Synthèse biologique de l'acide hippurique et Phosphorylation biologique de la thiamine Leer - Vide - Empty Thèse No 2014 Synthèse biologique de l'acide hippurique et Plws|ilion lalion biologique de la thiamine THÈSE présentée à l'Ecole Polytechnique Fédérale, Zurich pour l'obtention du grade de Docteur es Sciences techniques par Hjalmar Gaston MKI SKN de nationalité danoise Ing.-chimiste E. P. F. Rapporteur : Corapporteur : Prof. Dr V. Prelog Prof. Dr L. Ruzicka 1953 Imprimerie Ganguin et Laubscher S. A. — Montreux Que Monsieur le Docteur Fr. Leuthardt, Professeur de physiologique à l'Université de Zurich, veuille trouver ici l'expression de ma vive reconnaissance pour les conseils éclairés et l'extrême bienveillance qu'il a bien voulu me pro¬ diguer tout au long de l'exécution de ce travail. En témoignage de profonde reconnaissance et de respec¬ Chimie tueuse affection. A Monsieur le Docteur L. Ruzicka, Professeur de la Faculté de Chimie de l'Ecole Polytechnique et directeur Fédérale de Zurich, qui a eu l'amabilité d'être le coréférent et membre du jury de cette thèse, j'exprime mes hommages reconnaissants. A Monsieur le Docteur V. de Chimie Prelog, Professeur à la Faculté organique de l'Ecole Polytechnique Fédérale de Zurich, qui a bien voulu accepter d'être le réfèrent et membre du jury de la présente thèse, j'exprime mes remerciements et mes hommages reconnaissants. A la mémoire de A ma Mère et à mon ma Père chère Edith Leer - Vide - Empty INTRODUCTION Les fonctions chimiques de la cellule si l'on admet que les différents processus ne sont chimiques compréhensibles sont liés à la que structure microscopique ou ultramicroscopique de la cellule. Depuis les travaux classiques de Friedrich Miescher * sur la chimie du noyau cellulaire, on de la cellule, certains a essayé de localiser dans les différentes parties constituants ou ferments. Récemment on a isolé, par centrifugations fractionnées et par d'autres méthodes appliquées à des tissus homogé¬ néisés, des constituants morphologiquement bien définis de la cellide (noyaux cellulaires, granules cytoplasmiques) et on les a obtenus assez purs en grande quantité. De cette façon il a été possible d'analyser ces constituants cellulaires et en particulier d'étudier leurs systèmes enzymatiques. Au cours des deux dernières années, nous avons entrepris dans notre la fonction des granules cytoplas¬ sur laboratoire diverses recherches miques (mitochondries) du foie. Ce travail fournit également une contri¬ bution à l'étude des systèmes enzymatiques dans la cellule hépatique. La première partie de ce travail traite de la synthèse de l'acide hippurique. Nous démontrons que les mitochondries sont le siège de cette réaction. ferment, une de la cellule Dans la seconde partie, transphosphorylase, qui et nous se trouve décrivons dont l'action consiste à transporter le l'acide adénosine triphosphorique (ATP) sur un nouveau dans les fractions solubles pyrophosphate de la thiamine. 9 Leer - Vide - Empty PREMIERE PARTIE BIOLOGIQUE SYNTHESE nous sommes utilisant rique généisé. Cet homogénat en de Leuthardt synthèse dans une proposés d'étudier la synthèse système enzymatique le foie comme successives à 0° C. el en et nous nous coll. 3. Les nous sur Nous en la les avons des fractions. Dans fonctions chimiques Comme est fractionnons le basant la provenance de la glycine d'autres acides aminés. a) HIPPURIQUE Généralités /. Nous DE L'ACIDE par de l'acide hippu¬ cobaye homo¬ des centrifugations 2 Hogeboom et coll. de travaux de ensuite cherché à localiser la chapitre suivant, nous étudierons remplaçant par des peptides et par un des mitochondries du allons le montrer, la synthèse foie. de l'acide hippurique jouent aussi un rôle sont le siège de la phos- localisée dans les mitochondries. Ces dernières dans la formation de la cocarboxylase, car elles phorylation oxydative de l'acide adénylique et fournissent ainsi l'ATP Nous donnons, par nécessaire à la phosphorylation de la thiamine. conséquent, d'abord quelques détails sur la fonction des granules cytoplasmiques. Par centrifugation du foie homogénéisé on obtient facilement deux fractions de particules : 1. un sédiment constitué par des granules visibles 3 ,m), au microscope (diamètre environ 0,5 large granules des auteurs mitochondries de la cellule les essentiellement contient anglo-saxons, qui obtient par centrifu¬ à on 2. un duquel partir hépatique ; surnageant gation prolongée, à grande vitesse de rotation (24.000-100.000 g), des microparticules ultramicroscopiques désignées par Claudei comme recherles somes Chantrenne6, Brachet1). D'après (Claude 4, Sternh, - « » « » U ches de Brachet de et ses élèves dernières tances ne représentant un de fractions pas seulement sont fraction contiendrait la cette plus grande de la cellule. partie de l'acide ribonucléique L'analyse des différentes granules a montré que ces accumulation de différentes subs¬ une matériel de réserve, mais qu'elles constituent de vrais organes chimiques, contenant des systèmes enzymatiques importants de la cellule. Ainsi se confirme l'hypothèse émise, il y a soixante-cinq ans déjà, par R. Altmann couvertes Dans nos considéré les a granules cytoplasmiques 10 dé¬ comme culièrement intéressés collaborateurs 8, qui les organes du métabolisme cellulaire. recherches ce sont les mitochondries qui nous ont lui, par (morphologie furent les Hertwig9). Hogeboom voir à établir parti¬ et ses méthode permettant de mitochondries intactes gardant leurs carac¬ d'obtenir des suspensions tères morphologiques. Ces premiers auteurs observations de Guillermond n se sont une appuyés sur les anciennes le chondriome des cellules végétales, hypertonique de saccharose comme liquide de suspension. Dans des solutions d'électrolytes, les mitochondries s'altèrent et s'agglutinent. Dans ces conditions il est impossible de les séparer des et ont utilisé une sur solution autres constituants du tissu. Dans nos recherches citrulline, la détermination colorimétrique pas pu être faite. De ce fait nous avons mannite. En outre la mannite n'est pas mitochondries, ce qui évite une en sur la formation de la présence de saccharose n'a remplacé le saccharose par la attaquée par les ferments des complication des processus enzymatiques étudiés. 0. Warburg (1913) 12 semble être le premier à avoir démontré expérimentalement la participation des granules cytoplasmiques du foie à la respiration cellulaire. Il trouva qu'une suspension de granules pré¬ parées à partir du foie de cobaye absorbe de l'oxygène. Des travaux récents confirment en effet que les granules cytoplasmiques sont le siège principal de la respiration cellulaire. Schneider et coll. 13 ont montré succinodéhydrase se trouve exclusivement localisée dans les mito¬ hépatiques. Des recherches ultérieures ont révélé que les granules cytoplasmiques contiennent la totalité des enzymes du cycle des acides tricarboxyliques et qu'elles sont aussi le siège de l'oxy¬ dation des acides gras (Mùller et Leuthardt u, Leuthardt et Mauron 15, Kennedy et Lehninger 16). La figure 1 montre l'oxydation du pyruvate et de divers produits intermédiaires du cycle tricarboxylique au moyen d'une suspension de mitochondries. L'oxydation du pyruvate et des différents acides carboniques inter¬ médiaires représente la source d'énergie la plus importante pour la phosphorylation oxydative dans la cellule hépatique. Les mitochondries, que la chondries des cellules en fournissant continuellement l'ATP, jouent donc processus de la vie cellulaire utilisant des liaisons un rôle dans tous les phosphatées riches en selon Lipmann 1?). Le rôle que énergie (« energy rich phosphate bonds jouent les mitochondries dans les réactions dépendant de l'ATP se montre » 12 purification de certains enzymes homogénéisé ou des extraits non purifiés, on trouve que les mitochondries sont indispensables. Dans l'extrait brut, l'ATP est continuellement hydrolyse par l'action de l'adénosine triphosphatase (ATP-ase). Dans ces conditions il faut, pour maintenir un taux suffisant en ATP. le système phosphorylant des façon d"une très nette au solubles. Si l'on travaille cours avec de la du tissu Une fois que le système enzymatique a été séparé de l'ATP-ase, l'ATP ajouté n'est utilisé que par le système étudié ; il y a une réaction stoechiométrique entre l'ATP et les substances en question. Un exemple du cas précité sera décrit dans ce travail ; un autre est donné par la synthèse de la glutamine (Frei et Leuthardt 18, Speck 19). mitochondries. b) formation Rôle de la de l'acide hippurique. La synthèse de l'acide hippurique à partir de glycocolle et benzoïque nécessite la formation d'une liaison peptidique. réaction peut être considérée, dans un certain sens, de l'acide Or cette modèle de la comme synthèse d'une liaison peptidique. On s'est déjà souvent demandé si la synthèse peptidique dans l'organisme est simplement l'inverse de l'hydro¬ lyse et dépend des mêmes peptidases. Les travaux de Bergmann 20 et de ses élèves parlent en faveur de cette dernière hypothèse. Ces auteurs ont décrit la formation de peptides à partir de certains acides aminés subs¬ titués (principalement des dérivés carbobenzoxy ou anilides), en présence de protéinases. Cependant les conditions dans lesquelles ces synthèses fermentatives ont lieu ne peuvent pas être comparées directement aux physiologiques. Il ne s'agit pas de substances naturelles. La formation des produits finaux est favorisée par leur faible solubilité. Il est possible que, dans certains cas particuliers, des peptides puissent ainsi être synthétisés dans les cellules vivantes. Dans la règle, la synthèse des peptides à partir des acides aminés étant un processus exergonique, l'état d'équilibre serait déjà atteint après la formation de très petites quantités de peptides. La synthèse peptidique doit donc être liée à un processus exergonique et pour autant qu'on le sache aujourd'hui, elle nécessite la présence de l'ATP. La synthèse de l'acide hippurique en est On connaît un ferment, l'hippuricase (ou histozyme) qui un exemple. hydrolise l'acide hippurique. La synthèse à partir du glycocolle et de l'acide benzoïque se fait cependant par un système enzymatique plus complexe. Au point de vue physiologique, la synthèse de l'acide hippurique appartient aux réactions désignées sous le nom de réactions de désintoxi¬ conditions de détoxication. On groupe sous ce lesquelles interviennent des susbtances cation dans ou (Williams21). formés ne Le sont terme pas de toujours désintoxication moins toxiques terme l'organisme produits produits initiaux. étrangères est que les réactions toutes inexact. les à Les 13 Ils peuvent même l'être davantage. Souvent les produits introduits dans l'organisme sont transformés en dérivés plus solubles (formation d'acides glucuroniques conjugés ou de sulfates conjugés). Le couplage de l'acide benzoïque avec le glycocolle pour former de l'acide hippurique, qui sert chez les herbivores à l'élimination des grandes quantités d'acide benzoïque formé dans l'intestin, est un des processus de désintoxication les plus répandus. On connaît d'autres réactions similaires. C'est ainsi que dans l'organisme du lapin l'acide pyridine-acarboxylique se couple avec le glycocolle pour donner de l'acide a-pyridinurique. Les dérivés phénylés des acides gras subissent d'abord une /î-oxydation et se transforment finalement en acide benzoïque ou phénylacétique (Knoop 22). Chez l'homme, le lapin, la chèvre et le porc, l'acide benzoïque administré se combine en majeure partie avec le glycocolle et s'élimine sous forme d'acide hippurique. Le chien élimine environ 80 % de l'acide benzoïque administré comme acide libre. Comme l'acide benzoïque, l'acide phénylacétique est en général couplé à la glycine et s'élimine sous forme d'acide phénacétique. Chez l'homme ainsi que chez le chim¬ panzé, l'acide phénylacétique se combine avec la glutamine pour former la N-phénacétyl-glutamine (Thierfelder et Sherwiti23). Chez les oiseaux qui remplace le glycocolle pour former de la dibenzoyl- c'est l'ornithine ornithine. Des essais in vivo ont montré que par administration de fortes doses d'acide benzoïque il y a plus