Applications du NGS à la pathologie tumorale Dre Bettina Bisig Institut de Pathologie CHUV Lausanne 29 septembre 2016 PATHOLOGIE TUMORALE HE Examen macroscopique Bloc FFPE Coupes Lames blanches (non colorées) FFPE = formalin-fixed paraffin-embedded Morphologie (HE) Morphologie (HE) Examen macroscopique Bloc FFPE Coupes Lames blanches (non colorées) FFPE = formalin-fixed paraffin-embedded Analyses moléculaires Sequençage Mutations petites insertions/délétions enrichissement sur lame Translocations in vitro (ADN) in situ (ADN) Immunohistochimie Analyses d’expression in situ (protéines) Copy number variations in situ (ADN) FISH Sequençage Mutations petites insertions/délétions enrichissement sur lame Translocations in vitro (ADN) BIOMARQUEURS in situ (ADN) DIAGNOSTIQUES Immunohistochimie PRONOSTIQUESCopy number variations Analyses d’expression PREDICTIFS in situ (protéines) in situ (ADN) FISH Biomarqueurs PRONOSTIQUES Prédisent la survie indépendamment grade du traitement LVI Biomarqueurs PREDICTIFS Prédisent la réponse à un traitement déterminé MÉDECINE PERSONNALISÉE BIOMARQUEURS PREDICTIFS Bayer Healthcare ADENOCARCINOMES PULMONAIRES Env. 15%: mutation EGFR EGFR Mutation activatrice du domaine tyrosine kinase de l’EGFR Activation constitutive de la signalisation Prolifération, survie, invasion,… Hudis CA, NEJM 2007 ADENOCARCINOMES PULMONAIRES Env. 15%: mutation EGFR EGFR Inhibiteurs de l’EGFR: Gefitinib / erlotinib Hudis CA, NEJM 2007 groupe EGFR muté = meilleure survie avec gefitinib (versus chimio standard) (progression-free survival = survie sans progression) groupe EGFR wild-type = moins bonne survie avec gefitinib (versus chimio standard) ADENOCARCINOMES PULMONAIRES Env. 15%: mutation EGFR EGFR = BIOMARQUEUR PREDICTIF Hudis CA, NEJM 2007 ADENOCARCINOMES PULMONAIRES TCGA, Nature 2014 ADENOCARCINOMES PULMONAIRES T Mitsudomi, Nat Rev Clin Oncol 2013 CARCINOMES PULMONAIRES: Médicaments disponibles ou en cours de développement Thérapies Ciblées Sequençage Mutations petites insertions/délétions “on-slide” tumor enrichment Translocations in vitro (DNA) THERAPIES CIBLEES in situ (DNA) Immunohistochemistry BIOMARQUEURS PREDICTIFS Expression analysis in situ (proteins) Copy number variations in situ (DNA) FISH Bloc épuisé Nombre croissant d’altérations moléculaires « actionnables » Nombre croissant d’analyses moléculaires Taille de plus en plus petite des échantillons Techniques moins invasives de prélèvement Augmentation des délais (TAT) Augmentation des coûts Epuisement des échantillons tissulaires / cellulaires Sensibilité technique relativement faible (20-30% cell. tum.) Nombre croissant d’altérations moléculaires « actionnables » Augmentation des délais (TAT) Nombre croissant d’analyses moléculaires Augmentation des coûts Epuisement des SOLUTION? échantillons tissulaires / Taille de plus en plus petite des échantillons Techniques moins invasives de prélèvement cellulaires Sensibilité technique relativement faible (20-30% cell. tum.) NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) Multiples altérations moléculaires dans un seul run Multiples échantillons dans le même run Gestion optimale des échantillons tissulaires/cellulaires Sensibilité analytique élevée Délais et coûts diminués Remplace le séquençage classique et … Sensibilité accrue (5-10% cell. tum.) NEXT GENERATION SEQUENCING (NGS) Capable de détecter: ‐ Mutations ‐ Insertions/deletions ‐ Translocations ‐ Gains / pertes (CNV) GENOME Simon and Roychowdhury, Nat Rev Drug Discover 2013 EXOME « HOTSPOTS » SEQUENÇAGE CIBLÉ (TARGETED SEQUENCING) TRANSCRIPTOME SPECIFICITÉS DU NGS SUR TISSU TUMORAL - Tissu fixé (FFPE): ADN dégradé - Biopsies: quantité limitée - Tissu hétérogène: • hétérogénéite génétique • cellules tumorales et non Fréquences alléliques très variables Enrichissement en cellules tumorales (manuel / laser) - Altérations somatiques versus germinales CARCINOMES PULMONAIRES: Médicaments disponibles ou en cours de développement Thérapies Ciblées ADENOCARCINOMES PULMONAIRES EGFR HER2 ROS1 ALK