Cancer du col utérin de stade débutant et

Université de Liège Faculté de Médecine
GIGA-Cancer
Laboratoire de Biologie des Tumeurs et du Développement
Promoteur : Professeur F. Kridelka
Co-promoteur : Professeur J-M Foidart
Cancer du col utérin de stade débutant et
dissémination ganglionnaire : analyse informatique
détaillée du réseau vasculaire lymphatique global sur
tissus cervicaux humains
Cédric BALSAT
Mémoire de thèse présenté en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Biomédicales et Pharmaceutiques
- Année académique 2013-2014 -
Remerciements
A l’issue de la rédaction de ce manuscrit, il me tient à cœur de remercier l’ensemble
des personnes qui, de près ou de loin, ont contribué à l’aboutissement de ce projet
professionnel et défi personnel.
En premier lieu, je tiens à remercier les Professeurs Agnès Noël, Jean-Michel
Foidart et Didier Cataldo pour m’avoir accueilli au sein de leur laboratoire. En particulier
Agnès, je te remercie pour ta disponibilité, ton aide et tes conseils prodigués tout au long de
ces années. Les discussions que nous avons eues autour des résultats, des articles et des
présentations scientifiques m’ont permis d’évoluer et ont toujours stimulé chez moi l’envie
d’aller plus loin dans le projet. Monsieur le Professeur Foidart, vous m’avez appris
l’importance et la nécessité de partager ses données et son point de vue scientifique, que ce
soit par le biais de publications ou de présentations orales. Je vous remercie pour vos
encouragements ainsi que pour la confiance que vous m’avez accordée depuis le début.
Ce travail de thèse ne serait pas ce qu’il est sans la participation active de mon
promoteur, le Professeur Frédéric Kridelka, qui m’a encadré depuis le début. Malgré un
emploi du temps de clinicien chargé, vous avez toujours su vous rendre disponible. Vos
conseils et votre implication tout au long de ce travail m’ont été d’une aide précieuse et me
permettent aujourd’hui de défendre ma thèse. Nous avons parfois dû lutter contre vents et
marrées, mais nous avons toujours accosté à bon port. Merci pour votre soutien, vos
encouragements et votre confiance. Ce fut une expérience enrichissante et un plaisir de
travailler sur ce projet avec vous.
La suite de mes remerciements va au Docteur Silvia Blacher, spécialiste en analyse
d’images digitales au laboratoire. Silvia, ta passion et ton expertise dans ces domaines ainsi,
que ton don pour le développement de nouvelles méthodes de quantification, ont
indéniablement contribués à l’originalité de ce travail. Merci pour ta patience et ta joie de
vivre communicative. C’est superbe !
Je remercie également le Docteur Nicolas Signolle dont les talents ont permis de
mettre au point les différentes méthodes de processing d’images digitales. Merci Nicolas pour
ta gentillesse, ton calme inébranlable, ta bonne humeur et tes "petits programmes". Nous
avons partagés d’excellents moments tout au long de ton passage au laboratoire et avons liés
de vrais liens d’amitié.
Je souhaite aussi remercier tout particulièrement les Docteurs Frédéric Goffin, Aude
Béliard et Carine Munaut pour le temps que vous m’avez consacré, en participant
notamment de manière assidue aux réunions "Plan Cancer" internes au laboratoire. Vos
réflexions, analyses et recommandations m’ont été d’une grande aide pour l’orientation de
mon travail et m’ont permis de progresser tout au long de ces années.
J’adresse également des remerciements spécifiques à Alexandra Paye, Charlotte
Epicum, Sylvain Hansen, Ludovic Maertens et Benoît Detry pour tous les bons moments
que nous avons partagés, leurs encouragements et leur amitié. Alexandra merci pour ta bonne
humeur et tous tes conseils durant cette thèse. Entre autres, j’ai apprécié partager nos idées
lors de la rédaction de nos thèses au cours de ces derniers mois. Charlotte, Sylvain et Ludo,
votre bureau ressemble à un petit état indépendant où il est agréable de s’égarer à l’occasion.
Il s’y mélange une ambiance de camaraderie, de second degré et de vannes en tout genre qui
ont vite fait de vous donner le sourire. Merci aussi pour l’entraide que nous avons partagée
durant ces années et à Ludo pour ses intarissables "Zedrig" à travers le labo. Finalement, un
tout grand merci à toi Benoît pour les nombreuses discussions sérieuses et moins sérieuses
que nous avons partagées. Excellent collègue de travail, de délire et snipper de l’humour, ce
fut véritablement un plaisir de passer ces 5 ans en ta compagnie. Encore merci pour ton
amitié !
Il m’est également indispensable de remercier toutes mes collègues de bureau, les
Docteurs Soraya Labied et Julie Lecomte ainsi que Natacha Leroi et Meggy SuarezCarmona. Merci pour la bonne ambiance quotidienne, vos conseils avisés et pour votre
patience. Vous avez malgré vous été victimes de mon humour particulier mais vous l’avez
toujours pris avec le sourire… ou résignation, je sais plus trop.
Je remercie également l’ensemble des personnes qui m’ont apporté une aide technique.
Notamment Patricia Gavitelli, Isabelle Dasoul et Emilie Feyereisen pour la série
importante de blocs qu’elles ont patiemment techniqués ainsi que pour leurs conseils lors de
la mise au point des marquages immunohistochimiques. Je remercie aussi le Docteur Katty
Delbecque pour son aide et son expertise de pathologiste au cours de ce travail. Je remercie
chaleureusement Karin Vandewalle et Hélène Brisy pour toute leur aide administrative. Un
tout grand merci à l’ensemble des membres de mon laboratoire et particulièrement à Laurette
Volders, Marie Dehuy, Guy Roland et Orianne Carnet pour la bonne ambiance partagée
au bench et Morgane Boursy pour son sens de l’humour. Merci également au Docteur
Michaël Herfs pour son amitié et ses conseils souvent prodigués à des moments opportuns.
Je tiens à remercier l’ensemble des membres du jury pour le temps consacré à
l’évaluation de ce travail. Ce sera un plaisir de discuter avec vous lors de la défense de ma
thèse.
Enfin, je tiens à terminer en remerciant tous mes proches. Merci à ma maman, mes
sœurs, ma grand-mère et Arnaud qui m’ont toujours soutenu et encouragé tout au long de
ma thèse. Si j’arrive au terme de ce travail c’est aussi en grande partie grâce à vous. Merci à
Stéphanie, Olivier, Gabriel et mes beaux-parents pour tous leurs conseils et
encouragements. Parmi eux, je remercie tout particulièrement mon beau-père Michel Audrit
pour la relecture de ce manuscrit. Je remercie aussi tous mes amis qui m’ont également
encouragé et plus particulièrement Simon, Laurie, Raphaël et Stéphanie. Merci à vous les
gars !
La dernière personne que je souhaite remercier, et non la moindre, est ma femme
Anne-Sophie Audrit. Un tout grand merci pour ta patience et ton dévouement durant toutes
ces années et plus particulièrement pendant la rédaction de ce manuscrit. Tu as réussi à gérer
mes sautes d’humeurs et mes moments de doutes avec brio. Merci d’être là et merci d’être
toi !
Avec le soutien du Télévie et du Plan National contre le cancer.
Résumé
La dissémination lymphatique est un évènement clé lors de la progression des
néoplasies cervicales et des marqueurs tumoraux connexes sont vus comme des facteurs
pronostiques potentiels d’extension ganglionnaire. A ce jour, la lymphangiogenèse (formation
de nouveaux vaisseaux lymphatiques à partir de vaisseaux préexistants) est décrite comme un
processus central favorisant la dissémination des cellules néoplasiques jusqu’aux ganglions
locorégionaux et la densité en vaisseaux lymphatiques (LVD) péritumorale est proposée
comme un facteur pronostique précoce d’extension ganglionnaire. Cependant, en raison du
manque d’objectivité et de reproductibilité qui caractérise la technique de hot-spot, aucun
consensus n’a actuellement pu être établi à ce sujet.
Dans le but de valider l’éventuelle valeur pronostique de la vascularisation
lymphatique sur le risque d’extension ganglionnaire, nous avons mis au point une technique
originale d’analyse d’images digitales permettant de réaliser des quantifications objectives,
robustes, reproductibles et détaillées du réseau vasculaire dans son intégralité. A l’aide de
cette technique, l’évolution de la vascularisation lymphatique au cours de la progression
tumorale a été caractérisée, comparée à celle présente au niveau de cols sains et confrontée
aux paramètres de dissémination ganglionnaire (statut
ganglionnaire et
emboles
lymphatiques). Nous avons mis en évidence la présence d’une activité lymphangiogène
intense, méconnue à ce jour, sous la zone de transformation des cols sains, région au niveau
de laquelle les néoplasies cervicales se développent. Au cours de la progression tumorale,
nous avons observé que ce microenvironnement spécifique est maintenu. Seule la distribution
des vaisseaux par rapport à la jonction "cellules néoplasiques/stroma" est modifiée. Au niveau
des lésions de stade FIGO IB1, nous avons démontré que la LVD absolue n’est pas un
marqueur de dissémination ganglionnaire, mais que la distribution spatiale des vaisseaux
lymphatiques apparaît comme un élément important lors de la dissémination tumorale.
En conclusion, nos travaux soutiennent l’intérêt primordial d’une analyse globale de la
vascularisation lymphatique pour une meilleure caractérisation des paramètres pouvant être
impliqués dans le processus de dissémination tumorale. Ils démontrent également que
l’évaluation du risque de dissémination lymphatique ne peut se référer exclusivement à une
simple augmentation du nombre de vaisseaux lymphatiques. Ils mettent également en lumière
des modifications de l’organisation spatiale du réseau vasculaire lymphatique pouvant jouer
un rôle non négligeable dans la progression des tumeurs.
Abstract
Lymphatic dissemination is a key event during cervical cancer progression and related
tumor markers are viewed as potential prognostic factors of lymph node extension. To date,
Lymphangiogenesis (formation of new lymphatic vessels from pre-existing ones) are
described as a central process improving neoplastic cell dissemination to loco-regional lymph
nodes and the lymphatic vessel density (LVD) is proposed as a new early prognostic factor of
nodal extension. However, due to lack of reproducibility associated to the hot-spot technique
no consensus currently exists.
In order to validate the potential prognostic value of the lymphatic vasculature on the
risk of nodal extension, we developed an original digital image analysis technique allowing to
perform objective, robust, reproducible and detailed quantifications of the entire lymphatic
vascular network. Based on this new technique, lymphatic vasculature changes during cancer
progression were characterized compared to those initially observed in benign cervical tissues
and confronted to the lymph node and lymphovascular space invasion status. We described
for the first time an unappreciated lymphangiogenic niche under the transformation zone of
benign cervix known as the regions in which neoplasic lesions develop. During the cancer
progression, we observed that this specific microenvironment is maintained. Only a
modification of the spatial lymphatic vessel distribution from the tumor edges was found. In
FIGO IB1 cervical lesions, we demonstrated that the LVD is correlated neither with the
lymph node status nor with the lymphovascular space invasion but a modification of the
lymphatic vessel distribution appears as a prominent event in tumor cell dissemination
through the lymphatic vasculature.
To conclude, our study supports a primordial interest of a global lymphatic network
analysis for a better characterization of mechanisms potentially involved in tumor cell
dissemination. It demonstrates also that the risk of a lymphatic dissemination cannot be
resumed to a mathematical increase of the number of lymphatic vessel around the tumor but
sheds light on topographical features that are worth considering in cervical cancer.
Table des matières
INTRODUCTION .................................................................................................................... 1
I. Col de l’utérus : Informations générales ............................................................................. 2
1. Anatomie ........................................................................................................................ 2
2. Histologie ....................................................................................................................... 3
3. Evolution ........................................................................................................................ 3
3.1. Evolution structurelle .............................................................................................. 3
3.2. Zone de transformation et métaplasie ..................................................................... 6
II. Cancer du col de l’utérus ................................................................................................... 7
1. Epidémiologie ................................................................................................................ 7
2. Les papillomavirus humains........................................................................................... 8
2.1. Les HPV oncogènes ................................................................................................ 8
2.2. Description et tropisme ........................................................................................... 8
2.3. Cycle cellulaire et transformation néoplasique ..................................................... 10
2.3.1. Cycle cellulaire normal .................................................................................. 10
2.3.2. Transformation néoplasique ........................................................................... 10
2.3.3. Cycle cellulaire et marqueur de néoplasie cervicale ...................................... 11
3. Zone de transformation et néoplasies cervicales .......................................................... 12
3.1. Les molécules d’adhésion ..................................................................................... 12
3.2. L’inflammation...................................................................................................... 13
3.2.1. Cellules présentatrices d’antigènes ................................................................ 14
3.2.2. Polarisation Th2 ............................................................................................. 14
3.3. Réseau vasculaire lymphatique ............................................................................. 15
4. Carcinogenèse et évolution clinique ............................................................................ 16
4.1. Carcinogenèse ....................................................................................................... 16
4.2. Les lésions précancéreuses .................................................................................... 18
4.3. Les lésions cancéreuses ......................................................................................... 19
4.3.1. Progression tumorale ...................................................................................... 19
4.3.2. Classification FIGO........................................................................................ 20
III. Traitement ...................................................................................................................... 24
1. Lésions intra-épithéliales.............................................................................................. 24
2. Lésions cancéreuses ..................................................................................................... 24
2.1. Plan thérapeutique ................................................................................................. 25
2.2. Traitements adjuvants ........................................................................................... 29
2.3. Morbidité thérapeutique ........................................................................................ 30
2.4. Contrôle de la morbidité thérapeutique ................................................................. 31
IV. Dissémination Tumorale ................................................................................................ 35
1. Dissémination lymphatique .......................................................................................... 35
1.1. La vascularisation lymphatique ............................................................................. 35
1.1.1. Structure et fonctions ..................................................................................... 35
1.1.2. Flux et dissémination passive ......................................................................... 37
1.2. Chémokines ........................................................................................................... 38
1.3. Lymphangiogenèse : progression et dissémination tumorale ............................... 39
2. Cancer cervical : lymphangiogenèse et densité en vaisseaux lymphatiques ................ 42
3. Quantification de la lymphangiogenèse ....................................................................... 45
3.1. Les marqueurs des vaisseaux lymphatiques .......................................................... 45
3.2. Techniques de quantification ................................................................................ 47
3.2.1. Hot-spot .......................................................................................................... 47
3.2.2. Systèmes d’acquisition et analyse d’images digitales .................................... 49
BUTS ET PLAN ..................................................................................................................... 52
RESULTATS .......................................................................................................................... 56
I. Développement d’une nouvelle technique de quantification de la vascularisation
lymphatique .......................................................................................................................... 57
1. Contexte ....................................................................................................................... 57
2. Hot-spot et objectivité .................................................................................................. 57
3. Description de notre technique d’analyse d’image ...................................................... 58
3.1. Marquage immunohistologique............................................................................. 59
3.2. Acquisition et gestion des images digitales ........................................................... 60
3.3. Segmentation des structures d’intérêt ................................................................... 62
3.4. Segmentation du tissu et génération de zones d’intérêt ........................................ 65
3.4.1. Segmentation du tissu..................................................................................... 65
3.4.2. Génération de zones d’intérêt ......................................................................... 66
4. Hot-spot versus analyse informatique d’images digitales ............................................ 68
4.1. Exactitude .............................................................................................................. 68
4.2. Reproductibilité ..................................................................................................... 68
5. Conclusions .................................................................................................................. 69
II. Caractérisation stromale détaillée de la vascularisation lymphatique dans les cancers
cervicaux débutants .............................................................................................................. 70
1. Contexte ....................................................................................................................... 70
2. Résultats ....................................................................................................................... 71
3. Conclusions .................................................................................................................. 72
III.
Analyse informatique détaillée du réseau vasculaire lymphatique global sur tissus
cervicaux humains ................................................................................................................ 81
1. Contexte ....................................................................................................................... 81
2. Résultats ....................................................................................................................... 82
3. Conclusions .................................................................................................................. 84
IV.
Résultats complémentaires ....................................................................................... 98
1. LVD et métaplasie ........................................................................................................ 98
2. Inflammation ................................................................................................................ 99
3. Lymphangiogenèse : VEGF-C ................................................................................... 100
4. Lymphangiogenèse : vaisseaux en cours de prolifération .......................................... 102
5. Paramètres morphologiques ....................................................................................... 102
6. Résultats complémentaires : conclusions ................................................................... 103
Résultats principaux ....................................................................................................... 104
DISCUSSION ET PERSPECTIVES .................................................................................. 105
CONCLUSIONS................................................................................................................... 117
ANNEXES ............................................................................................................................. 120
Figure S1 ........................................................................................................................ 121
Liste des publications ..................................................................................................... 122
BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................... 123
Liste des abréviations
5’-Nase-ALPase
5'-nucleotidase-alkaline phosphatase
99m
Technétium
ADN
Acide Désoxyribonucléique
Ang
angiopoétine-1
CCL
C-C motif Chemokine ligand
CCR
C-C motif Chemokine Receptor
CDK
Cycline Dependant Kinase
CDKN2A
cyclin-dependent kinase inhibitor 2A
CIN
Carcinome intra-épithélial
CXCL
C-X-C motif Chemokine ligand
CXCR
C-X-C motif Chemokine Receptor
ESAM
Endothelial Cell Adhesion Molecule
FGF
Fibroblast Growth Factor
FIGO
Fédération Internationale de Gynécologie Obstétrique
HGF
Hepatocyte Growth Factor
HPV
Human Papillomavirus Virus
HSIL
High grade Squamous Intraepithelial Lesion
IGF
Insuline-like Growth factors
IL
Interleukine
INF-γ
Interferon gamma
JAM-A
Junctional Adhesion Molecule A
JSC
Jonction Squamocylindrique
kDa
Kilo Dalton
LCR
Long Control Region
LSIL
Low grade Squamous Intraepithelial Lesion
LVD
Lymphatic Vessel Density
LVSI
LymphoVascular Space Invasion
Tc
LYVE-1
Lymphatic vessel endothélial hyaluronan receptor 1
LZW
Lempel-Ziv-Welch
MIA
Microscopic Image Analysis
MIP-1α
Macrophage Inflammatory Protein 1 alpha
MMP
Matrix Metalloproteinase
MT-MMP
Membrane Type Matrix Metalloproteinase
MTS1
multiple tumor suppressor 1
PDGF
Platelet-Derived Growth Factor
PGE2
Prostaglandine E2
pRB
Protéine du Rétinoblastome
Prox1
Prospero-related homeobox transcription factor
siRNA
Small interfering ribonucleic acid
TGF-β
Transforming Growth Factor beta
Th
T helper
Tiff
Tagged Image File Format
TNF-α
Tumor Necrosis Factor alpha
TNM
Tumor – Nodal status – distant Metastasis
uPARAP
Urokinase Receptor Associated Protein
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor
VEGFR
Vascular Endothelial Growth Factor Receptor
INTRODUCTION
1
Introduction
I. Col de l’utérus : Informations générales
1. Anatomie
Le col utérin fait partie du système reproducteur féminin (figure 1). Il correspond à la
partie inférieure de l’utérus et est localisé entre les faces antérieure du rectum et postérieure
de la vessie. Il présente une forme cylindrique de 3 à 4 cm de long et 2,5 cm de diamètre dont
environ la moitié inférieure se projette dans la cavité vaginale. Il délimite un canal
endocervical en contact avec la cavité utérine au niveau de l’orifice interne et ouvert sur le
vagin au niveau de l’orifice externe. La paroi du col utérin se joint finalement dans sa partie
inférieure à la celle du vagin au niveau des fornix antérieur, postérieur et latéraux.
La vascularisation du col utérin est assurée par les artères utérines, également
impliquées dans l’irrigation de l’utérus et de la partie supérieure du vagin. Le drainage
veineux est effectué par les veines utérines qui se poursuivent par les veines iliaques internes
et enfin la veine cave inférieure. La lymphe est quant à elle majoritairement redirigée par les
vaisseaux lymphatiques pelviens vers des ganglions paramétriaux, obturateurs, iliaques
internes, iliaques externes et iliaques communs. Enfin, l’innervation sensorielle, sympathique
et orthosympathique du col est assurée par les fibres nerveuses dérivant du plexus
hypogastrique [1].
Figure 1 : Représentation schématique du système reproducteur féminin.
2
Introduction
2. Histologie
Le col de l’utérus est composé de trois régions anatomiques différentes : l’exocol,
l’endocol et la zone de transformation (figure 2). Ces dernières se distinguent les unes des
autres par leur localisation et leur structure histologique. L'exocol est délimité par un
épithélium pavimenteux pluristratifié de type épidermoïde. Il se compose d’une couche
inférieure de cellules basales de couleur sombre qui se divisent et se différencient pour former
les couches supérieures. Au niveau de la partie intermédiaire, les cellules prennent une forme
polygonale, présentent un cytoplasme riche en glycogène et s’aplatissent progressivement au
fur et à mesure que l’on se rapproche de la partie superficielle de l’épithélium. L’exocol se
situe dans la partie inférieure du col et constitue la paroi supérieure de la cavité vaginale.
L’endocol est composé d’un épithélium cylindrique mucosécrétant qui s’invagine dans le
stroma jusqu’à une profondeur de 5 à 8 mm et forme de nombreuses glandes tubuleuses
ramifiées. Il est localisé au niveau des régions internes du col utérin et délimite le canal
endocervical. Finalement, la zone de transformation est localisée entre l’exocol et l’endocol.
Elle est définie comme la région cervicale au niveau de laquelle un épithélium squameux
surplombe des glandes localisées dans le stroma et/ou coexiste avec un épithélium
cylindrique. Celle-ci est le résultat d’un remplacement de l’épithélium glandulaire en un
épithélium pavimenteux par un processus adaptatif appelé métaplasie qui se produit lorsque
les cellules glandulaires sont soumises à un stress mécanique ou chimique [1, 2].
3. Evolution
3.1. Evolution structurelle
L’organisation histologique du col de l’utérus évolue tout au long de la vie et varie en
fonction de différents paramètres indépendants tels que l’âge, le statut hormonal ou encore
dans certaines conditions physiologiques comme la grossesse.
Au cours de la période pré-pubère, l’endocol succède directement à l’exocol. Une
transition brutale entre les épithéliums squameux et glandulaire, dénommée jonction
squamocylindrique "originelle", est observée à proximité de l’orifice externe du canal
endocervical (figure 3) (figure 4A). A partir de la puberté et durant toute la période de
reproduction, une évolution de la structure du col utérin est observée (figure 4) [1, 2].
3
Introduction
Figure 2 : Coupe frontale du col utérin. Coloration du tissu à l’hématoxyline éosine. (A) Coupe histologique du
col utérin dans son intégralité. (1) L’exocol, est localisé dans la partie inférieure. (2) La zone de transformation
surplombe des glandes cervicales (étoiles). (3) L’endocol est visible sur la gauche de l’image. (B, C et D)
Visualisation de la paroi de l’endocol (B), de la zone de transformation (C) et de l’exocol (D). La zone de
transformation présente une coexistence d’un épithélium squameux et de cellules cylindriques (cadre) ainsi
qu’un épithélium squameux qui surplombe des glandes localisées dans le stroma (étoiles).
Figure 3 : Coupe histologique du
col
de
l’utérus
colorée
à
l’hématoxyline éosine. La transition
brutale entre l’épithélium squameux
et
l’épithélium
appelée
zone
glandulaire
de
est
jonction
squamocylindrique.
4
Introduction
La croissance du col utérin et l’allongement du canal endocervical, sous l’influence des
œstrogènes produits lors du cycle menstruel, provoquent l’émergence de la partie inférieure
de l’épithélium glandulaire dans la cavité vaginale (figure 4B). Les cellules glandulaires
apparaissant au niveau de la cavité vaginale sont alors progressivement remplacées par un
épithélium pluristratifié de type squameux par un processus adaptatif appelé métaplasie
(figure 4C). Celui-ci est activé en réponse à l’agression des cellules glandulaires par l’acidité
du fluide vaginal. Ainsi, la jonction squamocylindrique originelle disparaît et laisse place à
une nouvelle zone de jonction dénommée jonction squamocylindrique "observée". Cet
évènement se produit de manière récurrente tout au long de la période reproductrice chez la
femme. De cette façon, la zone de transformation s’élargit et la jonction squamocylindrique
"migre" progressivement dans le canal endocervical (figure 4D). A la ménopause, cette
dernière apparait totalement enfouie au sein du canal endocervical et est généralement
invisible lors de l’examen visuel par colposcopie (figure 4E).
Figure 4 : Représentation schématique de l’évolution structurelle du col utérin. L’épithélium de l’endocol est
représenté par un trait fin s’invaginant dans le tissu. L’exocol et la paroi vaginale sont représentés par un double
trait noir. L’épithélium de la zone de transformation est symbolisé par un trait noir épais. (A) Absence de zone
de transformation au cours de la période pré-pubère. La transition brutale entre l’exocol et l’endocol est appelée
jonction squamocylindrique (JSC) originelle. (B) Eversion de l’endocol dans la cavité vaginale. (C)
Etablissement de la zone transformation (trait noir épais). (D) Migration de la zone de jonction nouvellement
observée dans le canal endocervical en fin de cycle. (E) Chez la femme ménopausée, la zone de jonction
observée est enfouie profondément dans le canal endocervical. Schéma adapté de Sellors et al [1].
5
Introduction
3.2. Zone de transformation et métaplasie
Le processus de métaplasie qui mène à la formation de la zone de transformation du
col utérin est un processus adaptatif activé en réponse à une agression répétée de l’épithélium.
Celui-ci est également observé au niveau des bronches, de l’œsophage, de la vessie, de
l’estomac et du rectum [3]. Dans un premier temps, les cellules souches non-différenciées
présentes à la base de l’épithélium glandulaire prolifèrent, se différencient et forment un
épithélium squameux immature caractérisé par une absence de stratification (métaplasie
immature). Par la suite, ces cellules évoluent en kératinocytes matures et forment un
épithélium pluristratifié identique à celui détecté au niveau de l’exocol (métaplasie mature)
(figure 5) [4]. Ce processus est fréquemment associé au développement d’une réponse
inflammatoire chronique, à une dérégulation dans la production de facteurs solubles impliqués
dans la réponse immunitaire antivirale (cytokines et chémokines) ainsi qu’à une altération des
protéines de jonctions intercellulaires au niveau de l’épithélium. La zone de transformation se
présente ainsi comme une région singulière du col utérin particulièrement fragile et sensible
aux infections virales sexuellement transmissibles [5].
Figure 5 : Illustration de la conversion de l’épithélium glandulaire (en haut de l’image) en un épithélium
pluristratifié immature (métaplasie immature) puis en épithélium squameux mature (métaplasie mature) au
niveau de la zone de transformation d’un col utérin sain.
6
Introduction
II. Cancer du col de l’utérus
1. Epidémiologie
Le cancer du col de l’utérus est le troisième cancer le plus fréquent chez la femme
avec 529.000 nouveaux cas détectés à travers le monde en 2008, ainsi que la première cause
de cancérisation du tractus génital féminin. Il est également responsable de 274.000 décès la
même année et représente ainsi la 4ème cause de mortalité parmi les patientes atteintes d’un
cancer. Des disparités géographiques sont cependant observées. Plus de 85% de cette
problématique mondiale sont recensés dans les pays en voie de développement (Afrique,
Amérique centrale, Amérique du sud, Asie du sud et de l’ouest). Dans l’ouest de l’Europe,
l’incidence standardisée sur la population mondiale est de 6,9/100.000 personnes et le taux de
mortalité standardisé sur la population mondiale est de 2/100.000 personnes, soit
respectivement 9.300 nouveaux cas et 3.800 décès par an. Ces résultats prennent en
considération les dernières estimations réalisées auprès de 182 pays pour les 27 cancers les
plus fréquents dans le monde (figure 6) [6].
Figure 6 : Proportion de nouveaux cas détectés chaque année pour les cancers les plus fréquents chez la femme.
Schéma adapté des dernières estimations réalisées par Ferlay et al [6].
7
Introduction
2. Les papillomavirus humains
2.1. Les HPV oncogènes
Les cancers du col de l’utérus sont la conséquence d’une infection persistante des
cellules cervicales par un papillomavirus humain (HPV). Une étude réalisée sur un large
échantillonnage de biopsies de cancers du col démontre en effet la présence du génome viral
dans 99,7% des cas [7]. Actuellement, plus d’une centaine d’HPV différents ont été
répertoriés dont approximativement un tiers d’entres eux possèdent la capacité d’infecter le
tractus génital féminin [8]. Parmi ces derniers, une distinction est réalisée entre les HPV à
faible potentiel oncogénique ("Low Risk" HPV), rarement détectés dans les carcinomes du col
utérin, et les HPV à haut potentiel oncogénique ("High Risk" HPV) impliqués dans près de
95% des cancers du col de l’utérus. Une quinzaine d’HPV à haut potentiel oncogénique ont
été répertoriés et parmi eux, les HPV-16 et 18 sont responsables de plus de 70% des cancers
du col (figure 7) [9-11].
Figure 7 : Estimation du pourcentage de cas de cancers du col attribués aux HPV oncogènes les plus fréquents
parmi toutes les régions du monde [12].
2.2. Description et tropisme
Les papillomavirus humains se présentent sous la forme de virions de 55 nm de
diamètre délimités par une capside et renfermant un ADN circulaire double brins d’environ
8000 paires de bases [13, 14]. Leur génome est composé de 6 gènes codant pour les protéines
8
Introduction
impliquées dans la réplication et l’intégrité de l’ADN viral (E1, E2, E4, E5, E6 et E7), de
deux gènes codant pour les protéines structurelles de la capside (L1 et L2) ainsi que d’une
origine de réplication comprenant une région régulatrice de l’expression de ces gènes (LCR :
"Long Control Region") (figure 8A) [15]. Les HPV possèdent un tropisme particulier pour les
cellules de la couche basale des épithéliums squameux et peuvent ainsi infecter la paroi du col
de l’utérus, du rectum, de la vulve, du pénis et de l’oropharynx [16]. En cas de micro-abrasion
au niveau de ces épithéliums de surface, les particules virales peuvent accéder à la membrane
basale, à laquelle ils se lient, avant de pénétrer dans les kératinocytes adjacents (figure 8B)
[17]. Au sein des cellules hôtes, l’ADN viral se présente initialement sous la forme
d’éléments extra-chromosomiques (épisome). Dans ce cas, les gènes E1 à E7 (E = early) sont
rapidement exprimés au niveau des couches inférieures de l’épithélium et induisent la
réplication des épisomes. La synthèse des protéines de la capside L1 et L2 (L = late) ainsi que
l’assemblage de nouveaux virions sont réalisés au niveau des cellules des couches moyennes
et superficielles de l’épithélium avant que ces derniers ne soient relargués dans le milieu
extracellulaire à la surface de l’épithélium [18]. Dans un second temps, le génome viral
s’intègre au génome humain. Ce processus induit le développement et l’accumulation
d’instabilités chromosomiques responsables de l’apparition du caractère oncogénique et de la
progression tumorale [19, 20].
Figure 8: (A) Génome du papillomavirus humain le plus fréquemment impliqué dans les cancers du col de l’utérus (HPV16).
(B) Développement des lésions précancéreuses au niveau de l’épithélium squameux du col utérin. La présence de microabrasions permet aux particules virales HPV d’atteindre les cellules de la couche basale. Après avoir infecté ces cellules
(noyaux mauves) les protéines E1 à E7 sont répliquées dans les couches inférieures de l’épithélium. Les protéines structurelles
L1 et L2 sont synthétisées au niveau des couches moyennes et superficielles et permettent l’encapsidation du génome viral. Les
virions nouvellement formés sont relargués à la surface de l’épithélium. Une fois à l’extérieur, ceux-ci peuvent à leur tour
infecter de nouvelles cellules saines. Enfin, le génome viral peut également s’intégrer au génome humain (noyaux rouges) [18].
9
Introduction
2.3. Cycle cellulaire et transformation néoplasique
2.3.1. Cycle cellulaire normal
La prolifération et l’apoptose sont des processus finement régulés au sein des cellules
normales (figure 9). Ces cellules sont majoritairement maintenues dans un état de quiescence
grâce à l’association de la protéine de la famille du rétinoblastome (pRb) au facteur de
transcription E2F [21]. Au cours de la phase G1 du cycle cellulaire, la phosphorylation de
pRB par les cyclines kinases dépendantes activées (CDK 2, 4 et 6) provoque la libération du
facteur de transcription E2F [22]. Ce dernier active alors l’expression des gènes codant pour
les protéines impliquées dans la régulation la phase "S" du cycle cellulaire au cours de
laquelle l’ADN génomique est répliqué [23]. A l’inverse, le facteur de transcription
suppresseur de tumeur p53 peut activer l’expression des gènes codant pour les protéines
impliquées dans l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose [24]. Tel est le cas pour les protéines
p21 et p27 qui contrôlent l’arrêt de la croissance cellulaire en inhibant l’action des cyclines
[25-27].
