Cyril Iaconelli (UMR PAM) : Le cas problématique des bactéries
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Cyril Iaconelli – Doctorant Directeurs de thèse : Pr Patrick Gervais/ Pr Laurent Beney . 1 Introduction au projet F.PARIS 1 - Un microbiote, des probiotiques… Présentation de Faecalibacterium prausnitzii Objectif du projet F.PARIS Production de biomasse 2 - Schéma de production Equipements de production et stabilisation Des difficultés, un challenge Optimisation des conditions de production de biomasse Stabilisation et conservation 3 2 - Séchage : impact sur les organismes vivants Mise au point d’un procédé pilote de séchage Optimisation du rendement de lyophilisation Sensibilité de la souche au passage dans le tractus digestif Introduction au projet F.PARIS 1 - Un microbiote, des probiotiques… Présentation de Faecalibacterium prausnitzii Objectif du projet F.PARIS Production de biomasse 2 - Schéma de production Equipements de production et stabilisation Des difficultés, un challenge Optimisation des conditions de production de biomasse Stabilisation et conservation 3 3 - Séchage : impact sur les organismes vivants Mise au point d’un procédé pilote de séchage Optimisation du rendement de lyophilisation Sensibilité de la souche au passage dans le tractus digestif Surface du tractus digestif 200-300 m2 1014 bactéries (10x plus que de cellules humaines) 20 000 x Jusqu’à1000 espèces différentes au sein d’un même individu Rôles multiples : 4 Détoxification Digestibilité de fibres Production de vitamines Prévalence à l’obésité Action sur le système immunitaire… Vit B9 Vit K • Une des bactéries les plus abondantes du colon humain • Souche strictement négative anaérobie et Colon : 1010 à 1012 bactéries/g gram • Productrice de butyrate, formate, lactate et CO2 • F.prausnitzii (et son surnageant) ont un effet anti-inflammatoire important • Moins abondante chez des patients atteints par des maladies intestinales chroniques Sélectionner, produire et conserver une souche F.prausnitzii pour réduire les symptômes de patients atteints de maladies intestinales chroniques. 5 Duncan S. et al 2002 Growth requirements and fermentation products of Fusobacterium prausnitzii, and a proposal to reclassify it as Faecalibacterium prausnitzii gen. nov., comb. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 52, 2141–2146 Sokol H. et al. 2008. Faecalibacterium prausnitzii is an anti-inflammatory commensal bacterium identified by gut microbiota analysis of Crohn disease patients. Proceedings of the National Academy of Sciences 105(43):16731-16736 Étude clinique : - Production Production à d ’un batch pour l’échelle l’étude Optimisation des industrielle : - Recrutement process : - Scale-up - Management de - Croissance - Conservation sous Étude préclinique : - Dossier Novel Food - Statut GRAS - Tests toxicologiques 6 Sélection de la forme sèche et/ou « meilleure » souche : liquide - Effets anti- - Stabilité (viabilité et inflammatoires vitalité) dans le temps - Croissance et aptitude à être stabilisée - Implantation dans la flore intestinale l’étude Sélection des souches : - Isolation des souches Évaluation des effets antiinflammatoires (avant et après stabilisation) Évaluation des différents taux de croissance Colonisation du tractus digestif Résistance au passage dans le tractus digestif … - Toxicité et dossier Novel Food : - Étude toxicologique Production d’acide gras à chaine courte Activités enzymatiques Resistance aux antibiotiques Transfert de gène Preuves cliniques … - 7 Conditions de culture et stabilisation : - Optimisation de la production de biomasse - Optimisation de sa stabilisation (forme sèche ou liquide) - Encapsulation protégeant la souche et permettant sa libération au niveau du colon - … Scale-up et industrialisation : - Constitution d’un milieu industriel - Optimisation du process (production et stabilisation) aux conditions industrielles - Constituition de la formule finale - … Introduction au projet F.PARIS 1 - Un microbiote, des probiotiques… Présentation de Faecalibacterium prausnitzii Objectif du projet F.PARIS Production de biomasse 2 - Schéma de production Equipements de production et stabilisation Des difficultés, un challenge Optimisation des conditions de production de biomasse Stabilisation et conservation 3 8 - Séchage : impact sur les organismes vivants Mise au point d’un procédé pilote de séchage Optimisation du rendement de lyophilisation Sensibilité de la souche au passage dans le tractus digestif Préparation d’une cryobanque Culture en tube (ml) Culture en