de glycocolle excrété (sous forme d'acide hippurique) qu'il n'y en a à disposition dans les protéines. C'était la première preuve directe de la synthèse d'un acide aminé dans l'orga¬ nisme animal. L'excès de glycocolle doit provenir d'autres sources, car cet acide aminé ne se trouve pas élaboré dans l'organisme en quantités suffisantes. Chez le chien, la formation de l'acide hippurique a lieu dans le rein, l'animal néphrectomisé est incapable de le synthétiser 2i. Chez le rat, le cobaye et le lapin, la synthèse se fait également dans le foie, qui en général est le siège principal des réactions de désintoxication. L'acide hippurique est un constituant normal des urines. Il se trouve petite quantité chez l'homme, en quantité plus élevée chez les herbi¬ vores, dont le régime contient des corps générateurs d'acide benzoïque. en c) Synthèse de l'acide hippurique. En incubant des coupes de rein ou de foie de cobaye, de lapin ou de rat, dans une solution appropriée contenant de l'acide benzoïque, Borsook et Dubnoff25 ont observé une formation d'acide hippurique. Ces auteurs ont établi que la synthèse est accompagnée d'une augmen¬ tation de l'énergie libre. Ils trouvent pour la réaction : benzoate (aq) + + 2670 Cal. à 38° C. glycine (aq) hippurate (aq), la valeur de A F Cela veut dire que la synthèse ne représente pas simplement l'inverse = 14 = de l'hydrolyse. Cette dernière peut se faire spontanément par l'hippusynthèse doit être liée à une réaction libérant de l'énergie. D'après les observations de Borsook et Dubnoff23 cette énergie doit provenir d'une oxydation car la synthèse est inhibée par une solution de KCN, 0,001 M. Avec la méthode des coupes, il n'a pas été possible de pousser plus loin l'étude des différentes étapes de la synthèse enzymatique. Cette dernière est limitée par la perméabilité des surfaces cellu¬ laires. L'étude approfondie des facteurs influençant la synthèse, ne pouvait se faire qu'en utilisant des homogénats de tissus. Borsook et Dubnoff 26 furent les premiers à obtenir une formation d'acide hippurique à partir de benzoate et de glycine en utilisant un homogénat de foie de cobaye, préparé d'après la méthode de Potter et Elvehjem 27. L'addition à leur milieu d'incubation de cétoglutarate et d'acide adénylique avait pour effet de doubler la quantité d'acide hippurique synthétisé. Cohen et Me Gilvery28 étudièrent la synthèse de l'acide p-amino-hippurique dans des homogénats de foie de rat. Ces auteurs ont établi que la synthèse dépend de l'acide adénosine-triphosphorique. En fractionnant l'homogénat de foie de rat par centrifugation, ils purent démontrer que la synthèse de l'acide p-amino-hippurique était liée aux particules insolubles de la cellule hépatique. ricase mais la d) Formation de la glycine. La glycine nécessaire à la synthèse de l'acide hippurique peut être formée à partir d'autres acides aminés. Leuthardt 29 ainsi que Borsook 2o et Dubnoff ont obtenu en présence de coupes de foie de cobaye une synthèse considérable d'acide hippurique en remplaçant la glycine par I-glutamine, la d, I-sérine, la l-proline, l'oxyproline, l'acide aspartique Shemin 30, confirmant les résultats de Leuthardt et l'acide glutamique. et Glasson sl, prouva par la suite à l'aide de la 1-sérine marquée (N15 dans le groupe aminé et C13 dans le groupe carboxylique) que cet acide aminé est transformé en glycine par la scission entre les atomes a et /5 de la la chaîne carbonée. La réaction et et Greenberg 83 ont du formiate prouvé marqué. la Selon Siekevitz et réversible. Sakami synthèse Sakami position /? de la serine peut choline. est :i2 de la 1-sérine à ainsi que Siekevitz partir du glycocolle s~ a également trouvé que l'atome être fourni par les groupes méthyl de Greenberg 33 l'atome en position a de en la la- glycine fournit du formiate qui se condense avec une seconde molécule de glycine pour donner de la serine. La synthèse de la serine à partir de la glycine est également prouvée par les constatations de Winnick 34 el coll. montrant que la radioactivité de la glycine marquée (C14) se retrouve surtout coll. en 35 dans la serine des protéines. Récemment Braunstein et un travail sur la synthèse enzymatique de la glycine publièrent utilisant des coupes de tissus de différentes espèces d'animaux. Ils 15 trouvèrent synthèse la qu'en présence de coupes de foie de rat de l'acide hippurique, la glycine pouvait ou cobaye, dans remplacée par de être 36 ont trouvé expériences in vivo, Abbott et Lewis la sarcosine (mais non la N, N-diméthylglycine ou la bétaïne) aug¬ la thréonine. Par des que mente également la quantité d'acide hippurique excrétée chez le lapin. ingérer de la sarcosine marquée (N15 du groupe aminé) Bloch En faisant et Schœnheimer 3? ont confirmé les résultats d'Abbott Partie //. et Lewis 36. expérimentale a) Matériel. Animaux : Nous avons utilisé des rats que des albinos adultes de 150-200 gr. avaient reçu une cobayes de 200-300 gr. Les animaux nourriture optimale et furent mis à jeun environ 36 l'expérience. ainsi Substrats : Le benzoate de Na ainsi que à 40 heures le fumarate de Na avant sont des produits commerciaux recristallisés. La glycine, l'acide glutamique, la thréonine, la sarcosine, la leucyl-glycyl-glycine, la leucyl-glycine, le glutathion sont des produits Hoffmann La Roche. L'acide /3-oxyglutamique fut préparé selon la méthode de Harington et Randall 38. L'acide adénosine-triphosphorique (ATP) est préparé selon les méthodes combi¬ nées de Needman, Kerr et Le Page 39. Le cytochrome C est préparé à partir de cœur de cheval selon la méthode de Keilin et Hartree 40, et gardé en solution. Une partie de ce produit nous a été fourni par la Robapharm, Bâle. Toutes les solutions sont préparées avec de l'eau bidistillée et leur pH ajusté à 7,5. L'isotonicité du milieu est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K et de pH 7,5. - b) Préparation des suspensions enzymatiques. Toute la à l'aide d'un préparation centrifugeur des différentes fractions s'effectue à 0° C. et Après la mort de l'animal, le foie est immédiatement mis dans la glace. L'homogénéisation du tissu s'effectue pendant au moins 45 secondes dans l'appareil de Potter et Elvehjem 27, contenant du KCl isotonique comme milieu de suspension. L'homogénat ainsi obtenu est filtré à à froid. travers deux couches de gaze. La des différentes fractions s'effectue selon le schéma I. 16 préparation SCHEMA 10 ce. I Homogénat de foie de 20 au KCl isotonique centrifugé pendant 15 min. (3500 X y r Résidu + 3 ec. g) Surnageant mannite isot. chauffé pendant 5 min. bain-marie à 100° C. centrifugé pendant 10 min. (3500 X g) au centrifugé pendant 10 min. i Y Y Y Surnageant Résidu Résidu J- 2 ce. isot. 7 min. Y Surnageant mannite Kochsaft « » centrifugé (3500 X g) Y Y Surnageant Résidu - 2,5 ce. mannite isot. centrifugé pendant 1 min. (3500 X g) Y Y Surnageant Résidu Suspension de (Noyaux, débris cellulaires) mitochondries = « Culot » cobaye à 20 % sont centrifugés (3500 X g). Le surnageant est décanté pour la préparation soit du jus bouilli (« Kochsaft »), soit d'un surnageant dialyse. Le foie de cobaye contient une substance de coloration 10 ce. pendant et gardé d'un homogénat 15 minutes à 4600 verte, de densité trouvons résidu, d'un car est un de foie de t. m. peu inférieure mitochondries. De aux après la première centrifugation un anneau homogénat vert dont l'épaisseur à l'autre. Cet et anneau est comme couche ce fait nous supérieure du l'intensité de coloration varient éloigné au moyen d'une pipette, couche contient des corps inhibiteurs de la réaction étudiée. Il dans bien des cas impossible, même avec plusieurs lavages à la mannite cette isotonique, d'éloigner complètement chondries ainsi obtenue reste suspension de mitochondries ce corps et la verdâtre. Pour est peu active, notre dans suspension de mito¬ synthèse une telle certains cas même 11 totalement inactive. La nature de la bile qu'il provient (voir dans les foies des animaux manque en carottes et du corps inhibiteur est inconnue. Il semble 33). Il est particulièrement abondant page recevant hiver, quand les cobayes du foin. Peut-être de l'herbe dans leur nourriture, il sont nourris avec des betteraves, des s'agit-il d'un produit de dégradation de la chlorophylle. on ajoute 3 ce. d'une solution de mannite isotonique et suspension homogène. Cette dernière est centrifugée pen¬ Au résidu on refait une t. m. Le surnageant est décanté. La troisième dure que 7 à 9 minutes. Une partie des mitochondries ne se sont pas sédimentées et le surnageant blanc-verdâtre est décanté. Ce n'est qu'après la quatrième centrifugation que nous obtenons, selon dant 10 minutes à 4600 centrifugation ne procédé, une suspension de mitochondries presque blanche. Le microscopique (microscope à contraste de phase) révèle une suspension homogène de particules dans laquelle on ne trouve que rare¬ ment un noyau ou une hématie (fig. 2). L'activité des suspensions dépend du nombre des granules par unité de volume, mais leur dénombrement direct est très difficile. Dans quelques expériences nous avons comparé la densité optique des suspensions (mesurée à 375 m/u à l'aide du pho¬ tomètre de Beckmann) avec leur teneur en azote. Le dosage de la densité optique pour différentes dilutions de la même suspension, montre que ce contrôle la densité optique est une fonction linéaire de la concentration de la suspension, donc du nombre des particules. La figure 3 montre qu'en moyenne la densité optique est également proportionnelle à la teneur en azote. Ceci permet d'utiliser l'azote nombre des particules contenues dans mesure approximative suspension. comme une du c) Incubation. Le volume final par essai est L'incubation s'effectue dans des Ces derniers d) sont agités pendant Extraction de l'acide Après de 4 ce. La phase gazeuse est de l'air. erlenmeyers d'une capacité de 25 ce. 45 minutes à 38° C. hippurique. l'incubation la réaction est arrêtée par l'adjonction de 1 ce. % d'acide métaphosphorique. Après centrifugation des protéines on prélève 4 ce. que l'on pipette dans un petit appareil d'extraction du type Kutscher-Steudel d'une capacité d'environ 6 ce. On ajoute 0,2 ce. d'ILiSC^ N. Les tubes d'extraction sont refroidis à l'eau froide afin d'éviter une hydrolyse. L'extraction dure 5 heures. Le résidu de l'extrait éthéré est dissout dans 3 ce. d'HCl azéotropique. Le ballon est muni d'un réfrigérant à reflux et on fait bouillir la solution pendant 2 heures. Après hydrolyse l'HCl est complètement éliminé au vide à 100° C. Le résidu sec est dissout dans 10 ce. d'eau distillée. On agite d'une solution de 10 18 solution en présence de 0,5 gr. de permutite de Na pour éloigner l'NHfj. La solution est filtrée et une partie aliquote du filtrat sert à la cette glycine détermination de la forme de N aminé. sous e) Dosage de la glycine. Méthode I (voir Russel 41). — Dans cette méthode nous avons utilisé i2 (coloration orange en pour le dosage de la glycine le réactif de Folin milieu alcalin avec l'acide a-naphto-quinone-sulfonique). Avec chaque série de densité les extinctions d'une solution dosage, des solutions optique est test sont mesurée à l'aide du déterminées. La spectrophotomètre de Beckmann. En utilisant cette méthode de dosage, il est important de refroidir récipients à extraction susmentionnés, dès que les essais contiennent de l'acide glutamique ou de la glutamine, sinon ces derniers se trans¬ forment en acide a-pyrrolidonecarboxylique (Wilson et Cannan43) qui est extrait en partie et qui après hydrolyse apparaît sous forme d'azote les aminé. Méthode II. toutes — La méthode I n'est pas spécifique puisqu'elle englobe qui sont extraites par de l'éther et qui par hydrolyse les substances donnent des groupes aminés libres. D'autre part, dans nos recherches, travaillons avec des homogénats de tissu et il fallait établir la nous formation de glycine Krueger 44, qui est à partir d'autres acides aminés. C'est la méthode modification de celle de Alexander et coll. 45, employée. Cette méthode se base sur le fait qu'une solution diluée de glycine donne à l'ébullition en présence de ninhydrine (hydrate de tricétohydrindène) 1 mol. de formaldéhyde