2.3.2. Transformation néoplasique
Lors d’une infection des cellules hôtes par un papillomavirus humain, les protéines
virales E6 et E7 induisent une hyper-prolifération cellulaire, une déficience des mécanismes
d’apoptose ainsi que la formation et l’accumulation d’anomalies génomiques responsables de
l’acquisition du caractère oncogénique (figure 9) [28]. E7 cause la dissociation du complexe
pRB-E2F en se liant directement à pRB et provoque l’entrée des cellules en phase "S" [2931]. Il inhibe également l’action des déacétylases impliquées dans la répression de la
transcription de l’ADN [32] et empêche la répression du cycle cellulaire en interagissant avec
les protéines p21 et p27 [33, 34]. Parallèlement, E6 contribue à l’immortalisation des cellules
infectées en neutralisant l’action de la protéine suppresseur de tumeur p53 [35-37] et stimule
la prolifération cellulaire en activant la transcription de la "telomerase reverse transcriptase",
un facteur de transcription des enzymes responsables de la réplication des régions terminales
des chromosomes [38].
Au fur et à mesure de la prolifération cellulaire, les oncoprotéines E6 et E7 provoquent
une accumulation d’altérations structurelles et numériques au niveau des chromosomes des
cellules infectées. D’une part, un nombre important de cassures est observé lors d’une
10
Introduction
expression intense des oncoprotéines E6 et E7. Celles-ci sont dues à l’association des
télomères de deux chromatides sœurs pouvant mener à un gain ou à une perte de matériel
génomique lors de l’anaphase [39]. D’autre part, elles provoquent la synthèse d’un nombre
supra-numéraire de centrosomes (> 2 centrosomes) [40]. La formation du réseau mitotique qui
en résulte mène à une répartition inégale du matériel génomique lors de la division cellulaire
(aneuploïdie) [41]. Ces altérations chromosomiques ont été mises en évidence dans les
néoplasies du col utérin et on été associées au caractère invasif des cellules cancéreuses [42,
43].
Figure 9 : Mécanismes impliqués dans la dérégulation du cycle cellulaire lors d’une infection par un
papillomavirus humain oncogène. Schéma adapté de Leemans et al [44].
2.3.3. Cycle cellulaire et marqueur de néoplasie cervicale
Parmi les divers mécanismes régulateurs du cycle cellulaire, P16INK4a, également
connue sous le nom de cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (CDKN2A) ou multiple tumor
suppressor 1 (MTS-1), est utilisée comme marqueur des cellules néoplasiques cervicales.
Cette protéine suppresseur de tumeur régule la progression du cycle cellulaire en agissant sous
la forme d’une boucle de rétroaction négative (figure 9). Exprimée au cours de la phase S, elle
a pour rôle d’inhiber l’action des CDK 4 et 6 responsables de la dissociation du complexe
Rb/E2F [45]. Dans les cellules infectées par HPV, le catabolisme de Rb par l’oncoprotéine E7
11
Introduction
induit une surexpression de P16INK4a. La prolifération cellulaire n’étant cependant pas
dépendante des CDK4 et 6, une production intense de P16INK4a est observée tout au long de la
progression tumorale sans pour autant que cette dernière ne puisse avoir d’effet sur le cycle
cellulaire [46]. Aisément analysable par immunohistochimie, ce marqueur présente l’avantage
de faciliter la détection des petits amas isolés de cellules. Couplée à une analyse de coupes
colorées par l’hématoxyline éosine, l’analyse de P16INK4a facilite le diagnostic des dysplasies
cervicales de petite taille [47].
3. Zone de transformation et néoplasies cervicales
La zone de transformation est actuellement reconnue comme la région du col utérin au
niveau de laquelle les néoplasies cervicales se développent. En 1983, se basant sur une étude
histo-morphologique, Burghardt et al déterminèrent que, dans la grande majorité des cas, le
précurseur de lésions néoplasiques se présente sous la forme d’une métaplasie squameuse
atypique localisée au sein de la zone de transformation [48]. Récemment, une population
d’une quarantaine de cellules faisant partie de la zone de jonction squamocylindrique ont été
suggérées comme les réels précurseurs des lésions néoplasiques cervicales [49]. D’une part,
ces cellules présentent un profil génomique différent de celui des cellules squameuses et
glandulaires adjacentes et d’autre part, celles-ci expriment différents marqueurs spécifiques
des cellules de la zone de jonction (Kératine 7, antérior gradient 2, cluster differentiation 63,
matrix metaplloproteinase 7 et guanine deaminase) qui apparaissent conservés dans
l’ensemble des lésions néoplasiques intra-épithéliales de haut grade et cancéreuses. Il est ainsi
suggéré que l’association entre le développement cancéreux et la zone de transformation est
liée à la présence d’une zone de jonction fragile, siège d’une conversion métaplasique de
l’épithélium glandulaire en épithélium squameux consécutif à l’agression de l’endocol par
l’acidité vaginale.
3.1. Les molécules d’adhésion
La principale fonction attribuée à la conversion de l’épithélium glandulaire en
épithélium pluristratifié est le développement d’une paroi robuste permettant une meilleure
protection du tissu cervical contre les agressions extérieures. Cependant, les kératinocytes des
12
Introduction
épithéliums métaplasiques localisés à proximité de la zone de jonction présentent un manque
de maturation comparativement aux épithéliums squameux normaux. Notamment, la Ecadhérine, protéine d’adhésion intercellulaire impliquée dans le maintien de l’architecture des
épithéliums, y est plus faiblement exprimée [50]. Une production limitée des kératines qui
constituent les filaments intermédiaires du cytosquelette (kératine -10, 17 et 19) ainsi que des
composants impliqués dans le renforcement de la paroi cellulaire (involucrine et loricrine) y
sont également observés [50, 51]. Par conséquent, les métaplasies immatures présentent un
manque de résistance aux stress mécaniques et non-mécaniques qui les rendent plus
vulnérables aux microtraumatismes permettant l’infection des cellules basales de l’épithélium
par un HPV. La zone de transformation du col de l’utérus est ainsi considérée comme la
principale voie d’entrée du virus HPV [5].
3.2. L’inflammation
Les cellules immunitaires présentes au niveau de l’épithélium métaplasique jouent un
rôle central dans les mécanismes de défense contre les pathogènes. Ces cellules sécrètent un
grand nombre de chémokines et de cytokines immunorégulatrices impliquées dans
l’activation et le maintien d’une immuno-surveillance au niveau de la zone de transformation
du col utérin [52]. Tout au long de la vie sexuelle, l’agression répétée de la zone de jonction
provoque un recrutement de cellules inflammatoires et le développement d’un
microenvironnement spécifique différent de celui présent sous l’exocol et l’endocol. Entre
autres, des niveaux élevés d’interleukines (IL)-1, IL-6, IL8, IL-10, IL-12, de Tumor Necrosis
Factor (TNF)-α, d’interferon (INF)-γ et de Macrophage Inflammatory Protein (MIP)-1α ainsi
qu’une concentration importante de macrophages et de lymphocytes T sont détectés sous la
zone de transformation du col utérin [53, 54]. Chez certaines femmes, la production intense
d’immuno-modulateurs et l’activation répétée du système immunitaire peut mener à
l’instauration d’une inflammation chronique sous-épithéliale, processus généralement associé
à une réduction de l’efficacité de la réponse immunitaire et à une potentialisation du
développement de lésions cancéreuses [55]. Une diminution de l’activation des lymphocytes
T par les cellules présentatrices d’antigènes ainsi qu’une polarisation de type Th2 de la
réponse immunitaire sont notamment décrites sous la zone de transformation. Il est
actuellement soutenu que cette réduction de l’immuno-vigilance favoriserait la persistance
13
Introduction
d’une infection par un HPV ainsi que le développement des néoplasies cervicales dans cette
région [56].
3.2.1. Cellules présentatrices d’antigènes
Parmi les cellules impliquées dans les mécanismes d’immuno-surveillances, les
cellules de Langerhans ont été caractérisées pour leur implication majeure dans le
développement d’une réponse immunitaire adaptée. Ces cellules présentatrices d’antigènes
immatures situées dans les couches supra-basales des épithéliums squameux permettent
l’activation et le recrutement des lymphocytes T lors de l’infection [57]. Au niveau de la zone
de transformation, une diminution de leur densité comparativement à l’exocol ainsi qu’une
altération de leur capacité à présenter l’antigène ont été décrites [58]. Ces évènements sont
expliqués par des différences d’expression des cytokines et chémokines. Une faible
expression du MIP-3α, permettant le recrutement des cellules de Langerhans vers
l’épithélium, est détectée [58]. Parallèlement, une intense production de la prostaglandine E2
(PGE2) induit une diminution de la motilité de ces cellules [59]. Finalement, une
surexpression de Transforming Growth Factor (TGF)-β a été mise en évidence au niveau de la
zone de transformation et fut démontrée comme pouvant réduire la densité des cellules de
Langerhans. Il est responsable d’une diminution de l’expression de la cadhérine E par les
kératinocytes permettant l’adhésion des cellules de Langerhans au sein de l’épithélium
squameux [50].
3.2.2. Polarisation Th2
Les lymphocytes T sont subdivisés en deux sous-groupes, les lymphocytes T helper
(Th) CD4+ et les lymphocytes cytotoxiques CD8+. Selon les cytokines sécrétées par les
lymphocytes CD4+, une distinction est réalisée entre les lymphocytes T helper de type Th1 et
Th2. En règle générale, les lymphocytes de type Th1 sécrètent de l’INF-γ, du TNF-α, de l’IL2 et régulent l’activation et le recrutement des lymphocytes T cytotoxiques, macrophages et
mastocytes. A l’inverse, les lymphocytes de type Th2 sécrètent de l’IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 et
IL-13 et favorisent le développement d’une réponse immunitaire humorale [60]. Au cours de
ces dernières années, une inflammation chronique de type Th2 a couramment été observée
tout au long de l’infection du col utérin par un HPV et a été décrite comme un élément
14
Introduction
favorisant le développement de lésions cancéreuses [61]. Une prédominance de lymphocytes
T de type de Th2 au sein des tumeurs cervicales a également été démontrée. Ces cellules
montrent une production élevée d’IL-10 et TGF-β pouvant induire une augmentation de
l’expression d’IL-4 ainsi qu’une diminution d’INF-γ [62].
Au niveau de la zone de transformation du col utérin bénin, une expression intense
d’IL-4, IL-6 et IL-10 ainsi que de faibles taux d’IL2 ont été constatés. Cette réponse
immunitaire de type Th2 est supposée favoriser la persistance de l’infection par un HPV et le
développement des néoplasies cervicales dans cette région [58].
3.3. Réseau vasculaire lymphatique
La présence d’un microenvironnement inflammatoire particulier au niveau de la zone
de transformation des cols sains est actuellement bien acceptée. A l’inverse, le statut
vasculaire lymphatique dans cette région est encore méconnu. Pourtant, les vaisseaux
lymphatiques possèdent une position centrale parmi le système immunitaire. Ceux-ci sont
notamment impliqués dans le transport des cellules présentatrices d’antigènes jusqu’aux
ganglions lymphatiques périphériques, étape essentielle pour l’activation de la réponse
adaptative [63]. Il existe également une relation étroite entre l’inflammation chronique et la
lymphangiogenèse (formation de nouveaux vaisseaux lymphatiques à partir de vaisseaux
préexistants). Sous l’influence des cytokines sécrétées lors de l’inflammation chronique, les
cellules présentes au niveau du site inflammatoire, telles que les macrophages, les cellules
dendritiques, les neutrophiles, les mastocytes et les fibroblastes, peuvent sécréter des facteurs
de croissance menant à la formation d’un réseau vasculaire lymphatique dense qui facilite la
libération de l’infiltrat inflammatoire [64-67]. Enfin, de nouveaux éléments soutiennent
également un rôle immuno-modulateur des vaisseaux lymphatiques [68]. Ces derniers
possèdent la capacité de sécréter différentes chémokines telles que la chémokine (C-C motif)
ligand 21 (CCL21) afin de réguler le recrutement des cellules présentatrices d’antigènes
jusqu’aux ganglions lymphatiques [69]. Une surexpression de CCL21 a également été
démontrée comme étant capable d’induire une polarisation de type Th2 de la réponse
inflammatoire et stimuler la croissance tumorale [70].
A ce jour, aucune description de la vascularisation lymphatique sous la zone de
transformation de cols sains n’a encore été détaillée.
15
Introduction
4. Carcinogenèse et évolution clinique
Le développement du cancer du col de l’utérus se caractérise par la présence d’une
phase asymptomatique pré-invasive au cours de laquelle les cellules infectées par un HPV
oncogène progressent en lésions intra-épithéliales. Dans un premier temps, des dysplasies
légères sont observées dans la partie inférieure de l’épithélium. Ces lésions, appelées lésions
intra-épithéliales de bas grade (LSIL : Low grade Squamous Intraepithelial Lesion) sont
caractérisées par de légères modifications de la forme et la de taille des cellules typiques
d’une infection par un HPV présent sous la forme d’épisome. Dans un second temps, celles-ci
progressent en lésions intra-épithéliales de haut grade (HSIL : High grade Squamous
Intraepithelial Lesion) caractérisées par la présence de dysplasies sévères dues à l’intégration
du génome HPV dans celui des cellules hôtes. Tout au long de la phase pré-invasive, les
cellules dysplasiques colonisent graduellement l’épithélium de surface à partir de la couche
basale jusqu’aux couches superficielles. L’étape ultime est la colonisation de la totalité
l’épithélium sur sa hauteur, lésion dénommée carcinome intra-épithélial de grade 3 (CIN3).
La phase pré-invasive est suivie par une phase invasive durant laquelle les cellules
tumorales colonisent progressivement le tissu sous-épithélial et disséminent à distance [71]. A
tout moment, les lésions pré-invasives et invasives peuvent être suggérées par cytologie de
frottis cervicaux, référées macroscopiquement par colposcopie et confirmées par biopsies
dirigées suivies d’une analyse histologique. Les cellules néoplasiques exhibent un rapport
nucléo-cytoplasmique accru, une condensation de la chromatine ainsi qu’une augmentation de
leur coloration (hyperchromasie) pouvant être visualisés à l’aide d’un microscope optique. La
présence de mitoses en excès peut également être détectée lors de l’analyse histologique.
4.1. Carcinogenèse
Le mécanisme physiopathologique menant à l’apparition de lésions cancéreuses est un
processus long pouvant s’étaler sur une période de 10 à 20 ans [72]. Celui-ci est le résultat
d’une infection persistance par un HPV oncogène (figure 10).
L’infection par un papillomavirus humain n’est pas un évènement rare. Il est estimé
qu’environ 75% de femmes seront atteintes au cours de leur vie sexuelle [73]. Chaque année,
cela représente près de 12% de la population mondiale [74, 75]. Néanmoins, dans la grande
majorité des cas, le virus est naturellement éliminé et seul 10 % des patientes présenteront une
16
Introduction
infection persistante après 2 ans [76]. A ce stade, le risque de développer une lésion cervicale
invasive reste encore limité. La plupart des lésions intra-épithéliales induites par un HPV
régressent spontanément et environ 10 à 20% des patientes présentant une infection
persistante développeront un carcinome intra-épithélial de grade 3 (CIN3) [77]. Enfin, seuls
30 à 40% de ces dernières évolueront en cancer [78].
Figure 10: Schéma représentant le risque de développer une infection persistante à un HPV oncogène ainsi
qu’une néoplasie cervicale. La partie gauche de la figure représente la proportion d’infections résolues
(clearance), qui persistent (persistence) ou qui progressent en CIN3 dans les 3 ans qui suivent la première
détection de l’HPV. La partie de droite représente la proportion de lésions CIN3 qui progressent en cancer dans
les 30 années qui suivent le diagnostic initial. Schéma adapté de Schiffman et al [72].
Le risque de développer un cancer du col de l’utérus dépend de différents facteurs
personnels et paramètres inhérents au virus HPV. Les plus importants sont le potentiel
oncogénique de l’HPV impliqué, l’intégration du génome viral au sein du génome humain
ainsi que l’âge de la patiente lors de l’infection [79].

Potentiel oncogénique : Comme présenté au point 2.1, une quinzaine d’HPV à haut
risque sont impliqués dans près de 95% des cancers du col de l’utérus et parmi eux, les
HPV-16 et 18 sont responsables de plus de 70% des cancers du col [9-11]. Le type
d’HPV influencera ainsi le risque de développer un cancer et sera le plus important
chez les patientes atteintes par un HPV16 ou 18.
17
Introduction

Intégration du génome viral : Au cours de la prolifération cellulaire, le génome viral,
initialement présent sous la forme d’épisome, s’intègre progressivement au génome
humain. Ce processus induit la stabilisation de l’expression des gènes codant pour les
oncoprotéines E6 et E7 menant ainsi à une augmentation de leur production.
L’apparition des caractères oncogéniques et de la progression tumorale dans les
cancers du col sont intimement associés à cette intégration du génome viral dans celui
de la cellule hôte [80].

Age : L’âge lors de la première relation sexuelle apparaît comme un facteur de risque
important de développer un cancer du col de l’utérus. L’état plus vulnérable du col
utérin chez les adolescentes est proposé comme une possible explication de cette
sensibilité accrue aux infections par un HPV [81]. Ainsi, la première infection par un
HPV apparaît généralement rapidement après le premier rapport sexuel et la
prévalence de patientes HPV positives se révèle la plus importante chez les jeunes
femmes âgées de moins de 24 ans [75]. De manière similaire, la prévalence de CIN2/3
est maximale chez les patientes âgées entre 20 et 29 ans [82]. Par conséquent, l’une
des caractéristiques majeure du cancer du col de l’utérus est qu’il peut affecter des
patientes jeunes, à partir d’une vingtaine d’années.
4.2. Les lésions précancéreuses
En fonction de la proportion de l’épithélium atteinte par les cellules dysplasiques, ces
lésions sont subdivisées de manière subjective en 3 grades : carcinomes intra-épithéliaux de
grade 1, 2 ou 3 (figure 11). Les carcinomes intra-épithéliaux de grade 1 (CIN1) sont
caractérisés par la présence d’un faible nombre de cellules néoplasiques dans le tiers inférieur
de l’épithélium. Quelques rares mitoses ainsi que de légères anomalies nucléaires sont
observées. Les CIN2 et 3 sont respectivement définis par la présence de cellules néoplasiques
dans les 2/3 et la totalité de l’épithélium. [83].
18
Introduction
Figure 11 : Progression des néoplasies intra-épithéliales. Lésions intra-épithéliales (A) CIN1, (B) CIN2 et (C)
CIN3. Les barres représentent la proportion d’épithélium envahi par les cellules néoplasiques. Une cellule en
cours de mitose est indiquée par une flèche.
4.3. Les lésions cancéreuses
4.3.1. Progression tumorale
4.3.1.1. Locale
L’étape subséquente à la colonisation de l’épithélium de surface est l’envahissement
du tissu sous-épithélial par les cellules néoplasiques. Pour ce faire, les cellules néoplasiques
acquièrent un phénotype migratoire au cours d’un processus appelé transition epithéliomésenchymateuse. Celle-ci se caractérise par une perte des protéines de jonctions
intercellulaires et une augmentation de la production de vimentine, filament intermédiaire du
cytosquelette conférant une flexibilité accrue aux cellules [84]. Parallèlement, une expression
intense de métalloprotéases matricielles (MMPs) par les cellules néoplasiques est observée.
Ces MMPs constituent une famille d’endopeptidases qui clivent les composants de la matrice
extracellulaire et induisent un remodelage ainsi qu’une dégradation de la matrice
extracellulaire afin de faciliter l’invasion du tissu par les cellules tumorales [85]. Dans les cas
de néoplasies cervicales, une expression intense de MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-14 et
MMP-15 est détectée tout au long de la progression tumorale [86].
Dans un premier temps, les cellules néoplasiques colonisent le tissu sous-épithélial
dans le sens de la profondeur et de la largeur menant à une déstructuration progressive de
l’architecture du col utérin. Par la suite, les lésions cancéreuses s’étendent au-delà du tissu
cervical, jusqu’aux organes périphériques. La partie supérieure du vagin ainsi que le
paramètre sont les premiers éléments à être atteints. Au fur et à mesure de la progression
19
Introduction
tumorale, les lésions progressent jusqu’à la paroi pelvienne avant de finalement accéder à la
muqueuse de la vessie et/ou du rectum [87].
4.3.1.2. A distance :
A tout moment, les cellules néoplasiques peuvent entrer en contact avec des vaisseaux
lymphatiques et/ou sanguins et disséminer jusqu’aux ganglions périphériques et organes à
distances. La formation de métastases à partir de carcinomes est un processus complexe qui se
déroule selon une cascade d’évènements impliquant l’intravasation des cellules tumorales à
l’intérieur d’un vaisseau sanguin ou lymphatique, leur survie au sein de la circulation
sanguine ou lymphatique, leur extravasation hors de la circulation et leur prolifération au
niveau de l’organe secondaire. Néanmoins, différentes études expérimentales, précliniques et
cliniques ont mis en évidence la vascularisation lymphatique comme la principale voie de
dissémination tumorale pour les carcinomes [88, 89].
Dans les cancers du col de l’utérus, la dissémination tumorale est un évènement
pouvant s’effectuer de manière précoce au cours de la progression cancéreuse et les ganglions
locorégionaux sont reconnus comme les premiers organes à développer des métastases [90].
Etant donné que plus de 90% des décès chez la totalité des patients atteints d’un cancer sont
dus à la présence de métastases, celle-ci apparaît comme une étape essentielle de la
progression tumorale [91]. Le statut ganglionnaire est d’ailleurs considéré en clinique comme
le facteur pronostique principal de survie sans récidive à 5 ans et est largement pris en
considération lors du choix de la stratégie thérapeutique à adopter [92, 93]. Actuellement, il
n’est cependant pas connu si la présence de métastases ganglionnaires se présente comme une
indication du transit des cellules qui disséminent ou si celle-ci accentue le risque de
dissémination à distance en fonctionnant comme une sorte de "base de lancement" à partir de
laquelle les cellules tumorales rejoignent la vascularisation sanguine [89, 94, 95].
4.3.2. Classification FIGO
La Fédération Internationale de Gynécologie Obstétrique (FIGO) est une organisation
mondiale qui regroupe des associations d’obstétriciens et de gynécologues parmi 125 pays. Sa
mission est de promouvoir le bien-être des femmes et d’améliorer les normes des pratiques
20
Introduction
standards dans les domaines de l’obstétrique et de la gynécologie. Dans ce contexte, elle a
notamment pour but de proposer un système de classification permettant de répertorier les
lésions néoplasiques du col utérin. En fonction de la taille et de l’extension tumorale, un stade
FIGO allant de 0 à IV est attribué. De manière conventionnelle, une distinction est réalisée
entre les cancers du col de stade débutant mesurant maximum 4 cm de grand axe (stades
FIGO IA – IB1) et les cancers du col de stade avancé présentant un grand axe tumoral
supérieur à 4 cm (stades FIGO IB2 – IV). Ce système de classification est largement utilisé
par les cliniciens afin de déterminer la stratégie thérapeutique à adopter. Il est également
régulièrement révisé afin de prendre en considération les dernières avancées réalisées dans ce
domaine. La classification FIGO faisant actuellement référence est détaillée dans le tableau 1
et présentée au niveau de la figure 12 [87].
Tableau 1 : Système de classification FIGO des cancers du col de l’utérus
Stade 0
Carcinome in situ, lésion intraépithéliale de Grade III.
Stade I
Carcinome strictement confiné au col de l’utérus.
Ia
Ib
Stade II
Stade III
Stade IV
Carcinome invasif ne pouvant être diagnostiqué que par microscopie. La profondeur de la lésion est de
maximum 5 mm et l’extension horizontale n’excède pas 7 mm. La profondeur d’invasion est calculée à
partir de la base de l’éptihélium squameux ou glandulaire initial. La présence d’emboles sanguins ou
lymphatiques ne doit pas modifier le stade alloué.
Ia1 L’invasion stromale mesurée n’excède pas 3 mm de profondeur et 7 mm d’extension
Ia2 L’invasion stromale mesurée est comprise entre 3 mm et 5 mm de profondeur avec une
extension qui n’excède pas 7 mm.
La lésion cervicale visible cliniquement est limitée au col de l’utérus.
Ib1
La lésion n’excède pas 4 cm de grand axe.
Ib2
La lésion mesure plus de 4 cm de grand axe.
Le carcinome cervical envahit le tissu au-delà de l’utérus, mais pas la paroi pelvienne ni jusqu’au
tiers inférieur du vagin.
IIa
Absence de lésions ayant débordées au niveau des paramètres.
IIa1 La lésion n’excède pas 4 cm de grand axe.
IIa2 La lésion mesure plus de 4cm de grand axe.
IIb
Présence manifeste d’envahissement des paramètres.
Le carcinome s’est étendu jusqu’à la paroi pelvienne. Lors de l’examen rectal, il n’y a pas d’espace
libre entre la tumeur et la paroi pelvienne. La tumeur envahit dans le tiers inférieur du vagin. Tous
les cas d’hydronéphrose ou de déficience rénale sont inclus, à moins que ceux-ci soient provoqués
par autre chose.
IIIa
La tumeur envahit le tiers inférieur du vagin, mais aucune extension pelvienne n’est observée.
IIIb
Extension de la tumeur jusqu’à la paroi pelvienne et/ou présence d’hydronéphrose ou de
déficience rénale.
Le carcinome s’est étendu au-delà du pelvis ou a atteint la muqueuse de la vessie ou du rectum.
IVa
Propagation de la tumeur jusqu’aux organes adjacents.
IVb
Propagation de la tumeur jusqu’à des organes distants.
21
Introduction
Figure 12 : Système de classification FIGO des cancers du col de l’utérus (symbolisé en jaune) en fonction de
leur taille et de l’extension tumorale. Schéma adapté de Quinn et al [87].
22
Introduction
La classification des néoplasies cervicales est basée sur une évaluation clinique de la
lésion. Les examens suivants peuvent être réalisés : la palpation, la colposcopie,
l’hystérescopie, l’urographie, la radiographie ainsi que la biopsie.
Dans le cas de lésions traitées par chirurgie, une analyse postopératoire des tissus
réséqués sera également systématiquement réalisée afin de préciser le diagnostic initial. Dans
ce cas, une seconde classification appelée TNM (Tumor – Nodal status – distant Metastasis)
est utilisée. Celle-ci permettra notamment d’informer le clinicien sur la présence/absence de
métastases ganglionnaires et/ou à distance, paramètres associés à un risque de récidive élevé.
Ceux-ci justifieront l’indication de thérapies postopératoires adjuvantes [87].
23
Introduction
III. Traitement
1. Lésions intra-épithéliales
Le traitement des lésions néoplasiques intra-épithéliales a pour objectif de prévenir
l’apparition de cancers du col invasifs. Celui-ci consiste soit en une destruction du tissu
affecté par cryothérapie ou vaporisation au laser (méthodes ablatives) soit en une résection de
la lésion avec des marges saines par conisation à froid ou à l’aide d’une hanse diathermique
(méthodes d’excision) [96]. Classiquement, une distinction entre les lésions CIN1 et CIN2-3
est réalisée. Les CIN1 sont des lésions fréquentes et une très grande majorité d’entres elles
régressent spontanément [72]. C’est pourquoi, seul un suivi des patientes est recommandé. Un
test du génome HPV tous les 12 mois ou un examen cytologique tous les 6 à 12 mois seront
néanmoins réalisés. Dans le cas où la lésion persiste toujours après 2 ans, un traitement de
celle-ci pourra être réalisé. Les CIN2 et 3 sont systématiquement traités. Un suivi des
patientes après le traitement est nécessaire au cours duquel un test du génome HPV tous les 6
à 12 mois est recommandé avec une colposcopie réalisée en cas de positivité. Dans tous les
cas (CIN1, 2 et 3), si le test du génome HPV est négatif ou si la cytologie est négative 2 fois
consécutives, un retour aux recommandations standards du screening est recommandé [97].
Il est estimé que le taux de réussite du traitement des néoplasies intra-épithéliales
cervicales 12 mois est compris entre 85 et 95% à [98]. Des troubles de la fertilité avec un
risque d’accouchement prématuré, des fausses couches tardives et un risque accru de mortalité
périnatale pour les grossesses futures lui sont néanmoins associés [99, 100]. Par conséquent,
deux catégories de personnes ne sont pas soumises aux "guidelines" présentés ci-dessus : les
adolescentes et jeunes femmes ainsi que les femmes enceintes. Pour celles-ci, dans la mesure
du possible, un suivi sera préféré au traitement [97].
2. Lésions cancéreuses
Idéalement, une monothérapie sera proposée pour le traitement des lésions cancéreuses
du col utérin. Ce dernier peut être réalisé soit par chirurgie, soit par radiothérapie. Le choix de
la stratégie à adopter sera déterminé en fonction du stade FIGO. De manière conventionnelle,
24
Introduction
les cancers du col de stade débutant (Stade FIGO ≤ IB1) sont traités par chirurgie. Un
traitement adjuvant postopératoire est également administré aux patientes présentant un risque
élevé de récidive. Dans la mesure du possible, l’association de ces deux procédures sera
cependant évitée. Les cas de cancers du col de stade avancé (Stade FIGO > IB1), présentent
un risque important d’une indication d’un traitement adjuvant postopératoire [90]. Pour cette
raison, ces lésions sont traitées directement par radiochimiothérapie concomitante [101].
Dans le cadre de ce travail, nous nous intéresserons exclusivement aux cancers du col
de stade débutant.
2.1. Plan thérapeutique
2.1.1. Traitement de la tumeur primaire : Hystérectomie
Le traitement chirurgical des cancers du col de stade débutant consiste en une
hystérectomie radicale élargie. Au cours de cette intervention, une ablation de l’utérus ainsi
que de la partie supérieure du vagin est réalisée dans le but de réséquer la tumeur primaire.
Afin de garantir des marges de sécurité péritonéales, une excision des régions latérales,
antérieure et postérieure par rapport au col utérin est également accomplie (figure 13). Les
différentes structures anatomiques généralement impliquées lors de cette intervention sont les
suivantes (figures 13 et 14) : (1) les fosses rétropéritonéale, paravésicale et pararectale
jusqu’au planché pelvien ; (2) les ligaments utéro-sacrés, cardinaux, vésico-utérins et vésicovaginal ; (3) les uretères ; (4) les paramètres jusque la paroi pelvienne ; (5) et bien entendu
l’utérus et la partie supérieure du vagin comme précédemment mentionné [102, 103].
Depuis la publication des premières méthodes chirurgicales mises au point à partir de
larges séries de patientes, plusieurs procédures d’hystérectomies élargies présentant des
niveaux de radicalité différents ont été décrites et appliquées. En 2008, un nouveau système
de classification des hystérectomies radicales a été proposé par Querleu et Morrow avec pour
objectif de standardiser la procédure chirurgicale. Celle-ci est aujourd’hui largement acceptée
pour le traitement des cancers du col de l’utérus [104]. Quatre types de résections par
hystérectomie ont été décrites en fonction de l’extension latérale de la résection à réaliser :
Hystérectomie élargie de type A : Une résection minimale des régions latérales ainsi
que de la partie supérieure du vagin (généralement 10 mm) est réalisée. Les ligaments utéro25
Introduction
sacrés et vésico-utérins ne sont, quant à eux, pas sectionnés à distance de l’utérus. Cette
intervention permet de réséquer le col utérin tout en évitant l’apparition de lésions mécaniques
au niveau de l’uretère ainsi que des troubles de la circulation sanguine au niveau de la partie
terminale de l’uretère. Elle est principalement indiquée pour le traitement des lésions
néoplasiques mesurant moins de 2 cm présentant un faible risque d’extension tumorale au
niveau de la région para-cervicale.
Hystérectomie élargie de type B : Au cours de cette intervention, les ligaments utérosacrés et vésico-utérins sont partiellement sectionnés. L’uretère est également découvert et
glissé latéralement afin de permettre la section de la région para-cervicale au niveau du tunnel
utérin. Les éléments nerveux postérieurs et profonds de la région para-cervicale ne sont pas
épargnés. Finalement, au moins 10 mm de la partie supérieure du vagin sont réséqués. Cette
intervention est indiquée pour le traitement des patientes atteintes d’un cancer du col de
l’utérus de stades 1A2 et 1B1 mesurant moins de 2 cm d’invasion.
