101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) Hiver 2015 FICHES TECHNIQUES de bactériologie TABLE DES MATIÈRES 1. 2. 3. 4. 5. CARACTÉRISTIQUES DES COLONIES SUR GÉLOSE PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’un bouillon PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’une gélose COLORATION DE GRAM LE MICROSCOPE A) Figure B) Liste des parties C) Utilisation 6. ENSEMENCEMENT D’UNE GÉLOSE PAR STRIATION (4 stries) 7. MILIEUX DE CULTURE A) Gélose nutritive B) Gélose au sang C) Gélose MacConkey D) Gélose Mannitol-sel E) Gélose Bacillus F) Tubes TSI 8. TESTS ENZYMATIQUES A) Catalase B) Oxydase C) Coagulase 9. CULTURE ANAÉROBIE 10. ANTIBIOGRAMME Département de biologie Page 1 2 3 4 5 6 7 8 9 9 10 11 12 13-14 15 15 15 16 17-18 Collège Lionel-Groulx 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) Hiver 2015 1. CARACTÉRISTIQUES DES COLONIES SUR GÉLOSE COULEUR COULEUR 1 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 2. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’un bouillon 1. Flamber l’anse bactériologique dans la flamme du brûleur. 2. Laisser refroidir quelques secondes (10) près de la flamme. 3. Bien mélanger la culture par rotation (et non par inversion) 4. Flamber l’entrée du tube à chaque ouverture et fermeture. 5. Prélever une bouclée de bouillon. 6. Étaler le prélèvement à la surface de la lame à la grandeur d’un 10¢ Attention : flamber l’anse avant de la redéposer! 7. Laisser sécher (complètement) à l’air 8. Fixer les bactéries sur la lame en passant celle-ci rapidement dans la flamme, 3 fois. Laisser tiédir quelques secondes après chaque passage. 2 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 3. PRÉPARATION D’UN FROTTIS à partir d’une colonie sur gélose 1. Déposer une petite goutte d’eau sur une lame 2. Flamber l’anse bactériologique dans la flamme du brûleur 3. Laisser refroidir quelques secondes (10), en restant près de la flamme 4. Prélever un minuscule fragment d’une colonie (effleurer à peine une colonie suffira!). Attention, surveiller l’asepsie : couvercle entrouvert et rester à proximité de la flamme. 5. Étaler le prélèvement à la surface de la lame en le dispersant dans la goutte d’eau. Étaler à la grandeur d’un 10¢ Attention : flamber l’anse avant de la redéposer! 6. Laisser sécher (complètement) à l’air 7. Fixer les bactéries sur la lame en passant celle-ci rapidement dans la flamme, 3 fois. Laisser tiédir quelques secondes après chaque passage. 3 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 4. COLORATION DE GRAM 1. Couvrir le frottis bactérien de 2. Rincer avec un mince filet 3. Mettre l’eau iodée (lugol) ; cristal violet (colorant d’eau ; faire «tomber» l’eau attendre 1 minutes. primaire); attendre 1 minute. un peu au-dessus du frottis et non directement dessus. 4. Rincer avec un mince filet 5. Décolorer en couvrant 6. Rincer avec un mince filet d’eau. d’alcool ; attendre 30 sec. d’eau. 7. Couvrir de safranine 8. Rincer avec un mince filet 9. Assécher doucement la lame : (colorant secondaire) ; d’eau. égoutter et essuyer le dessous attendre 1 minute. de la lame à l’aide d’un papier à lentille. 10. Observer la lame à l’huile à immersion (G : 1000 X) 4 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 5. LE MICROSCOPE -- A) Figure 16 7 8 2 15 3 9 1314 10 6 11 12 1 5 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 5. LE MICROSCOPE -- B) Liste des parties PARTIES MÉCANIQUES : 1. Base supporte tout l’appareil. 2. Potence bras recourbé par lequel on saisit l’appareil pour le transporter ; supporte le tube optique et la platine. 