par mol. de glycine (Mac Fadyenie). D'après Eegriwe41 l'aldéhyde formique condense à 100° C. dans un milieu d'HgSC^ conc. avec de l'acide se chromotropique pour donner une coloration d'un violet intense. Les détails du procédé sont ceux proposés par Krueger. Le rendement de la première méthode est de 80 à 90 %, tandis que la seconde méthode nous permet de retrouver 90 à 97 % de l'acide hippurique ajouté. de que nous avons une finalement ///. a) Résultats Conditions de synthèse. Borsook Dubnoff et discussion Dépendance de VATP. 26 ont prouvé pour la première fois la possibilité synthèse de l'acide hippurique dans le tissu homogénéisé (foie de 28 cobaye) et la nécessité de l'addition de l'ATP. Cohen et Me Gilvery et d'une 19 ont précisé les conditions de la synthèse zoïque. Nous prouvons dans ce travail en que utilisant l'acide p-aminoben- les mêmes conditions sont synthèse de l'acide hippurique à partir de l'acide de la et benzoïque glycine, dans le foie de cobaye. En exprimant l'activité de la synthèse par le rapport : jumol. acide hippurique formé / mgr. N, nous observons que, dans les mêmes conditions d'expérience, une sus¬ pension de mitochondries préparée à partir d'un foie de rat est aussi active qu'une même suspension préparée à partir d'un foie de cobaye (tableau 1). Le dosage de la glycine a été fait dans ces deux cas selon nécessaires pour la TABLEAU 1 Suspension de mitochondries 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0,015 M. ; fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. Dosage selon la acide méthode I. Essais Conditions fiM.. acide blanc Rat glycine 0,49 0,54 3,04 glycine 1,00 2,03 4,91 benzoate benzoate Cobaye + blanc benzoate benzoate la méthode I. Il ceci surtout est pour cobaye. Dans + hippurique formé Activité 0,22 0,24 1,35 0,42 0,85 2.05 à remarquer que les valeurs à blanc sont élevées et essais contenant des mitochondries de foie de les extrayons, avec l'éther, après déprotéinihydrolysée, libère de l'azote aminé. C'est la raison pour laquelle nous avons préféré la méthode II décrite plus haut. La constatation la plus importante concernant la synthèse de l'acide hippurique, est sa dépendance de l'ATP. Cette synthèse présente un nouvel exemple d'une réaction endergonique couplée avec la déphosphorylation de l'ATP. Le tableau 2 montre l'activité des mitochondries en sation, une ces essais nous substance qui, fonction de la concentration de l'ATP. Les mitochondries ainsi que la solution surnageante contiennent des ferments hydrolysant l'ATP. Pour maintenir une concentration suffisante en ATP, il faut ajouter un substrat oxydable permettant la rephosphorylation oxydative de l'acide adénylique (Millier et Leuthardt48). comme substrat oxydable. 20 Nous avons utilisé le fumarate TABLEAU 2 Suspension de mitochondries 0 5 ce. Acide benzoïque 0.001 M. ; glycine 0,015 M. ; acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KCl 0,04 M. ; cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 30 min. à 38° C. fiM. «M. ATP par essai formé 0 0,15 0.5 0.20 1.0 0,40 1,10 3,05 3,0 6,0 b) Localisation de la Pour obtenir la Me Gilvery28 synthèse. p-amino-hippurique, de l'acide synthèse travaillé avaient hippurique acide des avec homogénats lavés Cohen et et avaient particules insolubles de l'homo¬ hippurique, à partir de benzoate différentes fractions résultants des centrifugations constatons que le système de synthèse se trouve trouvé que cette synthèse était liée aux génat. En étudiant la synthèse de l'acide et de glycine, dans les l'homogénat, nous de mitochondries, ceci aussi bien pour des mitochondries partir d'un foie de rat que d'un foie de cobaye (tableau 3). localisé dans les préparées à TABLEAU 3 Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0,015 M. ; acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KCl 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. Hc homogénat complet ; M = = mitochondries ; S = surnageant ; C = culot. «M. acide +4 Hc ac. ac. benzoïque benzoïque + Rat Cobaye Rat 0,112 0,760 2,55 0,028 0,133 1,25 0,730 0,358 glycine 0,083 0,304 3,94 0,054 0,092 2,06 2,220 0,566 0,179 0,195 0,068 0,072 0,230 0,645 0,155 glycine M M + M 4- ac. ac. benzoïque benzoïque + benzoïque benzoïque 4- glycine 0,112 0,158 0,179 benzoïque + glycine 0,340 S S 4 ac. S 4- ac. C 4- ac. Activité Cobaye Hc Hc hippurique formé Additions 0.108 21 La faible activité deux ces Il dans le surnageant et le culot est reste de mitochondries. retenue possible est de déterminer approximativement mitochondries dans les différentes fractions la succinodéhydrase (méthode ls coll. due, dans fractions, à la présence d'un cet enzyme se trouve de est méthode cette Potter*9). van la de quantité déterminant l'activité de Selon Schneider et uniquement dans les mitochondries. Or l'activité des différentes fractions mitochondries. Par en proportionnelle nous avons à leur teneur trouvé quantité de mitochondries (ou débris de mitochondries) en qu'une certaine reste, après le fractionnement par centrifugation, dans le liquide surnageant. En considérant l'activité de la synthèse, nous constatons qu'elle élevée dans les essais plus essais contenant de contenant l'homogénat complet. substrat mitochondries que dans Par contre, dans les essais est les les qui du benzoate, la synthèse d'acide l'homogénat complet qu'avec les mito¬ chondries. Le surnageant contient donc des substances qui, avec le benzoate, donnent de l'acide hippurique. En prenant comme système contiennent ne hippurique est comme plus forte avec enzymatique les fractions que de suivantes : mitochondries seules, mitochon¬ + surnageant, mitochondries + Kochsaft, et comme substrat du benzoate seul, nous avons constaté que la synthèse de l'acide hippurique dries TABLEAU 4 Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0,015 M. ; acide iumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de mitochondries ; pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 et 90 min. à 38° C. M = S surnageant ; = M K S = Kochsaft. K Benzoate Glycine 45 + + 1,610 + + + + Incubation Incubation 22 -h + + + + + + + min. + 90 + + + + + + + — /uM. hippurique 0,279 0,312 0,009 0,387 0,413 0,013 0,780 r min. acide + 0,221 3,200 + 0,805 + 2,64 + + -L- 0,155 3,18 Activité 0,179 0,243 0,198 0,212 0,840 0,091 2,010 0,433 0,722 0,008 1,710 est plus importante le surnageant dans les essais contenant en plus des mitochondries, le Kochsaft. Ces deux dernières fractions contiennent ou précurseur thermostable de la glycine. La vitesse de synthèse à partir ce précurseur est plus lente qu'à partir de la glycine (tableau 4). En outre la quantité d'acide hippurique formée à partir de ce précurseur varie d'un animal à l'autre et peut atteindre après 90 minutes d'incu¬ un de bation des valeurs considérables. c) Effet des Nous fractions dialysées. dialyse à 0° C. 12 de surnageant pendant 15 heures dialysat (solution extérieure) est réduit au vide, à 30° C. à 3 ce. La solution reste claire et il n'y a pas de précipitation. Simultanément 12 ce. du même surnageant sont gardés à la même température pendant le même temps. 13 ce. de surnageant sont chauffés au bain-marie bouillant pendant 5 minutes et centrifugés. Le surnageant ou Kochsaft est également dialyse pendant 15 heures contre 15 ce. d'eau distillée. Le dialysat est réduit au vide à 3 ce. En étudiant la synthèse de l'acide hippurique à partir de benzoate et du précurseur en présence des fractions susmentionnées, nous constatons que le surnageant dialyse perd son activité. Cette dernière peut être restaurée en ajoutant le dialysat concentré aussi bien du surnageant que du Kochsaft (tableau 5). contre 80 avons ce. « ce. d'eau distillée. Le volume du » TABLEAU 5 Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine 0.015 M. ; acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de mitochondries ; S sur¬ pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. M nageant gardé pendant 15 heures à 0° C. ; Sd surnageant dialyse ; Ds dialysat Kochsaft dialyse ; DK du surnageant ; Kd dialysat du Kochsaft. = = = = S Sd — = Kd Ds DK Benzoate Glycine — + + — — — — — _ _ -;—— + + + — _ hippurique 0,730 1,59 1,90 3,55 _ + ac. 0,410 — "T + = i I — __ _ + 0,300 0,725 1,43 3,48 Activité 0,229 0,202 0,406 0,860 2,04 0.130 0,290 0,540 1.52 23 d) Peptides, précurseurs Les résultats de la susmentionnés glycine. nous ont laissé supposer que le pré¬ peptide à poids moléculaire En effet le tel en élevé, remplaçant la glycine par glutathion. que peu certains di- ou tripeptides contenant dans leur molécule de la glycine, nous constatons que la synthèse de l'acide hippurique a lieu, et ceci aussi bien avec l'homogénat complet qu'avec les mitochondries. Donc les deux fractions contiennent les peptidases nécessaires à l'hydrolyse des pep¬ tides utilisés. En ayant comme système enzymatique une suspension de mitochondries, la synthèse à partir de la 1-leucyl-glycyl-glycine, de la curseur pourrait être un acide aminé « £0 SO W> SO ou 60 FIGURE Oxydation de divers acides 70 un 80 90 Jfltn- 1 intermédiaires du cycle tricarboxylique, au moyen d'une suspension de mitochondries. Suspension de mitochondries 0,33 ce. (1,25 mgr. N) ; substrats 0,0083 M. ; ATP 0,001 M. ; MgS04 0,0033 M. ; tampon phosphate 0,0066 M. de pH 7,4. L'isotonicité final 3 24 ce. est atteinte Incubation à 38° C. au moyen d'une solution de KCl 0,5 M. Volume FIGURE 2o Groupe de cellules hépatiques montrant les granules plasmatiques (photographie au microscope à contraste de phases). *#ÉF-* .4P tji7* C >^2 S^-ff-*' FIGURE Suspension 2 6 de mitochondries. Fixation à l'acide Coloration selon Altmann. osmique. 25 If- ¥ "f 1 3 2 î 4 FIGURE 6 Kfrjf ' 3 Proportionnalité entre la densité optique et la teneur en azote de différentes suspensions de mitochondries. • Suspension de mitochondries préparées à partir d'un foie homogénéisé dans du KC1 isotonique. Homogénat de foie de 10 %. + Suspension de mitochondries préparées à partir d'un homogénat de foie au KC1 isotonique. Homogénat de foie de 20 %. Q Suspension de mitochondries prépaiées à partir d'un foie homogénéisé dans de la mannite isotonique. Homogénat de foie de 20 %. glycyl-glycyl-leucine ou du glutathion est plus lente qu'à partir de la glycyl-l-leucine. L'addition du surnageant ou du surnageant dialyse (donc contenant plus le précurseur), à la suspension de mitochondries, ne accélère de beaucoup la synthèse à partir du tripeptide (tableau 6). Mais comme nous l'avons indiqué 50, il semble que les dipeptidases et tripeptidases sont de la cellule par P. différemment réparties entre les fractions protéiques solubles et les mitochondries. Un phénomène analogue a été observé et J. P. Greenstein 51. La question se pose synthèse de l'acide hippurique à partir des peptides, contenant de la glycine en position terminale, pourrait se faire en absence de l'ATP, par le passage de la glycine d'un groupe acyl à un autre (réac¬ tion analogue à la transphosphorylation). Le tableau 7 montre que tel n'est pas le cas. La synthèse à partir des peptides en absence d'ATP est aussi faible qu'à partir de la glycine libre. On peut en conclure que la glycine est libérée avant d'être incorporée à l'acide hippurique. de J. Fodor, V. E. Price savoir si la e) Analyse chromatographique du Kochsaft ». du dialysat, du surnageant et « Nous tographie 26 essayé d'identifier la nature du précurseur par chromapapier filtre (Consden, Gordon et Martin52, Dent53), avons sur TABLEAU 6 Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; di- ou tripeptides 0.015 M. ; fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KCl 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cyto¬ chrome C 0,0000145 M. L'isotonicité du milieu est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 60 min. à 38° C. Hc mitochondries ; S surnageant ; Sd surnageant dialyse. homogénat complet ; M acide = = = = ,aM. Additions benzoïque acide benzoïque acide benzoïque Hc + acide Hc + Hc M + + acide M + acide M + acide M + acide M + acide 1-leucyl-glycyl-glycine + glutathion + glycyl-1-leucine + benzoïque benzoïque + benzoïque + benzoïque 4benzoïque + . .... . 