Schott (~100ml) Gestion de l’anaérobie Optimisation de la formulation Conservation Culture en fermenteur (L) Centrifugation et récolte Optimisation du procédé Récupération de la poudre Lyophilisation de la crème Equipement de production : Equipement de stabilisation et de conservation : Enceinte anaérobie Lyophilisateur Fermenteur 5 litres (anaerobe ready) 10 Lit fluidisé Enceinte pilote de séchage à HR contrôlée Anaérobie stricte Bactérie commensale du colon Reproduire en laboratoire les conditions (composition en nutriments, composition gazeuse) favorables à sa croissance Compositions gazeuse UFC.ml-1 (à 20h) N2(85%)-H2(5%)CO2(10%) 1.5 108 N2(95%)-H2(5%) 5.6 107 CO2 1 108 N2 11 Croissance Composition qualitatives et quantitatives en nutriments Atmosphère gazeuses Ajout de micronutriments Milieu de laboratoire Milieu industriel développé Volume 10mL 2L DO (600nm) Inf. à 1 Sup. à 5 Dénombrement 108UFC/mL Contraintes Présence de farines animales 2 109 UFC/mL Exempt de farines animales Introduction au projet F.PARIS 1 - Un microbiote, des probiotiques… Présentation de Faecalibacterium prausnitzii Objectif du projet F.PARIS Production de biomasse 2 - Schéma de production Equipements de production et stabilisation Des difficultés, un challenge Optimisation des conditions de production de biomasse Stabilisation et conservation 3 13 - Séchage : impact sur les organismes vivants Mise au point d’un procédé pilote de séchage Optimisation du rendement de lyophilisation Sensibilité de la souche au passage dans le tractus digestif RNS O. ROS Physiques Principales perturbations induites par le séchage Diminution du volume, augmentation du rapport surface volume, déformation membranaire, Changement d’état (liquide verre solide), cristallisation, transitions de phase des lipides Chimiques Cinétique de séchage, osmoprotectants, adjuvants vitrifiants, antioxydants Antioxydants, atmosphère Stress oxydant, augmentation intracellulaire en soluté, stimulation du métabolisme 14 Viabilité 50% 50% 40% 40% 30% 30% 20% 20% 10% 10% 0% 0% PBS Tréhalose Tréhalose + Proline Inuline Séchage en couche mince de la souche Mise au point d’un procédé de séchage pilote permettant de sélectionner les protectants. 15 PBS Tréhalose Tréhalose + Proline Séchage par lyophilisation Avantages : Rapide Simple Faible volume à produire Homogénéité avec les résultats de lyophilisation 60% 25% 40% Viabilité(%) Viabilité 50% 0% 0% Trehalose(5%) Glycerol(1%) Concentration en tréhalose 30% 30% 20% 10% pH:4.85% Trehalose pH:6.410% Trehalose Tréhalose 5%(1/1) + PBS Viabilité Viabilité Trehalose(5%) 50% viabilité pH du milieu de lyophilisation 16 Glycerol(1%) Cinétique de congélation 4% viabilité 0% 1°C/min 20% LYBHI-4°C LYBHI-25°C LYBHI-37°C PBS-25°C Condition de réhydratation Condition de réhydratation 2°C/min 20% 10% 0% 2,50% 5% 10% 20% Concentration en tréhalose Composition des différents tampons (recommandé par la pharmacopée européenne) NaCl HCl KH2PO4 30 min – 37°C Témoin Sels NaOH Pepsine Pancréatine biliaires Pectinase Mortalité totale dans l’estomac Estomac pH 1,8 Jéjunum proximal pH 6,4 Jéjunum distal pH 6,8 Sensible aux sels biliaires Iléum distal pH 7,4 Côlon pH 6 0 5 Viabilité (Log10 UFC/ml) La bactérie présente une forte sensibilité à l’acidité stomacale ainsi qu’aux sels biliaires. La conception d’une gélule gastro-résistante est indispensable. 17 Encapsulation Stabilisation Ingestion Production de la bactérie F.prausnitzii Conditions Colonisation dans le colon : stressante Action sur les maladies intestinales chroniques 18 Estomac : pH 1.8 + pepsine + O2 (Au moins 30min) Petit intestin : pH 6.4 – 6.8 Sels biliaires (5 – 10 h) Gros intestin : pH 7.2 – 7.4 18 Challenges Initialement Production 108 CFU/mL Aujourd’hui Production de biomasse x4000 2L 10mL Séchage Survie après séchage Survie x600 Préservation de la fonctionalité Survie à l’état sec Aucune valeurs Tested in-vitro Survie après séchage 50% 0.1% Survie après stockage 2.109 CFU/mL 4 mois à 25°C Modèle d'inflammation intestinal murin Survie après stockage 10% Fonctionalité in-vivo des bactéries sèches ◦ L’équipe de l’INRA de Jouy-en-Josas : Sylvie Hudault, Sylvie Miquel, Rebeca Martin Rosique, Véronique Robert, Chantal Bridonneau, Florian Chain, Luis Bermudez, JeanMarc Chatel, Muriel Thomas, Philippe Langella ◦ Biovitis : Tony Pouply, Laurent Rios ◦ Merck Medication Familiale : Severine Le Roy, Stéphanie Courau, Pascal Molimard ◦ Welience : Alexandre Charriau, Élise Perrette, MariePierre Montaron ◦ UMR-PAM : Laurent Beney, Patrick Gervais Merci de votre attention