BRAF RET KRAS MET PIK3CA NTRK1 NRG1 …… FGFR1 1ère LIGNE de TTT (=TTT STANDARD) 2ème LIGNE de TTT TTT dans des ETUDES (évt. OFF-LABEL) CLINIQUES PANELS DE BIOMARQUEURS LIGNES DE TRAITEMENT PETIT PANEL 1ère LIGNE de TTT PANEL MOYEN 2ème LIGNE de TTT GRAND PANEL TTT dans des ETUDES CLINIQUES PLATEFORME NGS - STRATEGIE IPA LAUSANNE PHASE 1 Pathology target population Classical Sequencing Molecular oncology reports, consult., tumor boards Next Generation Sequencing Clinical Trials Small cancer panel (50 genes) Large cancer panel (400 genes) Ion Torrent PGM Smaller number of genes, 10ng DNA PHASE 2 Illumina MiSeq Larger number of genes, 50-200ng DNA PETIT PANEL TUMEURS SOLIDES - 52 GENES Séquenceur Panel de gènes Ion Torrent PGM Ion AmpliSeq Custom Cancer Hotspot Panel IPA (Cancer Hotspot Panel v2 lég. modifié) ‐ 52 gènes (hotspots), 218 amplicons ‐ 2’800 mutations/indels, 23.9 Kb ‐ 10 ng ADN par échantillon ABL1 CDH1 ERBB2 FGFR3 HRAS KIT NOTCH1 PTPN11 SRC AKT1 CDKN2A ERBB4 FLT3 IDH1 KRAS NPM1 RB1 STK11 ALK CSF1R EZH2 GNA11 IDH2 MAP2K1 NRAS RET TP53 APC CTNNB1 FBXW7 GNAQ JAK2 MET PDGFRA SMAD4 VHL ATM DDR2 FGFR1 GNAS JAK3 MLH1 PIK3CA SMARCB1 BRAF EGFR FGFR2 HNF1A KDR MPL PTEN SMO PETIT PANEL GENES DE FUSION - 4 GENES / >50 TRANSCRITS Séquenceur Panel de gènes Ion Torrent PGM Ion AmpliSeq RNA Fusion Lung Cancer Research Panel - 4 gènes, >50 transcrits de fusion ‐ 85 amplicons ‐ 10 ng ARN par échantillon ALK RET ROS1 NTRK1 >50 transcrits de fusion GRAND PANEL TUMEURS SOLIDES - 400 GENES Séquenceur MiSeq / Illumina Panel de gènes LARGE CANCER PANEL 400 gènes (exons) ‐ mutations/indels ‐ translocations ‐ gains/pertes (50 ng ADN) Amplicon-based Ion Torrent, Life Technologies Capture-based PANEL LYMPHOMES T PERIPHERIQUES Séquenceur Panel de gènes Ion Torrent PGM Custom Panel Ion AmpliSeq ‐ 9 gènes (hotspots ou séq. codantes) ‐ 262 amplicons, 28.7 Kb ‐ 20 ng ADN par échantillon (2x10 ng) Gènes CD28 DNMT3A IDH2 PLCG1 RHOA SETD2 STAT3 STAT5B TET2 Exons Ex 2&4 Plusieurs (16x) Ex 4 Tous (21x) Ex 2 Tous (21x) Ex 20 & 21 Ex 16 Tous (11x) Cible Hot spots Hot spots Hot spots Séq. Hot codante spots Séq. codante Hot spots Hot spots Séq. codante PANEL BRCA1 + BRCA2 Séquenceur Panel de gènes MiSeq / Illumina BRCA Tumor MASTRTM Plus Dx (Multiplicom) Gènes BRCA1 + BRCA2 (séquences codantes complètes) (80-200 ng ADN) Sequençage Mutations small insertions/délétions “on-slide” tumor enrichment Translocations in vitro (DNA) in situ (DNA) Copy number variations NEXT GENERATION SEQUENCING in situ (DNA) FISH DÉFIS Stockage des données INFORMATIQUE SOCIETE SUISSE DE PATHOLOGIE MOLECULAIRE GROUPES DE TRAVAIL REGIONAUX/NATIONAUX Analyse des données RESEAU PATHOLOGIE / ONCOLOGIE SWISS INSTITUTE BIOINFORMATICS Altérations à basse fréq. allélique DONNEES DE SEQUENÇAGE Hétérogénéité tumorale Traduction dans la prise en charge clinique BIOINFO / PIPELINES ANALYTIQUES MODELISATION PROTEINES Nouvelles altérations Découverte fortuite altérations germinales GENETIQUE DEVELOPPEMENTS: BIOPSIES LIQUIDES ADN TUMORAL CIRCULANT (ctDNA) Bettegowda et al, Sci Transl Med 2014 DEVELOPPEMENTS: IMMUNOTHERAPIE CHARGE MUTATIONNELLE (MUTATIONAL LOAD) REPONSE A L’IMMUNOTHERAPIE Dr E. Missiaglia DEVELOPPEMENTS: IMMUNOTHERAPIE PERSONNALISEE NEOANTIGENES TUMORAUX EXPANSION EX VIVO DE LYMPHOCYTES T SPECIFIQUES ou VACCINS SPECIFIQUES CONCLUSIONS CONCLUSIONS NGS EN PATHOLOGIE TUMORALE: - Multiples biomarqueurs et multiples échantillons - Mutations, translocations, gains, pertes - Sensibilité accrue - Remplace les techniques habituelles et au delà - Recherche clinique et translationnelle - Défis et développements… REMERCIEMENTS INSTITUT DE PATHOLOGIE, CHUV Prof. Laurence de Leval Labo de biologie moléculaire Dr sc. Edoardo Missiaglia Dr sc. Audrey Letourneau Dr sc. Nathalie Scamuffa Véronique Roux Samuel Rappo Paola Izzo Robin Russi Véronique Vocat Dr sc. Patricia Hornitschek Soheyb Sellah Jérémy Vidal Labo de FISH Labo d’immunohistochimie Labo d’histologie DEPARTEMENT D’ONCOLOGIE, CHUV Prof. Olivier Michielin Dr K. Homicsko