1-Ieucyl-glycyl-glycine glutathion glycyl-1-leucine alanyl-glycine . .... + M + S + S + benzoïque benzoïque acide benzoïque acide M + Sd + acide M + Sd + acide benzoïque benzoïque hipp. Activité -h + -•- 1-leucyl-glycyl-glycine glycyl-1-leucine . 1-leucyl-glycyl-glycine TABLEAU 1,00 2,60 2,03 3,15 0,286 0,658 0,605 0,900 0,33 1,10 1,43 3,31 0,140 0,610 0,770 1,400 1,790 3.35 M + S + acide M ac. formé 1,15 3,69 3,26 0,277 0,886 0,73 0,208 0,935 3,27 0,784 7 Acide benzoïque 0,001 M. ; glycine ou Suspension de mitochondries 0,5 ce. dipeptides 0,015 M. ; acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KCl 0,04 M. ; cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 30 min. à 38° C. «M. ATP par Exp. Additions I glycyl-1-leucine glycyl-1-leucine glycyl-1-leucine glycyl-1-leucine 0,5 1,0 glycyl-l-leucine glycyl-1-leucine alanyl-glycine alanyl-glycine glycine 1,0 II essai 3,0 6,0 «M. acide hippurique formé 0,10 0,20 0,30 2,15 6.0 0,30 1,50 0,40 3,20 6,0 3,35 6,0 1,0 27 12 de surnageant, d'un ce. 14 heures à 0° C. réduit au 70 contre vide à 3 ce. 1 ce. ce. °0, dialyses pendant dialysat est cette solution est ajouté à 3 ce. d'HCl ébullition pendant 10 heures. L'acide homogénat de 20 sont d'eau distillée. Le volume du de % et le tout chauffé à chlorhydrique est évacué au vide. Le résidu sec est dissout dans 3 ce. d'eau et filtré. Le volume du filtrat, dont la couleur est jaune, est réduit à environ 0,5 ce. Nous avons utilisé du papier filtre Whatman au vide No 1 et avons développé le chromatogramme pendant 18 heures à tem¬ pérature ordinaire en utilisant comme solvant une solution de phénol saturée d'eau et une atmosphère contenant de l'ammoniaque. Avec le filtrat susmentionné la ninhydrine fait apparaître deux taches distinctes. Les niveaux de ces taches correspondent à l'acide glutamique et à la glycine témoins sur la piste S (fig. 4). de 20 • là -< acide -< glycine -4 alanine FIGURE glutamique 4 Chromatogramme du dialysat du liquide surnageant d'un homogénat de foie de cobaye centrifugé. Le dialysat est hydrolyse pendant 14 heures. Après évaporation de l'HCl, le résidu est dissout dans 3 ce. d'eau bidistillée et filtrée. De ce filtrat on a déposé en 2 deux, en 4 quatre gouttes. En S on a déposé une goutte d'une solution standard de glycine, d'acide glutamique et d'alanine. Développement à la ninhydrine. — 13 au ce. trifugation. 28 % sont chauffés pendant 5 minutes protéines coagulées sont séparées par cenest dialyse pendant 15 heures à 0° C. contre d'un surnageant de 20 bain-marie à 100° C. Les Le « Kochsaft » 30 ce. sont d'eau distillée. 13 également dialyses ce. du même surnageant et du même homogénat 30 ce. d eau distillée pendant le même contre temps. Le volume des deux dialysats est réduit à sec par évaporation au vide. Chaque résidu est redissout dans 3 ce. d'eau. De ces solutions 2 ce. sont transférés dans deux ballons contenant 4 ce. d'HCl de 20 % que l'on porte à ébullition durant 24 heures. Après distillation de l'HCl au vide, chaque résidu est redissout dans 0,2 ce. d'eau bidistillée. Nous avons Kochsaft opéré de la même manière avec l'hydrolysat du dialysat du (DK). Après développement à la ninhydrine nous observons des taches correspondant à l'acide glutamique et à la glycine (fig. 5). Nous pouvons en déduire que le précurseur du surnageant est iden¬ Kochsaft et, comme nous l'avons déjà mentionné, tique à celui du thermostable. Même une hydrolyse prolongée de 10 à 24 heures ne fait « » « DK 2 » DS S 1 S 2 cvsteine *• lit acide glutamique valine FIGURE 5 Chromatogramme du dialysat du liquide surnageant et du Kochsaft du même chromatogramme de l'hjdrolysat du dialysat du homogénat de foie de cobaye. Ds En 1 on a déposé une et en 2 deux gouttes de l'hydrolysat. liquide surnageant. DK chromatogramme de l'hydrolysat du dialysat du Kochsaft. En 1 on a déposé En S des deux chromatogramme^. on a 2 deux gouttes de l'hydrolysat. et en une déposé une goutte d'une solution standard de valine. d'acide glutamique. de glycine et de cystéine. Développement à la ninhydrine = = — 29 apparaître d'autres acides aminés que celui qui a une valeur Rf. D'après le tableau de Dent 53 nous pouvons avoir à cet endroit l'ornithine, la valine, la norvaline ou le tryptophane. Il est possible que le précurseur se trouve être la glutathion, car cette substance est assez répandue dans les différents organes des mammifères (Awapara 54). Dans nos conditions d'expérience nous n'avons néanmoins jamais pu prouver la présence de la cystéine sous forme de cystine. pas de 0,77. Influence de la f) concentration de la glycine. D'après les travaux de Cohen et McGilvery2H il faut 15 fois plus glycine que d'acide p-amino-benzoïque pour obtenir en 45 minutes une synthèse totale. Nous avons montré qu'à partir de benzoate et du pré¬ curseur on pouvait obtenir une quantité considérable d'acide hippurique. Il est peu probable que la glycine libérée ou formée à partir d'autres corps se trouve dans une concentration dépassant de beaucoup celle de l'acide benzoïque. En effet, dans nos conditions d'expérience, c'est-à-dire de avec un système enzymatique tel 45 minutes d'incubation que les mitochondries, /«mol. avec 4 de nous obtenons synthèse de 77 %. Avec 12 jumol. de glycine, donc une concentration trois fois supé¬ rieure à celle de l'acide benzoïque, nous obtenons une synthèse de 98 % (tableau 8). Il est à noter qu'un tel rendement n'est possible qu'avec une en glycine une suspension de mitochondries suffisamment active contenant au moins 2 mgr. N par essai. En comparant nos expériences à celles de Cohen 28 et coll. nous voyons que la conjugaison de la glycine avec l'acide ben¬ zoïque se fait plus rapidement qu'avec l'acide p-amino-benzoïque. TABLEAU 8 de mitochondries 0,5 ce., 2,07 mgr. N par essai. Acide benzoïque acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate Suspension 0,001 M. ; de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. fM. Additions ac. 4 4 4 4 30 fM. fM.. fM. fM. ac. ac. ac. ac. benzoïque benzoïque benzoïque benzoïque + 4 + 8 +12 + 20 fM. fM. ftM. fiM. glycine glycine glycine glycine hippurique 0,25 3,08 3,56 3,95 3,98 Rendement % 76,9 89,5 98,6 99,5 de la g) Synthèse glycine à partir d'autres acides aminés. Après ingestion de fortes doses d'acide benzoïque, la quantité de glycine, éliminée sous forme d'acide hippurique, dépasse de beaucoup les réserves de glycine (libre ou combinée) disponible dans l'organisme. 11 doit y avoir une synthèse de la glycine à partir d'autres substances. Borsook et Dubnoff 25, étudiant la formation de l'acide hippurique dans des coupes de tissus, ont trouvé que certains amino-acides, en présence de l'acide benzoïque, augmentent la quantité d'acide hippurique formée. Leuthardt 29 a prouvé, à l'aide de coupes de foie de cobaye, que la glutamine fournit presque autant d'acide hippurique que la glycine. Leuthardt 31 ont montré que, dans les mêmes conditions d'expérience, et Glasson la serine également transformée en glycine. Ce résultat fut confirmé qui, en utilisant de la serine marquée (d, 1-sérine N15-l-C14), est par Shemin 30 fournit la preuve définitive d'une scission de la chaîne carbonée de la serine entre les positions fi et y. Nous basant sur ces données, nous avons possibilité d'une synthèse de la glycine à partir d'autres acides l'homogénat de foie et les mitochondries. Avec un homogénat de foie de cobaye ou une suspension de mito¬ chondries, il ne nous a pas été possible d'obtenir une synthèse d'acide hippurique à partir des acides aminés suivants : acide /?-oxyglutamique, 1-leucine, 1-valine, l'asparagine, la bétaïne, l'alanine et la d, 1-sérine. Par cherché la aminés dans à partir de la thréonine ou de la sarcosine, nous obtenons une quantité considérable d'acide hippurique. Ceci aussi bien avec un homo¬ génat qu'avec une suspension de mitochondries. L'activité de ces deux contre acides aminés de la ment saires glycine est presque aussi grande que celle de la partir de la thréonine et de la dans des suspensions de mitochondries à à la transformation de ces localisés dans les mitochondries deux TABLEAU se La synthèse produit égale¬ pures. Les enzymes néces¬ corps (tableau 9). glycine. sarcosine en Avec la glycine se trouvent glutamine ou l'acide 9 Système enzymatique 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; acide fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; ATP 0,0005 M. ; cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un tampon phosphate de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. Hc mitochondries. homogénat complet ; M = — /uM. Additions benzoïque benzoïque acide benzoïque acide benzoïque Hc + acide Hc + acide Hc + Hc + M + acide M + acide M + acide benzoïque benzoïque benzoïque + -1- 40 mM. thréonine 8 («M. thréonine + 40 «M. sarcosine + 40 + ac. hipp. formé 8 f 40 ^M. /tM. ,«M. thréonine thréonine sarcosine Activité 0,90 1,50 1,35 1,20 0,31 0,52 0,41 0,42 0,40 2,20 1,74 2,21 0,22 1,22 0,84 1,23 31 glutamique nous obtenons dans l'homogénal une faible formation d'acide hippurique. En présence d'une suspension de mitochondries les valeurs il sont semblables à celles obtenues à partir du précurseur naturel dont était question plus haut (page 24). Les combinaisons des systèmes enzymatiques : mitochondries + surnageant, mitochondries + surnageant dialyse ou mitochondries + Kochsaft, ne favorisent pas la formation de la glycine à partir des deux acides aminés susmentionnés. La prolon¬ gation du temps d'incubation a pour seul effet d'augmenter la synthèse de l'acide hippurique à partir du benzoate et du précurseur. Nous avons également varié la concentration du tampon, sans obtenir d'effet. Il est curieux que la d, 1-sérine soit inactive tandis que la d, 1-phényl-sérine mito¬ nous donne une faible synthèse en présence d'une suspension de également, la combinaison des différentes frac¬ prolongation du temps d'incubation n'a aucun effet (tableau 10). Les résultats obtenus avec la glutamine, l'acide glutamique chondries. Dans tions ce cas la ou TABLEAU 10 Mêmes conditions que celles indiquées sous tableau 9. «M. ,,,.,. acide benzoïque + Hc + 40 Hc + Hc M et la ac. + + benzoïque -f- ac. benzoïque phényl-sérine ne . 38° C. ... Activité . 0,33 1,74 0,55 1,10 0,28 0,33 glutamique 1.54 0,46 0,90 0,96 0,45 0.27 phényl-sérine 40/iM. phényl-sérine 1,10 40 40 sont . à 1,22 0,20 + -j- min. hipp. . acide ac. 45 forme glutamique benzoïque -+- 40 ^M. /M. ac. r Additions Hc Incubation ^M. glutamine .... ac. i/M. pas réguliers et ne — 0,29 0,24 0,59 peuvent pas encore être capacité (coupes) glycine à partir de la d,l-sérine, de la glutamine et de l'acide glutamique, tandis que ces transformations n'ont pas lieu dans le tissu homogénéisé. Nous ne pouvons pas expliquer la raison pour laquelle la scission de la chaîne carbonée ne peut se produire après la interprétés. Or nous de former de la 32 constatons que le tissu intact a la destruction du tissu. Il est possible que les conditions de soient pas optimales parce qu'un facteur pendant la préparation de l'homogénat, ou ne nos indispensable que expériences été détruit a facteur ce se trouve être trop dilué. h) synthèse de l'acide hippurique Inhibition de la un par facteur hépatique. Dans le chapitre concernant la préparation des mitochondries, nous qu'une substance inhibitrice colorée se trouve dans les homogénats de foie de cobaye. En présence de cette substance, on obtient des suspensions de mitochondries légèrement colorées qui ne sont que avons peu mentionné ou pas actives. Ces observations ont nous laissé supposer que le corps inhibiteur pouvait provenir de la bile. Nous avons, après neutra¬ lisation, dilué 10 fois la bile du même animal avec un tampon phosphate de pH 7,5. nos Nous avons ajouté de essais. L'inhibition de la cette synthèse solution une quantité croissante à de l'acide hippurique est nette, animal à l'autre (tableau 11). mais n'est pas toujours la même et varie d'un synthèse dépend beaucoup de la manière dont les mito¬ chondries sont préparées (voir page 16). La quantité du facteur inhi¬ biteur, contenu dans le foie de cobaye, dépend de la nourriture de l'animal (herbe ou foin plus betteraves). Cette constatation ainsi que la coloration observée lors de la préparation des mitochondries, nous fait supposer qu'il s'agit d'un pigment d'origine végétale. Dans des expériences ulté¬ rieures, il s'agira de chercher la nature chimique de cet inhibiteur. L'activité de la TABLEAU 11 Suspension de mitochondries 0,5 ce. Acide benzoïque 0,001 M. ; fumarique 0,0025 M. ; MgS04 0,0026 M. ; KC1 0,04 M. ; cytochrome C 0,0000145 M. L'isotonicité est atteinte au moyen d'un de K de pH 7,5. Volume final 4 ce. Incubation 45 min. à 38° C. en azote de la solution de bile ajoutée, exprimé en mgr. acide Additions 3 benzoate + benzoate + benzoate + benzoate + benzoate + benzoate + N bile («M. acide glycine 0,015 ATP tampon N bile hippurique glycine glycine glycine 0,007 3.28 0,028 0.70 glycine glycine glycine 0,010 0,020 0,030 3,60 3,12 0,0005 M. ; M. ; phosphate = teneur formé 3,60 2.57 33 IV. 1. Il y Sommaire synthèse d'acide hippurique à partir de benzoate et de glycine hépatique homogénéisé du rat et du cobaye. La synthèse lieu qu'en présence de l'ATP. a dans le tissu n'a système enzymatique nécessaire à la synthèse de l'acide hippu¬ rique se trouve localisé dans les granules cytoplasmiques (mitochon¬ 2. Le 3. En dries) de la cellule présence concentrée 4. la 7. 