Hystérectomie élargie de type C : Une section des ligaments utéro-sacrés et vésicoutérins est respectivement réalisée au niveau du rectum et de la vessie. L’uretère est mobilisé
complètement et 15-20 mm de la partie supérieure du vagin sont réséqués. Cette intervention
est indiquée pour le traitement des patientes atteintes d’un cancer du col de l’utérus mesurant
plus de 2 cm.
Hystérectomie élargie de type D : Au cours de cette intervention, la totalité de la
région para-cervicale est réséquée jusqu’à la paroi pelvienne et le long des vaisseaux du
plexus hypogastrique induisant l’exposition de la racine du nerf sciatique. Cette intervention
est rare et principalement indiquée lors d’une exentération pelvienne.
26
Introduction
Figure 13 : Représentation schématique d’une coupe transversale du pelvis chez la femme au niveau de la 1ère
vertèbre sacrale. Les zones d’extensions chirurgicales antérieure, postérieure et latérales sont respectivement
indiquées en mauve, bleu et vert.
Figure 14 : Vue ventrale des différentes
structures
impliquées
lors
de
l’hystérectomie élargie : (1) incision
vaginale, (2) ligament vésico-utérin, (3)
ligament vésico-vaginal (4) l’uretère, (5)
paracervix, (6)
zone d’insertion du
paramètre, (7) paramètre, (8) artère
utérine.
27
Introduction
2.1.2. Stadification ganglionnaire
Le statut ganglionnaire (présence/absence de métastases ganglionnaires) représente le
facteur pronostique de survie sans récidive à 5 ans le plus fiable chez les patientes atteintes
d’un cancer du col utérin [93, 105]. Celui-ci est couramment utilisé par les cliniciens afin de
guider le choix d’une thérapie adjuvante postopératoire [92].
L’importance pronostique du statut ganglionnaire justifie la raison pour laquelle une
stadification ganglionnaire est actuellement systématiquement réalisée chez les patientes
atteintes d’un cancer du col de stade débutant. Pour ce faire, une lymphadénectomie pelvienne
est classiquement associée à l’hystérectomie radicale élargie dans un but uniquement
diagnostic. Celle-ci consiste en une résection des ganglions lymphatiques localisés au niveau
des régions iliaque commune, iliaque externe, inter-iliaque et paramétriales (figure 15).
L’analyse histologique postopératoire des ganglions lymphatiques réséqués permet de préciser
le diagnostic en mettant en évidence les patientes présentant un risque élevé de récidive (statut
ganglionnaire positif) et chez qui un traitement adjuvant apparait indiqué.
Figure 15 : Illustration des principaux ganglions lymphatiques pelviens et para-aortiques. Seuls les ganglions
lymphatiques localisés au niveau des régions iliaque commune, iliaque externe, inter-iliaque et paramétriales
sont réséqués. Schéma provenant de Yeong et al [106].
28
Introduction
2.2. Traitements adjuvants
Un traitement adjuvant de radiothérapie pelvienne postopératoire visant à améliorer les
chances de réussite du traitement est proposé aux patientes présentant un risque de récidive
élevé. Il est principalement déterminé par l’analyse histologique postopératoire des ganglions
lymphatiques (cfr chapitre III, point 2.1.2.). Près de la moitié des échecs du traitement
chirurgical sont également détectés chez les patientes ne présentant pas de métastases
ganglionnaires visibles lors de l’examen histologique [105, 107, 108]. Dans ce contexte, les
cliniciens ont mis en évidence plusieurs facteurs de risque de récidive pouvant être analysés à
partir de la tumeur primaire : le volume tumoral, la profondeur d’invasion ainsi que la
présence de cellules tumorales à l’intérieur de la lumière des vaisseaux lymphatiques
("LymphoVascular Space Invasion", LVSI) [109]. Sedlis et al ont démontré que
l’administration d’une radiothérapie adjuvante postopératoire chez des patientes présentant au
moins 2 des ces paramètres permet de réduire de 47% le risque de récidive à 2 ans [110].
Cependant, en raison d’une morbidité thérapeutique à court et long terme accrue, l’association
de la radiothérapie et de la chirurgie est si possible évitée [111].
Un graphique de la stratégie thérapeutique actuellement adoptée est présenté ci-après
(figure 16). Il est estimé que le traitement des cancers du col de stade débutant permet
d’atteindre un taux de survie sans récidive à 5 ans de l’ordre de 85% [109].
Cancer du col de stade débutant
Hystérectomie radicale
Lymphadénectomie pelvienne
Ganglions négatifs
Ganglions positifs
Radiothérapie / chimiothérapie
Faible risque
Risque élevé :
LVSI / Profondeur de l’invasion
Diamètre tumoral
Follow up
Radiothérapie adjuvante
Figure 16 : Protocol standard pour la gestion des carcinomes du col utérin de stade débutant. LVSI est
l’abréviation de "LymphoVascular Space Invasion". Schéma provenant de Kridelka et al [112].
29
Introduction
2.3. Morbidité thérapeutique
La radicalité des techniques chirurgicales et de la radiothérapie, la proximité du col de
l’utérus par rapport à certains organes tels que la vessie ou l’intestin ainsi que la rupture de
l’intégrité du système lymphatique sont associés à une morbidité thérapeutique pouvant
affecter la qualité de vie des patientes [113, 114]. Celle-ci peut se présenter sous la forme
d’une morbidité thérapeutique "non lymphatique", relative à l’hystérectomie radicale élargie,
d’une morbidité thérapeutique "lymphatique", relative à la lymphadénectomie et/ou d’une
morbidité cumulée en cas de radiothérapie adjuvante postopératoire [111].
2.3.1. Morbidité thérapeutique "non lymphatique"
Des troubles fonctionnels et sexuels sont les principales complications liées au
traitement par hystérectomie radicale élargie. Ceux-ci sont le résultat de dommages réalisés au
niveau des plexus nerveux pelviens lors de cette intervention [115, 116]. Ils se manifestent
sous la forme d’atonie vésicale, de constipations, d’obstruction intestinale (troubles
fonctionnels) ainsi que sous la forme de douleurs lors des rapports sexuels et des difficultés à
atteindre l’orgasme (troubles sexuels). Il est estimé que respectivement 9 à 18% et 22% des
patientes traitées par chirurgies développeront des dysfonctions urinaires, intestinales et du
rectum ainsi que des troubles sexuels dans les 2 ans [117, 118].
2.3.2. Morbidité thérapeutique "lymphatique"
La rupture de l’intégrité de la chaine ganglionnaire pelvienne mène à la formation de
lymphœdèmes. Ces derniers se caractérisent par une accumulation de fluide interstitiel au
niveau des membres inférieurs ainsi que par un risque de réaction inflammatoire locale
pouvant induire une détérioration des tissus. Cette pathologie est jusqu'à présent incurable et
affecte de manière importante la qualité de vie des patientes. Seul un drainage régulier des
liquides accumulés au niveau des tissus permettra de limiter l’expansion du lymphœdème
[119]. Il est estimé qu’un lymphœdème des membres inférieurs est diagnostiqué chez plus de
12% des patientes traitées pour un cancer du col de stade débutant dans les 5 ans qui suivent
la chirurgie [120].
30
Introduction
2.3.2. Morbidité cumulée
En 1997, la morbidité thérapeutique obtenue après une chirurgie radicale et celle
obtenue après une chirurgie radicale associée à une radiothérapie adjuvante ont été comparées
par Landoni et al [111]. A la suite de cette étude, une morbidité thérapeutique accrue à cours
et long terme a été démontrée lorsqu’une radiothérapie adjuvante postopératoire est
administrée. La proportion de patientes ayant développé une hydrourétéronéphrose, un
œdème des membres inférieurs ainsi que diverses complications vésicales et rénales telles que
la cystite actinique, l’incontinence et l’hyperpression rénale s’est avérée plus importante chez
les patientes ayant reçu de la radiothérapie adjuvante postopératoire. Par conséquent,
l’association de la radiothérapie et de la chirurgie doit si possible être évitée.
2.4. Contrôle de la morbidité thérapeutique
Conscient de la morbidité associée au traitement des patientes atteintes d’un cancer du
col de stade débutant, les cliniciens et les chercheurs se sont focalisés au cours de ces
dernières années sur l’étude de nouveaux moyens qui permettraient de proposer une
dégressivité de la radicalité des traitements actuels. Jusqu’à présent, trois grandes voies de
réflexion ont été investiguées : l’utilisation d’une chirurgie plus conservatrice lors de la
résection tumorale, la technique du ganglion sentinelle ainsi que la recherche de marqueurs
tumoraux permettant d’identifier de manière précoce les patientes présentant un risque de
récidive élevé.
2.4.1. Chirurgie conservatrice
Une grande partie de la morbidité associée au traitement chirurgical des lésions
cancéreuses du col utérin est due à la dissection du paramètre contenant les fibres nerveuses
autonomes qui contrôlent la vessie, l’intestin et les fonctions sexuelles. Afin de limiter
l’apparition de ces complications, la réalisation d’un traitement chirurgical avec préservation
nerveuse ainsi qu’une réduction de la radicalité de la chirurgie ont été proposés :
Le principe de préservation nerveuse : Au début des années 1960, Kobayashi et al
furent les premiers à proposer une modification de la procédure chirurgicale visant à obtenir
31
Introduction
une amélioration postopératoire de la fonction vésicale [121]. Cette méthode était basée sur
une préservation des nerfs splanchniques impliqués dans l’innervation de l’utérus et de la
vessie. Depuis lors, des progrès ont été réalisés dans la caractérisation anatomique des nerfs
des plexus autonomes pelviens [122-124]. Ceux-ci ont mené à une adaptation des techniques
chirurgicales visant à préserver au maximum les nerfs des plexus pelviens lors de la résection
de la lésion cancéreuse [125-127]. Actuellement, la nouvelle classification des procédures
d’hystérectomies radicales décrite par Querleu et Morrow prend en considération les
techniques de préservation nerveuses [104].
Réduction de la radicalité de la chirurgie : Plusieurs études ont démontré que chez les
patientes atteintes d’un cancer du col de stade débutant et présentant un risque de récidive
faible (diamètre tumoral n’excédant pas 2 cm et absence d’emboles lymphatiques), une
infiltration du paramètre est observée dans moins de 1 % des cas [128-132]. Par conséquent,
la réalisation d’une chirurgie moins radicale que l’hystérectomie élargie est suggérée chez ces
patientes. Jusqu’à présent, différents travaux rétrospectifs soutiennent que la réalisation d’une
conisation large [133-135], d’une trachélectomie [133, 136-138] ou d’une hystérectomie
vaginale [139] représentent des alternatives à l’hystérectomie. Une étude clinique prospective
dont l’objectif est de comparer la faisabilité et l’intérêt de la réalisation d’une hystérectomie
simple, qui consiste à réséquer l’utérus et le col utérin sans disséquer le paramètre,
comparativement à l’hystérectomie élargie est actuellement en phase de test [140].
2.4.2. Agressivité associée à la lymphadénectomie
Le statut ganglionnaire ne peut être négligé en raison de sa valeur pronostique
importante sur le risque de récidive à 5 ans [93]. Il justifie la raison pour laquelle une
lymphadénectomie pelvienne est systématiquement réalisée chez les patientes atteintes d’un
cancer du col de l’utérus de stade débutant. Cependant, il apparait que seulement 15-20%
d’entres elles présenteront réellement une métastase ganglionnaire diagnostiquée lors de
l’examen histologique postopératoire [105, 141]. Une grande majorité des patientes
actuellement traitées par chirurgie sont par conséquent soumises à une résection importante
du système lymphatique associée à un risque de développer des complications pouvant
affecter la qualité de vie (lymphœdème, infections tissulaires) alors que cette intervention
aurait pu être évitée. Afin de réduire l’agressivité associée à la chirurgie de la chaine
ganglionnaire, la technique du ganglion sentinelle à été proposée.
32
Introduction
Le ganglion sentinelle est défini comme le premier ganglion lymphatique atteint après
drainage du fluide interstitiel provenant de la tumeur primaire [142]. Il se présente comme le
premier site locorégional au niveau duquel une métastase peut théoriquement se développer
après dissémination par voie lymphatique et son statut (présence/absence de métastases
ganglionnaires) est supposé représenter l’état des autres ganglions localisés en aval. Ce
ganglion peut être facilement détecté par cœlioscopie après par injection au niveau du stroma
cervical d’un colloïde marqué par le radioélément
99m
Tc (technétium) et/ou d’une solution
colorée en bleu (bleu d’isofluran ou de méthylène) (figure 17) [143]. Cette technique, a
jusqu’à présent été utilisée avec succès dans le management des cancers du sein [144] et du
mélanome [145] et a permis de limiter de manière significative les complications
postopératoires associées à une lymphadénectomie systématique.
Figure 17 : Mise en évidence du ganglion sentinelle à l’aide d’une solution colorée en bleu.
Cette technique du ganglion sentinelle est également proposée pour l’évaluation du
statut ganglionnaire chez les patientes atteintes d’un cancer du col utérin de stade débutant.
Des études préliminaires rapportent une sensibilité dans la détection du ganglion sentinelle
avoisinant les 98% après injection de colorant et de colloïde radioactif [146], avec près de
85% d’entres eux localisés dans le pelvis [147], ainsi qu’une valeur prédictive négative de
près de 100% [148-152]. Actuellement, une étude multicentrique de phase III est également en
cours de test. L’objectif principal de cet essai est d'évaluer la méthode du ganglion sentinelle
chez des patientes ayant un cancer précoce du col utérin comparativement à la
lymphadénectomie pelvienne classique [153].
33
Introduction
2.4.3. Diminution du risque de morbidité associée au traitement combiné
L’association de la chirurgie radicale et de la radiothérapie doit si possible être évitée
en raison du taux élevé de morbidité aigue et chronique observé [111]. Dès lors, il apparaît
fondamental de parvenir à identifier de manière précoce les patientes présentant un risque de
récidive défavorable et pour lesquelles la chirurgie pourrait être délaissée au profit d’une
radiothérapie unique dans le but d’éviter l’apparition d’une morbidité cumulée.
Depuis la mise en évidence d’une dissémination préférentielle des cellules
néoplasiques par la voie lymphatique [88, 89], il est suggéré que l’analyse histologique du
réseau vasculaire lymphatique tumoral permettrait de détecter, à partir de la tumeur primaire,
les patientes présentant un risque élevé versus faible d’extension ganglionnaire [154, 155].
Dans ce contexte, la présence d’emboles lymphatiques au niveau de la tumeur primaire a déjà
été démontrée pour être corrélée à une agressivité tumorale accrue [93]. Ce paramètre est
d’ailleurs pris en considération lors du choix de la stratégie thérapeutique à adopter [110]. Au
cours de ces dernières années, la recherche s’est ainsi focalisée sur la compréhension des
mécanismes impliqués dans la dissémination des cellules tumorales ainsi que sur la mise en
évidence de nouveaux paramètres pronostiques d’extension ganglionnaire au niveau de la
tumeur primaire. Le chapitre suivant est consacré à ces deux éléments.
34
Introduction
IV. Dissémination Tumorale
1. Dissémination lymphatique
Au cours de ces dernières années, plusieurs mécanismes impliqués dans la
dissémination des cellules cancéreuses via le système lymphatique ont été étudiés.
Actuellement, même si la totalité de ces mécanismes n’a pas été complètement élucidée, il
apparait que la structure des vaisseaux lymphatiques, le flux, la sécrétion de chémoattractants,
ainsi que la lymphangiogenèse tumorale, joueraient un rôle important [156].
1.1. La vascularisation lymphatique
1.1.1. Structure et fonctions
Le système lymphatique est présent dans de nombreux tissus à l’exception du système
nerveux central, de la moelle osseuse, de la rétine ainsi que des tissus cartilagineux
avasculaires [89]. Sa fonction principale consiste à maintenir l’homéostasie du fluide
tissulaire. L’excès d’eau ainsi que les macromolécules délivrées par les vaisseaux sanguins au
sein du tissu interstitiel sont drainés par les capillaires lymphatiques et redistribués dans la
circulation sanguine au niveau du canal thoracique et du conduit lymphatique droit. Le réseau
lymphatique joue également un rôle important dans la réponse immunitaire adaptative. Il est
impliqué dans le transport des cellules présentatrices d’antigènes jusqu’aux ganglions
lymphatiques présents tout au long du parcours de la lymphe, permettant ainsi l’activation des
lymphocytes naïfs résidents. Finalement, les lipides alimentaires sont collectés par les
vaisseaux lymphatiques au niveau des villosités intestinales et transportés sous forme de
chylomicrons [63, 157].
Le système lymphatique se distingue du système vasculaire entre autres par différents
aspects structurels. Il débute par un réseau vasculaire unidirectionnel composé de capillaires
étroits (30-80 µm de diamètre) dont l’extrémité se termine en cul-de-sac (figure 18A) [158].
Contrairement aux capillaires sanguins, ces vaisseaux sont délimités par une paroi dépourvue
de membrane basale continue et composée d’une seule couche de cellules endothéliales
lymphatiques directement liées à la matrice extracellulaire par des filaments d’ancrage [159].
35
Introduction
Lors d’une augmentation de la pression du liquide interstitiel, les forces appliquées sur les
filaments d’ancrage induisent l’ouverture des vaisseaux lymphatiques et le drainage du liquide
tissulaire (figure 18B) [160].
Figure 18 : Organisation de la vascularisation lymphatique. (A) La vascularisation lymphatique est parallèle à la
vascularisation sanguine et draine le fluide interstitiel. Les flèches représentent le sens de la circulation des
fluides. (B) Coupe transversale d’un vaisseau lymphatique. Lors d’une augmentation de la pression interstitielle,
la pression exercée sur les filaments d’ancrage induit la formation d’espaces entre les cellules endothéliales
lymphatiques et permet de drainage du fluide interstitiel et des macromolécules. (C et D) Représentation
schématique des jonctions intercellulaires lymphatiques. (C) Les vaisseaux lymphatiques distaux présentent des
"button-like junctions" tandis que les cellules endothéliales des vaisseaux collecteurs sont reliées entres elles par
des jonctions continues appelées "zipper–like junctions". (D) Les "button-like junctions" sont localisées à la base
des interdigitations et sont majoritairement constituées de VE-cadhérine (rouge). Les prolongements cellulaires
(vert) se superposent et forment des systèmes de clapet qui permettent l’entrée des cellules et du fluide
interstitiel. Schéma adapté de Schulte-Merker et al [161] et Baluk et al [162].
Les cellules endothéliales lymphatiques présentent des prolongements cellulaires qui
se chevauchent (interdigitations) et sont connectées entre elle par des jonctions intercellulaires
particulières appelées "button-like junctions" (figure 18C) [162]. Ces structures sont
36
Introduction
principalement composées de VE-cadhérine, claudine-5, ESAM et JAM-A et sont uniquement
présentes qu’à la base des interdigitations (figure 18D). Au-delà, les prolongements cellulaires
sont dépourvus de jonctions et présentent une structure similaire à un "clapet". Cette
organisation particulière observée au niveau des capillaires lymphatiques permet le drainage
du liquide interstitiel et l’intravasation des cellules tout en conservant l’intégrité des
vaisseaux. Finalement, les capillaires drainent la lymphe vers les canaux pré-collecteurs et
collecteurs. A l’inverse des capillaires, ces derniers présentent une paroi composée de cellules
endothéliales connectées par des jonctions continues appelées "zipper-like junction" assurant
une cohésion intercellulaire élevée. Ces vaisseaux présentent également une fine couche de
cellules musculaires lisses ainsi qu’un système de valves assurant un transfert unidirectionnel
de la lymphe vers les ganglions lymphatiques.
La structure des vaisseaux lymphatiques, ainsi que la composition de la lymphe,
permettraient d’expliquer en partie la dissémination préférentielle par voie lymphatique. En
effet, l’absence de membrane basale continue et le faible nombre de jonctions intercellulaires
cellulaires faciliteraient l’intravasation des cellules tumorales dans les capillaires
lymphatiques. De plus, ces dernières présenteraient un taux de survie accru lorsqu’elles
transitent par le système lymphatique. Ceci serait dû à la présence d’un débit plus faible
associé à une réduction du stress cellulaire induit par des forces de cisaillement ainsi qu’à une
concentration plus importante d’acide hyaluronique, molécule aux propriétés antiapoptotiques [163, 164].
1.1.2. Flux et dissémination passive
Au cours de la croissance tumorale, la formation d’un réseau vasculaire sanguin
immature en réponse à une production intense de facteurs de croissance angiogènes par les
cellules en hypoxie, provoque une exsudation importante de liquide [165, 166]. Cette hyperperfusion du tissu cancéreux génère une augmentation de la pression du liquide interstitiel et
provoque l’ouverture des "button-like junctions" des vaisseaux lymphatiques suite aux forces
appliquées sur les filaments d’ancrage [167]. Ce mécanisme a pour objectif de drainer
l’excédent de liquide afin de réguler l’homéostasie tissulaire, principale fonction du système
lymphatique. Cependant, le flux généré entre la tumeur et les vaisseaux périphériques peut
également emporter les cellules tumorales et permettre leur translocation passive dans la
lumière des vaisseaux lymphatiques [168].
37
Introduction
1.2. Chémokines
Les vaisseaux lymphatiques sont les principaux conduits par lesquels les cellules
présentatrices d’antigènes transitent pour se rendre dans les ganglions et les organes
lymphoïdes secondaires. Ils permettent de libérer les tissus enflammés des leucocytes une fois
que ceux-ci ne sont plus nécessaires pour la circonscription du pathogène ou tout autre type
d’agression [89]. Ces mécanismes nécessitent le guidage des cellules inflammatoires vers les
vaisseaux lymphatiques afférents. Pour ce faire, les cellules endothéliales sont capables de
synthétiser différentes molécules chémoattractives qui interagissent avec les leucocytes et
induisent leur migration vers les vaisseaux. Notamment, les cellules dendritiques activées, de
même que les lymphocytes T et B qui expriment le récepteur CCR7 sont recrutées par les
cellules endothéliales lymphatiques suite à une production des chémokines CCL21 et CCL19
par ces dernières [69]. Un effet similaire est également observé lors de l’interaction de CCL12
avec son récepteur correspondant CXCR4 exprimé par les cellules dendritiques [169].
Finalement, d’autres chémokines peuvent être impliquées dans le recrutement des cellules
inflammatoires telles que CXCL1, CCL2, CCL5, CCL20, CXCL2, CXCL5, CXCL9,
CXCL10, CXCL13, et CXCL1 [170]. Des mécanismes similaires ont été décrits entre les
cellules endothéliales lymphatiques et les cellules tumorales et semblent jouer un rôle non
négligeable dans les processus de dissémination vers les ganglions locorégionaux. Une
expression importante des récepteurs CCR7 et/ou CXCR4 par les cellules tumorales dans les
cas de cancers du col de l’utérus a notamment été corrélée à la présence de métastases
ganglionnaires [171, 172]. Les cellules endothéliales lymphatiques apparaissent capables
d’attirer les cellules tumorales vers les vaisseaux et seraient ainsi en partie responsables de
leur dissémination préférentielle via le système lymphatique [173-175] (figure 19).
Figure
19 :
Chémoattraction
des
cellules tumorales par les cellules
endothéliales
lymphatiques
qui
produisent du CCL21. Le drainage du
fluide interstitiel par les vaisseaux
lymphatiques génère un gradient de
chémokines qui favorise la migration
des cellules tumorales vers la paroi
des vaisseaux lymphatiques. Schéma
provenant de Shields et al [174].
38
Introduction
1.3. Lymphangiogenèse : progression et dissémination tumorale
1.3.1. Lymphangiogenèse
La lymphangiogenèse est initialement un processus embryonnaire au cours duquel un
réseau lymphatique complexe est formé à partir d’une réserve de cellules endothéliales
lymphatiques primaires [119]. Chez l’adulte, la lymphangiogenèse est intimement liée à des
processus physiopathologiques tels que la cicatrisation, l’inflammation chronique et le rejet
d’allogreffes [155]. L’expression de facteurs lymphangiogéniques par les macrophages et les
granulocytes en réponse aux cytokines pro-inflammatoires sécrétées dans ces conditions
induisent la formation de nouveaux capillaires lymphatiques à partir de vaisseaux préexistants
[64].
L’activation du récepteur Vascular Endothelial Growth Factor (VEGFR)-3 par les
facteurs de croissances VEGF-C et VEGF-D représente la principale voie de stimulation de la
lymphangiogenèse tumorale [176-178]. Ceux-ci induisent une prolifération, une migration
ainsi qu’une augmentation de la survie des cellules endothéliales lymphatiques, mécanismes
requis pour la formation de nouveaux vaisseaux lymphatiques [179]. A l’inverse, l’inhibition
de l’action des VEGF-C et VEGF-D à l’aide de protéines de fusion ou d’anticorps bloquants
dirigés contre le récepteur VEGFR-3 empêche la régénération du réseau lymphatique chez des
souris adultes [180, 181]. Dans une moindre mesure, la lymphangiogenèse peut également
être activée suite à l’interaction de ces facteurs de croissance ainsi que le VEGF-A avec le
récepteur VEGFR-2 [182, 183]. Finalement, d’autres facteurs de croissance tels que le
Fibroblast Growth Factor-2 (FGF-2), les Insuline-like Growth factors (IGF-1 et IGF-2),
l’Hepatocyte Growth Factor (HGF), le Platelet-Derived Growth Factor BB (PDGF-BB) ainsi
que l’angiopoétine-1 (Ang-1) induisent également la formation de nouveaux vaisseaux
lymphatiques. Cependant, leurs mécanismes d’action apparaissent secondaires aux effets des
VEGF-C et VEGF-D sur les cellules endothéliales [119]. Un schéma reprenant les différents
facteurs lymphangiogiogènes est présenté au niveau de la figure 20.
39
Introduction
Figure 20 : Schéma des différents facteurs lymphangiogènes et de leurs récepteurs correspondants. Schéma
provenant de Van de Auwera et al [184].
1.3.2. Progression tumorale
De récents travaux suggèrent un rôle immuno-modulateur de certains facteurs
exprimés
lors
de
la
lymphangiogenèse
pouvant
mener
à
l’établissement
d’un
microenvironnement propice au développement cancéreux. Une surexpression de VEGF-C a
été associée à une infiltration accrue de lymphocytes T régulateurs, cellules impliquées dans
le maintien d’une immunotolérance, ainsi qu’à une réduction de lymphocytes T cytotoxiques
au sein de la tumeur, dans un modèle murin de mélanome. A l’inverse, une augmentation de
l’infiltration de celle-ci par les lymphocytes T cytotoxiques ainsi qu’une réduction de la
croissance tumorale a été mise en évidence lorsque l’expression du VEGF-C est inhibée
[185]. Dans un modèle murin de cancer de la peau induit par l’application d’un agent
chimique, l’inhibition des VEGF-C et D provoque une réduction du recrutement de cellules
inflammatoires, principalement des macrophages, et de la sécrétion de TNF-α sous les lésions
pré-invasives [186]. Une réduction du nombre de lésions intra-épithéliales et invasives s’étant
développées par souris ainsi qu’un retard dans le développement de lésions cancéreuses sont
également observés. Parallèlement, d’autres études ont démontré l’existence d’une
lymphangiogenèse au sein du ganglion sentinelle qui précède la dissémination tumorale et
certaines d’entres elles suggèrent un rôle des cellules endothéliales lymphatiques dans le
40
Introduction
développement d’une niche prémétastatique favorable au développement de métastases [187190]. Ensemble, ces études soutiennent l’existence d’un lien étroit entre la vascularisation
lymphatique et la progression tumorale.
1.3.3. Dissémination tumorale
L’implication de la lymphangiogenèse dans les mécanismes de dissémination tumorale
a été démontrée dans différents modèles expérimentaux. Notamment, une surexpression des
facteurs de croissance VEGF-C et VEGF-D par les cellules tumorales et du
microenvironnement tumoral provoque une lymphangiogenèse tumorale accrue ainsi qu’une
augmentation de l’incidence des métastases ganglionnaires dans des modèles de xénogreffes
de cellules tumorales mammaires [191-194], pulmonaires [195] et des cas de cancers
pancréatiques [196, 197]. A l’opposé, l’inactivation de la voie de signalisation du VEGFR-3 à
l’aide d’anticorps bloquants, de protéines de fusion, d’inhibiteurs des protéines kinases, de
siRNA ou encore chez des souris déficientes en VEGF-D induit une diminution importante de
l’incidence de métastases ganglionnaires [193, 195, 197-201]. Egalement, parmi les facteurs
lymphangiogènes secondaires, l’inhibition de l’action des IGF-1, PDGF-BB et VEGF-A
diminue de manière significative le risque d’extension au niveau des ganglions périphériques
[202-205]. Enfin, une diminution de la lymphangiogenèse tumorale, ainsi qu’une réduction de
60% de l’incidence de métastases ganglionnaires sont également observées dans un modèle
murin de carcinome cervical en condition hypoxique après inhibition du VEGF-C et de son
récepteur VEGFR-3 [206]. La dissémination tumorale observée après activation de la
lymphangiogenèse apparait principalement assurée par les vaisseaux lymphatiques péritumoraux. En effet, les vaisseaux lymphatiques intra-tumoraux peuvent présenter un manque
de fonctionnalité due à une augmentation de la pression intratumorale qui provoque leur
compression [193, 196].
Dans ce contexte, il est supposé qu’une augmentation du nombre de vaisseaux
péritumoraux au cours de la progression tumorale serait à l’origine d’un risque accru de
pénétration d’une cellule tumorale dans la vascularisation lymphatique et d’une dissémination
vers les ganglions locorégionaux. Parmi l’ensemble des mécanismes présentés ci-dessus, la
lymphangiogenèse tumorale est actuellement considérée comme l’évènement central
prédisposant au développement de métastases ganglionnaires [156].
41
Introduction
2. Cancer cervical : lymphangiogenèse et densité en
vaisseaux lymphatiques
Au cours de la physiopathologie cancéreuse du col utérin, la présence d’une
lymphangiogenèse activée de manière précoce, déjà à des stades pré-invasifs, est décrite.
Celle-ci a également été démontrée comme étant continuellement activée au fur et à mesure
de la progression tumorale et semble associée à une augmentation progressive du risque de
dissémination tumorale par voie lymphatique et de métastases au niveau des ganglions
périphériques (Tableau 2).
Différentes études réalisées sur des biopsies de néoplasies cervicales humaines
révèlent la présence d’une expression génique et protéique importante de VEGF-C et VEGFD dans des lésions CIN2/3 tandis que ceux-ci ne sont pas produits dans un tissu sain [207209]. Des niveaux élevés de ces facteurs de croissance sont également maintenus dans des
lésions invasives de cancers du col de stade débutant. Ceux-ci ont été associés à la présence
d’une vascularisation lymphatique tumorale dense ainsi qu’à à la présence de métastases
ganglionnaires [207, 210-213]. Parallèlement à ces études réalisées sur les principaux facteurs
lymphangiogènes, une augmentation importante de la densité en vaisseaux lymphatiques
("Lymphatic Vessel Density", LVD) est également détectée au niveau lésions intraépithéliales de haut grade [210, 213, 214] et celle-ci croît graduellement au cours de la
progression tumorale [214-216]. De manière similaire, une augmentation du nombre de
vaisseaux lymphatiques en cours de prolifération au niveau de ces lésions est rapportée et
confirme
l’existence
d’un
processus
lymphangiogénique
[217].
Finalement,
cette
augmentation de la LVD a été corrélée à une expression intense des facteurs de croissance
VEGF-C et VEGF-D [207, 210].
L’ensemble des études présentées ci-dessus soutient l’idée selon laquelle la LVD
tumorale représenterait un marqueur de choix pour l’étude de la lymphangiogenèse. Il est
proposé que la quantification de ce paramètre sur des coupes histologiques de tumeurs
primaires permettrait d’évaluer le risque de dissémination tumorale que présente une patiente
atteinte d’un cancer du col de stade débutant [218]. Ainsi, la LVD péritumorale est apparue au
cours de dernières années comme un nouveau paramètre pronostique prometteur de
dissémination tumorale.