3. Platine plateau sur lequel on dépose la préparation à observer ; elle est percée en son centre pour laisser passer la lumière. 4. Valets dispositif servant à retenir la lame en place. 5. Chariot pièce métallique située sur la platine ; sert à déplacer la préparation (contrôlé par les vis de déplacement du chariot). 6. Vis de déplacement du chariot permettent de déplacer le chariot (et donc la lame) ; l’une permet les déplacements avant-arrière (haut-bas pour l’image) et l’autre les déplacements LATÉRAUX (gauche-droite). 7. Tube optique porte à ses deux extrémités les deux composantes du système optique : l’oculaire et les objectifs. 8. Revolver pièce circulaire rotative reliée au tube optique et qui porte les objectifs ; permet de placer dans l’axe optique du microscope l’objectif approprié. 9. Vis macrométrique commande le déplacement en hauteur rapide et visible de la platine ; permet une première mise au point de l’objet à observer ; ne doit être utilisée qu’avec l’objectif à faible grossissement. 10. Vis micrométrique commande un déplacement en hauteur de la platine de très faible amplitude (mouvement produit peu visible) ; sert à faire la mise au point fine. 11. Vis du condensateur permet d’ajuster la hauteur du condensateur, pour obtenir l’éclairage optimal ; attention, il s’agit d’une grosse vis, pas d’une petite (ne touchez pas aux petites vis : le condensateur pourrait tomber)! PARTIES OPTIQUES : 12. Source lumineuse (lampe) fixée sur la base, sous le condensateur ; vous pouvez régler son intensité (attention de ne pas envoyer TROP de lumière : c’est plus fatiguant pour les yeux et on perd des détails!). 13. Condensateur système de lentilles situé sous la platine ; concentre les rayons lumineux pour augmenter la clarté de l’image. Sa hauteur est réglable par une vis. 14. Diaphragme intégré dans le condensateur ; dose la quantité de lumière qui traverse l’objet ; contrôlé par un petit levier qui se déplace latéralement (pas une petite vis : un levier!). 15. Objectif fixés sur le revolver, ils sont au nombre de quatre ; chacun est un système de lentilles pointé vers l’objet à observer ; produisent des images agrandies de l’objet (4X, 10X, 40X, 100X). 16. Oculaire système de lentilles pointé vers l’œil de l’observateur ; il agrandit une nouvelle fois (10X) l’image déjà agrandie par l’objectif et la transmet à l’œil. 6 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 5. LE MICROSCOPE – C) Utilisation 10 AVANT D'OBSERVER 1. Allumer la lampe et régler à une intensité moyenne. 2. Centrer la lame au-dessus du rayon lumineux (vis de la platine). 3. Élever la platine au maximum (vis macrométrique). (Condenseur remonté et diaphragme-iris ouvert) 20 MISE AU POINT AVEC LE PLUS PETIT OBJECTIF (4X ou 5X) 1. 2. 3. 4. Sélectionner l'objectif. Abaisser lentement la platine (vis macrométrique) jusqu'à l'obtention d'une image dans l'oculaire. Ajuster la mise au point (vis micrométrique). Choisir un point de l'image à grossir et l'amener au centre du champ visuel (vis de la platine). 30 MISE AU POINT AVEC L'OBJECTIF 10X Répéter les 4 étapes précédentes. 40 MISE AU POINT AVEC L'OBJECTIF 40X Répéter en n'utilisant que la vis micrométrique. 50 MISE AU POINT AVEC L'OBJECTIF A IMMERSION (100X) 1. Déplacer l'objectif 40X sans amener complètement l'objectif 100X. 2. Déposer une goutte d'huile au centre de la lame (l’indice de réfraction de l’huile étant proche de celui du verre, cette goutte minimise la réfraction et la perte de lumière lors de son passage entre la lame et la lentille de l’objectif). 3. Amener complètement l'objectif 100X. 4. Faire la mise au point avec la vis micrométrique. TRUCS POUR AMELIORER LA CLARTE DE L'IMAGE? 