20/01/2017
DU Cicatrisation des plaies,
brûlures et nécroses
Bactériologie cutanée
Pr Emmanuelle CAMBAU
Service de Bactériologie-Virologie
Bactériologie clinique
Champs d’applications multiples
Mise en évidence des bactéries responsables
d’infections
Surveillance et étude de bactéries émergentes
origine environnementale, animale, humaine
Dépistage et surveillance des bactéries
multirésistances impliquées ou non dans les
infections acquises à l’hôpital
Bactériologie clinique
Distinguer la « bonne » bactérie
de la « mauvaise »
Les Bactéries
Traite des interactions entre les
micro-organismes et l’être humain
Biomasse Bactérienne
Les surprises du classement
Habitat
Nombre de
cellules
% du total
1030
66
Sous-sol terrestre
1,4 x 1030
26
Sol émergé
2,6 x 1029
4,8
Eau de mer
1,2 x 1029
2,2
Eau douce et Lacs salés
2,3 x 1026
0,00043
Animaux domestiques
4,3 x 1024
0,000080
Glace polaire
4,0 x 1024
0,000074
Termites
6,5 x 1023
0,000012
Humains
3,9 x 1023
0,0000072
Oiseaux domestiques
2,4 x 1021
0,000000044
Sous-sol marin
3,6 x
Les bactéries
Procaryotes
(absence de noyau)
Effectuent pour leur compte les
synthèses cellulaires nécessaires à leur
croissance et à leur multiplication
Développement intra-cellulaire éventuel
Métabolisme reste indépendant de celui
de l’hôte contrairement aux virus
1
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Structure de la bactérie
Structure de la bactérie
Résistance aux antibiotiques
Chromosome
Plasmide
(Résistance naturelle)
(Résistance acquise)
Gène de résistance
Transfert vertical
(dans la descendance)
Transfert horizontal
(intra ou inter espèce)
Transmission possible d’un patient à l’autre
via les mains du personnel ou d’autres sources
Taxonomie et
classification
Relation entre hôtes et bactéries
 Bactéries saprophytes de l’environnement présence transitoire et sans danger
 Bactéries commensales au contact des muqueuses (E. coli
B éi
l
d
(E li ) )
ou de la peau (S. epidermidis)
 Bactéries opportunistes Bacille pyocyanique
 Bactéries pathogènes M.tuberculosis
C. diphteriae, Legionella, S. typhi
Bien identifier pour définir et classer
Classification en Famille, Genre, Espèce
Famille: Enterobacteriaceae,
Genre: Escherichia,
Espèce: coli
Aspect des bactéries
au Gram
Paroi bactérienne
Bactéries à Gram positif
Bactéries à Gram négatif
Mycobactéries
2
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Staphylococcus aureus
Staphylocoques blancs et dorés
aspect en culture
Streptocoque
S. aureus
S. auricularis
S. capitis
Staphylocoques
Aspect des bactéries
au Gram
S. caprae
S. cohnii
S. condimenti
S. epidermidis
S. equorum
S. saccharolyticus
S. haemolyticus
S. hominis
S. saprophyticus
S. schleiferi
S. intermedius
S. sciuri
S. lugdunensis
S. simulans
S. pasteuri
S. warneri
S.piscifermentans
S. xylosus
Corynébactéries
Aspect des bactéries
au Gram
Propionibacterium
3
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Entérobactéries
Entérobactéries
C. freundii
E. aerogenes
E. cloacae
E. gergoviae
E coli
E.
E. hermanni
E. asburiae
L. adecarboxylata
P. agglomerans
P. mirabilis
P. vulgaris
P. rettgeri
S. marcescens
K. pneumoniae
K. ascorbata
S. marcescens
S. typhimurium
Shigella flexneri
Aspect des bactéries
au Gram
Pyocyanique
Acinetobacter
Fusobactéries et
spirochettes
Spores bactériennes
4
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Mycobacterium
tuberculosis
Rapidly growing
mycobacteria
Slowly growing
mycobacteria
Bactéries planctoniques
Biofilm
Mise en place et organisation
d’une communauté bactérienne
adhérant à une surface et enrobée d’une
matrice d’exopolysaccharide
Biofilm bactérien
Biofilm
Modèle de formation d’un biofilm
par Pseudomonas aeruginosa.