42
Introduction
Tableau 2 : Risque précoce et croissant de dissémination tumorale au cours de la progression
tumorale
Switch
lymphangiogénique
Activation de l’expression de VEGF-C à des stades préinvasifs (CIN2-CIN3)
[207-209]
Activation de l’expression de VEGF-D à des stades préinvasifs
[207]
Augmentation de la densité en vaisseaux lymphatiques à des
stades pré-invasifs (CIN2-CIN3)
[210, 213,
214]
Augmentation de la densité en vaisseaux lymphatiques en
cours de prolifération à des stades pré-invasifs (lésions de bas
grade et haut grade)
Lymphangiogenèse
et risque d’extension
ganglionnaire
[217]
Expression élevée de VEGF-C maintenue dans les lésions
cancéreuses et corrélée au statut ganglionnaire
[210, 212]
Augmentation progressive de la densité en vaisseaux
lymphatiques au cours de la progression tumorale
[214-216]
Depuis près d’une dizaine d’années, les chercheurs ont tenté de déterminer le potentiel
pronostique de la densité en vaisseaux lymphatiques sur le risque d’extension ganglionnaire
chez des patientes atteintes d’un cancer du col utérin. En 2005, Gombos et al furent parmi les
premiers à corréler une LVD péritumorale élevée à la présence de métastases ganglionnaires,
ainsi qu’à une diminution du taux de survie à 5 ans [210]. Par contre, la vascularisation
intratumorale
ne
présente
aucune
valeur
prédictive
de
dissémination
tumorale.
Ultérieurement, des résultats similaires ont été reproduits dans la majorité des études
cliniques, confirmant ainsi l’intérêt d’une quantification de la LVD au niveau de la tumeur
primaire comme facteur pronostique de dissémination ganglionnaire [212, 215, 219-226].
Néanmoins, d’autres équipes rapportent une absence de corrélation entre la LVD peritumorale
et une extension ganglionnaire [214, 227-229]. Par conséquent, malgré l’existence de résultats
encourageants, la valeur pronostique de la LVD a été mise en doute et, jusqu’à présent, aucun
consensus à ce sujet n’a encore pu être établi (Tableau 3).
43
Introduction
Tableau 3 : Association entre la LVD péritumorale et le statut ganglionnaire (N+/N-) à partir de cas de
cancers du col utérin.
Méthode
Année
LVD péritumorale (moyenne ± DS)
Réf.
Marqueur
Objectif
Champs
Opérateurs
N-
N+
P value
2005
D2-40
20x
5
2
8,8 ± 0,5
11,6 ± 1
p < 0,001
[210]
2006
LYVE-1
40x
5
2
14,9
23,1
p < 0,001
[219]
2007
D2-40
20x
5
2
17,9
15,6
NS
[214]
2009
D2-40
40x
4
1
21,97 ± 6,44
33,27 ± 6,34
p < 0,001
[215]
2009
LYVE-1
20x
5
1
17,15 ± 1,49
17,93 ± 1,70
p < 0,05
[212]
2009
LYVE-1
20x
5
1
8,77 15 ± 0,65
9,67 ± 0,72
p < 0,05
[220]
2010
LYVE-1
40x
5
1
25,50 ± 1,84
26,33 ± 0,82
NS
[227]
2010
D2-40
40x
5 - 10
2
p = 0,01
[221]
D2-40
2010
Non mentionné
10,5 ± 3,8
12,7 ± 4,13
NS
4,3 ± 2,1
3,8 ± 1,8
NS
Prox-1
7,2 ± 3,1
6,8 ± 3,4
NS
VEGF-R3
2,5 ± 2,1
3,3 ± 1,9
NS
6,2 ± 0,7
11,2 ± 1,6
p < 0.0001
[223]
LYVE-1
20x
5
2
[228]
2011
5’-NaseALPase
2011
D2-40
20x
5
3
8,7 ± 1,2
15,9 ± 2,2
p < 0,05
[224]
2012
D2-40
20x
5
2
43% avec
LVD > 10
32% avec
LVD > 10
NS
[229]
2012
LYVE-1
20x
5
2
17,36 ± 5,3
19,28 ± 4,8
p = 0,019
[225]
2013
D2-40
10x
20
1
18,17 ± 6,44
33,27 ± 6,34
P < 0,001
[216]
2013
D2-40
40x
4
1
non précisé
non précisé
P < 0.05
[226]
Surface totale analysée = 1 mm²
Le manque de standardisation concernant les méthodes de quantification et dans le
choix des marqueurs des cellules endothéliales lymphatiques est supposé être responsable de
variations importantes dans les mesures de LVD entre les différentes études. Ce manque de
standardisation expliquerait en grande partie les divergences observées entres les différentes
études cliniques [184].
44
Introduction
3. Quantification de la lymphangiogenèse
3.1. Les marqueurs des vaisseaux lymphatiques
La sélection d’un marqueur optimal des cellules endothéliales lymphatiques est une
étape essentielle dans l’étude de la lymphangiogenèse sur coupe histologique. Un manque de
spécificité dans la détection des vaisseaux lymphatiques risquerait de mener à des résultats
erronés [184]. Jusqu’à présent, LYVE-1, prox-1, VEGFR-3 et la podoplanine ont été les
marqueurs les plus couramment utilisés dans les études réalisées sur le cancer du col de
l’utérus.
Le Lymphatic vessel endothélial hyaluronan receptor 1 (LYVE-1) est l’un des
marqueurs les plus utilisés pour la détection des vaisseaux lymphatiques. Il s’agit d’une
glycoprotéine membranaire initialement exprimée par les cellules progénitrices des cellules
endothéliales lymphatiques présentes au niveau de la veine cardinale et qui représente le
premier indicateur du phénotype lymphatique lors de la lymphangiogenèse embryonnaire
[230, 231]. LYVE-1 se présente comme un récepteur des hyaluronans, composant de la
matrice extracellulaire impliqué dans la migration et la différenciation cellulaire [232]. Celuici serait aussi capable d’internaliser ces hyaluronans matriciels et semble ainsi jouer un rôle
dans leur transport vers les ganglions lymphatiques où ces derniers sont métabolisés [233,
234]. Cependant, une réduction de son niveau d’expression à la surface des cellules est
observée dans des conditions inflammatoires pouvant mener à une sous-estimation du nombre
de vaisseaux lymphatiques au niveau des tumeurs [228, 235].
Le vascular endothélial growth factor receptor 3 (VEGFR-3) a été précédemment
décrit au point 1.3.1. Celui-ci est majoritairement exprimé par les cellules endothéliales
lymphatiques et représente le récepteur pour lequel les facteurs de croissance
lymphangiogènes VEGF-C et VEGF-D présentent la plus grande affinité. Néanmoins, ce
récepteur apparaît également exprimé par certains capillaires sanguins dans des conditions
physiologiques et angiogéniques [236, 237].
Le Prospero-related homeobox transcription factor (Prox1) est un facteur de
transcription clé dans le développement du réseau lymphatique. Au cours de l’embryogenèse,
celui-ci induit l’expression des gènes impliqués dans l’acquisition du phénotype lymphatique
45
Introduction
ainsi que dans la construction des vaisseaux lymphatiques à partir des cellules progénitrices
[238]. Prox-1 est également exprimé par les cellules endothéliales lymphatiques lors du
processus de lymphangiogenèse tumorale et induit l’expression d’autres marqueurs
lymphatiques tels que VEGFR3 et LYVE-1 [239]. Il se présente ainsi comme un marqueur de
choix pour l’étude de la néo-lymphangiogenèse.
La podoplanine est une glycoprotéine membranaire d’environ 38 kDa détectée pour la
première fois au niveau des cellules ostéoblasiques [240, 241]. Initialement dénommée
antigène E11, elle fut par la suite renommée podoplanine en référence aux podocytes rénaux
qui l’expriment dans des conditions physiologiques [242]. Celle-ci est impliquée dans le
maintien de la forme des podocytes et semble jouer un rôle important dans la régulation de la
perméabilité au niveau des glomérules [242, 243]. De même, il a été observé que cette
protéine peut être exprimée par les cellules alvéolaires pulmonaires de type 1 et les cellules
dendritiques des organes lymphoïdes [244]. Ultérieurement, elle fut caractérisée comme un
marqueur permettant de discriminer la vascularisation lymphatique des vaisseaux sanguins.
En effet, la podoplanine est détectée sur l’intégralité de la surface des cellules endothéliales
lymphatiques tandis qu’aucune expression par les cellules endothéliales sanguines n’est
observée [245]. Sa fonction au sein de l’endothélium lymphatique est encore méconnue.
Cependant, des souris déficientes pour le gène codant pour la podoplanine présentent des
vaisseaux dilatés et développent des lymphoedèmes, démontrant l’importance de cette
protéine dans l’intégrité des vaisseaux lymphatiques [246]. Finalement, la podoplanine est
également exprimée par les cellules tumorales dans des cas de mésothéliomes [247], de
carcinomes des testicules [248], de sarcomes des cellules dendritiques folliculaires [249] dans
différents sous-types de cancers du cerveau [250].
Parmi l’ensemble des protéines présentées ci-dessus, la podoplanine est considérée
comme le marqueur le plus fiable pour la détection des cellules endothéliales lymphatiques
humaines. Ce choix est motivé par l’absence d’expression de celle-ci au niveau du réseau
vasculaire sanguin [245] ainsi que par la possibilité de détecter un plus grand nombre de
vaisseaux lymphatiques comparativement à LYVE-1 et Prox-1 [235, 251]. Actuellement,
l’anticorps D2-40 dirigé contre la podoplanine humaine est recommandé pour l’étude de la
vascularisation lymphatique [184]. Initialement développé pour la reconnaissance de
l’antigène fœtal M2A au niveau des cellules germinales dans le cancer des testicules [252], il
fut démontré comme étant capable de détecter la podoplanine sur coupes histologiques chez
46
Introduction
l’homme [244]. Celui-ci présente une grande sensibilité (97,3%) et spécificité (98,8%) pour le
marquage des vaisseaux lymphatiques [253].
3.2. Techniques de quantification
La technique utilisée pour la caractérisation de la vascularisation lymphatique apparait
comme le paramètre le plus important à prendre en considération lors de la recherche de
facteur prédictif de dissémination tumorale. La qualité ainsi que la quantité d’informations qui
seront obtenues dépendront majoritairement des éventuelles limitations associées à cette
technique. Jusqu’à présent, la technique de "hot-spot" a été largement été utilisée dans les
précédentes études cliniques. Les progrès récents réalisés dans les domaines des systèmes
d’acquisition d’images et de l’analyse d’images ouvrent cependant de nouvelles perspectives
pour la quantification du réseau vasculaire.
3.2.1. Hot-spot
Traditionnellement, le microscope optique conventionnel est utilisé par les
pathologistes pour l’analyse de coupes histologiques. Celui-ci permet de réaliser une analyse
visuelle rapide de différents paramètres pathologiques microscopiques qui peuvent guider le
clinicien dans le choix d’une stratégie thérapeutique à adopter. Se basant sur cette technique,
Weidner et al décrivirent en 1991 une méthode permettant d’effecteur une quantification
simple et rapide de l’angiogenèse tumorale sur coupes histologiques [254]. Celle-ci consiste à
réaliser un comptage des vaisseaux sanguins immunomarqués au sein de régions présentant
une densité importante en vaisseaux appelées hot-spot. Ces dernières sont considérées comme
des régions à haut potentiel angiogénique au niveau desquelles les cellules tumorales
possèdent un risque élevé d’entrer en contact avec un vaisseau et de disséminer à distance. Par
analogie, la lymphangiogenèse a jusqu’à présent été quantifiée de la même manière et la
densité en vaisseaux lymphatique représente le paramètre le plus couramment étudié lors
d’études cliniques [184].
Un certain nombre de limitations associées à cette technique doivent néanmoins être
notés : (1) Cette technique de quantification est caractérisée par une variabilité intra- et interobservateurs importante due à un manque de reproductibilité dans l’attribution du hot-spot
47
Introduction
[255]. Cette dernière dépendra essentiellement de la formation et de l’expérience de
l’investigateur [184]. Il est soutenu que l’importante variabilité inhérente à cette technique de
quantification représente la principale cause des divergences observées entre les études
cliniques ayant évalué le potentiel pronostique de la LVD [184]. (2) L’utilisation de
microscopes conventionnels impose à l’investigateur l’étude d’une surface restreinte du tissu.
Pour des raisons pratiques, il s’avère en effet inconcevable de réaliser une quantification de
petites structures telles que les vaisseaux lymphatiques sur la totalité de coupes histologiques.
La technique de hot-spot se limite ainsi à une analyse d’une surface de tissu de 0,6 µm² et ne
permet de réaliser qu’une étude partielle de la vascularisation lymphatique tumorale. (3)
Finalement, seule une quantification du nombre de vaisseaux, ainsi qu’une approximation de
leur taille, peuvent être réalisées. Cette technique ne permet donc pas de caractériser de
manière détaillée la totalité des modifications pouvant résulter d’interaction entre les cellules
endothéliales lymphatiques et tumorales. La figure 21 illustre la manière dont la LVD est
quantifiée à l’aide de la technique de hot-spot.
B
A
Tumeur
Figure 21 : Illustration de la quantification de la densité en vaisseaux lymphatiques par la technique de hot-spot. (A)
Coupe histologique d’un cancer du col utérin. Les vaisseaux lymphatiques ont été détectés par immunohistochimie (rose).
Un agrandissement du tissu tumoral est représenté à droite. La tumeur a été entourée en rouge et le cadre noir représente
la surface de tissu analysée par la technique de hot-spot. (B) Agrandissement au niveau de la surface de tissu analysée
par la technique de hot-spot (cadre noir).
Jusqu’à présent, la technique hot-spot représente la technique de quantification la plus
couramment utilisée pour la quantification de la vascularisation lymphatique dans des cas de
cancers du col utérin. Cependant, l’évaluation d’une LVD globale est proposée comme une
48
Introduction
mesure plus appropriée et permettait une plus grande standardisation entre les différentes
études cliniques [256].
3.2.2. Systèmes d’acquisition et analyse d’images digitales
Au cours de ces dernières années, plusieurs systèmes d’acquisition d’images ont été
développés. Ceux-ci ont pour objectif de permettre l’étude d’une surface de tissu plus
importante et difficilement analysable à l’aide de la technique de microscopie optique
conventionnelle.
3.2.2.1. Microscopic Image Analysis (MIA)
La mise sur le marché de microscopes équipés de caméras reliées à des ordinateurs fut
un premier pas en avant pour l’analyse de marqueurs histologiques. Grace à ces systèmes,
l’investigateur peut acquérir plusieurs images numériques successives qui, une fois
assemblées à l’aide de programmes informatiques permettent d’obtenir une image d’une large
zone du tissu, voire sa totalité. De cette façon, la surface de tissu pouvant être analysée
s’avère nettement supérieure à celle prise en considération lors d’une quantification au
microscope optique conventionnel. Au sein de notre laboratoire, cette technique a été
précédemment utilisée avec succès pour la quantification de la vascularisation sanguine sur la
totalité de coupes histologiques d’endomètre [257, 258]. Cependant, la principale
problématique associée à cette méthode réside dans la gestion des images numériques. En
effet, les programmes informatiques utilisés pour l’assemblable des images sont limités par la
quantité d’informations numériques qu’ils peuvent gérer (environ 4 Giga-octets maximum).
Ainsi, un maximum de neuf images acquises à une résolution moyenne (inférieure à un
grossissement 100x) sont nécessaires pour obtenir une image de 80 mm². Dans ces conditions,
l’analyse d’images de grande taille, telles que des coupes de tissus de col utérin est
impossible.
3.2.2.2. Systèmes automatiques d’acquisition d’images numériques
Les premiers systèmes automatiques d’acquisition d’images firent leur apparition vers
le milieu des années 1990 [259]. Classiquement, on en dénombre trois types : (i) les
49
Introduction
microscopes à platine motorisée réalisant des clichés successifs des champs microscopiques
(ii) les scanners de lames qui utilisent un capteur qui balaye la coupe et (iii) les champs de
microscopies composés d’une grille de 80 lentilles fonctionnant comme des microscopes
indépendants. Par rapport aux méthodes précitées ci-dessus, le principal avantage de ces
systèmes est qu’ils permettent l’acquisition automatique à haute résolution de la totalité de
coupes histologiques quelle que soit leur taille. L’image ainsi obtenue est appelée "image
virtuelle". Ces technologies ont été initialement développées afin de permettre une
visualisation aisée et confortable de coupes histologiques dans leur intégralité et trouvèrent de
multiples applications. Elles présentent notamment un intérêt particulier pour l’examen
collectifs de lames histologiques [260], l’enseignement [261], la télépathologie [262] ainsi
que pour le stockage d’informations.
Parallèlement au développement des systèmes d’acquisition d’images numériques,
d’importantes avancées ont été réalisées dans le domaine de l’analyse d’images
informatiques. Divers softwares permettent actuellement de traiter automatiquement les
images digitales afin d’en extraire les structures à quantifier. Pour ce faire, ils se basent sur
des paramètres de couleurs, de forme et de textures que présentent ces structures. L’utilisation
de cette technologie en recherche a pour objectif d’optimaliser la quantification des
marqueurs histologiques [263]. En effet, une augmentation de la sensibilité, ainsi qu’une
diminution significative de la variabilité intra- et inter-observateurs, sont observées lorsque
les pathologistes sont assistés par ces systèmes d’analyse d’images [264, 265]. Jusqu’à
présent, aucun système de quantification de la vascularisation lymphatique n’existe. Seuls
quelques systèmes d’analyse de la vascularisation tumorale sanguine ont été développés mais
ils s’avèrent incapables de détecter de manière précise les vaisseaux dans leur totalité [265267].
Il est actuellement soutenu que le développement de méthodes de quantification de la
vascularisation lymphatique sur coupe histologique, caractérisées par une faible variabilité
intra- et inter-observateurs, est nécessaire afin de confirmer le potentiel pronostique de la
lymphangiogenèse chez les patientes atteintes d’un cancer [184, 256].
50
Introduction
En résumé, le cancer du col de l’utérus est le troisième cancer le plus fréquent chez la
femme et représente la première cause de cancérisation du tractus génital féminin. Il est la
conséquence d’une infection persistante par un HPV prenant naissance au niveau des cellules
de la zone de jonction squamocylindrique et présente la particularité d’affecter, entre autres,
des patientes jeunes, à partir d’une vingtaine d’années.
Au terme d’une phase précancéreuse asymptomatique, les cellules néoplasiques
envahissent le tissu cervical et peuvent à tout moment disséminer jusqu’aux ganglions
périphériques et organes à distances. La dissémination est un évènement clé de la
progression tumorale. Elle s’effectue préférentiellement par le système lymphatique et son
risque croît en même temps que la taille et la profondeur d’invasion tissulaire. Les ganglions
lymphatiques sont généralement les premiers organes à développer des métastases et le statut
ganglionnaire (N+/N-) est considéré comme le facteur pronostique principal de la pathologie.
Le traitement des cancers du col de l’utérus de stade débutant permet d’atteindre un
taux de survie sans récidive à 5 ans avoisinant les 85% au prix d’une chirurgie radicale et,
dans certains cas, d’une radiothérapie adjuvante postopératoire. Dans l’intention de limiter
la morbidité thérapeutique potentielle qui lui est associée, un intérêt particulier a notamment
été porté à la recherche de facteurs tumoraux prédictifs d’extension ganglionnaire.
A ce jour, plusieurs études expérimentales et cliniques soutiennent l’importance de la
lymphangiogenèse dans les mécanismes de dissémination lymphatique. La densité en
vaisseaux lymphatiques (LVD) péritumorale est apparue comme un marqueur tumoral qui
permettrait de différencier a tout moment le risque d’extension ganglionnaire. Cependant, au
vu du manque d’objectivité et de reproductibilité de la technique de quantification par
microscopie conventionnelle utilisée pour la quantification de ce paramètre (hot-spot), aucun
consensus n’est actuellement accepté. Dès lors, le développement d’une méthode de
quantification robuste de la vascularisation lymphatique est requis afin de confirmer le
potentiel pronostique éventuel de la vascularisation lymphatique tumorale sur le risque de
dissémination ganglionnaire.
51
BUTS ET PLAN
52
Buts et plan
PROBLEMATIQUE
Le taux de survie de 85% à 5 ans observé chez les patientes atteintes d’un cancer du
col de l’utérus de stade débutant est obtenu au prix d’un risque potentiel de développer des
troubles sexuels et fonctionnels pouvant affecter la qualité de vie des patientes. En outre,
l’administration d’une radiothérapie postopératoire adjuvante est associée à un risque accru de
morbidité thérapeutique.
PISTES PROPOSEES
Un intérêt particulier a récemment été apporté au versant lymphatique de la
pathologie. D’une part, la technique du ganglion sentinelle a été présentée comme une
technique prometteuse visant à préserver la continuité du réseau lymphatique. D’autre part,
l’analyse de marqueurs tumoraux pronostiques d’une extension ganglionnaire est apparue
comme une alternative idéale permettant de limiter le risque d’associer une radiothérapie
postopératoire à la procédure chirurgicale initiale. Une distinction précoce des patientes
présentant un risque faible versus élevé permettrait de proposer un traitement unique
(chirurgie ou radiothérapie).
ETAT ACTUEL DE LA RECHERCHE
A ce jour, une dissémination lymphatique préférentielle des cellules néoplasiques
cervicales a été démontrée et la présence d’emboles lymphatiques (LVSI) a également été
présentée comme un premier marqueur d’agressivité. Depuis lors, la recherche s’est focalisée
sur l’étude des mécanismes pouvant être impliqués au cours de la dissémination des cellules
néoplasiques. Actuellement, il est soutenu qu’une densification du réseau vasculaire
lymphatique, conséquence d’une lymphangiogenèse tumorale, est associée à un risque accru
de dissémination ganglionnaire. La densité en vaisseaux lymphatiques (LVD) au niveau de la
tumeur primaire est ainsi proposée comme un nouveau paramètre pronostique prometteur
d’extension ganglionnaire. Cependant, l’existence de résultats contradictoires entre les études
cliniques ne permet actuellement pas de confirmer le potentiel pronostique de ce marqueur.
Ces divergences sont supposées être principalement dues à un manque de reproductibilité et
d’objectivité des techniques de quantification utilisées jusqu’à présent. Il est soutenu que de
53
Buts et plan
nouvelles méthodes de quantification présentant une faible variabilité sont nécessaires afin de
confirmer le potentiel pronostique de la vascularisation lymphatique tumorale.
BUTS ET PLAN
Ce travail a été subdivisé en deux grandes parties. Dans un premier temps, une
nouvelle technique de quantification de la vascularisation lymphatique a été développée.
Celle-ci a pour principal objectif de palier les limitations actuellement associées à la technique
de hot-spot. D’autre part, celle-ci a également été développée afin de permettre une
caractérisation détaillée de la vascularisation lymphatique en vue de déterminer les principales
modifications pouvant résulter d’un dialogue entre les cellules néoplasiques et le stroma
tumoral (publication n°1). Dans un second temps, la vascularisation lymphatique a été
analysée à différents stades clés de la progression tumorale (CIN3, micro-invasion et stade
FIGO 1B1) et comparée à celle présente au niveau de tissus sains. Cette étape vise à analyser
l’évolution de la vascularisation lymphatique au cours de la progression tumorale. Enfin, les
paramètres associés à la vascularisation lymphatique ont été corrélés à la présence/absence
d’emboles lymphatiques ainsi qu’au statut ganglionnaire afin de tester leur éventuelle valeur
pronostique sur le risque de dissémination lymphatique (publication n°2).
La suite de ce manuscrit sera présenté comme suit : (1) La technique de quantification
de la vascularisation lymphatique que nous avons mise au point ainsi qu’une comparaison de
celle-ci par rapport à la technique de hot-spot seront exposées. (2) L’intérêt de celle-ci pour la
réalisation d’une analyse détaillée et objective de la vascularisation lymphatique sera discutée.
(3) L’application de cette technique pour la caractérisation de la vascularisation lymphatique
sur des coupes histologiques de néoplasies cervicales sera ensuite présentée. Nous mettrons en
évidence les principaux intérêts de notre technique pour la quantification du réseau
lymphatique et l’impact que celle-ci peut avoir sur la mise en évidence de paramètres
pronostiques d’extension ganglionnaire.
La technique de quantification de vascularisation lymphatique sur coupes
histologiques sera dans un premier temps détaillée. Par la suite, les principaux résultats
obtenus au cours de ce travail seront présentés sous la forme de publications scientifiques. Un
bref rappel du contexte dans lequel le travail a été réalisé ainsi qu’un résumé succinct des
données collectées seront présentés.
54
Buts et plan
Publication n° 1
"Whole slide quantification of stromal lymphatic vessel distribution and peritumoral
lymphatic vessel density in early invasive cervical cancer: A Method description"
C. Balsat, S. Blacher, N. Signolle, A. Béliard, C. Munaut, F. Goffin, A. Noel, J.M. Foidart,
and F. Kridelka
ISRN Obstet. Gynecol. 2011; 2011:354861.
Publication n° 2
"Improved computer-assisted analysis of the global lymphatic network in human
cervical tissues"
Cédric Balsat, Nicolas Signolle, Frédéric Goffin, Katty Delbecque, Benoit Plancoulaine,
Philippe Sauthier, Vanessa Samouëlian, Aude Béliard, Carine Munaut, Jean-Michel Foidart,
Silvia Blacher, Agnès Noël and Frédéric Kridelka
Accepté pour publication dans Modern Pathology le 23 septembre 2013
55
RESULTATS
56
Résultats
I.
Développement d’une nouvelle technique de
quantification de la vascularisation lymphatique
1. Contexte
Au cours de ces dernières années, plus d’une dizaine d’études se sont intéressées à
l’analyse de la vascularisation lymphatique sur coupes histologiques de cas de cancers du col
utérin. La plupart d’entres elles soutiennent qu’une mesure de la LVD péritumorale
permettrait de détecter de manière précoce les patientes présentant un risque élevé d’extension
ganglionnaire [212, 215, 219-225]. Cependant, la technique de hot-spot utilisée pour la
quantification de la vascularisation lymphatique dans la totalité de ces études est vivement
critiquée. Celle-ci se focalise notamment sur une zone restreinte du tissu, présente un manque
d’objectivité et semble peu adaptée pour la réalisation d’une quantification reproductible de
paramètres pronostiques [184]. Par conséquent, à ce jour, aucun consensus concernant la
valeur pronostique potentielle de la vascularisation lymphatique tumorale sur le risque
d’extension ganglionnaire n’existe. Van der Auwera et al avaient ainsi conclu que le
développement d’une méthode de quantification présentant un faible taux de variabilité était
requis afin de vérifier ce paramètre [184].
2. Hot-spot et objectivité
Le manque de consensus observé entre les différentes études cliniques ayant testé le
potentiel pronostique de la LVD est supposé être principalement dû à la présence d’une
variabilité inter-observateurs importante associée à la technique de hot-spot. Afin de
déterminer l’impact que cette variabilité pourrait avoir sur les conclusions de notre étude, les
LVD intra et péritumorale ont été quantifiées par 2 investigateurs distincts sur 46 cas de
cancers du col de stade débutant à l’aide de cette technique. Les résultats obtenus ont ensuite
été corrélés aux deux paramètres cliniques de dissémination lymphatique, le statut
ganglionnaire et la présence/absence d’emboles lymphatiques (Tableau 4). Au terme de cette
analyse, des divergences ont été observées entre les deux investigateurs. Notamment,
contrairement à l’investigateur n°1, les résultats obtenus par l’investigateur n°2 rapportent une
57
Résultats
corrélation entre la densité en vaisseaux lymphatiques péritumorale et le statut ganglionnaire.
De plus, contrairement à l’investigateur n°2, les résultats obtenus par l’investigateur n°1
indiquent une forte corrélation entre la densité en vaisseaux lymphatiques intratumorale et la
présence d’emboles lymphatiques. Ce test soutient ainsi l’intérêt de développer une nouvelle
technique de quantification qui présente un faible taux de variabilité inter-observateurs pour
l’étude de la vascularisation lymphatique sur coupes histologiques.
Tableau 4 : Corrélation entre les LVD intra/peritumorale et les paramètres cliniques de dissémination ganglionnaire.
Métastases ganglionnaires
Absent (n=34)
Présent (n=12)
p value
Emboles lymphatiques
Absent (n=25)
Présent (n=21)
p value
LVD péritumorale (Moyenne ± DS)
LVD intratumorale (Moyenne ± DS)
Investigateur n°1
Investigateur n°2
Investigateur n°1
Investigateur n°2
10,32 ± 4,30
9,7 ± 3,91
9,28 ± 3,50
7,23 ± 2,84
5,27 ± 4,62
5,67 ± 1,36
5,32 ± 3,42
5,45 ± 2,90
0,7450
0,0378
0,1947
0,7545
9,05 ± 4,67
10,79 ± 3,84
8,11 ± 3,76
9,13 ± 3,22
4,16 ± 3,60
9,13 ± 3,22
4,79 ± 3,63
5,77 ± 2,85
0,2408
0,4114
<0,0001
0,1969
Les résultats sont présentés sous forme de moyennes
les comparaisons.
déviation standard (DS). Un test de Mann-Withney a été réalisé pour
3. Description de notre technique d’analyse d’image
L’évolution des systèmes d’acquisition d’images virtuelles ainsi que les progrès
réalisés dans le domaine de l’analyse d’images digitales ont ouvert de nouvelles perspectives
pour la quantification de paramètres biologiques sur coupes histologiques. A l’aide de ces
outils, nous avons mis au point une nouvelle technique permettant de quantifier la totalité de
la vascularisation lymphatique présente sur l’intégralité d’une coupe histologique. Celle-ci se
base sur une analyse informatique d’images digitales acquises à haute résolution à l’aide d’un
système de microscopie digitale automatisé, plus communément appelé scanner de lames.
Cette étape a pour objectif le dépassement des principales limitations associées à la technique
de hot-spot afin de proposer une quantification robuste de la vascularisation lymphatique sur
coupes histologiques.
58
Résultats
3.1. Marquage immunohistologique
La mise au point d’une méthode de quantification valide et reproductible à partir
d’images digitales nécessite l’optimalisation de chaque étape de la procédure. Contrairement
au cerveau humain capable de compenser de manière efficace des variations d’intensité et de
couleurs, l’efficacité de l’analyse informatique d’images digitales sera intimement liée à la
qualité du marquage immunohistologique [263]. Le choix des marqueurs et du protocole
immunohistologique se présente ainsi comme une étape essentielle lors de la mise au point
d’une nouvelle technique d’analyse d’images digitales. La qualité de l’analyse informatique
dépendra principalement de la spécificité et de l’intensité du marquage immunohistologique
ainsi que du contraste que présenteront ces marqueurs par rapport aux autres éléments qui
composent le tissu.
Dans le cadre de ce travail, les vaisseaux lymphatiques ont été mis en évidence à l’aide
d’un anticorps D2-40 dirigé contre la podoplanine présente à la surface des cellules
endothéliales lymphatiques (figure 22A). Les cellules tumorales, initialement délimitées
manuellement (publication n° 1), furent par la suite automatiquement reconnues après un
marquage immunohistochimique de la protéine p16INK4a (figure 22B) (publication n° 2). Dans
ces conditions, un marquage intense et spécifique des structures d’intérêt ainsi qu’un contraste
élevé par rapport au reste du tissu sont obtenus.
Figure 22 : (A) Détection des vaisseaux lymphatiques (rouge) à l’aide de l’anticorps D2-40. Les vaisseaux sanguins
(étoile) ne sont pas détectés. (B) Détection des cellules tumorales à l’aide de l’anticorps anti-P16INK4A. Les cellules
épithéliales normales (zoom, partie inférieure du cadre) ne sont pas marquées. Dans les deux cas, les protocoles
immunohistologiques permettent d’obtenir un marquage intense, spécifique et présentant un contraste élevé des
structures d’intérêt.
59
Résultats
3.2. Acquisition et gestion des images digitales
3.2.1. Acquisition
Une fois le marquage immunohistologique des structures d’intérêt réalisé, une image
digitale de la totalité du tissu est obtenue à l’aide du système de microscopie digitale
automatisé "dotSlide" (figure 23). Ce dernier est composé d’un microscope optique, d’une
caméra couleur de haute résolution (1376 x 1032 pixels) ainsi que d’un capteur permettant
d’acquérir des clichés successifs des champs microscopiques. Au cours de cette étape, chaque
détail du tissu est numérisé à haute résolution afin que ces informations puissent, par la suite,
être analysées à l’aide de programmes informatiques d’analyse d’images.
