4. Essais enzymatiques

4. Essais enzymatiques
™ Principe général d’un essai enzymatique:
analyte
enzyme
produit(s)
(substrat)
™ Des matrices biologiques peuvent contenir des espèces qui
interfèrent avec une mesure directe de la concentration d’analyte.
™ Une méthode enzymatique permettrait de suivre une diminution
(substrat) ou augmentation (produit) du signal (absorbance,
fluorescence, courant) due à la conversion sélective de l’analyte
en produit(s), évitant ainsi une interférence analytique.
154
™ Exemple 4.1: consommation du substrat
O
HN
O
NH
N
H
N
H
oxydase
d'urate
O
NH
+ O2 + 2H2O
O
H2NC HN
O
N
H
+ CO2 + H2O2
O
ε293nm=1.22x104 M-1 cm-1
™ Pour quantifier l’acide urique, on mesure la diminution de A293nm.
™ Exemple 4.2: accumulation du produit
phosphotransacétylase
CoA-SH + CH3CO-OPO3H
CoA-S-COCH3 + H3PO4
ε232nm=4.5x103 M-1 cm-1
™ Pour quantifier la coenzyme A, on mesure l’augmentation de A232nm.
155
™ Pour certaines réactions enzymatiques, le changement de signal due à la
consommation du substrat ou l’accumulation du produit peut être utilisé.
™ Le choix d’espèce dépend des propriétés du substrat et du produit et de la
technique de mesure employée; une comparaison des sensibilités et limites
de détection s’impose.
™ Par exemple, si le substrat et produit sont tous les deux fluorescents et
possèdent des absorptivités molaires et des rendements quantiques
comparables, mais des longueurs d’onde d’excitation et d’émission
différentes, la quantification du produit est préférable puisqu’une petite
augmentation de la fluorescence est facilement mesurable sur un signal de
fond quasi-nul.
™ La décision devient plus compliquée dans le cas de la spectroscopie
d’absorption si le substrat et le produit possèdent des absorptivités molaires
égales. Puisque des spectromètres d’absorption mesurent la quantité de
lumière transmisse par un échantillon, le plus grand signal (avec une
précision plus petite) est obtenu à des concentrations faibles d’analyte.
™ Même si l’on choisit normalement de mesurer l’accumulation du produit en
spectrophotométrie d’absorption, il est important de comparer les courbes
de calibration pour la consommation du substrat et l’accumulation du
produit afin d’identifier la méthode optimale.
156
4.1 Mesures directes et couplées
™ Certaines réactions enzymatiques peuvent être suivies directement
(consommation du substrat ou accumulation du produit) avec une
précision adéquate pour un essai enzymatique direct.
™ Par contre, plusieurs enzymes catalysent des réactions impliquant
des espèces qui ne sont pas facilement détectables.
™ Dans ces situations, le produit est converti en une espèce
détectable dans une réaction subséquente («réaction couplée»
ou «réaction indicatrice»):
Analyte
Eprim
Produit primaire
Eind
Produit détecté
™ La réaction indicatrice peut être de nature chimique ou enzymatique;
le critère principal étant que la conversion du produit primaire en
produit détecté doit être rapide et quantitative.
157
™ Exemple 4.3:
NH2
N
N
N
adénosine
désaminase
N
O
N
HN
N
Ribose
P
+ NH3
N
Ribose
P
AMP
O
O
O
OH
NH3 + 2
N
OH
O
O
O
λmax=546 nm
158
Enzymes indicatrices
™ Les déshydrogénases:
déshydrogénase
Substrat +
(forme réduite)
NAD(P)+
Substrat + NAD(P)H + H+
(forme oxydée)
™ Les déshydrogénases sont utilisées lorsque la réaction enzymatique
primaire produit une espèce qui peut servir comme substrat pour
une réaction de déshydrogénase particulière. Cette espèce est
convertie en sa forme oxydée
dans la réaction indicatrice,
où le NADH ou NADPH formé
peut être détecté a 340 nm
(ε340nm=6.2x103 M-1 cm-1).
