Signalisation par activité enzymatique - GTPases la transduction des signaux est un événement transitoire (de courte durée) la signalisation par Ras et protéines G requière l'hydrolyse de GTP o la réaction d’hydrolyse dépend de Mg2+ comme cofacteur; Mg2+ compense en partie les charges négatives portées par les phosphates o la réaction est lente; si Ras et protéines G étaient des enzymes efficaces i.e. possédant un taux d’hydrolyse élevée, les signaux transmis par ces enzymes seraient trop courts pour être utilisables par conséquent ces enzymes ont évolué de manière à avoir des vitesses catalytiques peu élevées la transduction et la durée de vie du signal dépendent de l'exploitation d'un état conformationnel métastable provoqué par la liaison du GTP la signalisation est terminée lorsque GTP est hydrolysé en GDP Signalisation membranaire par les protéines G les sous-unités Galpha sont en général des catalyseurs peu efficaces l'hydrolyse du GTP par le sous-unité Galpha est lente (2 à 4 min-1) la dissociation de GDP de la sous-unité α est encore plus lente (0.03 min-1) o elle n'est pas détectable dans son complexe quaternaire en présence des sous-unités βγ leur taux d'hydrolyse est accéléré par des RGS afin de désactiver leur signalisation. o le taux d'hydrolyse du GTP augmente jusqu'à 100 min-1 dans ce cas Signalisation cytoplasmique par Ras l'hydrolyse du GTP est très lente (0.02 min-1) les signaux sont désactivés par des GAPs afin d’accélérer la réaction o le taux d'hydrolyse du GTP par Ras en présence de GAP est de l'ordre de 10 5 plus rapide et ce qui est presque identique à celui de Galpha en présence de RGS BCM 2505 Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme Page 1 / 10 Transducine la protéine Gt-alpha ou transducine est parmi les protéines Galpha les plus étudiées au niveau structurel o Rappel ici : comment la transducine fonctionne comme médiateur de la vision dans la rétine. Bref, la transducine couple les signaux de la lumière captés par le récepteur des photons, la rhodopsine, à l'effecteur la cGMP dépendante phosphodiestérase (PDE) L’essentiel dans ce schéma est la liaison du GTP et son hydrolyse impliquant des changements conformationnels la protéine Gt-alpha, montrée en figure 1a, possède deux domaines structuraux : o Domaine hélicoïdal = GDI (chez Ras) – identifié en figure 1a o Domaine GTPase = Ras – figure 1a et 1b à noter : absence du domaine hélicoïdal (GDI) en Ras Domaine GTPase GDI GDP Gt-alpha Figure 1a. Ras Figure 1b. Gt-alpha possède deux états conformationnels; o Un état inactif liant GDP (montré dans la figure 1a et 2a en rouge; GDP en jaune) o Un état actif auquel GTP est lié (montré superposé dans la figure 2a; les éléments de structure qui diffèrent par rapport à la liaison du GDP sont colorés dans la figure 2a: en bleu pour des différences importantes et désignées « switch » afin de les distinguées des différences moins importantes en vert) BCM 2505 Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme Page 2 / 10 o les trois régions correspondantes aux différences conformationels importantes, « switch » I, II, et III, sont identifiées en figure 2a; l’agrandissement des régions « switch » I et II en figure 2b. GTP ( P) II III I II I Régions « Switch » Figure 2a. Figure 2b. L’hydrolyse de GTP inactive l'effet stimulateur de Gt-alpha permettant au cycle de signalisation de recommencer Les changements conformationnels (« switch » I, II, III) sont donc impliqués dans 1) l'échange de GDP avec GTP, stimulé par le GPCR activé, et 2) dans l'hydrolyse du GTP o la liaison de GTP au sous-unité α de l'hétérotrimère (rouge en figure 3a) occasionne non seulement sa dissociation du Gt-alpha du récepteur, mais produit également le déplacement des sous-unités βγ de l'hétérotrimère (voir comment dans la comparaison par superposition de Gt- alpha-GTPS avec Gt- alpha-GDP dans l'hétérotrimère en figure 3b) GTP ( P) Galpha- GDP- Gbeta Ggamma Région d’interaction Figure 3a. BCM 2505 N - terminus Perte d’interaction Figure 3b. Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme Page 3 / 10 Des évidences cristallographiques des Galpha en présence de GTPγS, GDPNHP, GDP, et GDP.AlF4- ont permis l'analyse du mécanisme d'hydrolyse o l'hydrolyse non-enzymatique du GTP en GDP qui sera catalysé par l’enzyme consiste en une attaque nucléophile en ligne sur le phosphate Réaction nonenzymatique O O P O O GDP O H O H O P O GDP H O H O o le GTPγS et GDPNHP sont des inhibiteurs compétitifs de la liaison par GTP tandis que GDP.AlF4-, provoque une forme activée de protéine Galpha et agit comme analogue de l'état de transition Analogues O GDP O S P O GTPS F F H Al O O H H O H GDP F F GDP-AlF4-- H2O à noter que GTPγS > 102 moins réactif que GTP; S - faible donneur d’électrons Mécanisme d'hydrolyse enzymatique de GTP L'hydrolyse du GTP en GDP par une attaque nucléophile en ligne directe par une molécule d'eau sur le phosphate γ prévoit une catalyse enzymatique de type base générale par un résidu capable d’accepter un proton d’une molécule d’eau et ainsi générer un nucléophile hydroxyle Les études cristallographiques ont en effet montré la présence d'une molécule d'eau dans une position cohérente avec un tel mécanisme catalytique. o dans la structure du complexe Gt-alpha.GTPγS, cette molécule d'eau est positionnée afin d'interagir avec le S du thiophosphate et pourra faire une attaque directe en ligne sur le phosphate γ Molécule d’eau o dans la structure du complexe Gt-alpha.GDP.AlF4-, une molécule d'eau fait partie de l'intermédiaire pentavalent o il est donc probable que cette molécule d'eau joue le rôle d'un nucléophile une fois activée BCM 2505 Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme Page 4 / 10 HN Arg 174 H HN Arg 174 H N N H H H H O O P N H O O H GDP H F F H Gln 200 N H N H O GDP N Gln 200 H S H Al O H O F F H O O GtaGTPS Thr 177 GtaGDP-AlF4-- H2O Thr 177 GTP est très stable en milieu aqueux parce qu’il est difficile de faire une attaque nucléophile par OH-, qui est chargé négativement, sur le phosphate γ aussi chargé négativement. De ce fait, une réduction dans les charges négatives portées par les phosphates devrait se réaliser au sein du site actif afin de stabiliser l’état de transition et d’accélérer la réaction les études fonctionnelles dans la famille de protéines G ont démontré qu'Arg 174 (178 en Gi-alpha-1) joue un rôle essentiel dans l'hydrolyse du GTP o des mutations de l'Arg 174 empêchent l'hydrolyse du GTP et bloque Galpha dans son état toujours actif Stabilisation des charges o dans certaines tumeurs endocrines humaines, des mutants de R174 stimulent toujours l'adényl cyclase o l'inhibition, par la toxine du choléra, de l'hydrolyse du GTP en GDP se fait par l'entremise de la ribosylation de R174 le résidu R174 se retrouve dans la cavité du site actif proche de la région de jonction (linkers) des deux domaines structuraux dans la structure de Gt-alpha.GTPγS, l'Arg 174 joue un rôle critique à travers ses ponts hydrogènes avec le sulfure du phosphate γ et possiblement avec l'oxygène ester entre les phosphates β et γ une pareille interaction de l'Arg 174 avec un fluor de AlF4- et l'oxygène ester entre les phosphates β et γ est observée dans le complexe Gt-alpha.GDP.AlF4 ce résidu est donc bien placé pour stabiliser la charge négative qui se développe dans l'état transitionnel sur le phosphate γ pentacoordiné BCM 2505 Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme Page 5 / 10 o à noter que Mg2+ stabilise également les charges négatives le rôle de Gln 200 (203 en Gi-alpha-1) sert aussi à stabiliser l'intermédiaire pentacoordiné o la tautomérie de la Gln 200 pourrait stabiliser la coordination pentacoordinée par la formation de deux ponts hydrogènes, et