Résistance aux traitements antibiotiques
Amplification et synchronisation de la
virulence à l’ensemble de la population
bactérienne
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Biofilm
Les biofilms
pourraient
représenter le
mode de vie
normale
l d
des
bactéries
Les Flores
N’étudier que les bactéries
planctoniques (forme libre) laisse de
coté un pan énorme de la physiologie
bactérienne
L’homme est un hybride
primate-microbes
 Le corps humain est un écosystème
pour des milliards de bactéries qui cohabitent
naturellement,
notamment sur la peau et dans le tube digestif
 Nous hébergeons dix fois plus de bactéries
que nous ne possédons de cellules somatiques
et germinales.
L’homme est un hybride primate‐microbes
la séquence complète de ces microbiomes, représente probablement un pool de gènes é
b bl
ld è
100 fois supérieur au génome humain.
L’homme est un hybride
primate-microbes
 L’extrapolation des résultats
d
de t cat o moléculaire
o écu a e indique
d que que
d’identification
nous hébergerions de
15 à 30 000 espèces bactériennes
différentes.
L’homme est un hybride primate‐microbes
 Le microbiote varie d’un individu à l’autre, d’
d d à l’
d’une région à l’autre, d’un site anatomique à l’autre
6
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L’homme est un hybride primate‐microbes
«Human Microbiome Project»
Comparer les flores bactériennes de volontaires sains à celle de patients atteints d'infections aiguës ou de pathologies de type psoriasis ou syndrome du côlon irritable.
Flores microbiennes
 Flore commensales ou résidentes :
Flore cutanée (peau, conjonctive, nez)
Flore bucco‐dentaire, oropharynx
Flore digestive
Flore vaginale
 Sites stériles :
Sang, urine, lcr, liquide articulaire
Flores commensales
Une flore commensale vit en harmonie avec son hôte
Tant qu’elle ne change pas de compartiment
d
Colon Urine Peau Sang
Flores commensales
Les germes commensaux ne
provoquent pas d’infections
spontanées dans leur site.
p q
Toutefois,, ils compliquent
les
démarches d'identification des bactéries
dans les prélèvements polymicrobiens
Expertise bactériologique pour
distinguer les pathogènes des germes
banaux
Flore digestive
 Abondante :
Flore digestive
 Diversifiée: le tractus intestinal héberge le chiffre astronomique de 1014 bactéries 1000 espèces de bactéries représentent 90% de la population totale
p p
(cent milliards de bactéries par gramme de selles).
« Le métagénome intestinal » ‐ l’ensemble des bactéries cohabitant dans notre tube digestif ‐ est aujourd’hui considéré comme un organe à part entière.
1 kg de bactéries dans un intestin humain adulte
10 à 100 fois les cellules de notre corps
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Flore digestive
La peau n’est pas un site stérile
Flore cutanée
Rôle de défense non spécifique contre les microorganismes « pathogènes »
Ecosystème y
complexe
La peau n’est pas un site stérile
 Epiderme barrière physique
Epiderme barrière physique
 Flore (microbiote) cutané
 Ph
 Basse température
 Desquamation
Staphylocoque
Propionibacterium
Flore résidente
 102 à 105 bactéries par cm2 selon les zones
Majorité de bactéries à Gram positif
 Majorité de bactéries à Gram positif
 Staphylocoques  Corynébactérie
Corynébactéries
 Peptostreptococcus  Propionibacterium
 Anaérobies
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La peau n’est pas un site stérile
Représentation schématique des zones de très forte densité bactérienne de l’épiderme
Flore transitoire
Flore de contamination
 Composée de cocci
p
Gram positif
p
Staphylococcus aureus (20% de porteurs sains)
 Composée de bacilles Gram négatif
Entérobactérie (E.coli, Proteus sp)
Pyocyanique, Acinetobacter
Variation des populations bactériennes en fonction des zones cutanées
microbiote et microbiome cutanés
Variation des populations bactériennes en fonction des zones cutanées
Ecosystème complexe
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L'infection doit être distinguée de la colonisation bactérienne
L'infection doit être distinguée de la colonisation bactérienne Colonisation
Normal
Peu virulent
Flore bactérienne résidente
(Flore commensale)
Flore bactérienne transitoire
Infection
Modification de flore
Germes virulents
Retard cicatrisation
Extension
Rupture de l’équilibre
Locaux
Généraux
Lésions cutanées : plaies, brûlures…
Déficit immunitaire
Mauvaise hygiène
Corticothérapie générale
Macération
Immunosuppresseurs
Diabète sucré
Corticothérapie locale
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La distinction colonisation/infection peutelle être basée sur la clinique ?