(D’après Mikkelsen & Cortòn,
Bioanalytical Chemistry, 2004)
159
™ Les peroxydases:
H2O2
Colorant +
(forme réduite)
peroxydase
Colorant +
(forme oxydée)
H2O
™ Des réactions indicatrices à base de peroxydase sont utiles pour
suivre une réaction primaire produisant du peroxyde d’hydrogène.
™ Malgré la grande spécificité des peroxydases pour le H2O2, elles
réagissent avec une variété d’espèces chromogènes qui sont
incolores dans leur forme réduite, mais ont une forte absorption
dans la forme oxydée (ex. 2,4-dichlorophénol, O-dianisidine (3,3’diméthoxybenzidine), benzidine (diamino-4,4’-biphényl), vert
malachite).
160
™ Deux essais enzymatiques commerciaux pour le glucose dans le sérum
sanguin utilisent la déshydrogénase et la peroxydase:
CH2OH
O
+ O2
OH
OH
OH
OH
oxydase
de glucose
β-D-glucose
CH2OH
O
OH
OH
OH
O + H2O2
acide gluconique
peroxydase
H2O2 + O-dianisidine
β-D-glucose + ATP
2,2'-diméthoxybiphénylquinonediimine + 2H2O
ε450nm=8.6x103M-1cm-1
hexokinase
glucose-6-phosphate (G6P) + ADP
désydrogénase
G6P + NADP+
acide 6-phosphoglycérique + NADPH + H+
ε340nm= 6.2x103 M-1 cm-1
161
Analyte
Eprimaire
(Vmax)prim
Produit primaire (P1)
+ co-substrat (S2)
Eindicatrice
(Vmax)ind
Produit détecté
™ Seules les concentrations de l’analyte et du produit
primaire devraient limiter les vitesses des réactions
couplées. Un excès de tous les autres réactifs est
utilisé.
™ Pour une conversion linéaire du produit primaire en
produit détecté, des faibles concentrations du produit
primaire doivent être produites (i.e. région linéaire de
la courbe de cinétique Vo-[S]; [S]<0.1Km)
™ Dans des conditions optimales, la vitesse de la
réaction indicatrice (Veff)ind = vitesse de formation du
produit primaire (Vmax)prim.
(Vmax )prim = (Veff )ind =
(Vmax )ind
(1 + K m,P1 /[P1]) + (K m,S2 /[S2])
™ Puisque Km,P1 est une caractéristique de Eind
et [P1] est dictée par [analyte], les seules variables
qui peuvent être contrôlées expérimentalement sont
(Vmax)ind ( α [Eind]) et la concentration du co-substrat,
[S2]. Un grand excès (100 fois ou plus) de Eind est
employé, ainsi qu’une concentration saturante du cosubstrat (ex. O-dianisidine ou NADP+).
162
4.2 Classification des méthodes enzymatiques
™ Si [S] < 0.1Km, Vo α [S]
condition pour la quantification du substrat
™ Si [S] > 10Km, Vo α [E]
condition pour la quantification d’enzyme
™ Types d’essais enzymatiques: - essai cinétique
- essai à temps fixe
- essai à changement fixe
163
Essai cinétique
™ Dans un essai cinétique, le changement de concentration du
substrat ou produit est enregistré avec le temps (∆signal en fonction
du temps).
™ La vitesse de réaction est celle de la vitesse initiale (Vo).
™ Un graphique de Vo-[S] est utilisé pour la quantification du substrat.
™ Un graphique de Vo-[E] est utilisé comme courbe d’étalonnage pour
la quantification de l’enzyme.