Figure 23 : (A) Visualisation de l’image virtuelle obtenue à l’aide du programme fourni avec le scanner de
lames (format .vsi). Seules quelques mesures basiques peuvent être obtenues manuellement (par exemple : le
traçage de lignes, de formes ou encore la mesure de l’aire d’un élément) (cadre vert).
60
Résultats
3.2.2. Gestion des images digitales
Les images acquises par le scanner de lames sont enregistrées dans un format
particulier ne pouvant être ouvert qu’à partir du software fourni avec la machine
(format ".vsi"). Ce logiciel est principalement destiné à la visualisation des images digitales et
ne permet d’effectuer que quelques annotations basiques sur un nombre limité d’éléments
(figure 23, cadre vert). Dans le but de réaliser une analyse détaillée des structures d’intérêt, le
format des images est par la suite transformé dans un format "ouvert" pouvant être lu par la
plupart des programmes d’analyse d’images, le format ".Tiff" (Tagged Image File Format).
Au cours de cette étape, une compression de type LZW (pour Lempel-Ziv-Welch, noms des
chercheurs ayant mis au point cet algorithme) est également réalisée afin de réduire la taille
informatique de l’image. En effet, la quantité d’informations obtenues après l’acquisition des
images à haute résolution, et nécessaires pour une analyse informatique optimale, peut mener
à la formation de fichiers pouvant excéder la capacité de mémoire RAM des ordinateurs
actuels si ceux-ci ne sont pas compressés. A titre d’exemple, la taille de l’image digitale d’un
tissu mesurant 4 cm² acquis à haute résolution peut atteindre près de 10 giga-octets, rendant
impossible toute analyse informatique.
Brièvement, la compression LZW est une méthode permettant de réduire la taille
informatique d’une image sans avoir de pertes d’informations. L’information contenue dans
une image numérique est en réalité représentée par une succession de chiffres binaires (1 ou
0) communément appelés "bits". Lors de la compression LZW, l’image est passée en revue et
des chaines de bits d’une longueur constante sont générées. Les chaines identiques trouvées
sont ensuite classées dans une librairie. Cette dernière étape permet ainsi de réduire la quantité
d’informations (figure 24).
Figure 24 : Représentation schématique d’une compression LZW d’une image digitale. L’information
numérique contenue dans une image (partie supérieure) est enregistrée dans une librairie de chaines identiques
(partie inférieure). Pour l’exemple, des chaines de 6 bits ont été illustrées (lignes).
61
Résultats
3.3. Segmentation des structures d’intérêt
La segmentation est une étape qui consiste à extraire de la manière la plus exacte
possible du reste de l’image digitale les structures que l’investigateur souhaite analyser. Dans
le cas présent, les vaisseaux lymphatiques (marqués en rouge) et les cellules tumorales
(marquées en brun) ont été segmentés de manière automatique en se basant sur la composante
de couleur (figure 25). Cette opération est réalisée sur l’image .Tiff contenant la totalité de
l’information acquise à haute résolution. Brièvement, plusieurs étapes sont effectuées sur la
totalité du tissu :
1) La paroi des vaisseaux lymphatiques et les cellules tumorales sont segmentées
ensemble sans qu’aucune différence ne soit faite entre ces deux structures. Pour ce
faire, la composante "excès de rouge" a été utilisée. Cette étape permet la détection de
la totalité des structures de couleur rouge ainsi que des éléments bruns également
composés en partie de magenta, couleur à prédominance de rouge (brun = jaune +
cyan + magenta). Le terme technique exact de l’opération réalisée est : "segmentation
automatique par seuillage de l’entropie maximale réalisée sur la composante excès de
rouge" (figure 25A).
2) Les vaisseaux lymphatiques sont distingués des cellules tumorales. Pour ce faire, la
teinte de chaque structure segmentée au cours de la première étape est calculée
indépendamment. Les éléments présentant une valeur proche du rouge (moins de 3
radians) sont considérés comme des vaisseaux lymphatiques. A l’inverse, ceux dont la
valeur avoisine le brun (supérieure à 4,5 radians) sont considérés comme étant des
cellules tumorales (figure 25B).
3) Afin de prendre en considération les vaisseaux lymphatiques dans leur intégralité, les
lumières des vaisseaux ont également été analysées. Pour ce faire, la couleur de fond
de l’image scannée est segmentée (figure 25C) et seuls les éléments en contact direct
avec la paroi des vaisseaux sont conservés (figure 25D).
4) Finalement, un contrôle visuel de la segmentation automatique est réalisé. L’ensemble
des structures détectées ne correspondant pas à un vaisseau lymphatique ou à une
cellule tumorale sont manuellement éliminées (figure 25E). Par expérience, ces
"erreurs" de détection sont principalement dues à la présence de débris qui absorbent
le colorant lors du marquage immunohistologique (mucus à l’intérieur des glandes et
62
Résultats
poussières). Il s’avère également parfois complexe de segmenter certains vaisseaux à
proximité immédiate de cellules tumorales immunomarquées. Ceci est dû à une
incapacité de notre système à distinguer les couleurs rouge et brune lorsque celles-ci
sont localisées à proximité immédiate l’une de l’autre (figure 25F).
63
Résultats
*
#
*
Figure 25 : Illustration de la segmentation automatique des vaisseaux lymphatiques et des cellules tumorales. Les
images digitales sont présentées dans la colonne de gauche (les barres représentent 200µm) tandis que les images
binaires des détections correspondantes sont présentées à droite. (A) Les vaisseaux lymphatiques (rouge) et des cellules
tumorales sont segmentés ensemble. (B) Les vaisseaux lymphatiques (rouge) sont distingués des cellules tumorales
(blanc). (C) Détection de la couleur de fond du scan (jaune). (D) Seules les détections de la couleur de fond adjacentes à
un vaisseau lymphatique sont considérées comme des lumières de vaisseaux. (E) Correction manuelle des détections
des structures non vasculaires (double flèche) et des erreurs de détection (flèche). Les corrections sont réalisées à partir
des images sur lesquelles est apposé le squelette de la détection des structures considérées comme tumorales (ligne
verte, #) et lymphatiques (ligne bleu-mauve, *). (F) Détection immunohistologique initiale (gauche) et image binaire
finale (droite).
64
Résultats
Les algorithmes de traitement d’images utilisés lors de la segmentation automatique
nécessitent de stocker des résultats intermédiaires dans un espace de mémoire égal à plusieurs
fois la taille de l’image traitée. Dans ces conditions, il est impossible d’analyser une image
digitale acquise à haute résolution, même compressée, dans son intégralité sans dépasser la
capacité de mémoire RAM des ordinateurs. Afin de résoudre ce problème, un traitement par
blocs de l’image a été réalisé. Cette méthode consiste à découper virtuellement l’image
digitale en blocs indépendants et de réaliser la segmentation sur chacun de ces blocs. Dans le
cadre de ce travail, les images ont été découpées en blocs de 1023 pixels de coté avec un
recouvrement de 8 pixels avec le bloc voisin. Une fois la segmentation réalisée à haute
résolution sur chacun de ces blocs, une seule image binaire de la totalité des structures
d’intérêt ayant été détectées est finalement reconstituée automatiquement (figures 26F et 27).
3.4. Segmentation du tissu et génération de zones d’intérêt
Finalement, notre méthode d’analyse d’images digitales a été développée afin de
permettre l’étude de la vascularisation lymphatique aussi bien sur la totalité du tissu qu’au
sein de régions d’intérêt. Pour ce faire, une détection automatique du tissu ainsi qu’une
délimitation manuelle des régions d’intérêt sont effectuées.
3.4.1. Segmentation du tissu
Le tissu est dans un premier temps automatiquement segmenté en se basant sur la
composante de couleur bleu. Cette étape permet de détecter, en plus des structures
immunomarquées, la totalité des éléments mis en évidence lors de la contre-coloration du
tissu à l’aide de l’hématoxyline éosine. Dans un second temps, chacun des pixels qui
composent l’image segmentée est dilaté 10 fois afin de prendre en considération l’espace
présent entre la matrice extracellulaire ou encore la lumière des vaisseaux. Au final, une
image binaire de la totalité du tissu, à l’exception de la lumière des glandes, est obtenue de
manière automatique (figure 26C). Cette étape est indispensable pour la réalisation des
mesures de densité définies comme le nombre ou l’aire des vaisseaux détectés par unité de
surface.
65
Résultats
3.4.2. Génération de zones d’intérêt
Cette opération a pour but de délimiter des régions d’intérêt ne pouvant pas être
automatiquement segmentées tels que l’épithélium de surface et les zones anatomiques du col
utérin (exocol, zone de transformation et endocol) ainsi que les régions intra et périnéoplasiques. Dans ces cas, une image binaire de chaque région d’intérêt est générée après
une délimitation manuelle à partir d’un programme de visualisation d’images digitales
(figures 26D et E). Finalement, l’ensemble des images binaires obtenues au cours des
segmentations automatiques et des délimitations manuelles est fusionné afin d’obtenir une
seule image binaire à partir de laquelle les quantifications assistées par ordinateur sont
réalisées (figure 26F).
Figure 26 : Illustration de la méthode permettant de générer une image binaire à partir d’un col sain. (A) Image
virtuelle de la totalité d’une section d’un col utérin normal. (B et C) Images binaires obtenues après segmentation
automatique des structures d’intérêt (rouge = vaisseaux lymphatiques) (B) et du tissu (gris) (C). (D et E) Images
binaires obtenues après délimitation manuelle de l’épithélium (blanc) (D) et des 3 zones anatomiques du col
utérin (exocol = blanc, endocol = gris, zone de transformation = absence de blanc et de gris) (E). (F) Image
binaire finale. Les vaisseaux lymphatiques (rouge), le tissu (gris), l’épithélium (blanc) et les 3 zones anatomiques
(pointillés, exocol = 1, zone de transformation = 2 et endocol = 3) sont représentés dans une seule et même
image binaire.
66
Résultats
Une description schématique des images binaires finales obtenues à partir de tissus
cervicaux sains et à différents stades clés de la progression tumorale est présentée ci-dessous
(figure 27). Cette procédure a également été détaillée dans la publication n° 2.
Figure 27 : Illustration de notre méthode de traitement d’images. (A) Image virtuelle de la totalité d’une section
d’un col utérin normal. Les vaisseaux lymphatiques sont détectés à l’aide de l’anticorps D2-40 (rouge). Ces
structures sont automatiquement segmentées dans leur intégralité (paroi et lumière, zoom) sur la totalité de la
coupe histologique. (B) Une image binaire des vaisseaux (rouge), du tissu (gris) et de l’épithélium (blanc) est
générée. Une distinction entre les 3 régions anatomiques du col utérin est manuellement réalisée (pointillés 1 :
exocol, 2 : zone de transformation et 3 : endocol). La même méthode est appliquée aux lésions néoplasiques (C)
pré-invasives et (D) microinvasives du col utérin. Dans ces cas, les régions néoplasiques sont également
manuellement délimitées (barres et flèches vertes). (E) Image virtuelle de la totalité d’une section d’un cancer du
col (stade FIGO IB1). Les vaisseaux lymphatiques (rouge) et les cellules tumorales (brun) sont respectivement
détectés à l’aide des anticorps D2-40 et anti-P16INK4A. Ces structures sont automatiquement segmentées et
différenciées entre elles (zoom). (F) Une image binaire des vaisseaux lymphatiques (rouge) et des cellules
tumorales (blanc) est générée. (G) Finalement, les régions intra et péritumorale sont manuellement délimitées.
67
Résultats
4. Hot-spot versus analyse informatique d’images digitales
4.1. Exactitude
Nous avons déterminé que plus de 93% ± 3,5 de la totalité des vaisseaux lymphatiques
sont correctement détectés sur des tissus mesurant en moyenne 121
92 mm² à l’aide de notre
technique assistée par ordinateur. Comparativement, la technique de hot-spot permet de
compter de manière exacte le nombre de vaisseaux présents mais uniquement sur une surface
limitée.
4.2. Reproductibilité
L’un des soucis majeurs associés aux techniques de microscopie conventionnelle
réside dans la difficulté d’attribuer de manière reproductible la zone de hot-spot. En effet,
cette étape est subjective et dépendante de l’expérience de l’investigateur. Afin d’illustrer ce
propos, les variabilités intra et inter-observateurs ont été évaluées sur 46 cas de cancers du col
de stade débutant.
Une variabilité inter-observateurs atteignant 23,6% et 33,8% est observée lorsque les
LVD péritumorale et intratumorale sont respectivement évaluées à l’aide de la technique de
hot-spot (tableau 5). La variabilité intra-observateur quant à elle excède 40% lorsque les LVD
intra- et péritumorale sont évaluées à l’aide de la technique de hot-spot (tableau 6).
LVD péritumorale
LVD intratumorale
Investigateur 1
Investigateur 2
Variabilité (%)
Investigateur 1
Investigateur 2
Variabilité (%)
Echantillon 1
Echantillon 2
Echantillon 3
Echantillon 4
Echantillon 5
Echantillon 6
Echantillon 7
Echantillon 8
Echantillon 9
Echantillon 10
…
Echantillon 46
6,6
7,8
2,4
13,2
6,6
5,2
8,8
13,2
9,8
13,4
…
7,4
5,8
14,4
3,4
15,4
7,4
7,8
9
6,8
13,8
18,4
…
6
12,1
45,
29,4
14,3
10,8
33,
2,2
48,5
29
27,2
…
18,9
4,2
2,2
2,6
12,4
4
9,4
6,2
4,4
8,8
4,4
…
0,6
4,2
6,4
3,6
19,6
2,8
6,8
0,8
1,8
5,8
3
…
2,2
0
65,6
27,8
36,7
30
27,7
87,1
59,1
34,1
31,8
…
72,7
Moyenne
8,75
10,1
23,6
5,3
5,4
33,8
Tableau 5 : Variabilité inter-observateurs associée à la technique de hot-spot testée sur 46 cas de cancers du col
de stade débutant.
68
Résultats
LVD péritumorale
LVD intratumorale
Investigateur 1
Investigateur 1
Variabilité (%)
Investigateur 2
Investigateur 2
Variabilité (%)
Echantillon 1
Echantillon 2
Echantillon 3
Echantillon 4
Echantillon 5
Echantillon 6
Echantillon 7
Echantillon 8
Echantillon 9
Echantillon 10
…
Echantillon 46
6,6
7,8
2,4
13,2
6,6
5,2
8,8
13,2
9,8
13,4
…
7,4
5,4
8,6
3
4,2
5,6
1,4
5,4
2,8
6,4
6,8
…
4,6
18,2
9,3
20
68,2
15,2
73,1
38,6
78,8
34,7
49,3
…
37,8
4,2
2,2
2,6
12,4
4
9,4
6,2
4,4
8,8
4,4
…
0,6
2,8
4,4
2,2
13,8
3,2
3,2
1,6
6,8
6
2,3
…
0,2
33,3
50
15,4
10,1
20
66
74,2
35,3
31,8
40,9
…
66,7
Moyenne
8,75
5,3
40,2
5,3
3,5
45,2
Tableau 6 : Variabilité intra-observateur associée à la technique de hot-spot testée sur 46 cas de cancers du col
de stade débutants.
Comparativement à la technique de hot-spot, la quantification des LVD intra et
péritumorale réalisée sur lames successives de cancers du col de l’utérus à l’aide notre
technique d’analyse d’image assistée par ordinateur révèle l’existence d’une variabilité
n’excédant pas 5%.
5. Conclusions
La microscopie optique conventionnelle représente actuellement la technique la plus
largement utilisée par les scientifiques pour l’analyse de coupes histologiques. Elle présente
l’avantage de permettre une analyse visuelle rapide d’une coupe histologique. Néanmoins, à
cause du manque d’objectivité de cette méthode lors de la quantification de la vascularisation
lymphatique (hot-spot), l’éventuelle valeur pronostique de la densité en vaisseaux
lymphatiques sur le risque de dissémination ganglionnaire reste questionnée. Afin de
dépasser cette problématique, nous avons développé une nouvelle technique basée sur
l’analyse informatique d’images digitales. Celle-ci permet de générer des images binaires des
structures d’intérêt à partir desquelles des mesures informatisées reproductibles de densité en
vaisseaux lymphatiques peuvent être obtenues. Cette étape s’avérait ainsi requise afin de
tester de manière objective l’éventuelle valeur pronostique de la densité en vaisseaux
lymphatiques sur le risque de dissémination ganglionnaire dans les cas de cancers du col de
l’utérus de stade débutant.
69
Résultats
II. Caractérisation stromale détaillée de la
vascularisation lymphatique dans les cancers
cervicaux débutants
Publication n° 1
"Whole slide quantification of stromal lymphatic vessel distribution and peritumoral
lymphatic vessel density in early invasive cervical cancer: A Method description"
C. Balsat, S. Blacher, N. Signolle, A. Béliard, C. Munaut, F. Goffin, A. Noel, J.M. Foidart,
and F. Kridelka
ISRN Obstet. Gynecol. 2011; 2011:354861.
1. Contexte
Parallèlement au manque de reproductibilité, l’une des principales limitations
associées à la technique de hot-spot est que celle-ci impose à l’investigateur de se focaliser
uniquement sur une surface restreinte du tissu. Cette région, décrite comme la région
présentant le plus haut potentiel lymphangiogénique, ne tient cependant pas compte de la
totalité du microenvironnement tumoral. Pourtant, même si la formation de nouveaux
vaisseaux lymphatiques est supposée augmenter le risque que les cellules tumorales entrent en
contact avec un vaisseau, ces dernières peuvent néanmoins opter pour une dissémination via
les vaisseaux lymphatiques préexistants [156]. Par conséquent, la surface analysée à l’aide de
la technique de hot-spot s’avère peu représentative de la totalité du stroma tumoral et la
pertinence des résultats obtenus reste actuellement questionnée. Dans cette publication nous
avons décrit l’intérêt des mesures objectives de LVD et des analyses de distribution spatiale
des vaisseaux lymphatiques. Nous y discutons comment cette nouvelle méthode dépasse les
limitations associées à la technique de hot-spot.
70
Résultats
2. Résultats
Surface analysable
La méthodologie que nous avons développée possède l’avantage de ne présenter
aucune limite concernant la surface de stroma analysable. Celle-ci permet aussi bien de
réaliser une étude globale des vaisseaux sur la totalité d’une coupe histologique (figures 2b et
c) qu’une quantification de la totalité de la vascularisation lymphatique intra et péri-tumorale
(Tableau 1). A l’inverse, la technique de hot-spot se focalise uniquement sur l’analyse d’une
surface de tissu ne mesurant seulement 0,6 µm². Lorsque ces deux méthodes sont comparées,
des différences importantes concernant la mesure de densité en vaisseaux lymphatiques sont
observées (Tableau 1). Ces différences ont été expliquées par la possibilité de tenir compte de
la totalité du microenvironnement tumoral et de proposer une mesure objective de la LVD à
l’aide de notre technique d’analyse d’images digitales.
Distribution spatiale
Une analyse visuelle des coupes histologiques des néoplasies cervicales révèle la
présence d’une hétérogénéité dans la façon dont les vaisseaux lymphatiques se distribuent
(figures 2a et c). L’objectif de notre étude étant de déterminer l’interface qui existe entre les
vaisseaux lymphatiques et le front de migration des cellules tumorales, une nouvelle méthode
permettant d’évaluer la distribution spatiale des vaisseaux lymphatiques par rapport aux bords
des cellules tumorales a été développée. Grâce à l’application d’un algorithme spécifique, la
distance entre le centre de masse de chaque vaisseau et le bord de la tumeur le plus proche est
calculée (figure 4a). A partir de ces valeurs, un graphique représentant le nombre de vaisseaux
lymphatiques en fonction de leur distance par rapport à la tumeur est généré (figure 4b). A
titre d’exemple, cette méthode a été appliquée sur un cas de cancer du col de l’utérus de stade
débutant. Dans ce cas, l’analyse de la totalité du tissu a mis en évidence la présence d’une
distribution bimodale avec un amas de vaisseaux lymphatiques localisé jusqu’à une distance
de 2 mm par rapport au bord de la tumeur. L’analyse détaillée de cette région comprise entre
le bord de la tumeur et 2 mm de profondeur a également permis de quantifier et d’objectiver
l’hétérogénéité tumorale initialement observée lors de l’examen visuel (figures 5 et 6).
71
Résultats
3. Conclusions
Jusqu’à présent, la technique de hot-spot ne permettait qu’une analyse basique de la
vascularisation lymphatique sur une surface peu représentative du stroma tumoral. La
technique d’analyse d’images que nous avons mise au point permet maintenant de dépasser
ces limitations. D’une part, une densité en vaisseaux lymphatiques tenant compte de la
totalité du microenvironnement tumoral peut être quantifiée de manière objective et
reproductible. D’autre part, une analyse de la distribution spatiale des vaisseaux
lymphatiques par rapport à la tumeur peut également être réalisée. Ainsi une analyse
objective, détaillée et permettant de quantifier et d’objectiver l’hétérogénéité tumorale est
obtenue. L’objectif final de ces mesures est de permettre une meilleure caractérisation de la
vascularisation lymphatique tumorale afin de mettre en évidence les paramètres reflétant le
dialogue établi entre les cellules tumorales et les cellules endothéliales lymphatiques. Par
conséquent, la méthode d’analyse informatique d’images digitales que nous avons développée
représente une avancée pour l’étude de marqueurs tumoraux à partir de coupes histologiques
et ouvre de nouvelles perspectives dans ce domaine.
72
International Scholarly Research Network
ISRN Obstetrics and Gynecology
Volume 2011, Article ID 354861, 8 pages
doi:10.5402/2011/354861
Research Article
Whole Slide Quantification of Stromal Lymphatic Vessel
Distribution and Peritumoral Lymphatic Vessel Density in Early
Invasive Cervical Cancer: A Method Description
C. Balsat,1 S. Blacher,1 N. Signolle,1 A. Beliard,1 C. Munaut,1 F. Goffin,2 A. Noel,1
J. M. Foidart,1 and F. Kridelka3
1 Laboratory
of Tumor and Development Biology, Groupe Interdisciplinaire de Génoprotéomique Appliquée (GIGA-Cancer),
University of Liège, Pathology Tower (B23), 4000 Liège, Belgium
2 Department of Obstetrics and Gynecology, Hospital of la Citadelle, 4000 Liège, Belgium
3 Department of Obstetrics and Gynecology, CHU of Liège, 4000 Liège, Belgium
Correspondence should be addressed to F. Kridelka, [email protected]
Received 14 April 2011; Accepted 20 June 2011
Academic Editor: Y. S. Song
Copyright © 2011 C. Balsat et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which
permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Peritumoral Lymphatic Vessel Density (LVD) is considered to be a predictive marker for the presence of lymph node metastases
in cervical cancer. However, when LVD quantification relies on conventional optical microscopy and the hot spot technique,
interobserver variability is significant and yields inconsistent conclusions. In this work, we describe an original method that applies
computed image analysis to whole slide scanned tissue sections following immunohistochemical lymphatic vessel staining. This
procedure allows to determine an objective LVD quantification as well as the lymphatic vessel distribution and its heterogeneity
within the stroma surrounding the invasive tumor bundles. The proposed technique can be useful to better characterize lymphatic
vessel interactions with tumor cells and could potentially impact on prognosis and therapeutic decisions.
1. Introduction
Metastases are responsible for more than 90% of all cancer
deaths. In most carcinomas, lymph nodes are the first
organs colonized by metastatic cells. The lymph node status
(N+/N−) is amongst the strongest prognostic factors for
overall survival and disease-free survival for patients with
early cervical neoplasms [1, 2]. The exact mechanism by
which tumor cells can metastasize away from the primary
tumor is not fully understood but lymphatic vessels are
viewed as the preferential route for tumor cell dissemination
[3]. The increase in lymphatic microvessel number, due to
the production by tumor cells of growth lymphangiogenic
factors, could increase the probability that tumor cells enter
in contact with lymphatic vessels and disseminate to regional
lymph nodes [4]. In this context, the lymphatic vessel
density (LVD) is proposed as a promising predictive marker
of aggressive behavior and lymph node extension [5–9].
However, in the field of cervical cancer, studies on LVD yield
inconsistent or contradictory results [10, 11].
To date, the LVD is evaluated using the method described
by Weidner and colleagues [12] based on microvessel
counting within preselected microscopic regions showing
the highest neovascularization profile, called “hot spots”.
These regions are thought to represent the areas of biological
importance offering the highest probability for tumor cells
to intravasate into lymphatics and disseminate away from
the primary tumor. However, hot spot area assignment is
reported to be subjective and observer dependant. Such
selection biases are considered as the main reason for the lack
of reproducibility among studies about the prognostic value
of LVD [13, 14].
In order to overcome the limitations of the hot spot
approach, two techniques allowing to inspect entire histological sections are proposed: the use of motorized stage
scanning optical microscope or of autofocus device slide
scanner. Both techniques are easy to use and are widely
73
2
adapted for research [15]. Several studies have compared
the hot spot method to that of whole slide high-resolution
virtual image acquisition. These reports confirmed that the
latter technique is more reproducible, easier to implement
for standard quantification, and provides additional data
adapted to the specific morphologies considered [14, 16, 17].
Digital image acquisition methods for analyzing, either
hot spots or whole scanned sections, are sometimes accompanied by automatic or semiautomatic image analysis software. These software allows to process the image in order
to extract vessels from the background and to perform
measures such as vessel number and/or vessel size. However,
in most cases, standard software is unable to accurately
detect vascular structures and different teams have developed
home-made image processing methods for specific applications [14, 16–18]. Their success depends critically on the
immunohistochemical staining quality [19] which allows the
discrimination of objects of interest by a coloration and/or a
modification of grey-level intensities.
Our approach uses a high-resolution virtual imaging
system coupled with image analysis tools. This methodology
allows to determine, on one hand, an objective LVD quantification and, on the other hand, to detect possible spatial
modifications of lymphatic vessel distribution resulting from
tumor-stroma interactions. Different immunohistochemical
techniques are first reviewed in order to illustrate the
different features required for optimal automated detection. The image processing of slide scanning for analysis
of lymphatic vessel segmentation in paraffin-embedded
sections of cervical neoplasms is then described. Finally,
objective LVD quantification and original measurements
allowing quantifying the spatial distribution of lymphatic
vessels surrounding the tumor bundles are presented. This
technique is now available to give new insights into the tissue
remodeling associated with cancer progression and vascular
structure modifications.
2. Material and Methods
2.1. Tissue Collection and Processing. Surgical specimens of
invasive cervical carcinomas were obtained from the biobank
of the University of Liège (CHU, Liège Belgium) after
study approval by the local ethics committee (CHU, Liège
Belgium).
Immunohistochemical detection of podoplanin was
carried out using an avidin-biotin-phosphatase assay on
formalin-fixed paraffin embedded sections. Tissues were
dewaxed in xylene and rehydrated through serial decreasing
concentrations of ethanol/water solutions. Epitope retrieval
was performed by heating slides in a target retrieval solution
provided by the manufacturer (Dako S1699) (Dako, Heverlee, Belgium) during 11 minutes at 126◦ C at 1.4 bar of
pressure. Solution was cooled at room temperature to avoid a
fast temperature drop and nonspecific binding was prevented
by incubation of 10% normal goat serum for 30 minutes.
We used the primary monoclonal mouse antihuman antibody D2-40 that specifically recognizes the transmembrane
mucin-type glycoprotein podoplanin mainly expressed by
ISRN Obstetrics and Gynecology
endothelial lymphatic cells [20] (Dako M3619, 1 : 100). It was
applied during 90 minutes at room temperature. Subsequent
reaction with second goat anti-mouse biotinylated antibody
(Dako E0433) during 30 minutes was then achieved and
tissue was finally incubated, during 30 minutes, with a
complex of streptavidin and alkaline phosphatase (Jackson
Immunoresearch, St Martens-Latem, Belgium, 1 : 2000).
The phosphatase activity was revealed using the permanent red solution preliminary mixed with the endogenous
phosphatase inhibitor levamisole (1 drop/mL). Tissues were
finally counterstained with Carazzi hematoxylin 0.1% during
5 minutes.
2.2. Virtual Image Acquisition. Virtual images were acquired
with the fully automated digital microscopy system dotSlide
(Olympus, BX51TF, Aartselaar, Belgium) coupled with a
Peltier-cooled high-resolution digital colour camera (1376 ×
1032 pixels) (Olympus, XC10, Aartselaar, Belgium). Digital
images of the whole tissue sections were digitized at high
magnification (100x) producing virtual images in which
pixel size is 0.65 µm. It must be noticed that image processing
was performed on original virtual image which size may
exceed several gigabytes. Therefore, the time required for
whole slide segmentation ranges approximately from 30 to
60 minutes with one processor of a computer equipped
with Intel core i7 processor (2.80 GHz). Once the binary
image was obtained, high image size hampers calculations.
To overcome this limitation, before quantification, binary
images were decimated according to the procedure previously described [18]. Image analysis was performed using
image analysis library Pandore (GREYC, Caen France) and
tool box of MATLAB software (9.2).
2.3. Lymphatic Vessel Density Quantification. LVD was
defined as the number of lymphatic vessel section per mm2
of stromal tissue which was automatically detected by a
moment-preserving thresholding [21] applied on the blue
component of the original image decimated 8 times. LVD
was calculated for the entire stroma and more specifically for
the peritumoral region located within 2 mm of tissue from
the tumor invasion edge as it is proposed in the literature
[5, 7].
3. Results and Discussion
3.1. Selection of Lymphatic Marker for Automated Detection.
The discovery of several markers suitable to bring out
the lymphatic endothelium has marked major advances in
lymphangiogenesis study [22]. Most studies have mainly
used vascular endothelial growth factor 3 (VEGFR-3), Prox1, lymphatic endothelial hyaluronan receptor-1 (LYVE-1),
and podoplanin to identify lymphatics [3]. However, these
makers have their own features and are not fully comparable
for lymphatic vessel detection. Therefore, for setting up an
automated detection method, the initial selection of the best
marker candidate is mandatory.
The cell surface tyrosine kinase receptor VEGFR-3
mainly expressed by endothelial lymphatic cells can also be
74
ISRN Obstetrics and Gynecology
expressed by some fenestrated blood vessels [23] and then
should not be used to discriminate lymphatics from blood
vessels. Regarding Prox-1, a transcriptional factor driving
specific lymphatic gene expression, its nuclear localization
prevents it from being the ideal marker for quantifying
lymphatic vessel microscopically [24]. Finally, LYVE-1 is
reported to be downmodulated in response to inflammation
[25] and its staining often underestimates the lymphatic
vessel number when compared to D2-40 immunodetection
in cervical cancer [11]. Based on these scientific evidences,
the specific D2-40 antibody was selected for the present
study. Nevertheless, although D2-40 shows high accuracy
for lymphatic vessel detection, several limitations need to be
noted: pluristratified epidermis is reported to be recognized
by the D2-40 [26] and the expression of podoplanin can be
induced in squamous cell carcinoma [10, 20].
3.2. Vessel and Tumor Detection. Figure 1(a) shows the
detection of podoplanin after immunohistological staining
using D2-40 antibody. The lymphatic vessels are specifically
recognized and strongly stained in red with no background
observed at the level of cervical cancer tissue. Such a
staining allows an accurate detection of lymphatic vessels by
automated segmentation (Figures 1(a) and 1(b)). However,
given that structure detection is mainly based on color
segmentation, weakly stained lymphatic vessels could remain
unrecognized. Therefore, for automated detection, low specificity, weak staining, or high background must be avoided
otherwise large detection mistakes can occur leading to
erroneous measurements. In our experience, D2-40 antibody
appears to be an appropriate specific marker whose detection
provides an optimal contrast between lymphatic vessels
and the tissue background. The segmentation processes
described below, consisting in the transformation of the
original image into a binary one, can then be performed
automatically.
In digitized color images (RGB), stained lymphatic
vessel walls appear in red (Figures 1 and 2). In order to
increase the contrast between the vessel endothelium and
the surrounding tissue, the excess red component (two
times red value minus blue value minus green value) is
calculated. The lymphatic vascular structures are then easily
detected on the whole virtual slide using automatic entropy
thresholding [27]. Additionally, to take into account the
entire lymphatic vessels, lumens are identified as the lightest
structures in the tissue (the value of the threshold depends on
the average value of the background). To avoid the selection
of other structures (i.e., blood vessel lumen, holes), only
lumens neighboring the previously detected lymphatic walls
are considered. Finally to avoid misinterpretation due to
tumor and epidermal cells D2-40 recognition (see above),
nonlymphatic detections are removed manually (Figure 3).