La distinction colonisation/infection peutelle être basée sur la bactériologie ?
Conférence du Consensus International sur le
(SPILF 2007, IDSA 2007) :
Critères diagnostiques et classification des
pieds diabétiques infectés
4 GRADES
INFECTING WOUND
COLONIZING WOUND
GRADE 1
GRADE 2
GRADE 3
GRADE 4
Contamination/
Colonisation
Infection
Pathogènes usuels
impliqués
Flore bactérienne résidente
= Flore commensale
Flore bactérienne transitoire
= Portage de bactéries
pathogènes
Oui la distinction est actuellement clinique
Distinction colonisation/Infection: espèces
bactériennes et degré de virulence
Epidémiologie des ostéites du pied
Senneville
CID 2006
Wheat APMR
1986
Lavery JFAS
1995
Newman
JAMA 1991
S. aureus
26
40
47
31
SCN
25
10
11
50
Streptococci
12
45
61
27
Enterococcus sp.
8
30
28
8
Autre
5
10
-
-
Entérobactéries
11
55
14
20
Pseudomonas sp.
3
5
11
15
Anaérobies
6
60
15
4
Polymicrobien
-
70
83
-
Bactéries
Colonisation
Bactéries de la flore
commensale:
SCN
Corynébactéries
Infection
S. aureus +++
Streptocoques -hémolytiques
Anaérobies
Entérobactéries: Proteus
mirabilis, Escherichia coli,
Enterobacter sp., Klebsiella sp.
Cocci à Gram +
Bacilles à Gram -
Bactéries à potentiel de
virulence peu connu:
Entérocoques
Pseudomonas aeruginosa
Rôle pathogène de P. aeruginosa et
Enterococcus sp. ?
La distinction colonisation/infection peutelle être basée sur la bactériologie ?
Contamination/
Colonisation
Flore bactérienne résidente
= Flore commensale
Infection
Pathogènes usuels
impliqués
Flore bactérienne transitoire
= Portage de bactéries
pathogènes
Non le diagnostic ne peut pas être basé sur l’espèce bactérienne
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La distinction colonisation/infection
peut-elle être basée sur la quantification
des bactéries ?
Les prélèvements bactériologiques ne sont indiqués que infection établie cliniquement.
[a part, recherche de BMR]
Objectif
 isolement et identification des bactéries
responsables de l’infection
 étudier la sensibilité aux antibiotiques
Méthodes de prélèvement microbiologique
Définir les objectifs de l’analyse, – la manière de prélever selon les différentes présentations cliniques, – le matériel de prélèvement à utiliser, le matériel de prélèvement à utiliser,
– les conditions de transport, – les techniques analytiques – l’interprétation des résultats de la culture
Des protocoles conçus conjointement par les cliniciens et les microbiologistes sont indispensables. L’écouvillonnage simple
• Méthode la plus utilisée car la plus facile mais
A EVITER, car la moins fiable
• Peu adapté à la mise en évidence optimale des bactéries p
p
réellement responsables de l’infection • Recueil de la totalité de la flore aérobie colonisante si la préparation n’est pas optimale Débridement Mécanique
• Avant tout prélèvement, il faut PREPARER LA PLAIE.