8. glycine L'analyse mitochondries suffisamment une obtenu d'acide après centrifugation des mitochon¬ un précurseur de dialysable et sans altération. chromatographie sur papier a révélé glycine. Cela nous laisse supposer qu'un des précurseurs au moins est du glutathion. La glycine peut en effet être remplacée par certains polypeptides. Nous avons obtenu une synthèse d'acide hippurique à partir des peptides suivants : 1-leucyl-glycyl-glycine, glycyl-glycyl-leucine, le glutathion, la glycyl-1-leucine, et l'alanyl-glycine. En présence d'une suspension de mitochondries le rendement en acide hippurique est supérieur à partir des dipeptides. En ajoutant le liquide surnageant dialyse à la suspension de mitochondries on augmente la synthèse à partir des tripeptides. Ceci montre que dans la cellule la répar¬ tition des di- et tripeptidases est différente entre les fractions protéiques solubles et les mitochondries. La synthèse à partir des peptides n'a lieu qu'en présence de l'ATP. Dans nos précurseur glutamique conditions quelquefois une plaçant dans la tamine et la 34 de synthèse stoechiométrique benzoate et de glycine. thermostable du d, 1-phényl-sérine 9. suspension obtenons noyaux et des débris cellulaires contient de l'acide 6. nous hippurique à partir de Le liquide surnageant, dries, des 5. hépatique. d'une La bile de par et de la d'expériences la transformées sarcosine, la thréonine et la glycine. Nous obtenons très faible formation d'acide hippurique en rem¬ synthèse la glycine par l'acide glutamique, la glusont en d,l-sérine. cobaye contient l'acide hippurique. un facteur inhibiteur de la synthèse de DEUXIEME PARTIE LA PHOSPHORYLATION /. a) Rôle physiologique Il est connu que de la BIOLOGIQUE DE LA THIAMINE Généralités cocarboxylase. les troubles de l'avitaminose lement d'un trouble du catabolisme Bi relèvent essentiel¬ glucidique qui se traduit par une accumulation d'acide tissus nerveux. pyruvique dans les tissus et en particulier dans les Ces phénomènes sont devenus plus clairs depuis qu'on a la thiamine sous la forme de son dérivé phosphorylé, le thiaminepyrophosphate ou cocarboxylase, est le coenzyme de la décar¬ boxylation de certains acides a-cétoniques, surtout de l'acide pyruvique. Dans la levure, le produit de la décarboxylation de l'acide pyruvique est l'aldéhyde acétique. Dans les tissus animaux, la décarboxylation est couplée avec une oxydation. Mais il est peu probable que la cocarboxylase fonctionne en même temps comme coferment de la déshydrogénation. Nous discuterons ce problème plus tard. Un seul exemple de formation d'un aldéhyde dans un extrait de tissu animal a été constaté (Green1). La signification de cette constatation reste douteuse (Krebs2). Green 3 ont étudié la spécificité de la carboxylase purifiée de la levure. et coll. Ces auteurs ont trouvé que l'acide a-céto-isovalérique est décarboxylé avec la même vitesse que l'acide pyruvique. Pour l'acide oxalylacétique la vitesse est d'un tiers, les acides a-céto-isocaproïque et a-cétoglutarique sont à peine attaqués. L'enzyme ne réagit pas avec les acides acétoacétique, phénylpyruvique et p-oxy-phénylpyruvique. montré que b) Phosphorylation De nombreuses active de la vitamine Ce dernier a de la thiamine. expériences prouvent actuellement Bi n'est été isolé pour la pas la thiamine, première mais son que la forme pyrophosphate. fois par Lohmann et Schuster 4 35 à partir de la levure. Puisque la vitamine Bi est pleinement active dans l'animal vivant, il est clair que l'organisme dispose d'enzymes permettant la phosphorylation de la thiamine en son ester pyrophosphorique. La formation de ce En a été étudiée par cocarboxylase général, (levure lavée avec carboxylase privée de son zymase la dernier la » parations il apparaît une formée a plusieurs auteurs. été dosée à l'aide de ]'« aetio- des solutions tampons alcalines) contenant coferment. Mais en utilisant de telles pré¬ difficulté en ce sens que l'excès cocarboxylase présente. de thiamine (découvert Ochoa) est explicable par le fait que la thiamine inhibe l'hydrolyse de la cocarboxylase par une phosphatase contenue dans l'« aetiozymase (Westenbrink et coll. 5). Comme il n'a pas été tenu compte dans les effet premières recherches sur la synthèse de la cocarboxylase de cet d'Ochoa », l'interprétation des résultats en est incertaine. augmente l'activité de la Cet effet par » « La levure, les bactéries et le tissu animal contiennent des systèmes phosphoryler la thiamine. Euler et Vestin 6 ont observé que le pouvoir de décarboxylation, vis-à-vis de l'acide pyruvique, d'une poudre de levure de bière augmente lorsque cette dernière est incubée en pré¬ sence de thiamine, de phosphate minéral et de l'acide adénosinetriphosphorique (ATP). Goodhart et Sinclair7, Tauber9, Ochoa et Peter s9 ont étudié le mécanisme de la phosphorylation dans les tissus d'animaux. Ochoa 10 a trouvé que le foie contient un système phosphorylant actif. Les interprétations données aux résultats obtenus ont soulevé un certain nombre d'objections. Différents auteurs ont travaillé avec des capables de concentrations en thiamine assez considérables. Dans ces conditions, l'augmentation de la décarboxylation que l'on observe en ajoutant à Taetiozymase de levure la solution incubée, pourrait être due, comme nous venons de voir, à l'activation de la cocarboxylase préformée et non à la synthèse de cocarboxylase (Lipton et Elvehjem J1), Westenbrink et coll.5). Ochoa10 a démontré que les extraits exempts de cellules (foie, muqueuse intestinale, cerveau) n'étaient pas actifs. Par contre les pulpes d'organes ne réalisent la phosphorylation qu'au cours d'une respiration active. Weil-Malherbe 12 réussit à extraire d'une poudre acétonique de levure de bière, par précipitations fractionnées, une protéine active capable de phosphoryler la thiamine. Cette opération s'effectue en dehors de tout processus d'oxydation et l'ATP se trouve être le donateur du pyrophosphate. Nguyen van Thoai et Chevillard is décrivent une mé¬ thode de purification des protéines phosphorylant la thiamine. Ces auteurs ont extrait d'un homogénat de foie de chien, par précipitations fractionnées sulfate d'ammonium, une fraction semble-t-il très active la thiamine. Malheureusement, les conditions manquent de clarté. Nous reviendrons sur leurs résultats dans la discussion de ce travail. au capable de phosphoryler d'expérience et de dosage et 36 c) cocarboxylase. de la dosage Méthodes de et enzymatiques, c'est la dernière que nous dosage simple qui nous permette de déceler de petites quantités de cocarboxylase. Le dosage se fait indirectement et se base sur la décarboxylation de l'acide pyruvique en présence de l'apoferment de la décarboxylase de la levure. La quantité de CO2 dégagé chimiques Des méthodes avons est choisie afin d'avoir mesuré sieurs manométriquement. utilisé, comme apoferment, de l'a levure (Auhagenu, Westenbrink et coll.0). Par plu¬ lavages d'une poudre de levure de bière, avec des tampons phos¬ La lavée un plupart en phates des auteurs ont milieu alcalin alcalins ces l'« effet d'Ochoa », auteurs éliminent Westenbrink paration enzymatique un grand cocarboxylase préformée montre la activée par la thiamine le coferment. Pour supprimer 3 proposent d'ajouter à la pré¬ excès de thiamine. Dans ces conditions, et contenue coll. son activité maxima dans les solutions dont et on n'est veut plus doser 12 en se basant sur les données cocarboxylase. Weil-Malherbe de Axmacher et Bergstermann 13 a préparé à partir d'une poudre de levure une fraction protéinique contenant la carboxylase. Pour enlever le coferment il s'est servi de la même méthode que Warburg et Christian 16 ont utilisée pour scinder la d-aminoacidodésaminase (addition de HC1 dilué en présence de sulfate d'ammonium). Cette préparation était surtout destinée à étudier le mécanisme de la phosphorylation de la thiamine. Green et coll. 1? ont extrait de la levure de bière par précipitation au sulfate d'ammonium une décarboxylase très active. Cette dernière est la teneur en ensuite traitée à deux reprises avec une solution de sulfate d'ammonium l'apoferment (« split enzyme»). Kubowitz et Lûttgens 18 ont également préparé une carbo¬ xylase très active sans donner, cependant, des détails concernant la préparation. Pour nos dosages de la cocarboxylase nous avons essentiellement utilisé la préparation protéinique décrite par Weil-Malherbe 12. Mais alcaline. De comme nous cette le manière, verrons, ces auteurs obtiennent les excès d'ATP et de thiamine contenus dans essais peuvent fausser nos résultats quelle que soit la méthode de dosage. La préparation protéinique de Weil-Malherbe contient encore un nos enzyme pouvant phosphoryler la thiamine en présence d'ATP. Il nous fallait donc tout d'abord fixer les conditions permettant de doser la cocarboxylase formée en présence d'ATP et de thiamine. 37 //. a) Matériel et Animaux Ils ont reçu : Partie conditions Nous pendant avons expérimentale d'expérience. utilisé des environ 10 jours rats une albinos adultes de 150-200 gr. nourriture optimale contenant de la viande. Substrats : thiamine, la cocarboxylase, l'acide glutamique ainsi La que le pyruvate de Na sont des selon des produits Hoffmann-La Roche. méthodes mentionnées dans L'ATP est la préparé par première partie de ce travail. L'acide adénosine monophosphorique est un produit de Bischoff, U. S. A. L'acide adénosine diphosphorique a été obtenu à partir de l'ATP et de myosine. La levure de bière a été mise obligeamment à notre disposition par la brasserie Hûrlimann à Zurich. Conditions d'expérience : La phase gazeuse est de l'air. Après 20 minutes d'incubation à 38° C. la réaction est arrêtée par déprotéinisation à chaud pendant une minute au bain-marie. Après centrifugation une partie aliquote est prélevée pour le dosage de la cocarboxylase. nous b) Dosage enzymatique La et coll. notre préparation de de la cocarboxylase. l'apoferment selon la méthode de Westenbrink 5 n'a pas donné des résultats satisfaisants avec la levure mise à disposition. Il n'a pas été possible d'obtenir une actiozymase privée de cocarboxylase à partir de chaque préparation quantité de cocarboxylase présente dans nos pré¬ parations, après le lavage alcalin, s'élevait souvent à 1/4 de la quantité à doser. La préparation de l'apoferment selon les modalités de Weilsuffisamment de levure séchée. La Malherbe 12 donna la méthode la plus sensible. Mais la fraction nous protéinique qu'on obtient est capable de phosphoryler la thiamine en présence d'ATP. Du fait que nos solutions à doser contiennent encore de l'ATP et de la thiamine, il peut se produire en présence de l'enzyme de la levure une synthèse de cocarboxylase qui fausse les résultats. En évitant dans les essais un excès de thiamine il est cependant possible d'utiliser l'enzyme de Weil-Malherbe sans introduire une erreur notable. Mais par fractionnement au sulfate d'ammonium, nous avons réussi à éliminer complètement l'enzyme phosphorylant. Cette préparation ne forme aucune cocarboxylase même en présence d'un excès considérable de thiamine 38 et d'ATP. 1. Préparation de la solution enzymatique. La levure de bière fraîchement pressée est lavée pendant 72 heures pressée à nouveau et séchée en fines couches à tem¬ pérature ordinaire. Une poudre sèche, gardée à 0° C, reste active pen¬ dant plusieurs mois. La préparation de la poudre acétonique de la levure à l'eau courante, se un fait selon les indications de Weil-Malherbe 12. Gardée au vide dans dessicateur la poudre reste active pendant plusieurs semaines. 