To verify the accuracy of our methodology in detecting all
lymphatic vessels identified by immunohistochemistry, manual count was performed on 5 distinct cervical cancer tissue
sections, and results were compared with those obtained by
automated vessel detection program. Results indicate that
3
Table 1: LVD quantification in the whole cervical cancer tissue
and peritumoral area assessed by the automated lymphatic vessel
detection method in comparison with hot spot method described
by Weidner and colleagues [12].
Tissue surface (mm2 )
Vessel section number
LVD (vessel number/mm2 )
Whole
tissue
294.91
2084
7.07
Peritumoral
area
38.21
463
12.12
Hot
spot
0.6
43
76.67
93% ± 3.5 of lymphatic vessels are correctly detected and
counted on the whole tissue using the automated method.
Once lymphatic vessel sections are detected on the whole
slide, the tumoral tissue is manually delineated on the
virtual image. The manual delimitation is currently the
easiest method to delineate the tumor bundles on tissue
sections. However, the immunolabeling of cytokeratin could
be used to identify carcinoma cells. In this case, the same
procedure of segmentation to the one used for lymphatic
structure would allow an automated detection of tumor cells.
Figure 2(b) illustrates the binarized image of vessels and
tumor.
3.3. LVD Measurement. Once binary images are obtained,
parameters such as tissue surface, lymphatic vessel number,
and LVD can be measured in any part of the tissue using standard software. For illustration purposes, these parameters
were assessed on the cervical cancer sample presented above
(Figure 2). Results are presented in Table 1 and compared
with those determined with hot spot technique.
In this particular example, the assessed peritumoral area
and the number of lymphatic vessels are, respectively, more
than 60 and 10 times higher than those determined with
the hot spot approach. This result of the proposed measure
shows that total microenvironment can be taken into
account. This enables to provide an objective measurement
which is not subjected to inter- and intraobserver variability.
3.4. Spatial Lymphatic Vessel Distribution. The visual observation of both original and processed images (Figures 2(a)
and 2(c)) shows that lymphatic vessels are not homogeneously distributed throughout the tissue. Although LVD
value can inform us about level of lymphangiogenesis activity
near the tumor, it does not allow to characterize the tumor
heterogeneity. Because our main focus is to study the tumorvessel interface, quantification is focused on the spatial
distribution of vessels in relation to the tumor front of
invasion. The position of all vessels in relation to tumor cells
is determined. This is performed by applying the Euclidean
distance function [28] to the complementary image of
the binary image of the tumor. By this transformation, it
is assigned to each pixel surrounding the tumor a color
intensity corresponding to the distance between that pixel
and the nearest point of the tumor. This is illustrated in
Figure 4(a) in which the blue gradation of the background
is proportional to the distance of each pixel to the nearest
pixel belonging to the tumor mass. The value of the pixel
75
4
ISRN Obstetrics and Gynecology
(a)
(b)
Figure 1: Immunohistochemical detection of lymphatic vessels. Lymphatic vessels were detected on a cervical cancer section by
immunostaining with antipodoplanin antibody (D2/40) (red) (a). They are detected by automated segmentation (blue lines) (b). Blood
vessels are not stained (arrows).
(a)
(b)
(c)
Figure 2: (a) Virtual image of whole cervical cancer section with lymphatic vessel detection (blue lines) achieved at high resolution (insert).
(b) Binarized image of lymphatic vessels (D2/40 positive) (red) and tumor tissue (green). (c) Original image overlaid by binarized structures.
76
ISRN Obstetrics and Gynecology
5
(a)
(b)
Figure 3: Immunohistochemical detection of lymphatic vessels. Vessel sections detected by using an antipodoplanin antibody appear in red
(a) and are automatically segmented in blue (b) by image processing (blue lines). Some tumor cells positive for podoplanin are manually
eliminated (green circles in b).
0.25
Normalized frequency
0.2
0.15
0.1
0.05
0
(a)
1
2
3
4
5
6
7
8
Distance to the tumor (mm)
9
10
(b)
Figure 4: (a) Euclidean distance function applied to the binary image generated in Figure 2(b). The intensity of each pixel of the blue
background indicates the distance of this pixel to the nearest point to the tumor. The more a pixel is far from the tumor, the more its
intensity is bright. (b) Normalized histogram representing the number of vessels in function of their distance to the tumor.
corresponding to the centre of mass of each vessel gives a
measure of the distance separating vessel from the tumor.
From these data, a histogram representing the number of
vessels in function of its distance to the tumor is generated
(Figure 4(b)). In the representative example of Figure 4, the
vessel distribution displays a bimodal pattern indicating the
presence of two distinct areas. The first one corresponds
to vessels clustered around tumor cells covering a radius of
about 2-3 mm. The second area contains a large number of
vessels scattered between this limit and the tissue border.
Once the region of interest (2-3 mm around the tumor)
is determined, the degree of vessel distribution uniformity
around the tumor is investigated. From the tumor mass
centre, directional vessel distributions was calculated from
0◦ to 360◦ each 45◦ (counter clockwise). Images of vessels
oriented at 0◦ , 90◦ , 180◦ , and 270◦ from the tumor and
the corresponding histogram of distribution (normalized
frequency) for distances between 0–2 mm (insert), are presented in Figure 5. A visual observation of images indicates
that vessels cluster in the left part of the image. The spatial
histogram distribution allows to objectively quantify the
extent of this feature.
The area under the distribution histogram is a measure
of the vessel density by unit of length. This vessel density
is calculated for the 8 considered directions and drawn on
a polar graph (Figure 6) with the goal of better-visualizing
the vessel distribution around the tumor. The presence of
lymphatics is clearly detected in the area ranging from 90◦
to 270◦ directions, underlying the heterogeneity of vessel
distribution around the tumor.
77
6
ISRN Obstetrics and Gynecology
90◦
0◦
Normalized frequency
2
120
1.5
90
60
150
30
1
180
0.5
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
0
0
210
330
Distance to the tumor (mm)
(a)
240
270
1
4. Conclusion
0.5
0
Distance to the tumor (mm)
(b)
1.5
1
0.5
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
Normalized frequency
2
Distance to the tumor (mm)
(c)
2
1.5
1
0.5
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
Normalized frequency
300
Figure 6: Polar representation of the density of vessels by unit of
length measured from the tumor mass centre.
1.5
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
Normalized frequency
2
Distance to the tumor (mm)
(d)
Figure 5: Euclidean distance function applied to the region of
interest around the tumor. Vessels (in red) oriented at 0◦ (a),
90◦ (b), 180◦ (c) and 270◦ (d) are shown on the left (green =
tumor cells). The histograms on the right correspond to the vessel
distribution (normalized frequency) as a function of the distance to
the closest tumor nodules (mm).
Conventional optical microscopy technique (hot spot)
applied to characterize angiogenesis has shown low reproducibility due to high interobserver variability [14, 16,
17]. To date, most studies conducted on cervical cancers
have used the hot spot technique to assess the peritumoral lymphatic vessel density. Consequently, despite initial
promising data, the predictive value of lymphatic vessel
density remains unproven [6–11]. Thanks to the emergence
of digital virtual microscopy, whole biological tissue samples
can now be studied. This requires robust automated methods
for quantification. In the present work, we provide a new
method of vessel quantification that can be performed on
whole tissue sections. To ensure the accuracy of the proposed
measurements, two preliminary steps are mandatory: (i)
the appropriate immunohistochemical staining with optimal
contrast between background and the structures to be
quantified and (ii) an optimal image processing. The novelty
of this method relies on its capacity to assess the vessel distribution in the vicinity of tumor bundles to give new insights
into phenomenon taking place at the tumor-lymphatic
vessel interface. Presently, this proposed method is applied
to cervical cancer samples to illustrate how the obtained
information can contribute to a better understanding of
lymphatic vessel interactions with tumor cells. Although
clinical implications remain to be proven, this information
is expected to be of most interest for diagnosis/prognosis
and for a better guidance of therapeutical decisions. This
technique can also be applied to characterize lymphatic as
well as blood vessel distribution in relation to any structure
of interest.
Acknowledgments
This work was supported by Grants from the FP7-HEALTH2007-A Proposal no. 201279 “MICROENVIMET”, the Fonds
de la Recherche Scientifique Médicale, the Fonds de la
Recherche Scientifique—FNRS (F.R.S.-FNRS, Belgium), the
78
ISRN Obstetrics and Gynecology
Foundation against Cancer (foundation of public interest, Belgium), the CGRI-FNRS-INSERM Coopération, the
Fonds spéciaux de la Recherche (University of Liège), the
Centre Anticancéreux près l’Université de Liège, the Fonds
Léon Fredericq (University of Liège), the Direction Générale
Opérationnelle de l’Economie, de l’Emploi et de la Recherche
from the SPW (Région Wallonne, Belgium), the Fonds Social
Européen (F.S.E., Belgium), the Fonds d’Investissements
de la Recherche Scientifique (FIRS, CHU, Liège, Belgium),
the Interuniversity Attraction Poles Programme—Belgian
Science Policy (Brussels, Belgium), and the Plan national
Cancer (Federal public Service, Belgium). C. Balsat is
recipient of a Télévie-FNRS grant.
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79
8
ISRN Obstetrics and Gynecology
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80
Résultats
III.
Analyse informatique détaillée du réseau
vasculaire lymphatique global sur tissus cervicaux
humains
Publication n° 2
"Improved computer-assisted analysis of the global lymphatic network in human
cervical tissues"
Cédric Balsat, Nicolas Signolle, Frédéric Goffin, Katty Delbecque, Benoit Plancoulaine,
Philippe Sauthier, Vanessa Samouëlian, Aude Béliard, Carine Munaut, Jean-Michel Foidart,
Silvia Blacher, Agnès Noël and Frédéric Kridelka
Modern Pathology, accepté le 23 septembre 2013 (doi: 10.1038/modpathol.2013.195.)
1. Contexte
Il est actuellement soutenu que la dissémination des cellules néoplasiques cervicales
par la voie lymphatique peut s’effectuer de manière précoce et que le risque que cet
évènement se produise croît progressivement au cours de la progression tumorale [207-210,
214, 217]. La plupart des études cliniques rapportent également que ce risque peut être
déterminé à tout moment par l’analyse de la LVD, paramètre relatant le niveau de
lymphangiogenèse survenue [210, 212, 215, 216, 219-226]. Cependant, jusqu’il y a peu, la
vascularisation lymphatique a été quantifiée uniquement à l’aide de la technique de hot-spot,
méthode présentant un manque d’objectivité important et permettant uniquement la réalisation
de mesures basiques de densités. Dès lors, afin de déterminer de manière robuste la façon dont
le réseau vasculaire lymphatique évolue au cours de la progression tumorale ainsi que la
valeur pronostique potentielle des paramètres qui lui sont associés, une caractérisation fine de
celui-ci a été réalisée à l’aide de notre technique d’analyse d’images digitales. Pour ce faire, la
vascularisation lymphatique a été analysée au cours des différentes étapes clés de la
progression tumorale (CIN3, micro-invasion et cancer du col de stade FIGO IB1) et comparée
à celle présente au sein de tissus de cols de l’utérus normaux. Dans un second temps, les
81
Résultats
paramètres lymphatiques ont été corrélés aux paramètres de dissémination lymphatique
(présence d’emboles lymphatiques (LVSI+) et de métastases ganglionnaires (N+)).
2. Résultats
Densités en vaisseaux lymphatiques
La présence d’une distribution hétérogène de la vascularisation lymphatique à travers
le col utérin sain a tout d’abord été mise en évidence. Une densité proéminente en vaisseaux
lymphatiques est détectée à partir de la membrane basale de l’épithélium jusqu’à 2 mm de
profondeur. Au-delà de cette limite, les vaisseaux apparaissent dispersés de manière aléatoire
(figures 3a et b). Parmi cette "bande stromale" sous-épithéliale, les vaisseaux sont distribués
de manière homogène au niveau de l’exocol et la zone de transformation. A l’inverse, au
niveau de l’endocol, un nombre élevé de vaisseaux sont détectés sous les zones de métaplasies
immatures tandis que sous les régions "purement glandulaires", ceux-ci apparaissent
clairsemés (figures 3c, d et e). Lorsque ces 3 régions anatomiques du col utérin sont
comparées, une densité élevée en vaisseaux lymphatiques est détectée au niveau de la zone de
transformation des cols sains (figures 3d et f), région du col utérin particulièrement fragile et
sensible aux infections sexuellement transmissibles. Cette densité est supérieure à celle
mesurée au niveau de l’exocol mais non significativement différente de celle mesurée au
niveau de l’endocol.
Etant donné l’importance de la zone de transformation au cours de la carcinogenèse du
col utérin, la LVD mesurée au niveau de cette région fut par la suite comparée à celles
quantifiées lors des différents stades clés de la progression tumorale (CIN3, micro-invasion et
stade FIGO 1B1) (figures 3g, h et i). Dans ce cas, aucune différence n’a été observée (figure
3j). Une analyse ultérieure de la LVD dans le sens de la profondeur révèle que celle-ci est
élevée dans la région péritumorale des lésions invasives de stade FIGO IB1, région au niveau
de laquelle une LVD faible est initialement détectée (région localisée à une profondeur
supérieure à 2 mm à partir du bord de l’épithélium) (figure S1, présentée en annexe).
Par la suite, la lymphangiogenèse étant considérée comme un évènement central
pouvant
influencer
le
risque
de
dissémination
tumorale,
un
double
marquage
immunohistochimique D2-40 + Ki-67, permettant de mettre en évidence les vaisseaux
82
Résultats
lymphatiques en cours de prolifération, a également été réalisé (figure 4a). De manière
similaire aux résultats obtenus après la quantification de la LVD globale, une densité en
vaisseaux lymphatiques en cours de prolifération ("proliferating LVD") apparait une nouvelle
fois la plus intense sous la zone de transformation des cols sains (figure 4b). De même, lors de
la progression tumorale, aucune augmentation du nombre de vaisseaux en prolifération n’est
observée comparativement à ceux initialement détectés sous la zone de transformation des
cols sains (figure 4c).
Distribution spatiale
Afin de mieux comprendre l’organisation du réseau vasculaire lymphatique sous les
régions saines du col utérin ainsi qu’au cours de la progression tumorale, une analyse détaillée
de la distribution spatiale des vaisseaux lymphatiques par rapport aux bords des cellules
épithéliales saines et néoplasiques a été réalisée. Tout d’abord, dans les cas de cols sains, cette
étude confirme la présence d’un nombre plus important de vaisseaux lymphatiques sous la
zone de transformation comparativement à l’exocol et l’endocol mais précise que ceux-ci se
trouvent principalement localisés à proximité de la membrane basale de l’épithélium, entre 0
et 1 mm par rapport à la base de l’épithélium (figure 5a). Ensuite, dans les cas de néoplasies
cervicales, une modification de la distribution spatiale caractérisée par un rapprochement des
vaisseaux du bord des cellules néoplasiques est observée par rapport à ce qui est observé sous
la zone de transformation des cols sains (figure 5b). D’une part, la distance par rapport aux
bords de la tumeur à laquelle la densité en vaisseaux lymphatiques est maximale s’avère plus
faible dans les néoplasies cervicales. D’autre part, comparativement à la zone de
transformation des cols sains, une augmentation de 60 à 80% du nombre relatif de vaisseaux
lymphatiques est observée à cet endroit de densité maximale. Enfin, au cours de la
progression tumorale, cette distribution spatiale caractéristique apparaît conservée.
Corrélation de la vascularisation lymphatique avec les paramètres cliniques de dissémination
ganglionnaire.
Finalement, la valeur prédictive de la vascularisation lymphatique sur le risque
d’extension ganglionnaire dans les cas de cancers du col de stade débutant a été testée. Dans
ce travail, les densités en vaisseaux lymphatiques intra- et péritumorale globales ne sont ni
83
Résultats
corrélées au statut ganglionnaire ni à la présence d’emboles lymphatiques (Tableau 1). Par
contre, la présence d’une distribution spatiale particulière caractérisée par une densité élevée
en vaisseaux lymphatiques à proximité de la tumeur est associée à ces deux paramètres
témoins d’une dissémination lymphatique (figure 6).
3. Conclusions
Pour la première fois, une analyse robuste, reproductible et détaillée de la
vascularisation lymphatique a été réalisée. Sur la base de cette analyse originale, les
conclusions suivantes peuvent être formulées : (1) La mise en évidence d’une niche
lymphangiogène sous la zone de transformation des cols sains, maintenue au cours de la
progression tumorale (CIN3 et néoplasies invasives), souligne le caractère singulier de la
zone de transformation sur le plan de son réseau lymphatique. Cette observation, confrontée
à celles précédemment décrites (dérégulation de la production de facteurs antiviraux,
inflammation chronique de type Th2 et altération des protéines de jonctions intercellulaires
au niveau de l’épithélium), nous amène à postuler pour un rôle de "terreau" lymphangiogène
propice au développement et la progression tumorale au niveau de la zone de transformation.
(2) L’augmentation progressive de la densité en vaisseaux lymphatiques préalablement
rapportée
dans
la
littérature
n’est
pas
confirmée.
Nous
démontrons
qu’un
microenvironnement lymphangiogène est déjà présent au niveau de la zone de transformation
avant le développement des néoplasies cervicales et que celui-ci accompagne le front de
migration des cellules tumorales. (3) Néanmoins, l’analyse détaillée de la vascularisation
lymphatique révèle que parmi ce microenvironnement dense en vaisseaux lymphatiques, des
différences de distribution spatiale sont présentes. Une modification de la distribution
spatiale caractérisée par une densité maximale et accrue en vaisseaux lymphatiques à
proximité immédiate des cellules néoplasiques a été mise en évidence. (4) La LVD
péritumorale globale n’apparaît pas comme un marqueur de dissémination ganglionnaire
contrairement à ce qui est soutenu par la majorité des études réalisées précédemment. (5) Par
contre, l’analyse de la distribution spatiale des vaisseaux lymphatiques a démontré que la
façon dont ceux-ci se distribuent pourrait avoir un impact sur le risque de dissémination
lymphatique. En effet, un nombre élevé de vaisseaux localisés à proximité immédiate des
cellules tumorales a été corrélé à la présence de métastases ganglionnaires et d’emboles
lymphatiques.
84
Résultats
Cette étude confirme l’intérêt primordial d’une analyse robuste et globale de la
vascularisation lymphatique pour une meilleure caractérisation des paramètres pouvant être
impliqués dans les processus de dissémination tumorale. A la suite de cette analyse, nous
démontrons que le processus de dissémination des cellules tumorales par la voie lymphatique
n’implique pas simplement une augmentation du nombre de vaisseaux lymphatiques. A
l’inverse, l’analyse de la distribution spatiale de la vascularisation lymphatique indique
l’existence d’un dialogue complexe entre les cellules tumorales et les vaisseaux lymphatiques
pouvant mener à une réorganisation du stroma tumoral dans sa globalité. Cet évènement
semble avoir une importance sur le risque d’une dissémination lymphatique. Par conséquent,
une meilleure caractérisation des interactions pouvant mener à des modifications de la
distribution spatiale de la vascularisation lymphatique par rapport à la tumeur semble
indiquée afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués lors de la dissémination
tumorale.
85
Modern Pathology (2013), 1–12
1
& 2013 USCAP, Inc. All rights reserved 0893-3952/13 $32.00
Improved computer-assisted analysis of the
global lymphatic network in human cervical
tissues
Cédric Balsat1,7, Nicolas Signolle1,7, Frédéric Goffin2, Katty Delbecque3,
Benoit Plancoulaine4, Philippe Sauthier5, Vanessa Samouëlian5, Aude Béliard2,
Carine Munaut1, Jean-Michel Foidart1, Silvia Blacher1, Agnès Noël1 and Frédéric Kridelka6
1Laboratory
of Tumor and Development Biology, Groupe Interdisciplinaire de Génoprotéomique Appliquée
(GIGA-Cancer), University of Liège, Pathology Tower (B23), Liège, Belgium; 2Department of Obstetrics and
Gynecology, Hospital of la Citadelle, Liège, Belgium; 3Department of Pathology, Hospital of la Citadelle,
Liège, Belgium; 4GRECAN, University of Caen, Franc¸ois Baclesse Comprehensive Cancer Center, Caen,
France; 5Departement of Gynecologic Oncology, CHU of Montréal, Montréal, Canada and 6Department of
Obstetrics and Gynecology, CHU of Liège, Liège, Belgium
Lymphatic dissemination is a key event in cervical cancer progression and related tumor lymphatic markers are
viewed as promising prognostic factor of nodal extension. However, validating such parameters requires an
objective characterization of the lymphatic vasculature. Here, we performed a global analysis of the lymphatic
network using a new computerized method applied on whole uterine cervical digital images. Sixty-eight cases
of cervical neoplasia (12 CIN3, 10 FIGO stage 1A and 46 stage IB1) and 10 cases of normal cervical tissue were
reacted with antibodies raised against D2-40, D2-40/p16 and D2-40/Ki67. Immunostained structures were
automatically detected on whole slides. The lymphatic vessel density (D2-40), proliferating lymphatic vessel
density (D2-40/ki67) and spatial lymphatic distribution in respect to the adjacent epithelium were assessed from
normal cervix to early cervical cancer and correlated with lymphovascular space invasion and lymph node
status. Prominent lymphatic vessel density and proliferating lymphatic vessel density are detected under the
transformation zone of benign cervix and no further increase is noted during cancer progression. Notably, a
shift of lymphatic vessel distribution toward the neoplastic edges is detected. In IB1 cervical cancer, although
intra- and peritumoral lymphatic vessel density are neither correlated with lymphovascular space invasion nor
with lymph node metastasis, a specific spatial distribution with more lymphatic vessels in the vicinity of tumor
edges is predictive of lymphatic dissemination. Herein, we provide a new computerized method suitable for an
innovative detailed analysis of the lymphatic network. We show that the transformation zone of the benign
cervix acts as a baseline lymphangiogenic niche before the initiation of neoplastic process. During cancer
progression, this specific microenvironment is maintained with lymphatic vessels even in closer vicinity to
tumor cells.
Modern Pathology advance online publication, 6 December 2013; doi:10.1038/modpathol.2013.195
Keywords: cancer; cervix; computerized; distribution; lymphatic; metastasis
In uterine cervical neoplasms, and in most human
solid tumors, lymphatic vasculature is the common
pathway for initial tumor spread to regional lymph
nodes.1 In addition to tumor size, lymph node
status (positive/negative lymph node metastasis) is
Correspondence: Professor F Kridelka, PhD, CHU of Liège,
Service de Gynécologie-Obstétrique, 600 Rue Gaillarmont 4030,
Grivegnée, Belgium.
E-mail: [email protected]
7These authors contributed equally to this work.
Received 13 May 2013; revised 20 September 2013; accepted 23
September 2013; published online 6 December 2013
www.modernpathology.org
regarded as the strongest prognostic factor for
patient’s cancer-specific survival.2,3 It is widely
used for guiding therapeutic decisions and currently justifies a systematic lymphadenectomy in early
cervical cancer. Owing to the low rate of positive
lymph node detected (ranging from 12 to 22%)4 and
the potential morbidity associated with a lymph
node dissection, research has focused over recent
years on the identification of primary tumor variables predictive of lymphatic spread.5,6
In this context, lymphovascular space invasion
has been described as an independent factor predicting tumor aggressiveness.7 More recently, the
86
Computerized lymphatic network analysis
2
C Balsat et al
lymphatic vessel density, which witnesses the level
of lymphangiogenesis (formation of new lymphatic
vessels), has been proposed as a new promising
predictive variable of nodal extension.8 Notably,
studies on cervical tissues showed that high levels
of lymphatic vessel density as well as marked
expression of vascular endothelial growth factors
(VEGF)-C and VEGF-D, the two main lymphangiogenic promoters, are already detected in preinvasive neoplasia (CIN3).9–12 A gradual increase of
lymphatic vessel density has been reported in the
peritumoral stroma during cancer progression13–15
and in invasive cervical cancer, Gombos et al15 were
the first to link high peritumoral lymphatic vessel
density with growth factor expression, lymphovascular space invasion, lymph node metastases and
overall survival. Subsequent immunohistochemical
studies on cervical neoplasms confirmed a positive
association between lymphatic vessel density and
lymph node metastases.14,16–21 Taken together, these
results suggest an early lymphangiogenesis switch
with an increased risk of lymphatic dissemination
during cancer progression that could be assessed by
lymphatic vessel density quantification. However,
until recently, lymphatic vessel density quantification has relied on the hot spot technique previously
criticized for its subjectivity. The main disadvantages of this approach are its focus on a limited
tumor area and its lack of reproducibility.22
Consequently, no consensus exists on the potential
prognostic value of the tumor lymphatic vasculature
profile in cervical cancer.10,23,24
In order to overcome the major restrictions related
to the conventional hot spot approach, we have
developed an original semi-automated quantification method based on computerized image analysis
of lymphatic vessels on whole slide scanned tissue
sections.25 The present work aims at drawing
pathologist’s attention on the interest of a global
lymphatic vasculature analysis on cancer tissues. In
particular, we provide evidence for a so far unappreciated lymphatic niche under the transformation
zone considered as the site where neoplastic
changes occur primarily during the cervical oncogenic process.26,27 Furthermore, our study demonstrates that a global stromal evaluation sheds light
on topographical features of the lymphatic vascular
network that are worth considering in cervical
cancer as well as other cancers.
Materials and methods
Tissue Samples
Surgical specimens of 68 patients suffering cervical
neoplasia were obtained from the biobanks of the
University of Liège (CHU, Liège Belgium) and the
Centre Hospitalier Universitaire of Montreal
(CHUM, Hôpital Notre-Dame, Montreal Canada)
after study approval by local ethic committees.
Modern Pathology (2013), 1–12
Twelve cases of in situ carcinomas (CIN3: presence
of neoplastic cells that occupy the full thickness of
the epithelium), 10 microinvasive lesions (FIGO
stage IA1: neoplastic processr3 mm of depth
andr7 mm of width) and 46 early uterine cervical
cancers (IB1: clinically visible lesionr4 cm in
greatest axis) were successively collected. Stage
was allocated according to the International Federation of Gynecology and Obstetrics staging system
(FIGO). Lymph node metastases were detected in
12/46 invasive cases and lymphovascular space
invasion was present in 25/46 surgical specimens.
Ten benign uterine cervical samples were also
obtained from patients treated for non-oncological
reasons (fibroma, menorrhagia, uterine prolapse,
Lynch syndrome). The cervix was sectioned and
sections were oriented according to standard histological guidelines.28 All tissues were reviewed by a
pathologist blinded to the study purpose. CIN3 and
microinvasive lesions were diagnosed on a cone
biopsy specimen that encompasses a large part of
the tree anatomical regions of the uterine cervix.
Early cervical cancer lesions and benign cervix
samples of 0.5 cm thickness were collected after
radical surgical hysterectomy. For early cervical
cancers, this sampling was performed in the most
infiltrative area. Among representative slides, those
permitting optimal transformation zone (normal
cervix), dyspalsia or micro-invasive cancers evaluation as well as peritumoral stromal immunostaining
were selected.
Immunohistochemisty
Lymphatic vessels, proliferating lymphatic vessels
and tumor cells were identified using a monoclonal
anti-human antibody against podoplanin (D2-40,
1:100; Dako, Heverlee, Belgium), a prediluted multiplex cocktail composed of monoclonal mouse anti
D2-40 and rabbit monoclonal anti-Ki67 (ready to
use; Biocare Medial, Concord, USA) and a polyclonal rabbit anti CDKN2A/p16INK4a (1:100; Abcam,
Cambridge, UK), respectively.
Virtual Image Acquisition and Processing
Virtual images were acquired with the fully automated digital microscopy system dotSlide (Olympus, BX51TF, Aartselaar, Belgium). Whole tissue
sections were digitized at high magnification producing virtual images in which pixels measure
0.4225 mm2. DotSlide providing images in a proprietary format, images were converted into a standard
TIFF format, easier to handle. Thereafter, tumor
cells and lymphatic vessels were computerized as
illustrated in Figure 1. When Ki67-positive lymphatic vessel sections were considered, because of low
contrast between podoplanin and Ki67-positive
nuclei, vessels were manually drawn with the help
of the Aperio ImageScope v10.2.1.2314 software.
87
Computerized lymphatic network analysis
3
C Balsat et al
Figure 1 Illustration of tumor cell and lymphatic vessel detection. Virtual images of immunostained cervical cancer tissues are presented
on the left and corresponding binary images are shown on the right. (a) Tumor cells (brown, left image) and lymphatic vessels (red, left
image) are automatically segmented together thanks to a Maximum Entropy Thresholding performed on the excess red component.
(b) They are automatically distinguished based on the average value of the color presented by each detected structure (44.5 radians ¼
tumor cell in white, o3 radians ¼ lymphatic vessel in red). (c, d) In order to take into consideration lymphatic vessels in their integrality,
vessel lumens are filled. Background is firstly segmented (c, yellow) and detected structures in close contact with lymphatic wall are
considered (d). (e) Finally, to avoid misinterpretations, non-vascular structures that could have been detected and/or detection mistakes
are manually corrected (green arrows, right image). (f) The final binary image of detected tumor cells and lymphatic vessels (right image)
is obtained after the image processing. Scale bars represent 200 mm.
The three anatomical regions (exocervix, transformation zone and endocervix) were delineated on
virtual images by using the Aperio ImageScope
v10.2.1.2314 software. The transformation zone
was defined as the cervical area in which squamous
and columnar epithelia were present in continuity
and/or squamous epithelium was detected with
underlying glands.29 Epithelia of benign cervical
tissues, CIN3 and microinvasive lesions as well as
the boundary between intra- and peritumoral areas
in FIGO 1B1 cervical cancers were delimited in the
same way. Finally, tissues were extracted by a
moment-preserving thresholding method30 applied
on the blue component of the original virtual image.
Modern Pathology (2013), 1–12
88
Computerized lymphatic network analysis
4
C Balsat et al
Figure 1 (Continued).
Owing to high image size that hampers calculation,
all binary images of the detected structures were
decimated according to the procedure described
elsewhere.31 Figure 2 illustrates the different steps
of image processing.
Image Analysis
Image analysis and measurements were performed
using image analysis library Pandore (GREYC, Caen,
France), Aphelion 3.2 (ADCIS, Saint-Contest, France)
and image toolbox of MATLAB 9.2 (MathWorks,
Natick, MA, USA) software. Lymphatic vessel density,
proliferating lymphatic vessel density and spatial
distribution of lymphatic vessel were quantified from
Modern Pathology (2013), 1–12
the basal layer of the surface epithelium or neoplastic
edges to tissue border. Lymphatic vessel density and
proliferating lymphatic vessel density were defined as
the number of lymphatic vessels and Ki67-positive
lymphatic vessels per mm2 of tissue, respectively.
Spatial lymphatic vessel distribution analysis was
performed by measuring the Euclidean distance
between the center of mass of each vessel section
and the basal layer of the surface epithelium or
neoplastic edges as previously described.25 For
comparison, curves were normalized taking the
maximum of the control curve at one.
In CIN3, microinvasive and IB1 affected tissues,
the perineoplastic area was defined as the stromal
region located from neoplastic edges to 2 mm of
depth. The transformation zone of benign cervix was
89
Computerized lymphatic network analysis
5
C Balsat et al
Figure 2 Image processing illustration. (a) Virtual image of whole benign cervical tissue. Lymphatic vessel sections were detected by
immunostaining with the anti-podoplanin antibody (D2-40) and visualized in pink as illustrated at higher magnification in the insert
(top). Lymphatic vessel section edges and lumens were automatically segmented on virtual image (red) while blood vessels were not
detected (star). (b–d) Binary images of detected lymphatic vessel sections (red), tissue (grey) and epithelium (white) were generated.
Exocervix (1), transformation zone (2) and endocervix (3) were manually delineated (white dotted lines). Neoplastic lesions and their
underlying stromal tissues were manually highlighted in CIN3 (c) and microinvasive lesions (d) (green lines). Green arrow represents
tissue under neoplastic lesion that was analyzed. (e) Virtual image of whole cervical cancer slide. In invasive lesions, lymphatic vessel
sections (pink) and tumor cells (brown) were detected by immunostaining with D2-40 and CDK2A/P16IN4Ka antibodies, respectively.
High magnification is shown in the insert. Lymphatic vessel sections (red) and tumor nodules (white) were automatically and
discriminatory segmented (bottom insert). (f) Binary image of lymphatic vessel sections and tumor nodules on the whole slide (g).
Intratumoral (i) and peritumoral regions (p) were manually discriminated (yellow dotted line). Peritumoral area was considered as the
area located within 2 mm of depth from the tumor edges. White arrows represent the intra- and peritumoral areas that were analyzed.
considered as reference to which quantifications
obtained under the neoplastic lesions were compared.
statistical significance was set at Po0.05 for all
comparisons. Graphs are presented as scatter plots
of individual data points. Means are presented by
horizontal bars.