– débridement mécanique (voire chirurgical) : • curette ou scalpel stériles
– un nettoyage :
• gaze imbibée de sérum physiologique stérile
g
p y
gq
• NB : utilisation d’antiseptiques possible, mais à éliminer par du sérum physiologique stérile avant de réaliser le prélèvement.
Le Curetage‐Ecouvillonnage :
• Débrider et nettoyer l’ulcère
• Prélèvement du tissu par grattage de la base de l’ulcère au moyen d’une curette ou d’un scalpel stériles stériles
• Prélever en frottant avec un écouvillon la périphérie du fond de l’ulcère
• Cette méthode est indiquée pour les prélèvements superficiels et les plaies anfractueuses profondes • Difficultés d’isoler les bactéries anaérobies
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Le Curetage‐Ecouvillonnage :
Antibodies and
antibiotics unable to
penetrate biofilm
EPIDERMIS
Scab
Plus spécifiques que l’écouvillonnage simple
moins de bactéries colonisantes identifiées
DERMIS
Immune cells unable to
clear biofilm
Seulement si débridement de bonne qualité
Wound fluid
Recherche de bactéries anaérobies possible
Wound matrix
Granulation tissue
Conditions:
Chronic inflammation
and release of
proteases result in
tissue dammage
Bacterial cytotoxins kill
host immune cells
HYPODERMIS
Vessels
Macrophages
Neutrophils
L’Aspiration à l’aiguille fine :
• Débrider et nettoyer
• Désinfecter la peau en périphérie (antiseptique)
• Ponctionner avec une seringue et une aiguille pour IM ou SC :
IM ou SC : La ponction doit être effectuée en passant par une zone saine.
• Indiquée pour les plaies profondes collectées ou anfractueuses lorsque les prélèvements par écouvillons ne sont pas contributifs La Biopsie tissulaire :
• La sévérité de la neuropathie autorise souvent une biopsie au lit du patient sans préparation particulière. Planktonic bacteria
Biofilm matrix with pH, pO2, waster… gradients
Biofilm bacteria embedded in protective EPS
Antibiotic chelator enzymes
Quorum sensors
Bacterial cytotoxins
Antibiotics
L’aspiration à l’aiguille fine • En l’absence d’obtention de liquide, 1 à 2 ml de sérum physiologique stérile peuvent être injectés puis réaspirés immédiatement à l’aide d’une seconde aiguille pour être analysés.
• La seringue ayant servi au prélèvement est envoyée au laboratoire sans l’aiguille, purgée d’air et bouchée hermétiquement et stérilement. La biopsie osseuse
• La biopsie osseuse
est le moyen de diagnostic microbiologique le plus
fiable en cas d’atteinte osseuse
g
p
• Deux à trois fragments de tissu sont obtenus à partir de plusieurs zones ; immédiatement déposés dans un tube stérile additionné de quelques gouttes de sérum physiologique pour éviter la dessiccation. • Prélèvement
élè
de l’os
l par chirurgie ou par ponction
percutanée, peut être parfois guidé par
l’imagerie
• la biopsie est la méthode à privilégier chaque fois que possible devant toute lésion tissulaire profonde. • Passage en peau saine au moyen d'un trocart,
après désinfection la plus complète possible
pot stérile contenant du sérum physiologique
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La biopsie osseuse
Les hémocultures Aéro‐Anaérobies
• La biopsie osseuse est la méthode de référence pour le diagnostic d’ostéite : rapide, simple, sans effet secondaire
• Rarement réalisée en dehors des centres spécialisés
• Prélèvement par chirurgie ou par ponction percutanée, radio‐ ou écho‐guidée
– passage en peau saine au moyen d'un trocart, – après désinfection – sans anesthésie locale (neuropathie sensitive)
– pot stérile contenant du sérum physiologique
Notamment au cours des bactériémie secondaire à des ostéites
Diagnostic microbiologique Méthodes d’études
• Facile si
– Isolement d’une bactérie pathogène
– Hémocultures positives
– Lésion cutanée récente: trauma, inoculation, Corps étranger
• Difficile si
– Plaie subaigue ou chronique
– Escarre, ulcères, brûlures
Examen Microscopique
Etape du diagnostic
conventionnel
Examen direct après coloration (Gram …)
 Méthode la plus facile, la plus rapide et la moins coûteuse pour établir un diagnostic de présomption.