1. Ajuster le réglage de l'intensité lumineuse (bouton de réglage de la lampe) 2. Ajuster la hauteur du condenseur. (vis du condenseur) 3. Ajuster le diaphragme-iris. POUR RETROUVER UNE IMAGE PERDUE? Recommencer avec le plus petit objectif! (sûr et rapide) ESSENTIEL APRES UTILISATION DE L'IMMERSION: Essuyer les objectifs 40X et 100X avec du papier à lentilles 7 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 6. Ensemencement d’une gélose par striation (4 stries) ISOLATION DE COLONIES Après avoir prélevé aseptiquement un échantillon (près d’un brûleur, avec une anse bactériologique stérile) Strie 1 1. Effectuer une striation continue (gauche) ou une série de 4 stries (droite) en évitant de passer deux fois au même endroit. Refermer. Série 1 Flamber l’anse bactériologique. Strie 2 2. Effectuer une 2e striation continue (gauche) en ne passant que 2 fois dans la 1ère strie; ou une 2e série de 4 stries (droite) en évitant de passer deux fois au même endroit. Refermer. Série 2 Flamber l’anse bactériologique. 3. Effectuer une 3e striation continue (gauche) en ne passant que 2 fois dans la 2e strie; ou une 3e série de 4 stries (droite) en évitant de passer deux fois au même endroit. Refermer. Série 3 Flamber l’anse bactériologique. Strie 3 Strie 4 4. Effectuer une 4e striation continue (gauche) en ne passant que 2 fois dans la 3e strie; ou une 4e série de 4 stries (droite) en évitant de passer deux fois au même endroit. Incuber. Colonies isolées après incubation 8 Série 4 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 7. Milieux de culture A) GÉLOSE NUTRITIVE Description Utilisation Milieu de base utilisé pour cultiver et isoler les bactéries non exigeantes. Usages multiples, examen de l’eau, du lait, des aliments. Isolation de colonies en vue d’effectuer leur description, des colorations ou divers tests. Composition Formule par litre d’eau Digestion pancréatique de gélatine (peptone)…… 5g Extrait de bœuf…………………………………... 3g Agar……………………………………………...15g Note : contrairement à la gélatine, l’agar est toujours solide quand on incube une gélose à 37oC (point de fusion = 45oC) pH = 6,8 ± 0,2 Réf. http://www.quelab.com/htmleng/1369a.html 7. Milieux de culture B) GÉLOSE AU SANG – 5% mouton Description Utilisation Milieu de base légèrement enrichi (avec du sang de mouton) pour cultiver et isoler un large éventail de bactéries non exigeantes. Utilisé de routine en santé humaine et animale pour isoler des bactéries et les différencier selon le type d’hémolyse (α, β ou γ) Composition Formule par litre d’eau Extrait de tissu cardiaque ...……………………10,0g Extrait de bœuf ………………………….8,5g NaCl ……………………………………5,0g Agar …………………………………………15,0g Sang de mouton défibrinisé …………………………..50ml pH = 6,8 ± 0,2 Réf. Interprétation http://www.quelab.com/htmleng/1601a.html Plusieurs bactéries sécrètent des hémolysines, des substances qui lysent les globules rouges. Hémolyse β ou complète : les colonies sont entourées d’une zone claire et incolore; les globules rouges sont lysés et l’hémoglobine dégradée en un composé incolore. Hémolyse α ou partielle : l’hémoglobine est réduite en méthémoglobine et il y a alors une zone verdâtre ou brunâtre autour des colonies. Hémolyse γ : absence d’hémolyse. 