1 gr. de la poudre acétonique est pétri dans un mortier en ce. d'eau. On refroidit à 0° C. et on ajoute 1 ce. d'acide présence acétique 2 N. Le précipité est séparé par centrifugation. A la solution, 15 ce. de (NH4) 2SO4 sat. (1/3 saturation finale) sont ajoutés et le précipité obtenu éloigné par centrifugation. A nouveau 15 ce. de (NH4) 2SO4 sat. (1/2 sat. finale) sont ajoutés. Après centrifugation le précipité est dissout dans 10 ce. de tampon phosphate (1/20 M.) de pH 6,2. On ajoute 50 ce. d'eau et 30 ce. de (NH4) 2SO4 sat. (1/3 sat. finale). Après avoir refroidi la solution à —5° C, 30 ce. de HC1 N/10 (contenant assez de (NH4) 2SO4 pour donner une concentration finale de 1/3 saturation) sont ajoutés rapidement en agitant la solution. Il se forme un précipité. Ce dernier est récolté par centrifugation à —5° C. et lavé avec 20 ce. de (NH4) 2SO4 3/4 sat. (A ce stade la fraction enzymatique peut être gardée comme suspension dans une solution de (NH4) 2S04 3/4 sat. pendant plusieurs heures sans perte d'activité.) Le précipité est dissout dans 45 ce. de tampon phosphate (1/20 M.) de pH 6,2. Des protéines dénaturées sont éliminées par centrifugation. Toutes les opérations ainsi que les centrifugations s'effectuent à 0° C. La solution enzymatique est préparée avant chaque dosage à partir de la poudre acétonique. de 30 2. Dosage manométrique. Les fioles contiennent 1 ce. d'enzyme de levure, 1 ce. de tampon phosphate (1/20 M.) de pH 6,2, 0,1 ce. d'une solution de Mn++ et Mg++ N, et une partie aliquote de la solution de cocarboxylase inconnue. Le volume final est de 3 ce. Pour établir remplace la solution inconnue xylase (en général 0,05 y, 0,10 par y, des est versé de CO2 dégagée l'appendice est courbe de référence, connues de on cocarbo¬ 0,20 y). L'appendice contient 0,5 d'une solution de pyruvate 1/5 N. La température du thermostat est de 27° C. le pyruvate quantité de une quantités ce. phase gazeuse est de l'air. La Après 20 minutes d'équilibration dans la fiole. Dès mesurée toutes les ce moment, la 10 minutes pendant 1 heure. Dans ces conditions la quantité de CO2 libéré est proportionnelle quantité de cocarboxylase présente. Nous comparons les valeurs de CO2 obtenues après 30 minutes. Comme nous l'avons dit plus haut, notre préparation protéique contient une quantité variable d'un enzyme catalysant la synthèse de la cocarboxylase en présence de la thiamine à la 39 (thiamine + ATP) de la figure 1 montre une cocarboxylase. La thiamine ainsi que l'ATP seuls donnent des valeurs identiques au blanc. Dans nos expériences, la phosphorylation de la thiamine, en pré¬ sence d'ATP et de l'enzyme hépatique, est incomplète. De ce fait il nous reste après la période d'incubation un excès de thiamine et d'ATP. Dans ces conditions la quantité de cocarboxylase peut augmenter au cours de son dosage manométrique. En général l'erreur est négligeable; mais nous avons toujours ajouté à chaque série de dosage un essai qui sert à fixer la limite supérieure de l'erreur. Nous ajoutons à la solution enzymatique les quantités maxima de thiamine et d'ATP et de l'ATP. La courbe telle de la synthèse pouvant être introduites La figure 2 montre avec la solution inconnue. courbe de référence. En une général la quan¬ CO2 libérée, après 30 minutes, est une fonction linéaire de la quantité de cocarboxylase, jusqu'à une concentration d'environ 0,2 y de cocarboxylase. La solution enzymatique préparée selon la méthode tité de que nous venons La préformée. ne de représente de décrire de valeur en ne contient que des CO2 dégagé moyenne que les 3 % en traces présence de de cocarboxylase l'enzyme seul de la valeur obtenue pour 0,2 y cocarboxylase. Purification 3. La solution Malherbe 12 Vapoferment de obtenue enzymatique contient, de entre autres la décarboxylase. selon protéines, une les modalités de Weil- transphosphorylase très 0,2 y Cocurb 0,1 y Cocarb 0 05 y Cocarb 0,2 y Thiamine + 10 20 30 40 FIGURE 40 50 1 0,3fiMATP 60 Minutes 0.2 0.1 FIGURE 2 y Cocarb active. Dans le paragraphe précédent nous avons décrit une méthode de préparation d'une solution enzymatique ne contenant qu'une faible quantité de transphosphorylase. Nous avons néanmoins constaté que pour pouvoir étudier la synthèse de la eocarboxylase à partir de plus grandes concentrations (5 à 10 y) de thiamine et (5 à 10 ,uM.) d'ATP, il était nécessaire, pour des raisons que nous avons indiquées dans le chapitre susmentionné, d'éliminer complètement cette transphospho¬ rylase. Nous avons encore apporté les modifications suivantes à la mé¬ thode de préparation de l'apoferment. Le précipité obtenu par acidification à —5° C. en un milieu de (NH4) 2SO4 de 1/3 de saturation finale est récolté par centrifugation et lavé avec 20 ce. de (NH4) 2SO4 3/4 sat. On le centrifuge. Au culot on ajoute, tout en le triturant, 10 ce. d'une solution de NH4OH N/100. Le résidu protéique ne se dissout que partiellement et le pH de la suspension se trouve être de 7,0. A cette suspension on ajoute 30 ce. d'un tampon phosphate 1/20 M. de pH 6,2. Une petite quantité de protéines déna¬ turées sont écartées par centrifugation. Au surnageant on ajoute 30 ce. de (NH4) 2SO4 sat. (saturation finale de 43 %). Après centrifugation, le culot est redissout dans 20 ce. de tampon phosphate 1/20 M. de pH 6,2 et reprécipité à 43 % de saturation finale en (NH() 2SO4. On centrifuge. Le culot est redissout dans 15 ce. de tampon phosphate 1/20 M. de pH 6,2 et la solution est employée comme telle. Cette dernière contient 65 à 80 y de tyrosine par ce. Le tableau 1 montre quelques caractéristiques de notre solution enzymatique. Il en ressort que la décarboxylase est très active et que TABLEAU 1 récipients de Warburg contiennent 1,0 ce. de solution enzymatique de la (environ 0,5 mgr. de protéines) ; 1,0 ce. d'une solution de tampon phosphate 1/20 M. de pH 6,2 ; 0,1 ce. d'une solution contenant 1 mgr./cm3 de Mg 1 + et de Mn + ; dans l'appendice 0,5 ce. d'une solution de une partie aliquote de la solution à doser ; Les levure de Na 1/5 M. Le volume est complété à 3 ce. avec HoO bidistillée. quantités de substance indiquées dans le tableau se trouvent dans les récipients. pyruvate Additions mm3 CO-2 en 30 Les min. 1.5 0,05 y eocarboxylase 0,10 y eocarboxylase 97,7 . 158.5 . 10 y thiamine i- 2 mgr. ATP 0,5 y thiamine + 0,05 mgr. ATP . 4.4 3,2 6.4 1.0 2 mgr. 0,05 ATP mgr. ATP .... .... 1.0 2.1 41 la transphosphorylase a été complètement éliminée. Même en présence de 10 y de thiamine et de 2 mgr. d'ATP nous n'obtenons pas, ou tout au plus dans les limites d'erreur de la méthode, de formation de cocar- plus élevée de 6,4 mm3 de CO2 après 30 et même représente qu'environ 0,01 y de cocarboxylase. Il est à remarquer que, contrairement aux résultats de Weil-Malherbe 12, nous n'obtenons avec l'ATP aucun effet de cocarboxylase, ceci même avec boxylase. La valeur la 60 minutes, ne les concentrations de 2 mgr. d'ATP utilisées par cet auteur. Nous n'avons effet qu'en employant un produit obtenu des Schwarz cet observé Laboratories Inc., New-York, préparé à partir de la levure, et non pas à partir du muscle de lapin comme le nôtre ainsi que celui utilisé par Weil-Malherbe. Une telle préparation contient encore des traces de cocarboxylase (environ 8/100 de y par juM. d'ATP). L'effet de l'ATP observé par Weil-Malherbe est probablement un effet secondaire dont il est difficile de donner une explication. Il nous semble peu probable qu'il y ait formation, entre l'ATP de faible activité. décarboxylase et l'enzyme actif, d'une « pseudo- » 4. Dosage des Le dosage de l'azote mitochondries protéines. protéique des homogénats, des suspensions de des surnageants Pour les fractions contenant et été fait selon la méthode de a du (NH4) 2SO4 Kjeldahl. utilisé méthode de Folin-Ciocalteu19, basée sur la réaction de coloration donnée par la tyrosine et le tryptophane. Les extinctions sont lues au encore nous avons la spectrophotomètre de Beckman. L'activité boxylase est exprimée par le rapport : y de la synthèse de la cocar¬ cocarboxylase formée par essai. mgr. Pour calculer la N N protéique, nous nous sommes basés indiquant que 0,126 mgr. de tyro¬ sine correspondent à 1 mgr. de protéines. Cette valeur est en réalité trop élevée pour notre enzyme hépatique. La coloration que nous avons obtenue avec l'enzyme hépatique, équivaut à 7 8,5 % de tyrosine. N'ayant pu obtenir une teneur constante dans nos préparations, nous avons adopté le rapport indiqué par Weil-Malherbe comme base fictive permettant d'établir des points de comparaison d'une fraction à l'autre. sur teneur en les données de Weil-Malherbe 12 « » - 42 Résultats ///. a) Conditions de la synthèse et discussion dans le tissu hépatique. homogénat de foie de rat de 10 % préparé dans isotonique au moyen de l'appareil de Potter et Elvehjem 20. Une telle préparation contient un enzyme capable de syn¬ thétiser de la cocarboxylase à partir de la thiamine en présence de l'ATP, de ions Mg++ et d'un substrat oxydable tel que l'acide glutamique Nous utilisons une un solution de KCl (tableau 2). Le substrat oxydable est nécessaire pour maintenir la resynthèse oxydative de l'ATP, car les extraits bruts contiennent des enzymes qui hydrolysent l'ATP (l'« apyrase »). Nous utilisons le nom d'« apyrase pour désigner un enzyme hydrolisant les liaisons phospha¬ tées labiles de l'ATP. Le nom adénosinetriphosphatase ou ATP-ase devrait être réservé à la myosine, seul enzyme connu qui n'enlève qu'un seul reste phosphoryl de l'ATP. Le tissu homogénéisé contient une certaine quantité, variant d'un animal à l'autre, de cocarboxylase pré¬ formée. L'activité de l'homogénat, après soustraction de la valeur à » « blanc, est de » Le milieu d'incubation contient M. ; acide K 0,0066 M. : glutamique de pH 7,4. solution de KCl. Volume final 3 ce. 0,5 ce. 2 d'homogénat Homogénat + Homogénat + Homogénat + ac. ac. ac. ATP 0,001 M. ; tampon avec une Incubation 20 min. à 38° C. y cocarboxylase formée par essai glutamique + ATP glutamique + thiamine glutamique + thiamine + Localisation de la de foie ; M. ; thiamine 2 y par essai ; L'isotonicité du milieu est obtenue 0>0066 Additions b) » 0,43. TABLEAU Mg++ 0,0033 phosphate de « . . ATP 0,82 0,98 0,80 1,80 Activité 0,349 0,765 synthèse. centrifugation nous avons séparé les homogénats de foie en une : suspension de granules cytoplasmiques (mitochondries) et le liquide surnageant. La préparation de ces fractions est décrite dans un travail précédent 21. L'étude de la phosphorylation de Par deux fractions 43 la thiamine dans l'une ou l'autre des fractions susmentionnées nous qu'il faut la somme des systèmes enzymatiques pour obtenir une synthèse (tableau 3, exp. III). Pour purifier la phosphorylase, nous avons centrifugé un homogénat de 10 % pendant 30 minutes à 18.000 t. p. m. (25.000 X g). Toutes les opérations s'effectuent à 0° C. Au liquide surnageant, qui est tout à fait limpide, nous ajoutons un volume égal d'acétone. Le précipité est lavé avec de l'acétone et séché au vide. Une poudre acétonique gardée au froid dans un dessicateur ne perd pas de son activité pendant deux semaines. 