Ilots de Langerhans, cellules b et cellules souches pancréatiques
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Institut de Génomique Fonctionnelle, France INSERM U1191, CNRS 5203, Université de Montpellier DIPLOME d’UNIVERSITE MEDECINE REGENERATRICE Ilots de Langerhans, cellules β et cellules souches pancréatiques Comment élaborer/remplacer les cellules β pancréatiques ? Enjeux et problématiques ? Dalle Stéphane, Directeur de Recherche, INSERM Introduction How to make β-cells ? « Significant challenges remain for each strategies: First, it is important to set the bar high with respect to requirement for newly generated β cells: properly regulated insulin secretion and the capacity of cell renewal (replication) are at the top of the list…» D’après Borowiak, M., Melton DA, Curr Opinion Cell Biology, 2009, 21, 727-732 Plan La cellule β saine « Comprendre pour mieux appréhender les problématiques » - Son environnement - Comment définir une cellule β saine - Origine et cycle de vie La cellule β malade: Diabètes « Comprendre pour mieux appréhender les enjeux » - Problématique pour le diabète de type 1 - Problématique pour le diabète de type 2 La cellule β réparée: « Cellules souches et stratégies » - Stratégies actuelles et perspectives - Génération de cellules endocrines à partir de cellules immatures (cellules ES et iPS) - Régénération des cellules β au sein du pancréas Rappels anatomiques: Le pancréas et l’architecture de l’îlot Pancréas in situ Bile Canal pancréatique de Wirsung Corps du pancréas Queue du pancréas Canal biliaire Pancréas Duodénum Canaux interlobulaires Plis circulaires Abouchement ampoule de Vater Cellules canalaires Cellules acineuses Ampoule de Vater Flux enzymes digestives vers le duodenum Canaux interlobulaires Réseaux capillaires Cellules α Cellules β Cellules δ Adapté d’après © Encyclopædia Britannica, Inc. Îlot de Langerhans (1%) Canal lobulaire Rappels anatomiques/histologiques: Architecture de l’îlot de Langerhans Interactions endocrine-exocrine Cellule(s) exocrine(s) Duodénum Pancréas Estomac Zymogène Foie Pancréas Îlot de Langerhans Intestin Capsule Capillaires Cellule β Cellule α Cellule δ Proinsuline Insuline Peptide-c Glucagon Somatostatine Interactions intercellulaires Localisation des cellules β pancréatiques dans les îlots de Langerhans Adapté d’après Expert Reviews in Molecular Medicine © Cambridge University Press Rôle de la cellule β pancréatique: Sécrétion d’insuline et homéostasie glucidique Pancréas Îlot de Langerhans Cellule β Fibres musculaires Vx sanguins Insuline Glucose Plateforme histologie (IGF, Montpellier) Microscopie électronique (CRIC, Montpellier) Dr S. Costes, Dr C. Broca La cellule β saine « Comprendre pour mieux appréhender les problématiques » - Son environnement - Comment définir une cellule β saine - Son cycle de vie La cellule β malade: Diabètes « Comprendre pour mieux appréhender les enjeux » - Problématique pour le diabète de type 1 - Problématique pour le diabète de type 2 La cellule β réparée: « Cellules souches et stratégies » - Stratégies actuelles et perspectives - Génération de cellules endocrines à partir de cellules immatures (cellules ES et iPS) - Régénération des cellules β au sein du pancréas L’exocytose est biphasique Phase 1: - rapide et activée par [Ca2+] locale - mobilisation du pool de granules conditionnés (pool RRP)(n < 100/cellule) Mécanismes d’activation par le glucose: Initiateur/déclencheur Glucose Ca2+ Insuline (+ C-peptide) ext Membrane plasmique Imp ossi ble d’af fich er l’im age . Imp ossi ble d’aff icher l’ima ge. int Imp ossi ble d’af fich er l’im age . K+ G6P Ca2+ Im po ssi bl e d’ aff ic he r l’i m ag Pyr Im po ssi bl e d’ aff ic he r l’i m ag VDCC Ca2+ Cycle de Krebs Equivalents réduits Chaine respiratoire CC / IP3R ATP SERCA 3 RE Mitochondrial transport MITOCHONDRIE 1 Ashcroft FM, Rorsman P. Cell (2012) 148, 1160 Henquin JC. Diabetologia (2009) 52, 739 Dalle S et al. J Biol Chem (1999) 274:10869 KIR 6.2 2 Cellule β pancréatique 3 Im po ssi bl e d’ aff ic he r l’i m ag Glut 2 La cellule β saine « Comprendre pour mieux appréhender les problématiques » - Son environnement - Comment définir une cellule β saine - Son cycle de vie La cellule β malade: Diabètes « Comprendre pour mieux appréhender les enjeux » - Problématique pour le diabète de type 1 - Problématique pour le diabète de type 2 La cellule β réparée: « Cellules souches et stratégies » - Stratégies actuelles et perspectives - Génération de cellules endocrines à partir de cellules immatures (cellules ES et iPS) - Régénération des cellules β au sein du pancréas Vie et mort des cellules β pancréatiques Néogenèse Senescence/Vieillissement - Progéniteurs canaux pancréatiques - Transdifferenciation - Progéniteurs intra-îlots (?) - Facteurs génétiques - Stress oxydant - Détérioration de l’ADN Replication Apoptose A partir de cellules βpréexistantes - Importante chez le fœtus - Réduite chez l’adulte Equilibre dynamique Masse fonctionnelle de cellules β Plasticité de l’îlot de Langerhans Phénomène de compensation par les cellules β pancréatiques La plasticité de la masse β permet d’adapter au long cours la fourniture en insuline aux besoins métaboliques de l’organisme Développement postnatal Gestation Fonction β Masse β Obésité Régimes Hypergluc/Hyperlip Insulinorésistance Régénération Autoimmunité inflammation Vieillissement Fonction β Masse β Glucotoxicité/lipotoxicité Programmation in utéro (malnutrition) Facteurs β cytotoxiques Quand la robustesse de ces adaptations est dépassée… l’hyperglycémie s’installe: DT1, DT2 Phénomène de compensation par les cellules β pancréatiques Prentki, M. et al. J. Clin. Invest, 2006, 116, 1802-1812 Facteurs controlant la différenciation et la masse des cellules β pancréatiques Nutriments Glucose, FFA TGF-β, Activine A EGF (NGF, VEGF, FGF), IGF-1 INGAP (Ilotropin) + + + EGF, IGF-1 GLP-1 + + + APOPTOSE REPLICATION et DIFFERENCIATION Pancreatic β cells + NEOGENESIS DIFFERENCIATION Cellules precurseurs Cytokine Facteurs Inflammation IL-1β , TNF-α, IL-6, Interféron γ Nutriments Haut Glucose, FFA Hormones/incretines GH, GLP-1 SENESCENCE + - Facteurs stress oxydant Altération ADN Régulation de la masse des cellules β pancréatiques (plasticité) : Dualité des effets du glucose PROLIFERATION Cellules β pancréatiques APOPTOSE - + DIFFERENCIATION + CRIC-Montpellier Haut glucose (hyperglycémie) Diabète de type 2 Glucose (concentrations physiologiques) La cellule β saine « Comprendre pour mieux appréhender les problématiques » - Son environnement - Comment définir une cellule β saine - Son cycle de vie La cellule β malade: Diabètes « Comprendre pour mieux appréhender les enjeux » - Problématique pour le diabète de type 1 - Problématique pour le diabète de type 2 La cellule β réparée: « Cellules souches et stratégies » - Stratégies actuelles et perspectives - Génération de cellules endocrines à partir de cellules immatures (cellules ES et iPS) - Régénération des cellules β au sein du pancréas Role central des cellules β pancréatiques dans le DIABETE Insuline = seule hormone hypoglycémiante de l’organisme Diabète de type 1 et type 2 : Déficit de l’insulino-sécrétion Diabète de type 1 (10% des sujets diabétiques) Destruction des cellules β par un processus autoimmun Carence totale en insuline : Injections Diabète de type 2 (90% des sujets diabétiques) Déficit sécrétoire et mort par apoptose des cellules β, associés à une résistance à l’action de l’insuline Carence partielle puis totale en insuline: Arsenal thérapeutique Hyperglycémie chronique Complications dégénératives du diabète Apoptose des cellules β pancréatiques et diabète de type 1 Proposed model for the different pathways contributing to the execution of cytokine-induced ß-cell apoptosis. Arrows indicate genes for which expression was modified