9 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 7. Milieux de culture C) GÉLOSE Mac Conkey Description Utilisation Milieu sélectif pour isoler les entérobactéries à gram - et milieu différentiel pour distinguer si elles fermentent ou non le lactose. Milieu sélectif : la présence de Crystal violet inhibe la croissance de la plupart des bactéries gram +, et l’ajout de sels biliaires est toxique pour beaucoup de bactéries non adaptées au milieu intestinal. Milieu différentiel : la présence de lactose et d’un indicateur de pH permet de distinguer les entérobactéries capables de fermenter le lactose (ex : E. coli) de celles qui ne le peuvent pas (ex : salmonelles). Utilisé de routine en santé humaine et animale car plusieurs infections sont causées par les entérobactéries (incluant les coliformes); de plus, ce milieu permet de confirmer la coloration de gram. Très utilisé pour les analyses d’eau. Composition Formule par litre d’eau Peptone de gélatine ...……………………17,0g Peptone de caséine ……………………………1,5g Peptone de viande ………………………………1,5g Sels biliaires …………………………………1,5g Lactose …………………………………..10,0g NaCl ………………………………………….5,0g Rouge neutre ………………………………0,03g Crystal violet ……………………………..0,001g Agar ………………………………13,5g pH = 7,1 ± 0,2 Réf. Interprétation http://www.quelab.com/htmleng/1517a.html Deux résultats peuvent être interprétés : Croissance + ou - : o Confirmation du gram : la croissance de la plupart des gram + est inhibée par le Crystal violet; la présence de colonies peut donc confirmer un gram – (mais attention, quelques gram + peuvent aussi croître sur ce milieu). o La croissance de bactéries résistantes aux sels biliaires est une indication de la présence d’entérobactérie (encore là, il y a des exceptions). Lactose + ou - : o Lactose + : les bactéries capables de fermenter le lactose rendent le pH acide, et les colonies sont alors teintées d’un rose foncé par le colorant Rouge neutre. Parfois, le pH acide fait aussi précipiter les sels biliaires autour des colonies et le milieu devient opaque et rosé. o Lactose - : Les bactéries qui ne fermentent pas le lactose ne sont pas colorées. E. coli Lactose + Proteus sp. Lactose - 10 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 7. Milieux de culture D) GÉLOSE MANNITOL-SEL Description Utilisation Composition Réf. Interprétation Milieu sélectif pour isoler les staphylocoques et milieu différentiel pour distinguer s’ils fermentent ou non le mannitol. Milieu sélectif : la présence d’une forte concentration en sel inhibe la croissance de la plupart des bactéries pour favoriser la croissance des bactéries dites «halophiles» (qui aiment le sel) tels les staphylocoques (adaptés au milieu salé de la peau). Milieu différentiel : la présence de mannitol et d’un indicateur de pH permet de distinguer les bactéries capables de fermenter le mannitol : le milieu passe alors du rose au jaune. Utilisé en santé humaine et animale pour différencier les espèces de staphylocoques. Formule par litre d’eau Peptone de caséine ……………………………5,0g Peptone de viande ………………………………5,0g Extrait de bœuf …………………………………1,0g D-Mannitol …………………………………..10,0g NaCl ………………………………………….75,0g Rouge phénol ………………………………0,025g Agar ………………………………15,0g pH = 7,4 ± 0,2 http://www.quelab.com/htmleng/1858a.html Deux résultats peuvent être interprétés : Croissance + ou - : Une croissance positive est une indication de la présence de staphylocoques. D’autres espèces peuvent croître (ex : Enterococcus sp.) mais leurs colonies sont souvent très petites. Mannitol + ou - : les bactéries capables de fermenter le mannitol rendent le pH acide et le Rouge phénol fait passer le milieu du rose au jaune autour des colonies. Staph. aureus Croissance + Mannitol + Serratia marcescens Croissance - Staph. epidermidis Croissance + Mannitol - Strep. agalactiae Croissance - 11 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 7. Milieux de culture F) Gélose Bacillus cereus (PEMBA) Description Utilisation Composition Réf. Interprétatio n Milieu sélectif et différentiel