La réaction Antigène - Anticorps

Institut national de formation supérieure paramédicale
–ConstantineOption : laborantin
La réaction Antigène - Anticorps
Dr CHEROUAL El Amine
Plan:
I. Généralités:
- Les antigènes
- Les anticorps
- Objectif des techniques immunologiques:
- Notion de paratope et d’épitope
- Affinité et Avidité
- La zone d’équivalence:
II. Les réactions de précipitation:
1. Généralités
2. Précipitation en milieu liquide :
A/Réaction qualitative de précipitation (précipitation en anneau ou ring test)
B/Réactions quantitatives de précipitation
- La Néphélométrie
- La turbidimétrie
3. Précipitation en milieu gélifié:
A/ Méthodes De Diffusion Simple:
a/ Technique de OUDIN
b/ méthode de MANCINI (Immunodiffusion radiale (IDR))
c/méthode de LAURELL (Electroimmunodiffusion):
B/ Méthodes de diffusion double: Technique de OUCHTERLONY:
III- Les Réactions D’agglutination Et D’hémagglutination:
A- Aspects Fondamentaux:
a/La Théorie De Pollack:
b/Facteurs Influençant L’agglutination:
B. Méthodes:
a/ Agglutination Active :
b/ Agglutination Passive:
c/ Agglutination Indirecte (test à l’antiglobuline) :
d/Inhibition De L’agglutination:
I. Généralités:
. Les antigènes:
- Antigène = toute substance capable de se lier spécifiquement à un anticorps ou
TCR (récepteur des lymphocytes T).
- Immunogène = substance qui provoque une réponse immunitaire spécifique
quand elle est introduite dans un organisme.
. Les anticorps (Les immunoglobulines Ig) sont des glycoprotéines douées d’une
fonction anticorps.
Elles sont présentes :
- sous forme soluble dans le plasma et dans de nombreuses sécrétions
- sous forme membranaire comme élément du récepteur de l’Ag à la surface des
cellules B (BCR)
Objectif des techniques immunologiques:
1. Mettre en évidence des antigènes (Ag) A l’aide d’anticorps polyclonaux ou
monoclonaux
–Cellulaires, Tissulaires
–Présents dans les liquides biologiques (sérum, LCR, urines…)
2. Mettre en évidence des anticorps (Ac) À l’aide d’antigènes (germe entier,
antigènes, tissus...)
–Présent dans le sang/sérum/plasma ou d’autres liquides biologiques (LCR,
salive…)
Notion de paratope et d’épitope :On appelle paratope d’un Ac (ou site de liaison)
la
zone
qui
va
interagir
de
façon
stéréospécifique
avec
la
structure
complémentaire appelée épitope ou déterminant antigénique sur la molécule
d'antigène.
La valence d'un antigène et d'un anticorps
•Le nombre d'épitopes existant sur un antigène définit sa valence
•De même, le nombre de paratopes par molécule d'anticorps définit sa valence
•les conditions stériques limitent le nombre de molécules d'anticorps qui peuvent
se lier en même temps à une molécule d'antigène.
Quatre types de forces sont mises en jeu dans la liaisonantigène-anticorps. de
la plus forte à la plus faible:
–les forces électrostatiques
(liaisons ioniques)
–les liaisons hydrogènes
–les liaisons hydrophobes
–les forces de Van der Waals.
La réaction antigène-anticorps est:
1- Réversible:
2- spécifique: La spécificité de la réaction Ag-Ac permet d’identifier un des
éléments de la réaction lorsque l’autre est connu.
3- Exothermique: libère de la chaleur (2 à 40 kCal par mole).
La réaction antigène-anticorps dépend de l'affinité
Affinité: d’un Ac pour un Ag caractérise l’intensité des forces de liaison du
complexe Ag-Ac.
Elle rend compte de la complémentarité stérique entre le site Ac et l’épitope Ag
A l’aide d’Ag monovalent on peut mesurer l’affinité
d’un Ac qui équivaut à la
KA (la constance d’association)
Avidité:
- caractérise la rapidité de formation de l’immuncomplexe;
- dépend de la constance d’association, la valence de l’Ac, et de l’Ag
et les
conditions du milieu réactionnel (pH, T°, force ionique).
NB: au cours de la réponse immunitaire, l’affinité et l’avidité des Ac augmente
Sérum polyclonal (immum serum = anticorps polyclonal) :
- c'est un sérum qui contient un mélange d'anticorps provenant de LB différents
- obtention : en injecte un antigène avec 3 épitopes à une souris ; elle produit 3
LB différents reconnaissant les 3 épitopes ; différenciation en 3 plasmocytes
différents et donc sécrétion de 3 anticorps.
- Ces anticorps reconnaissent le même antigène mais avec des spécificités, des
affinités différentes selon les épitopes
Anticorps monoclonal :
c'est un anticorps provenant d'un seule clone de LB sti
stimulé
- obtention : technique in
in-vitro
vitro d'hybridation lymphocytaire : immunisation
d'une souris avec un antigène donc production de LB qui se différencient en
plasmocytes. On récupère la rate de cette souris. On immortalise les cellules par
fusion avec des cellules
ellules myélomateuses (cellule tumorale provenant de la
moelle osseuse) = hybridomes. On sépare ces cellules.
