécier l’impact d’une antibiothérapie sur la flore digestive. Nous avons en outre montré que les quantités de gènes blaTEM étaient corrélées aux dénombrements d’entérobactéries résistantes. Cet indicateur génotypique nous a permis de mettre en évidence que des modalités d’administration différentes de l’ampicilline pouvaient avoir un impact différent quant à l’excrétion de gènes de résistance. Cependant, les trois modalités d’administration de l’ampicilline testées ont toutes eu un impact négatif quant à l’émergence de résistance dans l’écosystème digestif du porc. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons approfondi la caractérisation de l’émergence de résistance lors d’administration d’ampicilline chez le porc en étudiant la dynamique du développement de cette résistance au sein des populations d’E. coli d’origine digestive. Nous avons voulu évaluer dans quelle mesure le développement de la résistance bactérienne au cours du traitement à l’ampicilline pouvait être attribué à la sélection clonale de souches minoritaires résistantes à l’ampicilline, et/ou à l’acquisition de cette résistance par des souches préalablement sensibles, après transfert horizontal des supports génétiques. Nous avons caractérisé sur le plan phénotypique et génotypique les profils de résistance qui ont émergé sous la pression de sélection de l’ampicilline, ainsi que la parenté génétique des souches porteuses de ces résistances. Pour ce faire, nous avons typé, avant et pendant le traitement, par électrophorèse en champ pulsé, des souches d’E. coli qui présentaient des profils de résistance différents. Les résultats de cette étude ont été présentés dans l’article 2. 136 Conclusions et perspectives Nous avons observé qu’avant l’administration d’ampicilline, les animaux hébergeaient un réservoir de souches d’E. coli résistantes dans leur tube digestif. Ces souches étaient majoritairement multirésistantes et l’analyse génotypique a montré que les pulsotypes associés à ces souches étaient partagés par des porcs non contemporains mais provenant du même élevage (issus d’une conduite en bandes classique en élevage porcin). Ces observations renforcent des données de la littérature suggérant l’importance de l’environnement dans la transmission et la pérennisation des réservoirs de bactéries résistantes au sein de la flore commensale digestive. Lors de l’administration d’ampicilline, nous avons mis en évidence que le traitement avait sélectionné majoritairement les souches résidantes résistantes à l’ampicilline. Ainsi, nos observations suggèrent que l’émergence de la résistance lors d’administration d’ampicilline était essentiellement due à la multiplication clonale de souches résistantes appartenant à des pulsotypes variés. Parmi les souches sélectionnées par l’administration d’ampicilline, celles qui étaient associées à un pulsotype particulier (le pulsotype A) ont majoritairement colonisé le tube digestif. Par la suite, il serait pertinent d’identifier les avantages que possèdent les souches appartenant à ce pulsotype leur permettant de coloniser majoritairement le tube digestif sous la pression de sélection exercée par l’ampicilline. Afin de mettre en évidence ces propriétés, plusieurs hypothèses mériteraient d’être explorées. Entre autres, il serait intéressant d’évaluer si la réussite des souches appartenant au pulsotype A est associée à la combinaison spécifique des gènes de résistance qu’elles hébergent. Nous n’avons pas mis en évidence au cours de cette étude l’existence d’un transfert de gènes de résistance à l’ampicilline à des souches préalablement sensibles, le développement de la résistance bactérienne observé au cours du traitement pouvant être attribué à la seule sélection clonale de souches résistantes. Cependant le fait que des souches appartenant à des pulsotypes variés et éloignés génétiquement soient associées avec la résistance à l’ampicilline semble être un indicateur de l’existence du phénomène de transfert horizontal de gènes dans le tube digestif. Le fait que nous n’ayons pas pu mettre en évidence cet événement au cours du traitement peut être mis en relation avec le phénomène d’élimination rapide des souches sensibles et potentiellement receveuses. Au contraire, ce même transfert pourrait être favorisé après la fin du traitement, au moment où la pression de sélection