développé pour détecter spécifiquement la présence de Bacillus cereus comme contaminant alimentaire. Milieu sélectif : l’antibiotique polymyxine B est l’agent sélectif pour le genre Bacillus. Milieu différentiel : la présence de mannitol et du colorant Bleu bromothymol permettent de détecter la fermentation du mannitol et l’ajout de jaune d’œuf indique l’activité d’une lécithinase. Utilisé pour détecter la présence de Bacillus cereus dans l’industrie alimentaire. Formule par litre d’eau Peptone de caséine ……………………………1,0g Mannitol …………………………………10,0g NaCl ………………………………………….2,0g MgSO4 ………………………………………….0,1g Phosphate de Na, dibasique ……………………………….2,5g Phosphate de K, monobasique ………………………….0,25g Pyruvate de Na ………………………………….10,0g Bleu bromothymol ……………………………………..0,1g Agar ………………..……………………………15,0g Solution de jaune d’œuf ………………………………50ml Antibiotique : Polymyxine B …………………100 000 unités pH = 7,6 ± 0,2 http://www.oxoid.com/CA/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0617&c=CA&lang=EN&org=&sec = Trois résultats peuvent être interprétés : Croissance + ou - : Une croissance positive est une indication de la présence du genre Bacillus. Mannitol + ou - : Le colorant Bleu bromothymol est jaune en milieu acide et bleu-vert en milieu alcalin. Des colonies bleues-vertes indiqueront une absence de fermentation du mannitol, typique de Bacillus cereus. Lécithinase + ou - : L’apparition d’une opacité du milieu autour des colonies est due à la précipitation du jaune d’œuf, indiquant l’activité d’une lécithinase, typique de B. cereus. Croissance de B. cereus sur milieu PEMBA. 12 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 7. Milieux de culture G) Tubes TSI (triple sugar iron) TEST TSI 1. Prélever une colonie bactérienne à l’aide du fil droit stérile. 2. En piquant avec le fil droit, inoculer le culot d’une gélose inclinée TSI; en sortant le fil de la gélose, effectuer une strie sinueuse sur la pente. 3. Ne pas visser le bouchon complètement. Incuber à 37oC pendant 24 hres et noter vos observations. Description Milieu différentiel utilisé surtout pour distinguer les divers types de bactéries pathogènes entériques, bacilles gram -. Il permet de détecter : La fermentation d’un des 3 sucres présents et ce, en surface et en profondeur dans le tube La production de gaz (au cours de la fermentation) La production de H2S Composition Formule par litre d’eau Peptone de gélatineine ……………………………5,0g Peptone de caséine ………………………………5,0g Extrait de levure …………………………………3,0g Extrait de bœuf ………………………………………3,0g Peptone de viande …………………………………..10,0g NaCl ………………………………………….5,0g Lactose ……………………………………10,0g Saccharose ………………………………10,0g Glucose …………………………………………1,0g Citrate d’amonium ferrique ……………………..0,2g Thiosulfate de Na ………………………..0,2g Rouge phénol ……………………………………..0,025g Agar ………………..……………………………12,0g pH = 7,3 ± 0,2 Réf. Interprétation http://www.quelab.com/htmleng/2354a.html Quatre résultats doivent être observés : Fermentation des sucres : la fermentation d’un des 3 sucres produit des composés acides qui font virer le milieu du rouge au jaune grâce au colorant Rouge phénol. Cette fermentation peut avoir lieu en surface (sur la pente de la gélose) et/ou en profondeur (dans le culot). Par convention, on notera un milieu jaune «acide» (ou A) et un milieu rouge «alcalin» (ou K, de l’anglais, alkaline); souvent, le résultat est noté sous forme de rapport : Ex : pente/culot = alcalin/acide ou K/A Note : si un dépôt noir (voir production de H2S) empêche de voir la couleur jaune ou rouge, on assume que le milieu est jaune (acide, A) Production de gaz : la fermentation peut être accompagnée de production de gaz qui se manifeste par des craques dans la gélose ou par le soulèvement de celle-ci. On note le résultat «avec» ou «sans», ou encore simplement par + ou -. Production de H2S : La production de H2S se manifeste par l’apparition d’un dépôt noir dans la gélose. Voir exemples page suivante. 