L'anticorps monoclonal produit est homogène :
La zone d’équivalence:
La concentration optimale en antigène et en anticorps
Principe général réactions Ag-Ac:
2 phases
1/ phase est la formation de l'IC = Ag-Ac
2/ phase est la visualisation de l'IC formé
° Réactions Ag-Ac directement visibles:
Les R° de précipitation et d'Agglutination (précipité ou agrégat).
Les R° faisant appel au complément (hémolyse GR)
Les réactions de neutralisation
° réactions d'immunomarquage:
L'IC formé n'est pas visible à l'œil nu. Utilisation de marqueurs (Ag, Ac, IC)
Selon la nature du marqueur utilisé, on distingue:
•R° radio-immunologique: M = Isotope
•R° IF: M = Fluorochrome
•R° Immuno-enzymatique: M = Enzyme
II. Les réactions de précipitation
1. Généralités
C’est une réaction qui apparaît dans un milieu liquide ou gélifié entre un
antigène soluble et 1 anticorps précipitant (Ig M, IgG).
Le précipité est dû à la formation d'un réseau macromoléculaire tridimensionnel
- l'anticorps doit être au moins bivalent (2 paratopes) ; seuls les sérums
polyclonaux donnent des réactions de précipitation.
- l'antigène doit être au moins bivalent (2 épitopes) : un haptène ne donne pas
de réactions (un seul épitope) ; sauf sil est couplé à une protéine porteuse, ça
marche.
2. Précipitation en milieu liquide :
a. Réaction qualitative de précipitation (précipitation en anneau ou ring test) :
Principe: Dans le fond d'un tube de faible section on introduit l'Ac, puis on
dépose délicatement l'Ag.
Une réaction positive est marquée par l'apparition en moins de 5 mn d'un
anneau à l'interface.
Application:
Suivi de la production d'Ac chez l'animal en cours d'immunisation
b. Réactions quantitatives de précipitation:
•A la zone d'équivalence, le précipité formé est maximal et il n’y a pas d'Ac et
d'Ag dans le surnageant.
•En ce moment si l'on dose le précipité et connaissant la quantité d’Ac apportée,
l'on peut déterminer le taux d’Ag.
•Deux méthodes sont utilisées pour doser le précipité: Néphélémétrie et
turbidimétrie
La Néphélométrie
Principe:
Les complexes Ag-Ac en suspension sont capables de disperser lumière incidente
Monochromatique sous différents angles (30-90° ou 5-15°)
La lumière dispersée est captée par photodétecteur dont signal est proportionnel
à lumière dispersée et donc à la quantité de précipité présent dans l’échantillon.
Cuve contenant les immuns complexes
La turbidimétrie
Principe: (semblable à celui de la néphélométrie).
Les agrégats d’IC en suspension peuvent diffuser la lumière incidente suivant le
même axe de propagation. Le turbidimètre mesure cette lumière transmise.
Applications néphélémétrie et turbidimétrie: Dosage des protéines.
La turbidimétrie est une méthode moins sensible que la néphélométrie.
3. Précipitation en milieu gélifié:
•Au cours de ces réactions l'un des partenaires de la réaction Ag-Ac diffuse vers
l'autre isolément ou simultanément.
•Dans tous les cas, le précipité formé augmente de taille jusqu'à l'équivalence.
A/ Méthodes De Diffusion Simple
Ce sont des techniques au cours desquelles ll’Ac
’Ac est inclus dans le gel et l'Ag
migre vers lui en formant un gradient de concentration.
a/ Technique de OUDIN
Principe:
Dans la moitié inférieure d'un tube de faible section on introduit un gel fluide
contenant l'Ac.
Après solidification, on dépose lla
a solution Ag sur le gel, (moitié supérieure du
tube).
Il se forme un disque de précipitation, à proximité de l'interface, qui migre vers
le fond du tube puis se stabilise.
La distance entre l'interface et le disque de précipitation est proportionnelle à la
concentration de l’Ag et au temps.
Applications: Dosage d’Ag.
b/ méthode de MANCINI (Immunodiffusion radiale (IDR))
•Principe:
L'Ag migre concentriquement à partir d'un puits creusé dans une plaque
contenant un gel dans lequel l'Ac est inclus à concentration constante.
Au point d’équivalence, les complexes immuns précipitent et s’immobilisent. Il
apparaît autour du puits un cercle de précipitation dont la surface est
proportionnelle à la quantité d’Ag.
Le taux d’Ag est obtenu à partir de la courbe d’étalonnage établie avec des
standard( concentration connue d’Ag).
•Application:
Dosage des protéines (Ig, fractions du complément, alpha foeto-protéine etc.)
c/méthode de LAURELL (Electroimmunodiffusion):
•consiste à faire migrer l'Ag, dans le gel contenant l’Ac, sous l'action d'un champ
électrique.
•Les précipités obtenus prennent la forme de pic ou fuseau ("rockets") dont la
hauteur est proportionnelle à la quantité d’Ag.