exercée par l’antibiotique diminue et où les souches sensibles ré-émergent. Il serait intéressant de tester cette hypothèse par un suivi au cours du temps en phase posttraitement de la parenté génétique et de la sensibilité à l’ampicilline des souches d’E. coli. 137 Conclusions et perspectives Pour finir, dans l’optique d’étudier les potentiels flux de gènes entre les souches digestives d’origine humaine et animale, il serait pertinent d’évaluer la capacité de transfert des gènes de résistance hébergés par les souches appartenant au pulsotype A à des souches d’origine humaine, dans des conditions proches de celles du tube digestif de l’homme. Par ailleurs, à l’échelle de l’environnement, la technique de quantification des gènes blaTEM dans les fèces par PCR en temps réel semble être un outil prometteur pour quantifier les gènes de résistance dans des environnements divers, et pourrait permettre d’appréhender les flux de gènes de résistance entre les réservoirs animaux et humains. Evaluation des bases d’une stratégie thérapeutique de prévention de l’émergence de résistance dans la flore digestive lors d’administration de bêta-lactamines par voie orale L’ensemble des résultats obtenus au cours de la première partie de notre travail de thèse ont montré que l’administration d’ampicilline chez le porc conduisait à l’émergence rapide et massive d’entérobactéries résistantes, et ce quelle que soit la modalité d’administration testée. Dans l’optique de prévenir l’émergence d’entérobactéries résistantes lors d’administration d’ampicilline, il apparaît donc que les résidus de la bêta-lactamine présents dans la lumière intestinale doivent être inactivés. Au cours de la deuxième partie de notre travail de thèse, nous avons évalué les bases d’une stratégie de prévention de l’émergence de résistance dans la flore digestive, qui consiste en la co-administration par voie orale d’un ester d’ampicilline (la pivampicilline) et de bêta-lactamase à vectorisation colique. Une étude pharmacocinétique nous a permis de mettre en évidence les avantages de la pivampicilline par rapport à l’ampicilline dans le cadre d’une association future avec des bêta-lactamases. Chez le porc, l’ampicilline administrée sous forme de pivampicilline présente une absorption supérieure et surtout plus précoce que l’ampicilline sous forme de sel. Ces caractéristiques pharmacocinétiques de la forme ester de l’antibiotique permettraient d’éviter, dans le cas de délivrance précoce ou de fuite de la bêta-lactamase vectorisée, une hydrolyse au niveau de la fenêtre d’absorption qui conduirait à une sousexposition systémique du porc à l’antibiotique. Par ailleurs, nous avons montré que l’enrobage sélectionné pour obtenir une vectorisation iléo-colique de la bêta-lactamase (l’Eudragit® FS 30 D) permettait une libération retardée du composé enrobé (la caféine) dans le tube digestif du porc. 138 Conclusions et perspectives En l’état de nos investigations, les caractéristiques combinées de la pharmacocinétique de la pivampicilline et de libération de l’enrobage Eudragit® FS 30 D dans le tube digestif de porcs semblent favorables à une dissociation temporelle des processus d’absorption de l’ampicilline (plus précoce) et de libération (avec retard) de l’enzyme capable de détruire cet antibiotique. Ces résultats nous incitent à poursuivre les investigations des propriétés de l’association pivampicilline + billes de bêta-lactamase enrobées d’Eudragit® FS 30 D. L’étape suivante consisterait à développer une formulation à base de bêta-lactamases enrobées d’Eudragit® FS 30 D. Cette formulation pourrait être testée in vitro afin de s’assurer que le processus de fabrication n’altère pas les propriétés de la bêta-lactamase, et que la formulation libère l’enzyme au pH iléo-caecal. Par la suite, l’étude in vivo de la formulation validée permettrait d’évaluer à la fois l’impact de la bêtalactamase sur la biodisponibilité de l’ampicilline administrée sous forme d’ester et sur la prévention de l’émergence de résistance au niveau de la flore digestive. Parmi les étapes ultérieures du développement de ce type de formulation, le choix de la bêta-lactamase est une étape importante. Nous avons vu, dans la synthèse bibliographique, qu’une équipe avait validé cette approche chez la souris en utilisant la combinaison pipéracilline-tazobactam par voie sous-cutanée avec une bêta-lactamase de classe B, qui est insensible à l’inhibiteur tazobactam (124). Le choix d’une bêta-lactamase de classe B semble judicieux dans la perspective d’étendre cette stratégie à l’ensemble des bêta-lactamines, notamment à celles qui sont associées à des inhibiteurs tels que le tazobactam chez l’homme. 