13 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 7. Milieux de culture G) Tubes TSI (triple sugar iron) EXEMPLES # Tube Pente/culot Gaz H2S 1 (témoin) K/K - 2 A/A - 14 3 A/A + - 4 K/A + 5 K/A + 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 8. TESTS ENZYMATIQUES CATALASE 1. 2. 3. 4. Placer une goutte de H2O2 sur une lame de verre (à godet). Avec une anse de Koch, prélever des bactéries et les disperser dans le H2O2. Observer immédiatement le dégagement de bulles d’O2 pour une réaction positive. NE PAS JETER LA LAME À GODETS : mettre à tremper (solution de javel) OXYDASE 1. Placer un papier absorbant sur une lame et l’imbiber avec le réactif d’oxydase. 2. Avec une anse de Koch, y déposer un prélèvement bactérien pris sur une gélose. 3. Observer l’apparition d’une coloration rosée à pourpre pour une réaction positive. COAGULASE 1. Ensemencer généreusement (2 bouclées si on utilise une culture en bouillon) un tube contenant du plasma de lapin avec EDTA (500 μl) 2. Incuber à 35 ± 1°C et examiner les tubes après un minimum de 4 heures. Les tubes négatifs sont incubés jusqu’à 24 heures. 3. La formation d’un caillot ferme et distinct est considérée comme une réaction de coagulase positive. À ce moment, aucune confirmation n’est nécessaire. Cette réaction peut être visible après 3 à 4 heures d’incubation mais ne peut être considérée négative avant 18 heures à 35 ± 1°C. TEST 1. Catalase PRINCIPE ET INTERPRÉTATION Les bactéries possédant l’enzyme catalase peuvent transformer le peroxyde d’hydrogène, H 2O2 (toxique), en H2O et O2, lequel est dégagé sous forme de gaz et entraîne la formation de bulles. On les dit « catalase + » Test utilisé en présence de coques gram+ pour différencier les staphylocoques (catalase+) des streptocoques (catalase -). Test aussi utilisé en présence de petits bacilles gram+ pour différencier divers genres bactériens. 2. Oxydase 3. Coagulase Les bactéries possédant l’enzyme cytochrome oxydase peuvent oxyder plusieurs réactifs. Le réactif utilisé dans ce test donne une coloration pourpre foncée lors de son oxydation. On les dit « oxydase + » Test utilisé pour distinguer divers groupes de bacilles gram-. Une réaction «oxydase -» est typique des bactéries de la famille des Enterobacteriacées. Les bactéries possédant l’enzyme coagulase peuvent provoquer la coagulation du plasma. On les dit «coagulase +». Test utilisé pour distinguer Staphylococcus aureus (coagulase +) de la plupart des autres espèces de Staphylococcus (coagulase -) 15 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 9. CULTURE ANAÉROBIE Types de bactéries Aérobies Facultatives Anaérobies Milieu Aérobie +O2 Anaérobie -O2 BESOINS EN OXYGÈNE Métabolisme Équation générale énergétique Respiration C6H12O6 + O2 CO2 + H2O cellulaire Fermentation C6H12O6 (CO2) + Composé organique (éthanol, ac. lactique, méthane, etc.) Rendement énergétique 38 ATP/glucose 2 ATP/glucose Gélose droite. On peut ensemencer des bactéries dans des tubes de gélose nutritive («géloses droites»). L’oxygène diffuse très peu à travers la gélose de telle sorte qu’il y a un gradient de concentration décroissant qui s’établit à partir de la surface vers le fond du tube; le fond constitue un milieu quasi anaérobie. Après incubation, on pourra observer la croissance à divers endroits dans la gélose selon les besoins en O 2 des bactéries : 1. Les aérobies obligatoires croissent à la surface. 