•Une courbe d'étalonnage rapportant la hauteur du pic permet d'obtenir la
concentration d’Ag.
B. Méthodes de diffusion double
Ici l'Ag et l'Ac sont séparés par un gel vierge. Ils migrent l'un vers l'autre
spontanément ou sous l'action d'un champ électrique.
Technique de OUCHTERLONY:
Principe:
L'Ag et l'Ac sont dans des réservoirs, distants de quelques millimètres, creusés
dans le gel.
Ils migrent l'un vers l'autre et à la zone d'équivalence on a un arc de
précipitation
Applications:
•détermination des spécificités des Ac d'un immunsérum ou du nombre de
constituants d'un mélange antigénique
•Identification des épitopes d'un Ag en comparant leur réaction à celle d'Ag
connus vis à vis d'Ac connus (monoclonaux).
III- Les Réactions D’agglutination Et D’hémagglutination:
A- Aspects Fondamentaux:
L’agglutination : ensemble de techniques permettant d’individualiser le couple Ag
particulaire (bactéries, globules rouges)et l’Ac correspondant.
- Il forme un agrégat visible à l’oeil nu ou au grossissement (X40) du microscope
•Quelques minutes
•Plus sensible que la précipitation
a/La Théorie De Pollack: permet d’expliquer le phénomène d’agglutination.
Les particules en suspension ( globules rouges) gardent une certaine distance
entre elles du fait des charges électriques.
Les Ac agglutinants viennent vaincre cette atmosphère ionique pour rapprocher
les particules antigéniques qui forment des agrégats visibles.
b/Facteurs Influençant L’agglutination:
1. Nature de l’Ag:
•Valence ≥ 2
•agglutination active
•agglutination passive
Ag particulaires (exemple: hématies, bactéries etc.).
Ag soluble préalablement fixé à des particules
inertes / cellules•
2. Nature de l’Ac
• agglutination spontanée
• agglutination artificielle
Ac agglutinants (IgM).
Ac non agglutinants (IgG) + artifices de
laboratoire.
3. Le potentiel Zéta:
•Le potentiel Z est la différence de potentiel entre la surface du GR et le milieu
neutre
A l’état normal, les GR en suspension n’agglutinent pas
spontanément.
•La capacité agglutinante d’un Ac dépend de l’aptitude à vaincre Z pour
atteindre les épitopes de 2 particules antigéniques.
4. Les conditions du milieu réactionnel
•la température : son influence dépend de la nature de l’Ac
•le pH : l’agglutination est bonne lorsque le pH est compris entre 6 et 8
•la force ionique : son rôle est ambivalent (son augmentation entraîne une
inhibition de la fixation des Ac et sa diminution est responsable d’agglutination
non immunologique).
B. Méthodes:
A/ Agglutination Active :
Ce sont des réactions d’agglutination mettant en présence directement des Ag
particulaires et des Ac agglutinants.
•Exemples d’application : le groupage sanguin ABO
b/ Agglutination Passive:
•réaction d’agglutination réalisée avec des Ag solubles préalablement fixés sur des
particules servant de support.
•Supports: globules rouges, particules inertes telles que le latex.
Trois techniques de fixation de l’Ag sur support :
1 .simple contact Ag-particule à 37°C pendant 2 à 4h ou à 4°C pendant 18 à
24h.
•Application : Test au latex pour la recherche de facteurs rhumatoïdes….
2 .voie chimique : les produits tels que la Benzidine et le glutaraldéhyde facilite
l’adhésion des Ag sur les globules rouges
•Application : diagnostic syphilis
3. voie immunologique :
la substance à fixer à la double propriété Ag/Ac.
La propriété Ac est dirigée contre la particule qui doit la porter, la propriété Ag
sera utilisée dans la réaction d’agglutination.
Application : fixation des IgG de lapin anti-GRM (globules rouges de mouton) sur
les GRM.
Le réactif est utilisé au cours de la réaction de Waaler-Rose qui met en évidence
les Ac anti-IgG sérique.
c/ Agglutination Indirecte (test à l’antiglobuline) :
Les réactions d’agglutination utilisant des antiglobulines sont appelées test de
Coombs. Ce test permet de déceler la présence d’Ac spécifique et/ou de
complément fixé sur les globules rouges.
Le réactif contenant l’antiglobuline est appelé sérum de Coombs.
Ce dernier peut être polyvalent ou spécifique selon la cible de l’antiglobuline
les composants (IgG, fractions du comp, IgA) .
le test de Coombs direct:
Met en évidence les Ac ou le complément fixé sur les globules rouges GR in vivo
(dans le sang périphérique ou ombilical)
Application : Diagnostic de la maladie hémolytique du nouveau-né
Le test de Coombs indirect:
Permet de rechercher les Ac circulants
.
Application : Mise en évidence des Ac anti-D, recherche des agglutinines
irrégulières (RAI)
d/Inhibition De L’agglutination:
C’est une méthode permettant de rechercher des Ag solubles qui en se fixant sur
les Ac agglutinants inhibent l’agglutination que ces derniers peuvent réaliser avec
des Ag particulaires.