Echantillon biologique
gq
 Examen direct
J0
 Culture et Identification
J24h
 Antibiogramme
J48h
Non spécifique d’espèce
Manque de sensibilité (>104 bacilles/ml)
 Permet aussi d’établir rapidement un diagnostic
pour les malades les plus contagieux (tuberculose)
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Méthodes conventionnelles
Culture et Isolement
Identification
Milieux pour l’isolement et la sélection des bactéries
Culture d’E.coli
Nouvelle approche de protéomique
Permet d’identifier les bactéries par la comparaison des profils protéiques
La spectrométrie devient un outil intéressant en routine de microbiologie clinique
Culture de
Klebsiella
pneumoniae
Deux raisons essentiellement
Bactéries cultivables «entières»
Bases de données
Exemple de spectres obtenus
milieux complexes
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20/01/2017
Tests rapides
Méthodes
conventionnelles
Immunochromatographique
Limite des méthodes phénotypiques
 Bactérie non cultivable ou de culture difficile
Bactérie non cultivable ou de culture difficile
 Délais parfois importants de la réponse
 Facteurs de virulence et/ou mécanismes de résistances
L. pneumophila sérogroupe1
Steptoccocus pneumoniae
Clostridium difficile GDH
Méthodes moléculaires
Méthodes moléculaires
Amplification par PCR de séquences cibles révélées par diverses techniques
Mise en place à différentes étapes du diagnostic
Identifications (rpoB, hsp65, 16S)
Toxines (LPV, Tox A/B)
Gènes de résistance aux antibiotiques
Performance
Temps technique
Gel
Hybridation
Séquence
Cout
•
Méthodes conventionnelles
Antibiogramme par diffusion en milieu gélosé K. pneumoniae
Antibiogramme par diffusion en milieu gélosé on mesure les inhibitions de la
croissance autour des disques
d’ATB pour classer les
bactéries en S/I/R
Souche sauvage
Souche productrice de Blse
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Mesure des CMI par E‐Test
Souche
productrice de
carbapenèmase
de type KPC
Les bacilles à Gram négatif
• Les Entérobactéries : – Proteus mirabilis, Escherichia coli, Klebsiella sp. – fréquemment en cas d’infections chroniques ou déjà traitées ou en cas de stade avancé • Pseudomonas aeruginosa : – après des hospitalisations de longue durée ou des bains de pied, ou un traitement par des pansements humides, le port de chaussures en caoutchouc – isolés de plaies punctiformes situées en regard du calcanéum et sont à l’origine d’ostéites – rôle dans les plaies superficielles ??
Interprétation des résultats : Principes
L’interprétation doit tenir compte :
– des conditions de recueil du prélèvement
– du délai et des conditions de transport du prélèvement au laboratoire
– du type de Bactéries isolées : staphylocoques, bacilles à Gram négatif
– du nombre de prélèvements où la même bactérie est isolée (cas des germes commensaux)
Conclusion
Interprétation des résultats : Principes
Il n’existe à ce jour aucun moyen formel permettant de différencier une colonisation d’une infection !!!
La connaissance Des critères d’infection des plaies Des bactéries en cause
Pas de moyens microbiologiques actuellement pour distinguer pathogène de non pathogène
De leur sensibilité aux antibiotiques est un pré‐requis nécessaire pour une bonne prescription
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20/01/2017
Conclusion
La qualité des prélèvements conditionne l’interprétation des résultats
Des protocoles doivent donc être établis pour une prise en charge optimale Qui nécessite une coopération multi‐diciplinaire entre les différents acteurs intervenant dans ces pathologies 18