Statistical Analysis and Graphs
For lymphatic vessel density, proliferating lymphatic vessel density and vessel distance to epithelium/
tumor border, data were analyzed with GraphPad
Prism 5.0 software (San Diego, CA, USA). Mean
values were each compared using the Mann–
Whitney test to determine whether a difference
between experimental groups could be considered
as significant. Statistical analysis of lymphatic
vessel spatial distribution was performed using a
Wilcoxon non-parametric test with the statistic
toolbox of MATLAB 9.2 software. The level of
Results
Hot Spot versus Computer-Assisted Analysis
Intra- and peritumoral lymphatic vessel density
were first assessed using the hot spot technique by
two independent operators according to the method
described by Weidner et al32 and then compared
with that determined by a computerized method on
46 cases of early cervical cancers. Inter-observer
variability obtained after quantifications within
the hot spot regions reaches 33.8% and 23.6% for
Modern Pathology (2013), 1–12
90
Computerized lymphatic network analysis
6
C Balsat et al
intra- and peritumoral lymphatic vessel density,
respectively. Also intra-observer variation exceeds
40% for both intra- and peritumoral lymphatic vessel
density. Using the computer-assisted technique, we
first determined that 93±3.5% of the lymphatic
vessels can be accurately detected on whole tissue
sections. Moreover, the quantification of intra- and
peritumoral lymphatic vessel density on five
successive slides reveals that the variability does
not exceed 5%.
Lymphatic Vessel Density
When analyzing the lymphatic vasculature of the
benign cervical stroma, we observe a prominent
lymphatic vessel density from the basal layer of the
epithelium to a depth of 2 mm. Beyond this depth,
lymphatic vessels are sparsely distributed and show
a significant and acute drop in density (Po0.0001;
Figures 3a and b). Based on this observation, the
lymphatic vasculature has been characterized thereafter in the stromal layer located within 2 mm of the
adjacent subepithelial basal membrane or the
nearest neoplastic invasive tumor edge. When
considering specifically the stroma of exocervical,
endocervical and transformation zone regions of the
normal cervix (Figures 3c–e), a high lymphatic
vessel density is detected under the transformation
zone. In the transformation zone and exocervix,
lymphatic vessels are distributed homogeneously
Figure 3 (a) Binary image of benign cervical tissue section. The green line represents the bottom limit of the stromal layer located within
2 mm of depth from the epithelium basis. (b) Lymphatic vessel density measured within 2 mm of depth in comparison with that detected
beyond this limit in benign cervical tissue. (c–e) Lymphatic vessel immunostaining (D2-40, pink) within the exocervix, the
transformation zone and the endocervix in benign cervical tissue. For the endocervix, pure glandular epithelium (left) and immature
squamous metaplastic zone (right) were presented. (f) Lymphatic vessel density measured under the three anatomical regions of the
benign uterine cervix (Endo, endocervix; Exo, exocervix; TZ, transformation zone). (g–i) Lymphatic vessel (D2-40, pink) and neoplastic
cells (p16INK4a, brown) immunostaining for (g) CIN3, (h) microinvasive and (i) 1B1 cervical neoplasia. (j) Lymphatic vessel density
measured within the perineoplastic area of CIN3, microinvasive (MI) and 1B1 cervical lesions in comparison with non-pathological
condition represented by the transformation zone of benign cervix (BC_TZ). Lymphatic vessel densities are expressed as the number of
lymphatic vessel sections/mm2. Scale bars represent 500 mm. *Po0.05, ***Po0.001.
Modern Pathology (2013), 1–12
91
Computerized lymphatic network analysis
7
C Balsat et al
Figure 3 (Continued).
Figure 4 (a) Double immunostaining of lymphatic endothelial cells (D2-40, pink) and proliferating cells (Ki67, brown). Magnification
represents a proliferating lymphatic vessel with Ki67-positive endothelial cell (arrow) next to a section with quiescent endothelial cell
(arrow head). Scale bar represents 500 mm. (b) Proliferating lymphatic vessel density measured under the three anatomical regions of the
benign uterine cervix (Endo, endocervix; Exo, exocervix; TZ, transformation zone). (c) Proliferating lymphatic vessel density measured
within the perineoplastic area of CIN3, microinvasive (MI) and 1B1 cervical lesions in comparison with non-pathological condition
represented by the transformation zone of benign cervix (BC_TZ). Proliferating lymphatic vessel density is expressed as the number of
lymphatic vessel sections/mm2. *Po0.05, **P40.01, ***Po0.001.
while at the level of endocervix, they are heterogeneously distributed with low lymphatic vessel
density under pure glandular epithelium and high
lymphatic vessel density under immature squamous
metaplastic zones that may be regarded as a focal
transformation zone effect. The transformation zoneassociated lymphatic vessel density is higher than
lymphatic vessel density observed under the
exocervix (P ¼ 0.0115) and not statistically different
from that measured under the endocervix
(P ¼ 0.2475; Figure 3f).
Given the importance of the transformation zone
in cervical oncogenesis,26,27 we next compared
lymphatic vessel density under the transformation
zone of benign cervix, CIN3, microinvasive and
stage IB1 invasive neoplasia (Figures 3g–i). No
difference is seen between these different stages of
cancer progression (transformation zone/CIN3
Modern Pathology (2013), 1–12
92
Computerized lymphatic network analysis
8
C Balsat et al
Table 1 Association between intra- and peritumoral LVD and
clinicopathologic tumor feature (LVSI and lymph node status)
Intratumoral LVD
Peritumoral LVD
Mean±s.d.
P-value
Mean±s.d.
P-value
Nodal metastasis
Absent (n ¼ 34)
Present (n ¼ 12)
8.57±7.47
7.78±3.79
0.7214
9.52±4.12
9.33±6.03
0.4455
LVSI
Absent (n ¼ 21)
Present (n ¼ 25)
7.10±7.80
9.21±5.62
0.0550
8.76±4.64
10.72±6.27
0.3777
Abbreviations: LVD, lymphatic vessel density; LVSI, lymphovascular
space invasion.
Results are represented as mean value±s.d. The Mann–Whitney test
was performed for comparison.
The stromal density of proliferating lymphatic
vessels is again higher under the transformation
zone than under the exocervix (P ¼ 0.0114;
Figure 4b). Transformation zone-associated proliferating lymphatic vessel density appears similar in
benign cervix, CIN3 (P ¼ 0.6189) and microinvasive
lesions (P ¼ 0.0889; Figure 4c). Proliferating lymphatic vessel density appears reduced in stage IB1
cervical cancers compared with microinvasive
lesions (Po0.0001), CIN3 (P ¼ 0.0081) and benign
cervix (P ¼ 0.0032).
Lymphatic Vessel Distribution
Figure 5 (a) Lymphatic vessel distribution under the three
anatomical regions of the benign uterine cervix (Endo, endocervix; Exo, exocervix; TZ, transformation zone). (b) Lymphatic
vessel distribution within the perineoplastic area of CIN3,
microinvasive (MI) and 1B1 cervical lesions in comparison with
non-pathological condition represented by the transformation
zone of benign cervix (BC_TZ). Curves were normalized taking
the maximum of the control curve at one.
P ¼ 0.0927,
transformation
zone/microinvasive
P ¼ 0.5288, transformation zone/invasive 1B1 cancers P ¼ 0.4349; Figure 3j). A further in depth
quantification shows that a higher lymphatic vessel
density is detected in the peritumoral area of IB1
cervical neoplasia compared with what was found
in the ‘deep tissue’ of benign cervical tissue, stroma
where lymphatic vessel density was initially low
(superior to 2 mm from the adjacent epithelium;
Supplementary Figure S1).
In order to specifically investigate the lymphangiogenic activity, proliferating lymphatic vessels
were detected by double immunostaining using
anti-D2/40 and anti-Ki67 antibodies (Figure 4a).
Modern Pathology (2013), 1–12
To better characterize the lymphatic vascular network, a global stromal analysis has been achieved by
determining the distribution of lymphatic vessels in
the region surrounding the epithelial layer in
normal, preinvasive and invasive conditions. This
generates vessel distribution curves allowing to
determine the precise depth at which maximal
vessel density is observed. In benign cervix, the
distribution curve confirms the close vicinity
between the lymphatic vessels and the epithelium
basal membrane, both under the transformation
zone and under the endocervix (Figure 5a). Indeed,
the lymphatic vessel number peaks at a distance of
0.30 mm±0.12 of depth under transformation zone
and 0.31 mm±0.23 under the endocervix, respectively. Oppositely, under the exocervix, the maximal
vessel number is detected at 0.65 mm±0.52 to the
epithelium, reaches a minimal value and remains
constant thereafter. Notably, under the neoplastic
epithelia, a shift of lymphatic vessel distribution
toward the tumor edges is detected (Figure 5b).
Indeed, the maximal lymphatic vessel density peaks
at a lower distance under neoplasia compared
with that found under the transformation zone of
benign cervix (CIN3 ¼ 0.13 mm±0.07, microinvasion ¼ 0.13 mm±0.08 and IB1 cervical cancers ¼
0.11 mm±0.07 versus transformation zone of benign
93
Computerized lymphatic network analysis
9
C Balsat et al
cervix ¼ 0.30±0.12; Po0.05). Moreover, at this
depth, a significant increase of relative vessel
number (ranging from 60 to 89%) is observed under
the neoplastic lesions.
Association between Lymphatic Vessel Density and
Spatial Distribution with Lymph Node Status and
Lymphovascular Space Invasion in IB1 Cervical
Cancer
We next focused our investigation on early stage
cervical cancer patients (FIGO stage IB1) by exploring intra- and peritumoral lymphatic vasculature.
Lymphatic vessel density and spatial lymphatic
distribution were tested for their ability to predict
lymphovascular space invasion and lymph node
status. Intra- and peritumoral global lymphatic
vessel density are neither associated with lymph
node status nor with lymphovascular space invasion
positivity (Table 1). Conversely, a smaller distance
between the entire peritumoral lymphatic vessels
and tumor edges is associated with those related
lymphatic dissemination parameters (positive lymphovascular space invasion ¼ 0.483 mm±0.2 versus
negative lymphovascular space invasion ¼ 0.640±
0.21 mm, P ¼ 0.0162 and positive lymph node ¼
0.388±0.19 versus negative lymph node ¼ 0.66
mm±0.19, P ¼ 0.0039; Figures 6a and b). In fact, a
detailed analysis of the lymphatic vessel spatial
distribution reveals that while the number of peritumoral lymphatic vessels peaks at similar distance
of the tumor edges (positive lymphovascular space
invasion ¼ 0.11 mm±0.04 negative lymphovascular
space invasion ¼ versus 0.13 mm±0.05; P40.05 and
positive lymph node ¼ 0.10±0.07 versus negative
lymph node ¼ 0.013±0.04; P40.05), a higher number at this depth is correlated with lymphovascular
space invasion (Po0.05) and lymph node metastasis
(Po0.01; Figures 6c and d).
Discussion
Figure 6 (a, b) Mean vessel distance between peritumoral
lymphatic vessels and the tumor edges. (c, d) Lymphatic vessel
distribution analysis within the peritumoral area of 1B1 cervical
cancers. Comparisons were performed regarding the presence/
absence of lymphatic vascular space invasion (LVSI) and lymph
node status (N þ /N ). Curves were normalized taking the
maximum of the control curve at one. *Po0.05, **Po0.01.
In early cervical cancer, the tumor lymphatic
vasculature profile is thought to be useful to early
predict the risk of lymph node extension. However,
owing to several limitations associated to the
conventional hot spot technique, no consensus
currently exists. In the present work, a detailed
analysis of the global cervical lymphatic vasculature
has been performed using an original and reproducible quantitative computerized assisted method.
We describe for the first time a prominent
lymphatic vessel density under the transformation
zone of healthy cervical tissues, which has been
characterized 30 years ago as the anatomical region
where precancerous and cancerous lesions develop.26 Interestingly, no statistical difference between
the transformation zone and the endocervix is due to
the presence of immature metaplasia, zones that
may be regarded as having a focal transformation
Modern Pathology (2013), 1–12
94
Computerized lymphatic network analysis
10
C Balsat et al
zone effect in the endocervix. The transformation
zone is increasingly drawing the attention of
researchers. It results from a metaplastic conversion of glandular epithelial cells into squamous
epithelium in response to a repetitive hormone
induce vaginal pH acidification and sexual intercourse injury.33 This metaplastic process is often
associated with local deregulation of cytokine and
chemokine production as well as inflammatory
response. Herfs et al34 hypothesized that this could
lead to the establishment of an immunosuppressive
microenvironment and potentiate tumor cell
progression to the underlying stroma. Moreover, an
elegant study reported that only a discrete population of cells at the squamocolumnar junction
would be the precursors for most HPV-associated
cervical carcinomas.27 In this context, the presence
of a lymphangiogenic niche under the transformation zone of healthy cervical tissues reported herein
suggests the existence of a specific microenvironment that could contribute to cancer progression.
These data also argue that for using this region as a
control to which neoplastic lymphatic vasculature
has to be compared.
To date, an early lymphangiogenic switch during
uterine cervical neoplasia progression appears well
accepted in the literature. Schoppmann et al35 were
first to observe a marked lymphatic vessel density
under preinvasive lesions compared with normal
cervical tissue but this failed to reach statistical
significance. These results were then confirmed in
three other studies that found a significant increase
of lymphatic vessel density under CIN2/3 lesions or
carcinoma in situ.10,11,15 A further rise of lymphangiogenesis in cervical cancers is supported by
Longattho-Filho and Yang’s studies10,14 while contradictory results were reported by Schoppmann
et al35 and Gombos et al.15 Recently, Cimpean et al12
showed an activation of the lymphangiogenic activity in preinvasive and microinvasive before
decreasing its intensity in early cervical cancers.
However, in most studies, stromal region of benign
cervical tissue that was considered as nonpathological condition (exocervix, endocervix or
transformation zone) was either not mentioned10,35
or corresponded to the exocervix.12,15,36 Discrepancies between early increase of lymphatic vessel
densities and our results showing a similar lymphatic vessel density detected under the transformation zone of benign cervix and preinvasive lesions
are thought to be due to an inappropriate choice for
the stromal region of benign cervix considered as
control.
In our experience, during early steps of cancer
progression (CIN3, micro-invasion and FIGO 1B1
neoplasia), no increase of lymphatic vessel density
is found when compared with transformation zone
of benign cervix. Our further observations of
lymphatic vessel distribution indicate that, lymphatic vessel density maintains a stable level through
the different stages of the neoplastic process
Modern Pathology (2013), 1–12
secondary to lymphangiogenesis occurring in the
deep tissue surrounding tumor invasive front in the
stroma where lymphatic vessel density was initially
low (superior to 2 mm from the adjacent epithelium). Moreover, the presence of Ki67-positive
lymphatic vessels under any degrees of neoplasia
supports that an ongoing lymphangiogenesis occurs
during cancer progression. Interestingly, topographical modifications with a shift of lymphatic
vessels toward the neoplastic edges are detected.
Especially, despite similar lymphatic vessel density,
a significant increase of the relative vessel number
in the vicinity of neoplasia is found when compared
the transformation zone of benign cervix. In accordance with the lymphangiogenic switch presented
above, recent data reported high expression of
VEGF-C and/or VEGF-D by neoplastic cells before
the invasive process.9,11 In addition, Issa et al37
demonstrated that VEGF-C can promote tumor cell
migration toward lymphatic vessels by increasing
their proteolytic activity and motility as well as
lymphatic secretion of the chemoattractive protein
CCL21. Therefore, this supports the concept that
lymphangiogenesis occurring during cancer progression is a continuum of the lymphangiogenic activity
already present under the transformation zone of the
benign cervix.
In patients with early cervical cancer, the lymphatic vessel density was proposed as a new
promising factor capable to predict lymph node
extension. Especially, most clinical studies showed
that peritumoral lymphatic vessel density is associated with an aggressiveness behavior and appeared as a strong predictive factor of lymph node
metastasis.14–21,36 However, contradictory results
were reported by three others groups.10,23,24 Interestingly, a few years ago, Van der Auwera et al22
proposed that these discrepancies are caused by a
lack of reproducibility when lymphatic vessel
density is measured by the conventional optical
microscopy (hot spot technique). They highlighted
that reliable quantification technique needs to be
developed for lymphangiogenesis quantification in
human solid tumors. In the present work, we
confirm that lymphatic vessel density determination through the hot spot technique is subjected to
high intra- and inter-observer variability. On the
contrary, the proposed computerized method shows
high accuracy and reproducibility in lymphatic
vessel detection. When global analysis of tumor
lymphatic vasculature is performed, intra- and
peritumoral lymphatic vessel density do not
correlated neither to lymph node metastasis nor to
lymphovascular space invasion. Nevertheless, we
demonstrate that the distribution of the lymphatic
vasculature must be taken into consideration when
characterizing the lymphatic vessel density. Indeed,
in IB1 cervical cancer, while similar lymphatic
vessel density is found, an increase of the relative
vessel number in the vicinity of the tumor edges is
associated with lymphovascular space invasion and
95
Computerized lymphatic network analysis
11
C Balsat et al
lymph node metastasis. This indicates that interactions between tumor and lymphatic endothelial
cells leading to a modification of the spatial
distribution of the lymphatic network could
promote tumor cell dissemination. In this context,
we aim to draw fundamental scientist’s attention on
the interest of a better characterization of the tumor
and lymphatic endothelial cell interactions. A better
understanding of such mechanisms could help to
find new specific predictive maker of lymph node
dissemination.
In conclusion, thanks to a novel computerassisted technique, a detailed reproducible and
reliable quantification of the lymphatic vasculature
can be performed on any immunostained tissue.
This approach allows to overcome limitations
associated with the hot spot technique and opens
new perspectives in the field of pathology. Notably,
we demonstrate that the spatial lymphatic vessel
distribution has to be taken into account when the
risk of nodal extension is tested. For these reasons,
we argue that global analysis of the tumor vasculature is preferable to the traditional focal hot spot
analysis. Moreover, such analysis highlights the
need to concentrate on a better understanding of
tumor cell and lymphatic vessel interactions that are
involved in topographical modifications of the
lymphatic vasculature during cancer progression.
Of great interest is our finding of a specific
lymphangiogenic niche under the transformation
zone where cell transformation occurs. Finally,
similarly to cervical cancer, prognostic value of the
tumor lymphatic vessel density has been studied in
other human solid tumors such as breast, colorectal,
prostate, non-small cell lung cancers and melanoma
and interestingly contradictory results were frequently observed.38 Consequently, the technology
developed in this study could potentially be used to
better characterize the lymphatic vasculature and
the risk of nodal extension in the context of other
tumors.
Acknowledgments
We address a particular acknowledgment to Paulette
Herlin from Groupe de recherche en informatique,
image, automatique et instrumentation of Caen
(GREYC, University of Caen, France) for her technical support for image decimation. This work was
supported by grants from the FP7-HEALTH-2007-A
proposal no. 201279 ‘MICROENVIMET’, the Fonds
de la Recherche Scientifique Médicale, the Fonds de
la Recherche Scientifique—FNRS (FRS—FNRS,
Belgium), the Foundation against Cancer (foundation of public interest, Belgium), the CGRI—FNRS—
INSERM Coopération, the Fonds spéciaux de la
Recherche (University of Liège), the Centre Anticancéreux près l’Université de Liège, the Fonds Léon
Fredericq (University of Liège), the Direction
Générale Opérationnelle de l’Economie, de l’Emploi
et de la Recherche from the SPW (Région Wallonne,
Belgium), the Fonds Social Européen (FSE, Belgium),
the Fonds d’Investissements de la Recherche Scientifique (FIRS, CHU, Liège, Belgium), the Interuniversity Attraction Poles Programme—Belgian Science
Policy (Brussels, Belgium), the Plan National Cancer
(Service Public Fédéral). The Actions de Recherche
Concertées (University of Liege, Belgium). CB is
recipient of a Télévie-FNRS grant.
Disclosure/conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
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Supplementary Information accompanies the paper on Modern Pathology website (http://www.nature.com/
modpathol)
Modern Pathology (2013), 1–12
97
Résultats
IV. Résultats complémentaires
1. LVD et métaplasie
Lors de l’étude détaillée de la vascularisation lymphatique des cols sains, une
distribution hétérogène de ce réseau a été rapportée sous la région endocervicale. Une LVD
élevée est généralement observée sous les régions de l’endocol présentant une métaplasie
immature contrairement aux régions "purement glandulaires" sous lesquelles une faible LVD
est détectée (figure 28A). Nous avons ainsi suggéré que l’absence d’une différence
significative entre les LVD quantifiées sous l’endocol et la zone de transformation pourrait
être due à la présence de ces zones de métaplasies immatures. Afin de tester cette hypothèse,
la vascularisation lymphatique uniquement présente sous les régions "purement glandulaires"
de l’endocol a été comparée à celle détectée sous la zone de transformation. Dans ce cas, une
diminution de la LVD initialement détectée sous l’endocol complet est observée. Cette LVD
nouvellement mesurée apparaît dès lors inférieure à celle détectée sous la zone de
transformation (figure 28B).
A
B
*
30
*
LVD
20
10
En
do
ZT
Ex
o
0
Figure 28 : (A) Vaisseaux lymphatiques (rouge) présents sous l’épithélium "purement glandulaire" (gauche) et
sous les zones de métaplasies immatures (droite) au niveau de l’endocol d’un cas de col sain. Un agrandissement
de l’épithélium métaplasique est présenté dans l’encadrement. La barre d’échelle représente 500µm. (B)
Quantification de la densité en vaisseaux lymphatiques sous les régions "purement glandulaires" de l’endocol
(Endo) comparativement à l’exocol (Exo) et la zone de transformation (ZT). *p<0,05.
98
Résultats
2. Inflammation
Le processus de métaplasie menant à la formation et l’élongation de la zone de
transformation est fréquemment associé à un recrutement de cellules inflammatoires pouvant
mener au développement d’une réponse inflammatoire chronique [53, 54]. Chez l’homme, la
lymphangiogenèse est un évènement intimement lié à l’inflammation chronique [155].
Certaines cellules inflammatoires telles que les macrophages peuvent notamment exprimer
des facteurs lymphangiogènes en réponse à la libération de cytokines pro-inflammatoires [6467]. Dans ce contexte, nous avons testé si un microenvironnement inflammatoire était
également présent sous la zone de transformation des cols sains au niveau de laquelle une
LVD maximale a été mise en évidence. Pour ce faire, une analyse de la densité en cellules
inflammatoires totales ainsi qu’en macrophages dans les différentes régions du col sains
(exocol, zone de transformation et endocol) a été réalisée par immunohistochimie à l’aide
d’anticorps respectivement dirigés contre les protéines CD45 et CD68. Les résultats ont été
obtenus après une analyse informatique des images digitales réalisée sur l’ensemble du stroma
sous-épithélial, jusqu’à une profondeur de 2 mm.
Comparativement à l’exocol, une densité supérieure en cellules inflammatoires totales
ainsi qu’en macrophages est détectée sous la zone de transformation des cols sains. De
manière similaire à ce qu’il avait été observé pour la densité en vaisseaux lymphatiques totaux
et en prolifération, aucune différence significative entre l’endocol et la zone de transformation
n’est observée (figure 29).
5
2
1
0
En
do
ZT
Ex
o
0
3
En
do
10
**
ZT
*
4
Ex
o
15
Densité en surface (CD68)
B
Densité en surface (CD45)
A
Figure 29 : Quantification assistée par ordinateur de la densité en surface (A) des cellules inflammatoires totales
ainsi que (B) des macrophages dans les 3 régions anatomiques des cols sains (Exo = exocol, ZT = zone de
transformation et Endo = endocol) jusqu’à une profondeur de 2 mm.
99
Résultats
3. Lymphangiogenèse : VEGF-C
Parallèlement à la densité en vaisseaux lymphatiques totaux et en prolifération, le
VEGF-C, principal facteur de croissance lymphangiogène, a également été étudié par
immunohistochimie afin de préciser l’activité lymphangiogène présente au niveau des cols
sains ainsi que dans les lésions cancéreuses du col utérin. Tout d’abord, une comparaison de
la densité et de l’intensité de marquage VEGF-C a été réalisée entre les 3 régions anatomiques
des cols sains. Par la suite, ces paramètres ont été quantifiés dans les lésions néoplasiques de
stade FIGO IB1 et comparés au statut ganglionnaire ainsi qu’à la présence/absence d’emboles
lymphatiques. Les résultats ont été également obtenus après une analyse informatique
d’images digitales.
a) Le col sain
Le VEGF-C est immuno-détecté dans le cytoplasme des cellules localisées dans le
stroma sous-épithélial (figure 30A). Ces cellules sont petites, présentent une forme arrondie
ainsi qu’un rapport nucléo-cytoplasmique élevé, morphologie caractéristique des cellules
inflammatoires. Une analyse automatique assistée par ordinateur révèle que, sous la zone de
transformation, la densité de marquage est supérieure à celle observée sous l’exocol (figure
30B). Cependant, une fois encore, aucune différence entre l’endocol et la zone de
transformation n’est observée. Enfin, dans chaque région, l’intensité de marquage moyen est
identique (figure 30C).
B
0.6
0.4
0.2
en
do
ZT
0.0
5
4
3
2
1
0
Figure 30 : Etude du marquage VEGF-C dans les cas de cols sains. (A) Immunomarquage des cellules localisées
au niveau du stroma sous-épithélial de la zone de transformation. (B) Densité et (C) intensité de marquage
détectées dans les 3 zones des cols sains (Exo = exocol, ZT = zone de transformation et Endo = endocol) jusqu’à
une profondeur de 2 mm.
100
En
do
0.8
6
ZT
1.0
**
Ex
o
*
VEGF-C intensité (10 6 (-)/mm²)
C
Ex
o
VEGF-C (densité en aire)
A
Résultats
b) VEGF-C et paramètres cliniques
Dans les néoplasies cervicales de stade FIGO IB1, un marquage VEGF-C est observé
au niveau du cytoplasme des cellules tumorales et de celui des cellules du stroma péritumoral.
La densité ainsi que l’intensité de marquage détectées ont ensuite été comparées au statut
ganglionnaire et à la présence d’emboles lymphatiques. Dans tous les cas, le profil de
marquage VEGF-C n’est pas corrélé à ces paramètres cliniques de dissémination lymphatique
(figure 31).
B
S
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
N-
T
NS
0.5
N+
VEGF-C (densité en aire)
A
D
2
N+
N-
0
0.3
0.2
0.1
6
4
2
0
0.0
LV
SI
+
4
0.4
NS
8
LV
SI
-
6
Intensité (10^6 (-)/mm²)
VEGF-C (densité en aire)
Intensité (10^6 (-)/mm²)
8
E
NS
0.5
LV
SI
+
NS
LV
SI
-
C
Figure 31 : (A) Mise en évidence du facteur de croissance lymphangiogène VEGF-C dans les cas de cancers du
col de stade FIGO IB1. Les cellules Tumorales "T" et certaines cellules du stroma "S" sont immunomarquées.
(B, C, D et E) Quantification informatique de la densité et de l’intensité de marquage. (B et C) Comparaison de
la densité et de l’intensité de marquage en fonction du statut ganglionnaire (N+/N-). (D et E) Comparaison de la
densité et de l’intensité de marquage en fonction de l’absence (LVSI-) ou de la présence (LVSI+) d’emboles
lymphatiques détectés lors de l’examen histologique. NS est l’abréviation de non significatif.
101
Résultats
4. Lymphangiogenèse : vaisseaux en cours de prolifération
La valeur diagnostique potentielle de la lymphangiogenèse en cours sur le risque de
dissémination ganglionnaire a également été analysée. Pour ce faire, la densité en vaisseaux
lymphatiques péritumoraux en cours de prolifération a été confrontée aux paramètres
cliniques de dissémination lymphatique (LVSI et métastase ganglionnaire). Aucune
corrélation entre la densité en vaisseaux lymphatiques en cours de prolifération et le statut
ganglionnaire ainsi que la présence d’emboles lymphatiques n’est observée (figure 32).
NS
NS
0.25
Prolifarating LVD
0.20
0.15
0.10
0.05
0.00
0.20
0.15
0.10
0.05
+
N
-
LV
SI
+
LV
S
I-
0.00
N
Proliferating LVD
0.25
Figure 32 : Corrélation entre la densité en vaisseaux lymphatiques en cours de prolifération (proliferating LVD)
et les paramètres cliniques de dissémination ganglionnaire : présence/absence d’emboles lymphatiques
(LVSI+/LVSI-) et le statut ganglionnaire (N+/N-). NS est l’abréviation de non significatif.
5. Paramètres morphologiques
Plusieurs études rapportent que les vaisseaux lymphatiques localisés en pérphérie de la
tumeur peuvent présenter une dilatation de leur lumière [210, 220]. Il est proposé qu’une
augmentation abrupte de la pression du fluide interstitiel consécutive à une croissance
tumorale rapide pourrait expliquer cette augmentation de taille des vaisseaux localisés en
périphérie de la tumeur. Zhang et al soutiennent qu’un nombre accru de vaisseaux
lymphatiques "dilatés" pourrait avoir un impact favorable sur le risque de dissémination
tumorale [220]. Afin de tester la valeur pronostique de la morphologie des vaisseaux
lymphatiques sur le risque de dissémination ganglionnaire, l’aire et la circularité (indice de
"rondeur" compris entre 0 et 1, dont la valeur la plus élevée indique la présence d’un rond
parfait) des vaisseaux lymphatiques ont été corrélées à la présence/absence d’emboles
lymphatiques ainsi qu’au statut ganglionnaire (Tableau 7). Il apparaît que l’aire des vaisseaux
102
Résultats
lymphatiques n’est corrélée ni à la présence d’emboles lymphatiques ni au statut
ganglionnaire. Une circularité accrue est néanmoins corrélée au statut ganglionnaire.
Cependant, étant donné la faible différence entre les cas N+ et N- (2,5% en moyenne), la
signification biologique de cette différence est discutable.
Tableau 7: Corrélation entre l’aire/circularité des vaisseaux lymphatiques et les paramètres
cliniques de dissémination ganglionnaire (LVSI et métastase ganglionnaire)
Aire (µm²)
Moyenne ± DS
P value
Circularité (%)
Moyenne ± DS
P value
Métastase ganglionnaire
Absent (n=34)
Présent (n=12)
1120 ± 357,1
1341,2 ± 620,8
0,3612
67,7 ± 3,5
70,3 ± 3,9
0,0390
0,1517
67,8 ± 3,6
68,8 ± 3,8
0,4020
Embole lymphatique
Absent (n=21)
Présent (n=25)
1277,2 ± 462,9
1060,9 ± 400,1
Les résultats sont présentés sous forme de moyennes ± déviation standard (DS).
6. Résultats complémentaires : conclusions
Nos résultats complémentaires indiquent que :
-
Au niveau des cols sains, la détection d’une LVD proéminente peut être associée à la
présence de zones de métaplasies. Cette observation soutient l’existence d’un
microenvironnement lymphangiogène sous la zone de transformation, résultat d’une
conversion métaplasique de l’épithélium glandulaire en un épithélium squameux en
réponse à une agression répétée de la zone de jonction.
-
Parallèlement à un réseau dense en vaisseaux lymphatiques, un microenvironnement
inflammatoire composé de cellules capables de produire du VEGF-C est également
présent sous la zone de transformation des cols sains.
-
La lymphangiogenèse active (VEGF-C et densité en vaisseaux en cours de
prolifération) n’apparaît pas comme un marqueur d’extension ganglionnaire. Cette
observation est en accord avec nos précédents résultats obtenus après quantification
de LVD péritumorale globale.
-
Les paramètres morphologiques des vaisseaux lymphatiques n’apparaîssent pas
comme des marqueurs d’extension ganglionnaire.
103
Résultats
Résultats principaux
La technique de hot-spot, basée sur l’analyse d’une surface de 0,6 mm² de tissu et
utilisée pour la quantification de la LVD, présente une variabilité intra et interobservateur
importante. Dans le cadre de ce travail, celles-ci ont été respectivement estimées à 45,2% et
33,8% pour la quantification de la LVD intratumorale ainsi que 40,2% et 23,6% pour la
quantification de LVD péritumorale. A l’inverse, la technique d’analyse d’images originale
que nous avons développée permet de détecter plus de 93% de la totalité des vaisseaux
lymphatiques sur la surface totale d’un tissu avec un taux de variabilité inférieur à 5%. De
plus, celle-ci permet de réaliser une caractérisation détaillée et objective de la
vascularisation lymphatique tout en tenant compte de l’hétérogénéité tumorale.