2. Les anaérobies obligatoires croissent au fond de la gélose. 3. Les facultatives s’observent sur toute la profondeur; elles se rassemblent le plus souvent au bout supérieur de l'éprouvette, là où la respiration aérobie est possible et fournit plus d’énergie que la fermentation effectuée plus en profondeur. On distingue aussi 2 autres cas, peu fréquents dans le domaine de la santé : 4. Les microaérophiles se regroupent près de la partie supérieure car elles n'ont besoin que d'une concentration minime en oxygène pour vivre. 5. Les bactéries anaérobies aérotolérantes se disposent de manière homogène dans l'éprouvette puisque l'oxygène n'a aucun effet sur eux. Chambre anaérobie. On peut incuber des géloses en boîtes de Pétri à l’intérieur de contenants hermétiques dans lesquels on enlève l’O2 à l’aide de systèmes réactionnels tels que celui qui est illustré ici. 1. Les aérobies obligatoires ne peuvent y croître. 2. Les anaérobies obligatoires pourront y croître alors qu’elles ne pourront croître en présence dO2. 3. Les facultatives pourront croître mais plus lentement qu’en présence d’O2, puisque la respiration cellulaire fournit plus d’énergie que le processus de fermentation. Bouillon thioglycollate. Enfin, on peut cultiver des bactéries anaérobies dans un bouillon nutritif contenant du thioglycollate; ce composé fixe l’O2 et rend le milieu anaérobie. 16 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 10. ANTIBIOGRAMME 1. INTRODUCTION L’antibiogramme est une méthode servant à déterminer la sensibilité d’une bactérie à divers antibiotiques. Il est particulièrement utile lorsqu’on se rend compte qu’un antibiotique n’est plus efficace pour guérir une infection ou encore lorsqu’on veut choisir un antibiotique approprié dès le début du traitement et que l’on n’est pas certain de l’identité de la bactérie responsable de l’infection. ZONE D’INHIBITION Le principe est simple : des papiers-buvards imbibés de quantités connues de divers antibiotiques sont déposés à la surface d’une culture fraîchement ensemencée. Si la bactérie est sensible, une zone d’inhibition de croissance sera observée autour du papier-buvard (voir figure ci-contre). Des normes internationales standardisées nous ANTIBIOTIQUES permettent de déterminer, selon la grandeur du diamètre de la zone d’inhibition, si la bactérie est résistante, moyennement sensible ou très sensible à l’antibiotique (voir page suivante). 2. MANIPULATIONS 1) À l’aide d’un écouvillon, prélever un échantillon de la bactérie inconnue et ensemencer une gélose de façon à former un tapis bactérien. 2) À l’aide de pinces stérilisées (flambées à l’alcool) et/ou d’un distributeur automatique, disposer les papiers buvards sur la gélose : ils doivent être placés en périphérie (1,0 cm du bord) et à au moins 2,0 cm les uns des autres. 3) À l’aide de pinces stérilisées, appuyer légèrement sur les disques de papier pour qu’ils adhèrent bien à la surface de la gélose (sans pour autant qu’ils s’y enfoncent). 4) Incuber selon les conditions appropriées pendant 24 heures. 3. RÉSULTATS Mesurer le diamètre (mm) de chacune des zones d’inhibition de croissance. À l’aide d’une chartre de valeurs standardisées (voir page suivante), déterminer le degré de sensibilité de la bactérie aux antibiotiques testés (sensible, moyennement sensible ou résistante). 17 101-NE2-LG Microbiologie et biotechnologies (ESP) 4. CHARTRE D’INTERPRÉTATION DES ANTIBIOGRAMMES Autres 14 19 Autres 8 29 PELCZAR M.J. et CHAN E.C.S. Eléments de microbiologie, HRW, Montréal, 1982. 18