by cytokines in a time course microarray analysis. ß-Cell apoptosis is probably mediated by three main pathways—namely JNK, ER stress, and liberation of pro-apoptotic proteins from the mitochondria. Cnop, M. et al. Diabetes, 2006, 54S2, 97-107 Les enjeux pour le diabète de type 1, et de type 2 Recherches fondamentale et clinique Restaurer Diabète de type 1 (Perte cellule β) Transplantation Pancréas entier/ Ilots de Langerhans Thérapie cellulaire (?) Préserver une masse fonctionnelle de cellules β Diabète de type 2 (Dysfonction cellule β) Agents pharmacologiques Cellules β pancréatiques et diabète de type 2 « β cell deficit and increased β cell apoptosis in humans with type 2 diabetes » ND DT2 « Therapeutic approaches designed to arrest β cell apoptosis could be a significant new development in the management of type 2 diabetes » Butler, A.E. et al. Diabetes, 2003, 52, 102-110 Del Guerra, S. et al. Diabetes, 2005, 54, 727-735 Développement et progression du diabète de type 2 et de ses complicationsa Progression du diabète de type 2 Insulino résistance Insulinémie Fonction cellulaire β Glucose post-prandial 4-7 années Glycémie à jeun complications microvasculaires complications macrovasculaires Intolérance au glucose Diagnostic du diabète (représentation conceptuelle) Adapté de Primary Care, 26, Ramlo-Halsted BA, Edelman SV, The natural history of type 2 diabetes. Implications for clinical practice, 771– 789, © 1999, with permission from Elsevier. Les enjeux pour le diabète de type 2 Déclin de la sécrétion d’insuline et de la masse de cellules β Hyperglycémie chronique Préserver la fonction et la survie des cellules β est essentiel Importance des études sur le maintien et/ou la restauration de la masse des cellules β fonctionnelles chez les diabétiques de type 2 Intérêt de prendre en charge tôt le pancréas - Cibler les fonctions physiologiques du pancréas - Agir sur l’insuline (et le glucagon) - Maintenir la structure de l’îlot: Masse fonctionnelle de cellules β pancréatiques La cellule β saine « Comprendre pour mieux appréhender les problématiques » - Son environnement - Comment définir une cellule β saine - Son cycle de vie La cellule β malade: Diabètes « Comprendre pour mieux appréhender les enjeux » - Problématique pour le diabète de type 1 - Problématique pour le diabète de type 2 La cellule β réparée: « Cellules souches et stratégies » - Stratégies actuelles et perspectives - Génération de cellules endocrines à partir de cellules immatures (cellules ES et iPS) - Régénération des cellules β au sein du pancréas Stratégies actuelles D’après Borowiak, M., Melton DA, Curr Opinion Cell Biology, 2009, 21, 727-732 Stratégies actuelles: Quelles sources de cellules (à partir de 2011) ? Génération de cellules endocrines à partir de cellules immatures Rappels d’embryogénèse: Origine et développement des cellules β pancréatiques Facteurs de transcription impliqués dans la différenciation pancréatique Cellules ES: Différenciation en cellules produisant de l’insuline Cellules ES Précurseur endodermal Cellule Insuline + D’amour, Nature Biotech, 2005, 2006 Cellules ES: Différenciation en cellules produisant de l’insuline TABLE 3 Derivation of PDX1 progenitors from hES cells References DE induction Pancreas induction D’Amour (2006) ActA Wnt3a; ActA FBS Johannesson (2009) Cai (2009) ActA Wnt3a; ActA FBS ActA; ActA ITS Jiang (2007) ActA Kroon (2008) ActA Wnt3a; ActA FBS FGF7 (4d); NG FGF7 (4d) Vallier (2009) ActA BMP4 bFGF (3d) ActA Wortmanin (4d) NG RA FGF10 SB431542 (6d) NG RA FGF7 (4d); EGF (5d) ActA Wnt3a; ActA FBS NG RA Cyclo (8d); FGF10 Ex4 Compound E (4d) Zhang (2009) Mfopou (2010) NaBut (7d) FGF10 Cyclo (4d); FGF10 Cyclo RA (4d) FGF4 RA ( / Cyclo) (DE replating on 3T3) FGF7 RA (6d) EGF bFGF NG (14d); EGF NG (7d) RA Differentiation DAPT HGF Key features Ex4; IGF1 Ex4 7%INS cells, double endocrine cells; no glucose response — 32%PDX1 cells, very