200 mgr. de poudre sèche sont triturés au moyen de l'appareil de Potter et Elvehjem dans 5 ce. de KC1 isotonique. On centrifuge afin d'écarter les particules insolubles. Dans un tel extrait, la formation de la cocarboxylase à partir de la thiamine et de l'ATP a lieu (tableau 3, exp. V), même en l'absence de mitochondries et du substrat oxydable. L'extrait contient encore une quantité considérable de cocarboxylase préformée, exprimée dans le tableau par l'essai « extrait seul ». En montre soustrayant mine » nous cette valeur de celle obtenue pour l'essai « extrait + thia¬ une activité de 1,18. obtenons pour l'extrait Ces expériences montrent que le liquide surnageant, résultant de centrifugation de l'homogénat complet, nécessite la présence du système phosphorylant des mitochondries. Ces dernières, par contre, ne la TABLEAU 3 Le milieu d'incubation contient : suspension enzymatique ; ATP 0,001 M. ; Mg++ 0,0033 M. ; acide glutamique 0,0066 M. ; thiamine 2 y par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. L'isotonicité du milieu est obtenue avec une solution de KO. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C. y Additions Exp. I 0,49 Mitochondries + thiamine 0.59 II 0,25 Surnageant III -r Mitochondries thiamine .... + surnageant . Mitochondries + surnageant + thiamine IV 44 cocarboxylase formée par essai Extrait + mitochondries 0.55 0,89 1,71 Extrait + mitochondries + thiamine 1,00 2,75 Extrait 0,81 2,16 + thiamine .... ..... pas directement à la phosphorylation de la 22 il a été prouvé que les granules série de travaux participent thiamine. Par cytoplasmiques sont le siège du cycle des acides tricarboxyliques et de la phosphorylation oxydative de l'acide adénylique ou de l'acide adénosinediphosphorique. Dans l'essai surnageant + thiamine », l'apyrase est très active et la faible activité obtenue est probablement due à la présence de mitochondries restées en suspension qui suffisent à maintenir une faible resynthèse de l'ATP. Le fractionnement à l'acétone élimine la plus grande partie de l'apyrase présente, sans, pour autant, diminuer la teneur en cocarboxylase préformée. C'est seulement après la séparation de la transphosphorylase de l'apyrase que la synthèse devient indépendante du système phosphorylant des mitochondries et du substrat oxydable. Ces constatations montrent que l'enzyme qui produit la phosphorylation de la thiamine est une protéine soluble, contenue dans le liquide sur¬ nageant et que l'ATP est nécessaire comme donateur de phosphore. une « c) Elimination de la Pour sommes cocarboxylase préformée. séparer la cocarboxylase de basés sur les constatations de la poudre acétonique, nous nous 16 concernant Warburg et Christian séparation du groupe prosthétique de la d-aminoacidodésaminase de apoferment. En présence de sulfate d'ammonium ayant une action protectrice, le groupe prosthétique peut être séparé du ferment par l'acide chlorhydrique dilué. 400 mgr. de poudre acétonique sont suspendus dans 10 ce. de tampon phosphate 1/25 M. de pH 7,5. On centrifuge après 2 heures d'extraction. la son l'extrait, dont le volume A mesure environ 9,7 ce., on ajoute 10 ce. de tampon phosphate 1/20 M. de pH 6,2, 37,5 ce. d'eau froide et 28,5 ce. de (NH4) 2SO4 sat. (saturation finale en (NH4) 2SO4 1/3). Le mélange = ajoute en remuant 28,5 ce. d'une solution d'HCl 1/10 N 1/3 saturé en (NH4) 2S04. Après centrifugation (—5° C.) la fraction précipitée est lavée avec 20 ce. d'une solution de (NH4) 2SO4 3/4 sat. Le résidu est dissout dans 7 ce. de tampon phosphate 1/25 M. de pH 7,5. On élimine par centrifugation les protéines dénaturées, et la solution est employée comme telle. Nous appelons cette fraction pré¬ cipité HC1 ». La phosphorylation de la thiamin»; avec cette fraction enzymatique est très active. La valeur à blanc est nulle, ce qui signifie que la cocar¬ boxylase préformée a été éliminée (tableau 3, exp. I). Nous avons vu dans un chapitre précédent que le fractionnement du liquide surnageant par l'acétone avait pour effet d'éliminer la plus grande partie de l'apyrase. Cette dernière a été totalement écartée par la seconde précipitation en milieu acide. De ce fait, l'acide glutamique comme substrat oxydable servant à la resynthèse de l'ATP peut être supprimé. Nous observons même une faible inhibition de la synthèse en présence de l'acide gluest refroidi à —5° C. Puis on « 45 tamique (tableau 4, menté. perd % que 5 de II). La stabilité de l'enzyme a également aug¬ enzymatique gardée à 0° C. pendant 5 jours ne activité initiale (tableau 4, exp. III). exp. Une solution son TABLEAU milieu Le MgT 7.4. d'incubation contient : 4 enzymatique suspension ; ATP 0,001 M. ; thiamine 2 y par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C. Ppté. HC1 fraction enzymatique + 0,0033 M. ; = (préparation : voir chapitre élimination de la cocarboxylase préformée }' Additions Exp. I « cocarboxylase formée par essai Ppté. HC1 seul 0,00 1,60 II Ppté. HC1 + thiamine + 5 [A.M. Ppté. HC1 + thiamine + 10 /M. Ppté. HC1 + thiamine -t 40 /<M. », ac. ac. ac. 2,16 2,14 1,93 1,86 glutamique glutamique glutamique III Ppté. HC1 frais + thiamine Ppté. HC1 après 5 jours + thiamine 0,00 2,34 2,22 . page 45). Activité 4,74 5,58 5,53 4.96 4,80 6,00 5,70 IOuMATP Influence de la concentration en ATP Le milieu contient : solution enzymatique (ppté. HC1) ; Mg++ 0,0033 M. ; thiamine 3 y par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final de 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C. Af> d) Influence de lATP et des ions Mg++. L'activité de la synthèse de la concentration en fonction des ions ATP (figure 3). Mg++ (figure 4). cocarboxylase est fonction de la phosphorylation est également La concentration optimale se trouve La 0.6 3 0,4 *-0,2 10 20 FIGURE Influence 30^MMg" 4 de la concentration des ions Mg+ + Le milieu d'incubation contient: solution enzymatique (ppté. HC1). ATP 0,001 M.; thiamine 2 y par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C. 7.5 pH FIGURE 5 Effet du pH Le milieu d'incubation ATP contient : solution 0,001 M. ; Mg++ 0,0033 M. ; thiamine K 0,0066 M. de pH différents. Volume final 3 2 enzymatique (ppté. HC1 neutralisé) ; y par essai ; tampon phosphate de ce. Incubation 20 min. à 38° C. 47 15 entre et 20 //M. de Mg encore peu clair. Le une action légèrement transphosphorylation est indispensable pour toutes les réac¬ 30 par essai. inhibitrice. Le rôle des ions Mg++ semble être Mg /uM. ont lors de la tions nécessitant de l'ATP. e) Effet La pH du figure du milieu et du temps d'incubation. de à verre synthèse 5 montre l'activité de la milieu d'incubation. Ce dernier avant et a été mesuré c'est-à-dire d'expérience, thiamine, la formation de la cocarboxylase 20 minutes d'incubation. Ce temps phosphoryler quantitativement de la cystéine (60 juM. par essai) dans le milieu d'incubation n'a aucun du est optimale présence de 2 y de général achevée après en du NaCN ou (160 /<M. ou par essai) inhibiteur sur l'enzyme. milieu contient solution : 5 enzymatique (ppté. M. ; Temps d'incubation en en ATP 0,001 M. ; y 90 1,32 2,20 2,33 3,30 120 5,43 40 60 de la concentration de ; Cocarboxylase formée minutes 20 f) Variation HC1) phosphate de K de pH 7,4 5 7 de thiamine par essai ; tampon Volume final 3 ce. Incubation à 38° C. Mg++ 0,0033 0,0066 M. en effet stimulateur TABLEAU Le est pH l'électrode augmente considérablement si l'on 5 y de thiamine (tableau 5). La pré¬ sence l'activité de fonction du moyen de après l'incubation. L'activité de la synthèse un pH de 6,8 à 6,9. Dans nos conditions veut en au l'enzyme. phosphorylation de la thiamine en fonction l'enzyme. La quantité de cocarboxylase formée augmente jusqu'à ce que la quantité de thiamine présente devienne le facteur limitant de la réaction. Dans l'expérience représentée par la courbe supérieure, la phosphorylation complète de la thiamine est atteinte avec une concentration de 0,210 mgr. N. (dosage selon Folin) La figure 6 montre la de la concentration de par essai. La courbe inférieure est obtenue un 48 peu moins active. avec une solution enzymatique 0,2 0.1 0,3 FIGURE mgN 0.4 6 Concentrations variables de la solution enzymatique Le milieu d'incubation contient : quantités variables de la solution enzymatique (ppté. HCl). ATP 0,001 M. ; MgH + 0,0033 M. ; thiamine 2 y par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C. La courbe supérieure correspond à une solution enzymatique plus pure (0.21 mgr. N/cc.) que la courbe inférieure (0,42 mgr. N/cc). g) Mécanisme de la La synthèse. phosphorylation enzymatique la de thiamine F ATP peut s'effectuer de deux manières différentes 1. Par l'addition successive de deux par substance une restes intermédiaire, le en présence de : phosphoryl, en passant monophosphate de la thiamine. ATP + thiamine ATP + thiamine en résumé > cocarboxylase Par addition d'un groupe ATP + thiamine (ADP phate). = i monophosphate + ADP cocarboxylase + ADP : 2 ATP + thiamine 2. thiamine monophosphate adénosine > + 2 ADP. pyrophosphate. cocarboxylase diphosphate ; AMP + AMP = adénosine monophos¬ 49 L'ADP qui fonctionner reste phosphoryl labile, ne peut pas phosphate. Il a au contraire une action (tableau 6, exp. II). Il s'agit très probablement possède comme fortement inhibitrice dune substitution encore un donateur de dans complexe enzymatique le (« compétitive inhibition »), la car structure de de l'ADP l'ADP est très à l'ATP semblable à celle de l'ATP. Cette inhibition est fonction de la quantité d'ADP présente. En remplaçant l'ATP par l'ADP, nous n'obtenons qu'une très faible formation de cocarboxylase et ceci même avec 10 juM. d'ADP qui contiennent autant de P labile que 5 fiM. d'ATP (tableau 6, exp. III). également un effet inhibiteur sur la phosphorylation de la thiamine (tableau 6, exp. IV). L'action inhibi¬ trice de l'AMP est cependant plus faible que celle de l'ADP. Cette cons¬ tatation est en plein accord avec notre hypothèse selon laquelle il s'agirait d'un remplacement de l'adénosine de l'ATP dans le complexe enzyma¬ tique par les substances inhibitrices. La structure de l'ADP est plus proche de la structure de l'ATP que celle de l'AMP. Il faut donc s'at¬ tendre à ce que l'ADP possède pour l'enzyme une affinité plus forte L'AMP P labile contenant aucun ne a que l'AMP. TABLEAU Le y de final 3 5 milieu contient solution : 6 (ppté. HC1) enzymatique celles contenues dans le volume final de 3 I ce. MgT + 0,0033 Incubation 20 min. à 38° C. y Additions Exp. «M. ATP 5 II 5 fiM. ^M. fiM. 5 5 III 1,50 1,02 ATP + 2,5 + 5 ATP + 10 /M. /M. fiM. ADP . ADP . ADP . 2,5 fiM. ADP 5 10 IV ATP 4 4 4 6 6 ^M. /uM. fiM. fiM. ,«M. cocarboxylase formée 2,5 /uM. ATP 50 ; M. ; thiamine par essai, tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume Les quantités d'ATP, d'ADP et d'AMP indiquées dans le tableau sont ce. 0,59 0,37 0,27 ADP 0,16 0,16 ADP 0.16 ATP ATP + ATP + 0,5 2 /M. fiM. AMP . AMP . (M. AMP ATP /M. /M. ATP + 2 . 2,00 1,83 1,52 2,20 1,72 monophosphate de la thiamine était un produit intermédiaire cocarboxylase, celui-ci devrait pouvoir remplacer Si le dans la formation de la la thiamine. Le tableau 7 montre si que substituons la thiamine- nous monophosphate * à la thiamine, on ne trouve qu'une faible synthèse de cocarboxylase. Il est donc peu probable que la thiamine-monophosphate soit l'étape intermédiaire dans la formation de la cocarboxylase. On devrait s'attendre, dans ce cas, à ce que le monophosphate soit transformé en cocarboxylase avec la même vitesse que la thiamine. La faible synthèse que nous avons constatée, peut être due à une hydrolyse partielle de la thiamine-monophosphate en donnant de la thiamine. Weil-Malherbe u, dans ses expériences avec l'enzyme de levure, avait trouvé une période d'induction plus longue, c'est-à-dire une vitesse de synthèse plus faible, la thiamine-monophosphate à la thiamine. D'autre part, en substituant la formation de la cocarboxylase est légèrement inhibée par l'addition de la thiamine-monophosphate. TABLEAU conditions Mêmes que celles indiquées 7 pour tableau le 6. TMP = thiamine- monophosphate. Additions 5 5 y Au <uM. ATP TMP + 5 fM. ATP + thiamine + 5 /M. ATP cours de l'ADP cocarboxylase formée 0,20 0,56 1,52 TMP y 5 y TMP + 5 5 y }' et de la selon .... synthèse, la seconde 5 y thiamine . il se de . 