A l’aide de notre technique d’analyse d’images, nous avons observé qu’au niveau du
col sain, une LVD significativement plus importante est présente jusqu’à une profondeur de 2
mm par rapport à celle mesurée au-delà de cette profondeur. Parmi cette région périépithéliale, les densités en vaisseaux lymphatiques totaux et en cours de prolifération sont
plus élevées au niveau de la zone de transformation que dans la région l’exocervicale et non
significativement différentes de celles détectées au niveau de l’endocol. Comparativement à la
zone de transformation, une LVD identique a été observée aux différents stades clés de la
progression tumorale (CIN3, micro-invasion et stade FIGO IB1). Par contre, la densité
maximale en vaisseaux lymphatiques est observée à une distance plus faible du bord des
lésions néoplasiques, et à cet endroit, une augmentation significative de la proportion en
vaisseaux lymphatiques a été détectée.
Dans les lésions cancéreuses de stade FIGO IB1, les densités en vaisseaux
lymphatiques totaux intra et péritumoraux ainsi que la densité en vaisseaux lymphatiques en
cours de prolifération dans la région péritumorale ne sont pas corrélées au statut
ganglionnaire et à la présence d’emboles lymphatiques. Par contre la présence d’un nombre
significativement plus important de vaisseaux lymphatiques à proximité immédiate du bord
des cellules néoplasiques a été corrélée à un statut ganglionnaire positif et à la présence
d’emboles lymphatiques.
104
DISCUSSION ET
PERSPECTIVES
105
Discussion et perspectives
Le cancer cervical de stade débutant représente 50% des néoplasies cervicales
diagnostiquées annuellement en Europe. Il succède à un état précancéreux, HPV induit,
prenant naissance au niveau de la zone de transition squamocylindrique [48, 49]. Le mode
préférentiel de dissémination est lymphatique et son risque croît avec le volume tumoral et la
profondeur d’invasion stromale [88, 89, 110]. Le pronostic du néoplasme cervical débutant est
favorable avec un taux de survie sans récidive de 85% à 5 ans au prix d’une approche
thérapeutique associant une résection radicale de la tumeur primitive et la stadification du
réseau ganglionnaire pelvien [109]. Le statut histologique de ce dernier représente le facteur
pronostic principal de la pathologie [93, 105]. Un intérêt particulier s’est récemment porté sur
le versant lymphatique du plan thérapeutique. La caractérisation de variables tumorales
prédictives d’une extension ganglionnaire d’une part et le ciblage de la stadification
lymphatique par la technique du ganglion sentinelle d’autre part, contribuent chacune à limiter
la morbidité thérapeutique potentielle.
La lymphangiogenèse est décrite comme un évènement central favorisant la
dissémination des cellules néoplasiques jusqu’aux ganglions locorégionaux [191-201]. La
densité en vaisseaux lymphatiques (LVD) péritumorale est proposée comme un facteur
pronostique prometteur d’extension ganglionnaire [210, 212, 215, 216, 219-226]. Cependant,
en raison du manque d’objectivité et de reproductibilité qui caractérise la technique de hotspot aucun consensus n’a actuellement pu être établi à ce sujet [214, 227-229]. Van der
Auwera et al ont conclu que le développement d’une méthode robuste caractérisée par un taux
de reproductibilité important était requise afin de vérifier le potentiel pronostique éventuel de
la LVD [184]. Conscients de la nécessité de dépasser les principales limitations associées à la
technique de hot-spot pour la quantification de la vascularisation lymphatique, nous avons
développé une nouvelle technique originale basée sur l’analyse informatique d’images
digitales. Celle-ci permet de détecter à haute résolution plus de 93% des vaisseaux
lymphatiques contenus sur la totalité d’un tissu avec un taux de variation inférieur à 5%.
Précédemment, d’autres systèmes d’analyse d’un réseau vasculaire à partir d’images digitales
avaient été décrits [265, 266, 268]. Cependant, ceux-ci s’avèrent incapables de détecter de
manière précise les vaisseaux sur la totalité du tissu. En effet, la principale problématique liée
à la détection automatique à partir d’images virtuelles réside dans la gestion de la taille de ces
images. Celles-ci peuvent bien souvent excéder la capacité en mémoire RAM des ordinateurs
actuels. Dès lors, ces études se sont concentrées soit sur la totalité du tissu acquis à faible
résolution, méthode ne permettant pas une détection précise des vaisseaux lymphatiques, soit
106
Discussion et perspectives
sur une surface restreinte acquise à haute résolution. Afin de contourner cette problématique,
les méthodes de compression sans perte d’informations LZW et de traitement par blocs de
l’image ont été inclues lors de la mise au point de notre méthode. La technique d’analyse
d’images développée dans le cadre de ce travail représente, à notre connaissance, le
premier système permettant de réaliser une étude robuste et reproductible de la
vascularisation lymphatique sur la surface totale de tissus immunomarqués.
Conjointement au gain de robustesse et de reproductibilité, la technique que nous
avons développée permet également de réaliser une caractérisation détaillée de la
vascularisation lymphatique tout en tenant compte de l’hétérogénéité tumorale. La génération
d’images binaires contenant la totalité des structures d’intérêt ouvre également de nouvelles
perspectives. Notamment, en plus des mesures classiques de densités en nombre et en aire
réalisées jusqu’à présent, des paramètres morphologiques telles que la taille, la circularité et
l’élongation des vaisseaux lymphatiques peuvent être analysés. Une nouvelle méthode de
quantification permettant de réaliser une étude de la distribution spatiale des vaisseaux
lymphatiques par rapport à la tumeur a également été développée. Celle-ci permet de
déterminer des modifications d’organisation spatiale pouvant potentiellement résulter
d’interactions établies entre les cellules tumorales et les cellules endothéliales lymphatiques.
A ce jour, de telles analyses ne pouvaient être réalisées à partir des techniques classiques de
microscopie conventionnelle. Pourtant, la dissémination lymphatique des cellules tumorales
est décrite comme un mécanisme complexe pouvant être influencé par différents facteurs
telles que la production intense de facteurs de croissance [206, 210, 212], une modification de
la pression du fluide interstitiel [168] ainsi que la production de chémo-attractants [171, 172].
Dès lors, il apparait qu’une analyse détaillée de la vascularisation lymphatique semble
indiquée pour l’étude des paramètres de risque de dissémination lymphatique. Plusieurs
groupes soutenaient également que le développement de nouveaux outils de quantification
permettrait de stimuler la recherche de nouveaux marqueurs biologiques pronostiques dans le
cadre d’études translationnelles [269, 270]. En accord avec ces demandes, la technique que
nous avons développée permet, dès à présent, d’analyser le réseau vasculaire
lymphatique de manière robuste, reproductible et détaillée dans le but d’obtenir une
meilleure caractérisation des phénomènes intervenant à l’interface entre les cellules
tumorales et le stroma périphérique.
Parallèlement aux avantages présentés ci-dessus, certaines limitations doivent être
discutées. La qualité des images digitales représente la principale problématique rencontrée.
107
Discussion et perspectives
La présence de poussières, débris, plis ou bulles au niveau de la coupe peut masquer une
partie de l’information et/ou induire l’acquisition de zones floues responsables d’erreurs lors
de la détection automatique assistée par ordinateur [271]. La réalisation d’un contrôle qualité
de l’image et la réalisation d’un nouveau scan de l’image peuvent, dans certains cas, être
responsables d’une perte de temps significative [272]. De même, afin d’obtenir un niveau de
reproductibilité élevé lors de la détection des vaisseaux lymphatiques, le respect d’une
méthode standard est obligatoire. Des modifications dans le protocole d’immunomarquage
et/ou d’acquisition des images pourraient être à l’origine d’une variabilité inter-laboratoires.
Finalement, la détection précise des structures d’intérêt à haute résolution et sur la totalité de
l’image requiert un délai pouvant atteindre jusqu’à une dizaine d’heures en fonction de la
taille du tissu. Par conséquent, notre méthode semble actuellement peu adaptée pour un usage
quotidien en pathologie clinique. Par contre, celle-ci se présente aujourd’hui comme la
méthode la plus appropriée pour l’étude globale de la vascularisation lymphatique dans
le cadre d’études expérimentales et translationnelles.
Un tableau récapitulatif des principaux avantages et limitations de la méthode
proposée est présenté ci-dessous (Tableau 8).
Tableau 8 : Tableau comparatif entre la technique de hot-spot et la technique d’analyse d’images
digitales.
HOT SPOT
IMAGES DIGITALES
ROBUSTESSE
Précision
Variabilité
Péritumorale
Intratumorale
Surface de tissu analysable
-
93
3,5%
23,6%
> 40%
< 5%
< 5%
0,6 mm²
Totalité du tissu
CARACTERISATION
DU RESEAU VASCULAIRE
LVD (nombre/mm²)
Applicable
Applicable
LVD (surface/mm²)
Approximation
Applicable
Paramètres morphologiques
Non applicable
Applicable
Distribution spatiale
Non applicable
Applicable
Vaisseaux lymphatiques
et sanguins
Pas de limitation
5 min par coupe
Dépend de la taille de l’image
(plusieurs heures par coupe)
Méthode de Weidner et al
Obligatoire
AUTRE
Marquage immunohistologique
analysable
LIMITATIONS
Temps
Standardisation
108
Discussion et perspectives
A l’aide de la technique d’analyse d’image digitale, une caractérisation détaillée de la
vascularisation lymphatique présente au niveau des tissus cervicaux a été réalisée. Celle-ci
nous a tout d’abord permis de rapporter l’observation originale selon laquelle une niche
lymphangiogène est présente sous la zone de transformation des cols sains. Des densités
maximales en vaisseaux lymphatiques totaux (LVD) et en cours de prolifération
("proliferating LVD") ont en effet été observées à cet endroit. En accord avec ces
observations, des résultats complémentaires indiquent la présence d’une LVD élevée sous les
zones de métaplasies immatures de l’endocol, métaplasie considérée comme processus
adaptatif menant à l’établissement et à l’élongation de la zone de transformation. Ceci suggère
donc que la mise en place et l’élongation de la zone de transformation s’accompagneraient
d’un processus de lymphangiogenèse. En 1983, Burghardt et al ont démontré que les
précurseurs de lésions néoplasiques se présentent majoritairement sous la forme d’une
métaplasie squameuse atypique localisée au sein de la zone de transformation [48].
Récemment, Herfs et al ont identifié la présence d’une population discrète de cellules souches
faisant partie de la zone de jonction squamocylindrique et suggèrent que ces cellules
représentent les réels précurseurs des lésions néoplasiques cervicales [49]. Parallèlement, la
présence d’un microenvironnement permissif semble requise pour la progression des lésions
néoplasiques. Une réduction de la densité en cellules présentatrices d’antigènes [59] ainsi
qu’une réponse inflammatoire chronique de type Th2 y ont notamment été décrites [58]. En
accord avec ce dernier, nous avons également observé la présence d’un infiltrat inflammatoire
composé de cellules produisant du VEGF-C sous la zone de transformation des cols sains que
nous avons analysés. Celles-ci pourraient expliquer la présence des densités maximales en
vaisseaux lymphatiques totaux et en cours de prolifération à cet endroit. De même, le fait que
la lymphangiogenèse soit reconnue comme un processus intimement lié à l’inflammation
chronique [63] est en accord avec notre observation d’un réseau vasculaire dense sous la zone
de transformation des cols sains. Ensemble, nos résultats soutiennent la présence d’une
niche lymphangiogène sous la zone de transformation des cols sains préalablement au
développement d’une lésion néoplasique.
Notre observation d’une niche lymphangiogène sous la zone de transformation ne
permet pas de déterminer le rôle qu’elle y joue. Nous suggérons cependant que la présence
d’un nombre important de vaisseaux lymphatiques pourrait faciliter la libération de l’infiltrat
inflammatoire à cet endroit comme cela est généralement décrit lors d’une réaction
inflammatoire chronique [64-67]. Récemment, de nouveaux éléments soutiennent également
109
Discussion et perspectives
un rôle immuno-modulateur des cellules endothéliales lymphatiques ainsi que des facteurs
exprimés au cours de la lymphangiogenèse pouvant mener au développement d’un milieu
propice au développement cancéreux [185, 187-190]. Dans ce contexte, nous émettons
l’hypothèse selon laquelle la présence d’une niche lymphangiogène sous la zone de
transformation pourrait participer activement à l’établissement d’un microenvironnement
favorable au développement des néoplasies cervicales à cet endroit. En accord avec cette
hypothèse, Alitalo et al ont récemment démontré, dans un modèle murin de mélanome
inductible, qu’une inhibition des VEGF-C et D induit une réduction du nombre de lésions
intra-épithéliales s’étant développées, ainsi qu’un retard dans le développement des lésions
invasives [186].
Actuellement, l’existence d’un "switch lymphangiogénique" précoce au cours de la
progression des néoplasies cervicales apparait largement acceptée. Schoppman et al furent les
premiers à observer la présence d’une LVD élevée sous les lésions pré-invasives
comparativement à des cols sains sans pour autant montrer de différences statistiquement
significatives [213]. Ultérieurement, plusieurs travaux démontrèrent une augmentation
marquée de la densité en vaisseaux lymphatiques sous les lésions CIN2/3 [210, 214]. Enfin,
Cimpean et al ont récemment mis en évidence que la présence du facteur de transcription
Prox-1 n’est observée qu’à partir des lésions CIN2 et 3 [273]. En contradiction avec ces
résultats, nous avons démontré qu’une LVD élevée est déjà présente sous la zone de
transformation des cols sains et que celle-ci n’est pas significativement différente de celle
mesurée sous les lésions CIN3. De plus, des vaisseaux lymphatiques en cours de prolifération
sont également déjà observés en l’absence de lésions néoplasiques. Nous expliquons ces
divergences par des différences dans le choix de la région du col utérin considérée comme
contrôle. En effet, dans la plupart de ces études, la région du col sain considérée comme non
pathologique était soit non mentionnée [213, 214, 273], soit correspondait exclusivement à la
région exocervicale [210]. Dans ce travail, nous soutenons qu’étant donné l’importance
de la zone de transformation lors de la carcinogenèse des néoplasies cervicales, celle-ci
doit être considérée comme la région contrôle à laquelle les mesures réalisées au cours
de la progression tumorale doivent être comparées.
A ce jour, plusieurs études soutiennent que le risque qu’une cellule tumorale entre en
contact avec un vaisseau lymphatique et dissémine jusqu’aux ganglions locorégionaux croît
graduellement tout au long de la progression tumorale. Une augmentation progressive de la
densité en vaisseaux lymphatiques au cours de la progression tumorale a notamment été
110
Discussion et perspectives
rapportée [214-216]. Cependant, des résultats contradictoires ont également été présentés et
ne permettent pas de confirmer cette hypothèse [210, 213]. Au cours de ce travail, nous avons
démontré que la LVD initialement mise en évidence sous la zone de transformation des cols
sains est maintenue aux différents stades clés de la progression tumorale (CIN3, microinvasion et stade FIGO IB1). L’analyse complémentaire de la répartition des vaisseaux
lymphatiques à travers les tissus révèle néanmoins l’existence d’une lymphangiogenèse tout
au long de l’invasion du stroma par les cellules tumorales. En effet, la LVD péritumorale
mesurée dans les cancers de col de stade FIGO IB1 s’avère significativement supérieure à
celle initialement mesurée au niveau du stroma profond des cols sains (localisé à plus de 2
mm du bord de l’épithélium). Par conséquent, nous soutenons l’existence d’une
lymphangiogenèse tumorale impliquée dans le maintien d’un microenvironnement dense en
vaisseaux lymphatiques initialement présent sous la zone de transformation des cols sains.
Ensemble, ces résultats suggèrent un rôle de "terreau" lymphangiogène propice au
développement et à la progression tumorale au niveau de la zone de transformation.
Malgré la présence d’une LVD similaire aux différents stades clés de la progression
tumorale (CIN3, micro-invasion et stade FIGO IB1), une modification de la distribution
spatiale des vaisseaux lymphatiques par rapport à la jonction "cellules néoplasiques/stroma"
des cellules néoplasiques a pour la première fois été mise en évidence dans des lésions CIN3.
Celle-ci est maintenue au cours de la progression tumorale. Les vaisseaux lymphatiques
s’avèrent majoritairement localisés à une distance inférieure à 0,15 mm des cellules
néoplasiques et, comparativement à ce qui est initialement observé sous la zone de
transformation des cols sains, une proportion de vaisseaux significativement plus élevée a été
observée à cet endroit. Cette observation pourrait être le résultat d’un dialogue complexe entre
les cellules tumorales et les vaisseaux lymphatiques pouvant mener à une réorganisation du
stroma dans sa globalité. Jusqu’à présent, plusieurs mécanismes d’interactions entre les
cellules néoplasiques et lymphatiques ont été décrits. Notamment, la production de facteurs de
croissance lymphangiogènes peut stimuler la migration des cellules endothéliales
lymphatiques et l’élongation des vaisseaux lymphatiques vers la source productrice [274,
275]. De même, une expression de facteurs chémoattractants par les cellules endothéliales
lymphatiques peut induire la migration des cellules présentant les récepteurs à ces chémokines
vers les vaisseaux lymphatiques [69, 169]. Concernant les néoplasies cervicales, Kodama et al
ainsi que Schrevel et al ont démontré une expression importante des récepteurs CCR7 et
CXCR4 par les cellules néoplasiques [171, 172]. Une production intense de VEGF-C et D par
111
Discussion et perspectives
les cellules néoplasiques à partir du grade CIN3 a également été démontrée [207-209]. Au
cours de la progression tumorale, des niveaux élevés en facteurs lymphangiogènes sont
maintenus [210, 212]. De plus, Issa et al ont démontré que l’expression de VEGF-C peut
favoriser la migration des cellules néoplasiques vers les vaisseaux lymphatiques en stimulant
la sécrétion de CCL21 par les cellules endothéliales lymphatiques [276]. Même si le lien entre
l’expression de ces facteurs et les modifications de distribution spatiale que nous avons
observées doit être confirmé, ces éléments soutiennent l’existence de mécanismes pouvant
induire des changements d’organisation de la vascularisation lymphatique par rapport
aux cellules néoplasiques. La conservation d’un profil de distribution spatiale aux différents
stades clés de la pathologie soutient la présence d’un microenvironnement lymphatique
spécifique est maintenu tout au long de la progression tumorale.
Actuellement, aucun consensus concernant la valeur pronostique potentielle de la
vascularisation lymphatique sur le risque de dissémination ganglionnaire n’existe. Malgré le
fait que la plupart des études cliniques soutiennent une corrélation entre la LVD péritumorale
et le statut ganglionnaire [210, 212, 215, 216, 219-221, 223-226], des résultats contradictoires
ont été rapportés [214, 227-229]. Afin de tester de manière robuste la valeur pronostique
potentielle de la vascularisation lymphatique, une étude détaillée de cette dernière a été
réalisée à l’aide de notre technique d’analyse d’images digitales. Les paramètres lymphatiques
quantifiés à l’aide de cette dernière ont par la suite été comparés au statut ganglionnaire ainsi
qu’à la présence/absence d’emboles lymphatiques. En accord avec cette démarche, Van der
Auwera et al soutiennent qu’une analyse à l’aide d’une méthode robuste et reproductible est
nécessaire afin de vérifier la valeur pronostique potentielle de la vascularisation lymphatique
sur le risque d’extension ganglionnaire [184]. Shields et al ont également précédemment
conclu que la quantification d’une LVD absolue se présente comme une mesure plus objective
que celle mesurée à l’aide de la technique de hot-spot [256]. Contrairement à la majorité des
études cliniques précédentes ayant utilisé la technique de hot-spot, les résultats obtenus au
cours de notre travail indiquent que les LVD intra et péritumorale absolues ne sont pas
corrélées au statut ganglionnaire ainsi qu’à la présence d’emboles lymphatiques. Par contre, la
présence d’une distribution spatiale spécifique caractérisée par un nombre élevé de vaisseaux
lymphatiques localisés à proximité immédiate des cellules tumorales a été associée à ces
paramètres témoins d’une dissémination lymphatique. Ces résultats suggèrent que
l’implication de la lymphangiogenèse dans le processus de dissémination ganglionnaire ne
peut se résumer à une augmentation du nombre de vaisseaux lymphatiques. D’ailleurs, les
112
Discussion et perspectives
résultats complémentaires que nous avons obtenus montrent une absence de corrélation entre
la densité en vaisseaux lymphatiques en cours de prolifération ainsi que le profil de marquage
VEGF-C et les paramètres de dissémination lymphatique. En accord avec cette hypothèse, de
récents travaux soutiennent l’existence d’une dissémination chémorégulée [171, 172, 277280]. De plus, il est également suggéré que les cellules tumorales seraient capables de
stimuler elles-mêmes leur transmigration à travers la paroi des vaisseaux lymphatiques en
induisant notamment une surexpression de protéines d’adhésion à la surface des cellules
endothéliales [281-283], en perturbant les protéines de jonctions intercellulaires et/ou en
provoquant des trous dans la paroi vasculaire lymphatique [284]. Par conséquent, nous
soutenons l’existence d’une relation complexe entre les cellules tumorales et le stroma
péritumoral dont la connaissance est encore très limitée. Contrairement à ce qui est
initialement proposé, nos travaux indiquent que l’évaluation du risque de dissémination
lymphatique ne peut se baser exclusivement sur une densité tumorale en vaisseaux
lymphatiques. La LVD n’est pas, à elle seule, un bon marqueur pronostique d’extension
ganglionnaire.
Le paramètre de distribution spatiale de la vascularisation lymphatique par rapport à la
tumeur ne se présente pas comme un outil de choix pouvant être utilisé en clinique pour
guider le choix du plan thérapeutique de la patiente. Notamment, il s’avère raisonnablement
impossible de déterminer une distance entre les cellules tumorales et les vaisseaux
lymphatiques à partir de laquelle une patiente présenterait un risque faible versus élevé de
dissémination tumorale. Néanmoins, la mise en évidence d’un profil de distribution spécifique
corrélé au statut ganglionnaire et à la présence d’emboles lymphatiques attire l’attention sur
l’importance de s’intéresser à l’étude des mécanismes pouvant induire une modification
de l’organisation spatiale du réseau vasculaire lymphatique.
En perspective de ce travail, nous proposons d’investiguer (1) les mécanismes pouvant
intervenir dans une modification de la distribution spatiale des vaisseaux lymphatiques dans
les néoplasies cervicales ainsi que (2) les interactions pouvant faciliter l’intravasation des
cellules tumorales à travers la paroi des vaisseaux lymphatiques. Pour ce faire, nous planifions
d’étudier l’urokinase receptor associated protein (uPARAP) et son rôle dans les mécanismes
de migration des cellules endothéliales lymphatiques en présence de cellules néoplasiques
cervicales. uPARAP est une protéine membranaire principalement exprimée par les cellules
d’origine mésenchymateuses et joue un rôle central dans le remodelage du collagène de la
matrice extracellulaire. Elle est impliquée dans l’internalisation du collagène dans la cellule et
113
Discussion et perspectives
la délivrance des endosomes aux lysosomes [285-292]. Au sein de notre laboratoire, Charlotte
Erpicum a récemment démontré qu’uPARAP joue un rôle important dans la migration des
cellules endothéliales lymphatiques vers la source de production de VEGF-C. Parallèlement,
la présence d’uPARAP a également été mise en évidence par immunohistochimie dans
plusieurs cellules endothéliales lymphatiques parmi les lésions de néoplasies cervicales que
nous avons étudiées dans le cadre de ce travail (figure 33).
A
B
*
50µm
C
50µm
D
Figure 33 : (A et C) Mise en évidence des vaissaux lymphatiques (rouge, D2-40) et (B et D) de uPAr associated
protein (uPARAP) à l’aide de marquages immunohistologiques réalisés sur des coupes sériées de néoplasies du
col utérin. (B) Parmi les vaisseaux lymphatiques présents au sein du tissu, certains d’entres eux présentent un
marquage positif pour uPARAP (cadre et agrandissement) tandis que d’autres ne sont pas marqués (étoile). (C et
D) Les cellules endothéliales lymphatiques montrent un marquage cytoplasmique de uPARAP (flèche).
Par la suite, les interactions pouvant avoir lieu entre les cellules endothéliales
lymphatiques et les cellules tumorales seront testées dans des modèles de co-cultures in vitro.
La morphologie (dilatation, rétraction, allongement) et l’apoptose des cellules endothéliales
lymphatiques seront étudiées. Les niveaux d’expression des protéines de jonctions des
cellules endothéliales lymphatiques telle que la VE-cadhérine, impliquée dans la structure des
"button-like junctions" entre les cellules endothéliales [162], seront également analysées. En
114
Discussion et perspectives
effet, nous supposons qu’une modification dans l’expression de protéines intercellulaires
pourrait avoir un impact sur l’intravasation des cellules tumorales à travers la paroi des
vaisseaux lymphatiques. Ces paramètres pourront ensuite être testés dans des modèles in vivo
de xénogreffes de cellules tumorales cervicales et corrélés au statut ganglionnaire observé.
Nous planifions également d’étudier in vivo la distribution spatiale des cellules tumorales qui
expriment la laminine-5 par rapport aux vaisseaux lymphatiques présentant des "button-like
junctions" et de corréler ce paramètre au statut ganglionnaire. La laminine-5 est un composant
majeur de la membrane basale des épithéliums squameux et permet de lier les cellules
épithéliales aux autres composants de la membrane basale. Elle joue un rôle majeur dans la
migration des cellules tumorales et serait impliquée dans les processus de dissémination
métastatique [293-295]. D’ailleurs, cette migration cellulaire est augmentée lorsque la chaine
γ2 de la laminine-5 est clivée par la Matrix Metalloprotéinase 2 (MMP-2) ainsi que par la
Membrane Type (MT)1-MMP, deux protéases bien connues pour leur implication dans le
remodelage de la matrice extracellulaire et la migration des cellules tumorales [296, 297]. Au
sein du laboratoire, sur des coupes de néoplasies cervicales, nous avons mis en évidence la
présence de cellules tumorales en cours d’intravasation et au sein de la lumière de vaisseaux
lymphatiques qui expriment de la laminine-5 (figure 34).
A
B
T
T
50µm
100µm
Figure 34 : (A et B) Double immunomarquage des vaisseaux lymphatiques (rouge, D2-40) et de la laminine-5
(brun) dans des néoplasies cervicales invasives. Les cellules tumorales (T) localisées au front de migration
montrent un marquage cytoplasmique intense en laminine-5. Des cellules tumorales laminine-5 positives en
cours d’intravasation sont observées (flèches).
115
Discussion et perspectives
Finalement, la technique d’analyse d’images que nous avons développée dans le cadre
de ce travail a permis de passer d’une étude d’une zone restreinte de tissu (hot-spot) à une
caractérisation détaillée de la vascularisation lymphatique sur la totalité d’images en deux
dimensions. Afin de se rapprocher d’avantage des conditions tumorales, nous proposons de
réaliser une analyse en trois dimensions de la vascularisation lymphatique.
Nous soutenons qu’une meilleure compréhension des mécanismes responsables d’une
modification de l’organisation spatiale du réseau vasculaire lymphatique permettra à l’avenir
de mettre en évidence de nouveaux facteurs tumoraux pronostiques de dissémination
ganglionnaire. Nous soutenons également que de telles études pourront mener au
développement de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à réduire le risque de
dissémination lymphatique.
116
CONCLUSIONS
117
Conclusions
L’étude de marqueurs tumoraux pronostiques d’une extension ganglionnaire
représente l’une des voies actuellement privilégiées visant à réduire le risque d’une indication
polythérapeutique pour le traitement des néoplasies cervicales débutantes. Au cours de ces
dernières années, la lymphangiogenèse est apparue comme un évènement central dans le
processus de dissémination lymphatique et la densité en vaisseaux lymphatiques péritumorale
a été présentée comme un marqueur pronostique prometteur d’extension ganglionnaire.
Cependant, au vu du manque d’objectivité et de reproductibilité de la technique de hot-spot
utilisée jusqu’à présent, la réalisation d’une caractérisation détaillée de la vascularisation
lymphatique s’avérait requise.
La méthode d’analyse d’images digitales que nous avons développée a permis de
dépasser les limitations associées à la technique de hot-spot. Une étude robuste, reproductible
et détaillée de la vascularisation lymphatique, tenant compte de l’hétérogénéité tumorale et
des principales interactions pouvant avoir lieu entre les cellules tumorales et le stroma, a pu
être réalisée. Une telle analyse d’images digitales se présente comme la méthode actuellement
la plus fiable pour la quantification du réseau vasculaire lymphatique à partir de coupes
histologiques dans le cadre d’études expérimentales et translationnelles.
Sur la base des résultats obtenus à l’aide de notre technique d’analyse d’images, nous
concluons que la lymphangiogenèse tumorale se présente comme un continuum d’une activité
initialement présente sous la zone de transformation des cols sains, région au niveau de
laquelle les néoplasies cervicales se développent. Nos données supportent le concept de
l’existence d’un terreau lymphangiogène propice au développement et à la progression des
néoplasies tout au long de la progression tumorale. Dans les cas de cancers du col utérin, le
risque qu’une cellule tumorale dissémine jusqu’aux ganglions locorégionaux ne peut se
résumer uniquement à la présence d’un réseau dense en vaisseaux lymphatiques en périphérie
de la tumeur. La façon dont les vaisseaux se distribuent par rapport à la tumeur est également
un paramètre important à prendre en considération.
Ce travail attire l’attention sur l’intérêt d’une analyse globale de la vascularisation
lymphatique pour une meilleure compréhension des mécanismes pouvant être associés à un
risque d’extension ganglionnaire. Il suggère également l’importance d’une caractérisation
future des mécanismes pouvant être responsables d’une modification de la distribution
spatiale de la vascularisation lymphatique au niveau des néoplasies cervicales. Une meilleure
compréhension de ces mécanismes pourra sans doute mener à la découverte de nouveaux
paramètres pronostiques de dissémination ganglionnaire, voire au développement de
118
Conclusions
nouvelles thérapies visant à bloquer l’intravasation des cellules tumorales au sein des
vaisseaux lymphatiques.
119
ANNEXES
120
Annexes
Figure S1
Figure S1 : Etude de la densité en vaisseaux lymphatiques dans le sens de la profondeur. (A) Image binaire d’un
tissu cervical sain. L’épithélium (ligne blanche), les vaisseaux lymphatiques localisés jusqu’à une profondeur de
2 mm à partir du bord inférieur de l’épithélium (points rouges) et les vaisseaux localisés au-delà de ces 2 mm de
profondeur (points blancs) y sont représentés. (B) Image binaire d’un cas de cancer du col de stade FIGO IB1.
Les cellules néoplasiques (blanc, partie supérieure de l’image), les vaisseaux lymphatiques péritumoraux (points
rouges) et les vaisseaux lymphatiques situés au-delà de la région péritumorale ("deep tissue", points blancs) y
sont représentés. (C). Dentés en vaisseaux lymphatiques quantifiées dans les régions péri-épithéliales (colonnes
rouges, 0-2 mm et péritumoral) de la zone de transformation des cols sains (BC_TZ) et des lésions cancéreuses
de stade FIGO IB1 (IB1 cervical cancers) comparativement à celles quantifiées dans les régions plus profondes
du tissu (colonnes blanches, > 2mm et "deep tissue").
121
Annexes
Liste des publications
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Foidart, and F. Kridelka (2011). Whole slide quantification of stromal lymphatic
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2) Benoît Detry, Charlotte Erpicum, Jenny Paupert*, Silvia Blacher, Catherine Maillard,
Françoise Bruyère, Hélène Pendeville, Vincent Lambert, Cédric Balsat, Sandra
Ormenese, Françoise Lamaye, Lieve Moons, Frederic Kridelka, Peter Carmeliet, Marc
Thiry, Jean-Michel Foidart, Ingrid Struman, and Agnès Noel (2012). Matrix
metalloproteinase-2 governs lymphatic vessel formation as an interstitial collagenase
3) Cédric Balsat, Nicolas Signolle, Frédéric Goffin, Katty Delbecque, Benoit
Plancoulaine, Philippe Sauthier, Vanessa Samouëlian, Aude Béliard, Carine Munaut,
Jean-Michel Foidart, Silvia Blacher, Agnès Noël and Frédéric Kridelka (2013).
Improved computer-assisted analysis of the global lymphatic network in human
cervical tissues. Modern Pathology.
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