139 140 REFERENCES 141 Références 142 Références REFERENCES 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. Aarts, H. J., K. S. Boumedine, X. Nesme, and A. Cloeckaert. 2001. Molecular tools for the characterisation of antibiotic-resistant bacteria. Vet Res 32:363-80. AFSSA. 2006. FARM 2003-2004 Rapport du programme français de surveillance de l'antibiorésistance des bactéries d'origine animale. AFSSA. 2007. Suivi des ventes de médicaments vétérinaires contenant des antibiotiques en France en 2006. AFSSA. 2006. Usages vétérinaires des antibiotiques, résistance bactérienne et conséquences pour la santé humaine. Agerso, H., and C. Friis. 1998. Bioavailability of amoxycillin in pigs. J Vet Pharmacol Ther 21:41-6. Alali, W., H. Scott, B. 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Am J Vet Res 38:1007-13. 150 TITRE ET RESUME EN ANGLAIS Title : Impact of beta-lactam antibiotics on the emergence of resistant enterobacteria in the digestive flora of swine : characterization and strategy of prevention Abstract : Antibiotic administration in animals is involved in the selection of antibiotic resistant bacteria in the digestive tract, potentially transferable to humans. Phenotypic and genotypic characterization of the emergence of resistant digestive enterobacteria, under selective pressure by a beta-lactam antibiotic, was performed in pig. Multiresistant E. coli isolates were mainly selected, and the analysis of the relatedness of these isolates suggested the selection of clones, which were already present at low level in the digestive tract before any treatment. A therapeutic strategy aiming at preventing the emergence of digestive resistant bacteria, during betalactam antibiotic administration by the oral route in pigs, was proposed. It consists of the association of an ester of beta-lactam antibiotic with coated beads which release beta-lactamase at the ileocaecal junction. The characteristics of the absorption of the ester and the characteristics of the delivery of the selected coating encourage us to follow the exploration of this strategy. Keywords : pig, beta-lactam antibiotics, beta-lactamase, antibiotic resistance, E. coli, commensal digestive flora 151 AUTEUR : BIBBAL Delphine TITRE : Impact des bêta-lactamines sur l’émergence d’entérobactéries résistantes dans la flore digestive chez le porc : caractérisation et stratégie de prévention DIRECTEURS DE THESE : Monsieur le Docteur Alain BOUSQUET-MELOU Monsieur le Professeur Pierre-Louis TOUTAIN LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : le 10 Décembre 2008 à l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse RESUME : L’antibiothérapie chez les animaux contribue à la sélection de résistances bactériennes au niveau du tube digestif, potentiellement transmissibles à l’homme. La caractérisation phénotypique et génotypique de l’émergence d’entérobactéries digestives résistantes, lors de pression de sélection par une bêta-lactamine, a été réalisée chez le porc. Des souches d’E. coli majoritairement multirésistantes ont été sélectionnées, et l’analyse des pulsotypes de ces souches suggère une sélection de clones déjà présents mais minoritaires dans le tube digestif. Une stratégie thérapeutique visant à prévenir l’émergence de bactéries digestives résistantes lors d’administration orale de bêta-lactamines chez le porc a été proposée. Elle consiste en l’association d’un ester de bêta-lactamine avec des billes à vectorisation iléocolique contenant des bêta-lactamases. Les caractéristiques d’absorption de l’ester et de libération par l’enrobage sélectionné encouragent à poursuivre l’exploration de cette stratégie. MOTS-CLES : porc, bêta-lactamines, bêta-lactamase, résistance bactérienne, E. coli, flore digestive commensale DISCIPLINE ADMINISTRATIVE : Pharmacologie INTITULE ET ADRESSE DU LABORATOIRE : UMR181 Physiopathologie et Toxicologie Expérimentales, INRA, ENVT Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse 23, chemin des Capelles BP 87614 31076 Toulouse Cedex 3