low INS expression HGF Ex4 NA 90%PDX1 ; co-expression (6d) FOXA2, HNF1b, HNF4a, HNF6, NKX6.1; some INS cells NA IGF2 (5d); NA EBs after DE induction; budding (2d) PDX1 INS clusters; 3D is better Transplantation in Endocrine cells in grafts, immunodeficient glucose response in vivo at 3 mice months, protection from STZ effect — PDX1 clusters, culture in feeder-free settings bFGF Ex4 BMP4 20%PDX1 , 25%INS , low NA ITS (7d) glucose response, ITS issue not addressed 50–80%PDX1 in 4 hES lines, NA Ex4 IGF1 BMP4 co-expression FOXA2, SOX9, HNF1b, HNF6, NKX6.1, low PTF1a. Some INS cells Mfopou, Diabetes, 2010 Cellules iPS: Différenciation en cellules produisant de l’insuline Fibroblaste humain$ humain Fibroblaste$ Human iPS$ iPS cells$ cells ES cells Relative gene expression B Endoderm induction Pancreatic 4 specialization 8 Act A+Wort RA+NOGGIN+FGF7 EGF Nico+bFGF+Ex-4+BMP4 DF12 F12/IMDM DMEM DF12 Day 0 3 Progenitor expansion 13 Maturation 20 Insulinproducing cells PDX1 C-peptide DAPI 2 MafA Glut2 Pdx1 Insulin 1 0 C1 C2 C5 H9 25% de cellules produisant de l’insuline à partir de cellules ES et iPS Zhang, Cell Research, 2009 Limites à l’utilisation de cellules pluripotentes Ethique ? Finesse des protocoles de différenciation à mettre en place: Utilisation de molécules spécifiques, en associations complexes, fenêtres d’action courtes, cultures 3D (Wandzioch, Science 2009) Risque tératogène des cellules pluripotentes Risque spécifique des iPS: Mutations de séquences codant pour des protéines, anomalies épigénétiques… Tumorigénèse possible (Gore, Nature 2001; Lister Nature 2001) Régénération cellulaire au sein du pancréas Physiologique chez le sujet obèse ou la femme enceinte Quelles sont les cellules à l’origine de cette régénération ? Régénération des cellules β au sein du pancréas ? Preuve de concept Preuve de concept Régénération des cellules β pancréatiques (1) Régénération des cellules β pancréatiques (2) Bibliographie sélectionnée Dor, Nature 2004 Xu, Cell 2008 Nir, J Clin Invest 2007 Collombat, Cell 2009 Thorel, Nature 2010 Herrera, Nature 2010 Régénération cellulaire au sein du pancréas: Limites Origines du renouvellement β-cellulaire débattues Etudes in vivo chez le rongeur uniquement Quelles molécules pharmacologiques pour promouvoir cette régénération ? - A partir de canaux: Tumorigénèse ? - A partir de cellules α ou β: dysfonction endocrine / dosage/rapport cellulaire ? Conclusion Les progrès effectués ces 10 dernières années permettent d’envisager de nouvelles sources pour traiter le patient diabétique - Cellules pluripotentes - Cellules reprogrammées - Cellules régénérées in situ - Avantages sur transplantation îlots ou pancréas Contrôle qualité Masse infusée contrôlée et adaptée Greffe autologue - Autres voies de recherche parallèles Lutte contre l’auto-immunité Site alternatif de transplantation (Ilots), tolérance… Autres encore non explorées ? How to make β-cells ? « We believe that the potential of cellular therapies for diabetics is ever closer and is an achievable goal…» D’après Borowiak, M., Melton DA, Curr Opinion Cell Biology, 2009 Institut de Génomique Fonctionnelle, Montpellier, France INSERM U1191, CNRS 5203, Université de Montpellier Merci pour votre attention Anatomie du pancréas îlots de Langerhans Foie Diaphragme Veine Porte Artère gastrique Vésicule Biliaire Tronc coeliaque Canal Cystique Glande surrénale Canal Hépatique Artère et veine spléniques Canal Cholédoque Rate Queue du pancréas Artère Hépatique Pancréas Corps du pancréas Rein droit Rein gauche Ampoule de Vater Jéjunum Artère et veine mésentériques sup Tête du pancréas Canal de Wirsung Duodénum Veine cave inférieure Aorte Veine mésentérique Bloc duodéno-hépato-pancréatique Adapté d’après © sanofi-aventis France Masse des cellules β pancréatiques adultes et renouvellement Croissance/Néogenèse CELLULES SOUCHES PROGENITEURS PROGENITEURS Canaux pancréatiques Mort