2.33 . forme selon la première hypothèse l'AMP. Comme nous travaillons en présence d'un très grand excès d'ATP par rapport à la thiamine, la quantité d'ADP ou d'AMP formée, par transphosphorylation, est du même ordre de grandeur que celle formée par hydrolyse spontanée de l'ATP de l'expérience. Pour cette raison, il n'est pas possible de cours au recherche des produits de prouver l'une ou l'autre des hypothèses par dégradation de l'ATP. D'après nos constatations, nous tirons la conclu¬ sion que la phosphorylation de la thiamine s'effectue par le transport d'une molécule de pyrophosphate. * La substance a été mise obligeamment à notre disposition par le professeur M. Viscontini. 51 CH3 I CH C C = - OH CH2-CH2 OH C H3C-C - ! OH I OH I HO-P-O-P-O-P-O-adénosine CH2 N - II C C-NH2 N O s - O O H I OH CH3 C CH I I Il II O 0 + 0 P-O-adénosine = I OH OH X C C-NH-> N = II Il I C-CHo-N H3C-C I CCH0-CH2-O-P-O-P = OH OH ! S - H Nous étudié la avons phosphorylation synthétisée été récemment dihydrothiamine. de la h) Phosphorylation par Karrer et de la dihydrothiamine, qui Krishna 23 * a : CH3 C CH N = C CH2 OH CH2 I H3C C C 'I l - N - C - N CH2 - C NH2 H2 En prenant acétonique, de la exp. nous comme obtenons système enzymatique l'extrait de la poudre une faible synthèse de cocarboxylase à partir présence d'ATP et de ions Mg++ (tableau 8, dihydrothiamine en I). Elle représente environ le 40 % même concentration de thiamine. Avec que et « 60 le précipité HCl », nous %, comparée à celle de pour la (tableau 8, * P. 52 La Karrer. est exp. substance fonction de synthèse obtenue avec la solution enzymatique telle synthèse variant entre 40 (tableau 8, exp. II). Comme la cocarboxylase à partir de la dihy¬ concentration de l'enzyme présent obtenons une la thiamine thiamine, la formation de drothiamine de la une la III). a été obligeamment mise à notre disposition par le professeur TABLEAU 8 solution enzymatique ; ATP 0,001 M. ; Mg ^ 0,0033 M. ; 2 y de dihydrothiamine ou de thiamine par essai ; tampon phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C. Le milieu contient : y Additions Exp. cocarboxylase formée I Extrait + dihydrothiamine Extrait + thiamine ..... Ppté. HC1 + dihydrothiamine Ppté. HC1 + dihydrothiamine Ppté. HC1 + thiamine II 0,89 1,30 1,88 0,45 . sans ATP 0,00 0,95 .... III 0,5 1,0 1,5 1,0 L'étude aérobies, de la ce. ce. ce. ce. ppté. HC1 + dihydrothiamine ppté. HC1 + dihydrothiamine ppté. HC1 + dihydrothiamine 0,50 0,60 0,78 ppté. HC1 + thiamine 1,14 phosphorylation . dans des conditions anaérobies et cystéine, montre que la quantité de cocarboxylase formée est plus forte en présence d'oxygène et en l'absence de cystéine. Il semble qu'une certaine quantité de dihydrothiamine est toujours oxydée milieu aqueux (tableau 9). La quantité d'oxygène nécessaire pour en avec et sans TABLEAU Le milieu Mg'+ 0,0033 phosphate de contient : solution 9 enzymatique (ppté. M. ; 2 y de dihydrothiamine par essai ; K 0,0066 M. de pH 7,4. Volume final 3 ce. ATP 0,001 M. ; HC1) ; cystéine 0,0032 M. ; tampon Incubation 20 min. à 38° C. de Warburg. La dihydrothiamine ainsi que la cystéine sont placées dans l'appendice. Pour les essais en milieu anaérobie on place dans le tube central de la fiole du phosphore et l'air est chassé par un courant d'azote. Les Le essais contenu anaérobies sont de sont effectués dans l'appendice est des fioles ajouté milieu au d'incubation y Additions Anaérobie Aérobie lorsque les conditions atteintes. Dihydrothiamine Dihydrothiamine Dihydrothiamine Dihydrothiamine cocarboxylase formée sans avec sans avec cystéine cystéine 0,39 0,40 cystéine cystéine 0,62 0,42 0,98 53 l'oxydation de cette petite quantité (pour 1 7 il faut 4.10-8 ce. d'C^). Il des pour éviter toute l'enzyme hépatique. de d'obtenir solution une continué à fractionner la précipitations à rigoureuses de la substance. i) Purification Afin est suffisamment conditions anaérobies oxydation dihydrothiamine est très faible évidemment impossible d'avoir de enzymatique plus pure, nous avons protéique précipité HCl par des solution de (NH4) 9SO4 saturée une solution successives avec « » 0° C. A 17 ce. de la solution on précipité HCl ajoute 12,8 ce. de (NH4) 2SO4 sat. (saturation finale de 43 %). Ce précipité est inactif et nous l'éloignons par centrifugation. Au surnageant nous ajoutons 26,9 ce. de (NH4) 2SO4 sat., ce qui porte la saturation finale à 70 %. Le précipité est récolté par centrifugation et dissout dans 10 ce. de tampon phosphate 0,004 M. de pH 7,1. Cette solution enzymatique est active et nous l'ap¬ pelons précipité 43-70 % I ». A 7,5 ce. de cette solution protéique, nous ajoutons 10 ce. de (NH4) 2SO4 sat. (saturation finale de 57 %). Le précipité est éloigné par centrifugation. Au surnageant on ajoute de nouveau 10 ce. de (NH4) 2SO4 sat. (saturation finale 73 %). Après cen¬ trifugation le précipité est dissout dans 3 ce. de tampon phosphate 0,004 M. de pH 7,1. Nous appelons cette fraction précipité 57-73 % II « » « « Le tableau 10 tiques. L'activité montre moyenne l'activité de ». des différentes synthèse du « précipité solutions 57-73 % enzyma- II » est de 18 à 23 7 de cocarboxylase par mgr. N. protéique. Cette fraction enzymatique est la plus pure que nous ayons obtenue jusqu'à maintenant. Nous avons comparée enrichissement de l'activité un à celle de enzymatique de 50 à 60 fois l'homogénat complet. TABLEAU 10 Le milieu d'incubation contient solution : thiamine 5 y par essai ; tampon Volume final 3 ce. Incubation 20 min. à 38° C. Mg++ 0,0033 M. ; y Additions Ppté. Ppté. .... Ppté. 43 70 % I seul Ppté. 43-70 % I + thiamine - .... Ppté. 57 73 % II seul Ppté. 57 73 % II 4 thiamine - - 54 cocarboxylase formée par essai HCl seul HCl + thiamine ATP 0,00166 M. ; enzymatique ; phosphate de K 0,0066 M. de pH 7,1. . .... Activité 0,00 2,22 7,8 0,00 2,26 16 0,00 2,86 24 IV. 1. Sommaire décrit une méthode permettant de préparer, à partir poudre sèche de levure de bière, une solution enzymatique qui contient Fapoferment de la décarboxylase de l'acide pyruvique. Au moyen de cette solution enzymatique, il est possible, dans des conditions appropriées, de doser d'une manière indirecte des quan¬ tités variant de 1/100 à 1/5 de y de cocarboxylase. Nous avons d'une 2. Cette solution enzymatique est très active et relativement instable. présence d'un excès de cocarboxylase nous obtenons environ 700 ce. de CO2 par minute par mgr. N. protéique. Cette préparation enzymatique ne contient plus de transphosphorylase. De ce fait, il est possible de doser de faibles quantités de cocarboxylase en pré¬ En 3. sence de thiamine Nous avons d'ATP. étudié la synthèse de la cocarboxylase à partir de la présence d'ATP, dans l'homogénat de foie de rat. L'enzyme hépatique provoquant la transphosphorylation est une protéine soluble, assez stable. thiamine, 4. et Nous en développons une enzymatique hépatique lase préformée. C'est que 5. La et nous avons méthode permettant d'obtenir en étudié la active, ne contenant phosphorylation de la thiamine nécessite Mg++. La phosphorylation de 2 y de ions après 20 minutes d'incubation à 38° C, enzymatique contenant au moins 0,240 optimum se trouve entre 6,8 et 6,9. 6. L'étude du mécanisme discutée. L'ADP La ne une solution cocarboxy¬ présence de cette solution enzymatique synthèse biologique de la cocarboxylase. très de la la plus de présence de l'ATP de thiamine est totale présence d'une solution mgr. N. protéique. Le pH en phosphorylation de la thiamine est fonctionne pas comme donateur de phosphate. par l'ATP, du corps intermédiaire hypothétique, phosphorylation thiamine monophosphate, est très faible. L'AMP a un effet inhibiteur beaucoup plus faible que l'ADP. De nos expériences, nous tirons la conclusion que la phosphorylation de la thiamine s'effectue par le transport d'une molécule de pyrophosphate de l'ATP sur la la thiamine. 55 7. Nous avons thiamine d'ATP et boxylase étudié la synthétique de ions Mg~t" variant phosphorylation enzymatique de en milieu aérobie +. Nous entre 40 et avons 60 %, et obtenu par anaérobie une la en dihydroprésence synthèse de cocarla synthèse à rapport à partir de la thiamine. 8. L'enzyme hépatique a encore été purifié par fractionnement de la solution protéique avec une solution de (NH4) 2SO4 sat. La fraction la plus pure a une activité de synthèse de 24 y de cocarboxylase par mgr. N. protéique. Nous avons ainsi augmenté de 50 à 60 fois l'activité enzymatique par rapport à celle de l'homogénat complet. Physiologisch-chemisches Institut der Zurich, Januar 1951. 56 Universitàt, CURRICULUM VITAE danoise, je suis né le 6 octobre 1918 à Sœrabaja, en onze années. En 1930, je suis entré à l'Ecole Privât Indonésie, j'ai à Genève. Faute de bases solides, j'ai dû quitter cette école en 1931 pour l'Institut G. Rauch à Genève, où je me suis préparé pour les examens De nationalité vécu où d'entrée au Technicum de Genève. J'ai réussi ces examens en automne quitter obligé majeures j'ai dû les suivre. Je suis entré alors provisoirement au Loughborough Collège en Angleterre. Au printemps 1937, j'ai quitté l'Angleterre pour la Suisse et suis 1934. En la 1936, des Suisse, raisons ont mes parents à et entré à l'Ecole Lémania à Lausanne, pour y préparer la maturité fédérale type C. J'ai passé ces examens en 1940, session de Fribourg. Les semestres de l'Ecole Polytechnique Fédérale ne commençant qu'en automne, je me suis fait immatriculer pour le semestre d'été à l'Université de Lausanne, à la Faculté des Sciences. En 1940, je automne me suis fait immatriculer à l'E. P. F. à la section printemps 1945, j'ai obtenu le diplôme d'ingénieur-chimiste de chimie. Au de l'E. P. F. Au début de remplacement l'année 1946, j'ai fait, pendant quelques mois, professeur comme de scientifiques, branches dans un un internat 4e Villars-sur-Ollon. En 1946, j'ai été engagé automne comme assistant non officiel et scientifique par M. le Professeur Leuthardt, Directeur de l'Institut de Chimie physiologique de la Faculté de Médecine de l'Uni¬ collaborateur versité de Genève. En automne 1947, M. le Professeur Leuthardt ayant été nommé directeur de l'Institut de Chimie de cet Zurich, je l'y institut porté sur physiologique de l'Université suivi, et, jusqu'au printemps 1951, j'ai travaillé dans qualité en surtout ai la de collaborateur recherche du scientifique. Mes métabolisme de travaux l'azote et sur ont les vitamines. De 1948 à cette thèse, au printemps 1951, j'ai eu le privilège de pouvoir travailler j'ai présentée au printemps 1951 à la section de chimie que de l'E. P. F. A partir de cette date, j'occupe un poste d'ingénieur dans l'industrie. 57 BIBLIOGRAPHIE PREMIERE PARTIE physiologischen Arbeiten, F. C. Vogel, Leipzig 1897. 2 G. H. Hogeboom, W.S. Schneider et G.E. Pallade, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 65, 320 (1947) ;J. Biol. Chem. 172, 619 (1948). 3F. Leuthardt et A.F. Muller, Exper. 4, 478 (1948) ; F. Leuthardt, A.F. Muller et H. Nielsen, Helv. Chim. Acta 32, 744 (1949). 4 A. Claude, Cold Spring Harbor Symposia on Quant. Biol. 9, 263 (1941) ; J. 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Dépendance de l'ATP 19 b) Localisation de la synthèse 21 c) Effet des fractions dialysées 23 . e) Analyse chromatographique du dialysat, du surnageant f) Influence de la concentration de la g) Synthèse de la glycine à partir Sommaire et du «Kochsaft» 26 30 glycine d'autres acides aminés h) Inhibition de la synthèse de l'acide hippurique IV. 18 19 glycine par un .... facteur hépatique 31 33 34 61 DEUXIEME PARTIE La I. phosphorylation biologique de la thiamine Généralités 35 a) Rôle physiologique de cocarboxylase 35 b) Phosphorylation de la thiamine 35 c) Méthodes de dosage de la cocarboxylase 37 II. Partie expérimentale a) Matériel et 38 conditions d'expérience 38 b) Dosage enzymatique de la cocarboxylase 1. 2. 3. 4. Préparation de la solution enzymatique Dosage manométrique Purification de Papoferment de la décarboxylase Dosage des protéines III. Résultats et discussion 39 .... 40 42 43 b) Localisation de la synthèse 43 c) Elimination de la 45 cocarboxylase préformée d) Influence de l'ATP et e) Effet du pH du milieu des ions Mg++ et du temps d'incubation 47 48 j) Variation de la concentration de l'enzyme 48 g) 49 Mécanisme de la synthèse h) Phosphorylation de la dihydrothiamine 52 i) Purification de l'enzyme hépatique 54 Sommaire 55 Curriculum vitae Bibliographie 62 39 43 a) Conditions de la synthèse dans le tissu hépatique IV. 38 57 58