164
™ Essai commercial pour la créatine kinase (CK) dans le sérum humain:
OP
O
HN
O-
CH3
O
N
C
CK
O-
+
+ ADP
H3N
+
CH3
O
N
C
O-
+ ATP
+
NH2
NH2
hexokinase
ATP + glucose
G6P + NADP+
déshydrogénase
ADP + G6P
6-phosphogluconate + NADPH + H+
™ Le sérum dilué est pré-incubé avec du glucose, de la hexokinase, du
NADP+ et de la déshydrogénase pour consommer toute la créatine
phosphate et ADP présents dans le sérum sanguin. Lorsqu’une valeur
constante de A340nm est obtenue, une solution concentrée de créatine
phosphate et d’ADP est ajoutée. L’augmentation d’A340nm est enregistrée
en fonction du temps.
165
Vo
(D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004)
166
Essai à temps fixe
™ Le changement de signal (correspondant à la consommation de S
ou à la formation de P) se produisant sur une période de temps fixe
et relativement longue est mesuré.
™ Ces essais s’appuient sur une conversion quantitative (ou quasiquantitative) du substrat en produit. Ils sont utilisés exclusivement
pour la quantification du substrat.
™ Une courbe d’étalonnage linéaire du changement de signal en
fonction de la concentration initiale du substrat est utilisée pour
quantifier le substrat.
™ Des essais à temps fixe ne requièrent pas que [S] < 0.1 Km, puisque
une conversion essentiellement complète a lieu.
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™ Essai commercial pour le cholestérol dans le sérum humain:
esters du cholestérol + H2O
cholestérol + O2
cholestérol estérase
cholestérol oxydase
cholestérol + acide gras
cholest-4-en-3-one + H2O2
peroxydase
H2O2 + 4-aminoantipyrène + p-hydroxybenzènesulfonate
colorant quinoneimine + 2H2O
λmax=500 nm
™ Une courbe d’étalonnage d’A500nm en fonction de [cholestérol] est utilisée
pour la quantification.
™ Un blanc contenant toutes les espèces et enzymes, à l’exception du
cholestérol, est préparé. La valeur de A500nm du blanc est soustrait de toutes
les autres valeurs d’absorbances mesurées, permettant ainsi de corriger
pour une oxydation du colorant qui n’est pas due à la réaction analytique.
168
Essai à changement fixe
™ Des essais à changement fixe sont relativement très peu utilisés.
™ Ils sont utilisés pour la quantification d’enzyme.
™ Ces essais mesurent le temps requis pour générer une certaine
concentration du produit ou pour qu’une certaine quantité du
substrat soit consommé.
™ [Enzyme] α (temps)-1 et un graphique de 1/t en fonction de [E] est
utilisé comme courbe d’étalonnage.
169
4.3 Méthodes instrumentales
4.3.1 Absorbance:
™ Méthode très pratique et populaire pour suivre des réactions
enzymatiques due à sa simplicité et précision.
™ La détection de la quantité de substrat consommée ou de produit
formé est basée sur la loi de Beer-Lambert: Aλ=ελbC.
™ Les substrats naturels les plus fréquemment utilisés sont les
coenzymes NAD(P)+/NADP(H) qui sont réversiblement réduits par
plusieurs enzymes:
NAD(P)+ + H2
NAD(P)H + H+
λmax=340 nm
λmax=275 nm
170
™ Si le substrat naturel de l’enzyme ne possède pas des propriétés spectrales
utiles, des analogues peuvent être utilisés:
Exemple: quantification de la phosphatase alcaline dans le sérum sanguin
O
O2N
O P O- + H2O
phosphatase
alcaline
O 2N
OH + HPO4
2-
-
O
ε450nm=1.85x104 M-1 cm-1
Un échantillon dilué de sérum est incubé avec une concentration saturante
de p-nitrophénylphosphate pendant 15 min avant de lire l’absorbance à 405
nm. La limite de détection est de 4 x 10-12 M pour la phosphatase alcaline
dans l’échantillon non-dilué de sérum sanguin.
171
™ La sensibilité d’un essai enzymatique basé sur des mesures de
l’absorbance dépend directement de l’absorptivité molaire de
l’espèce détecté: ∆A=εb∆C
™ La limite de détection (la concentration minimale d’analyte requise
pour générer un signal qui est 2 à 3 fois plus grand que l’écart type
du blanc) dépend aussi de l’absorptivité molaire de l’espèce
détectée. Pour les essais du glucose (section 4.1), si le bruit de fond
à 340 nm est comparable à celui à 450 nm, des valeurs
comparables de l’absorbance seront mesurées pour le blanc. Dans
ces conditions, une absorptivité molaire plus élevée donnera lieu à
une limite de détection plus basse. La limite de détection de l’essai
basé sur la réaction indicatrice colorant-peroxydase est plus basse
que celle de l’essai avec la déshydrogénase par un facteur de
8600/6200=1.4.
™ Les limites de détection des essais enzymatiques sont
généralement de l’ordre du µM pour la concentration du substrat.
172
4.3.2 Fluorescence:
™ La fluorescence moléculaire donne des limites de détection (pour
les produits des réactions enzymatiques) qui sont quelques ordres
de grandeur plus basses que celles obtenues par des méthodes
standard d’absorbance.
™ Pour une [analyte] faible, l’intensité de la fluorescence est α à la
[analyte] et l’intensité dépend de l’absorptivité molaire de l’analyte à
la longueur d’onde d’excitation et au rendement quantique de
l’analyte.
™ On peut détecter des plus faibles concentrations d’analyte par
fluorimétrie (vs. spectrophotométrie d’absorption) dûs aux principes
instrumentaux impliqués.
™ La détection par fluorescence est aussi intrinsèquement plus
sélective que la détection par absorption puisque λexcitation et λémission
peuvent être choisies pour un produit particulier.
173
™ Problèmes possibles:
- l’extinction de fluorescence par d’autres molécules qui absorbent
autour de λémission de l’espèce détectée
- l’absorption à λexcitation par des espèces autre que l’analyte
™ Exemple: quantification de la protéase Astacus (une endopeptidase qui
coupe les liens entre les résidus Arg et Ala).
O
S NH Pro
Lys Arg Ala Pro Trp Val
O
Substrat
synthétique
coupure
enzymatique
groupe dansylextincteur de
fluorescence
fluorophore
λexcitation=285 nm
λémission=360 nm
Fluorescence à 360 nm
augmente lors de la
réaction enzymatique
Ala Pro Trp Val
174
4.3.3 Électrochimie:
™ Méthodes ampérométriques - le courant résultant d’un potentiel appliqué à
une électrode est mesuré.
enzyme
Substrat
Produit (Ox)
e-
Produit (Red)
électrode
™ Le potentiel appliqué est d’une amplitude suffisante pour complètement
oxyder (à des potentiels positifs) ou réduire (à des potentiels négatifs)
chaque molécule d’analyte qui vient en contacte avec l’électrode .
™ Le courant produit sous contrôle de transport de masse (par diffusion ou
agitation) est directement proportionnel à la concentration d’analyte.
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™ L’ampérométrie est communément employée dans des essais
enzymatiques où le peroxyde d’hydrogène est un des produits:
H2O2
2H+ + O2 + 2e-
Eappliqué = +0.70 V vs. E.C.S.
™ Les électrons produits dans la réaction d’oxydation donne lieu à un
courant mesurable qui est directement proportionnelle à [H2O2].
™ Méthodes potentiométriques - mesure d’une différence de potentiel
dont l’amplitude est reliée à la [analyte] par une relation logarithmique
(ex. électrodes sélectives aux ions)
™ Exemple: Mesure de la consommation ou production de protons par
une réaction enzymatique avec une électrode de verre (méthode de
pH-stat - de l’acide ou base est ajouté pour maintenir le pH à une
certaine valeur)
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