par ce fait augmentera la nucleophilicité de l'eau axiale attaquante et diminuera la charge négative sur le phosphate γ dans l'état transitionnel Base générale HN Arg 174 H H N H H H O N H O N H P Gln 200 O O O GDP HN Arg 174 H H H O O N H O H N N H O H GDP P O Gln 200 O H O H O Intermédiaire Forme GTP Thr 177 pentacoordiné Thr 177 même si Gln 200 participe dans l'état transitionnel, son rôle n'est pas celui d'une base générale qui pourra activer la molécule d'eau, car son pKa est très élevé O o l'échange par mutagenèse dirigée de ce résidu en Glu augmente très peu kcat mais considérablement Km le résidu voisin Glu 203 (207 en Gi-alpha-1) pourra jouer ce rôle à cause de sa proximité de la molécule d'eau, 3.5Å o la rotation autour du lien Cβ-Cγ de la chaîne latérale placera le groupement carboxylique chargé négativement en position d’effectuer l'abstraction du proton activant ainsi la molécule d'eau o cependant ce rôle est peu probable parce que Glu 203 forme un pont salin avec une lysine et la rupture de cette interaction dans l'activation de l'eau par Glu 203 est BCM 2505 Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme Page 6 / 10 énergiquement très défavorable o de plus, le remplacement par mutagenèse dirigée de Glu 203 par Ala ou Gln a seulement diminué kcat très légèrement l'absence d'un résidu qui pouvant jouer le rôle d'une base générale et ainsi déprotoner un nucléophile est cohérent avec le fonctionnement des protéines G ceci assure une très lente hydrolyse du GTP pour maximiser leur signalisation o la modélisation de la réaction de Ras par des calculs de dynamique moléculaire et des études physico-chimiques suggèrent en effet qu'il n'y a pas de base générale pour activer l'eau, mais que c'est le phosphate γ qui lui-même joue ce rôle comme montré ci bas (à noter que Gln 61 chez Ras = Gln 200 chez Galpha) H Gln 61 N H Mécanisme réactionnel O H P O GDP O O O H O H Gln 61 N O O O H O P O H OH GDP H N H O O GDP BCM 2505 O O P OH Gln 61 O H Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme Page 7 / 10 Signalisation conformationelle la superposition entre les structures Galpha.GTPγS et Galpha.GDP indique que les changements conformationnels importants sont aux alentours du site de liaison du GTP. Voir les figures 4a et 4b, la partie GDP est montrée en jaune et celle du Pγ en bleu, Mg2+ en rose – la présentation des figures 4 diffère par rotation de 90° sur l’axe vertical. o le GTP est tenu entre deux régions flexibles, "switch I et II", en figure 4a et 4b, où les changements sont concentrés Switch II III Switch I Figure 4a. Figure 4b. ces régions flexibles contiennent les résidus catalytiques essentiels tandis que la reconnaissance du nucléoside ainsi que les phosphates α et β implique des interactions plutôt peu flexibles la région switch I dans le cas de Galpha correspond à une région de jonction (linker) entre le domaine hélicoïdal GDI et la partie GTPase o elle contient le résidu Arg 178 de Galpha (Arg 174 chez Gt-alpha) la région switch II contient Gln 204 chez Galpha-i1 (Gln 61 chez Ras et Gln 200 chez Gt-alpha) les changements conformationnels sont tous directement ou indirectement provoqués par la liaison du phosphate γ et son hydrolyse ces résidus ainsi que leurs régions "switch" doivent être réorientés afin de stabiliser l'état de transition Mobilité BCM 2505 o cette réorientation ainsi que l'absence d'une base générale a été postulée d’être à l’origine du faible taux d'hydrolyse de Ras et Galpha Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme Page 8 / 10 dans la liaison de Galpha-i1 avec son RGS les deux régions « switch I et II »sont impliquées et leurs interactions réduisent leur mobilité (dans les figures 5a et 5b, switch I est montrée en rouge et switch II en vert) o au site actif, l’Asn 128 de RGS contribue par cette interaction à stabiliser la conformation de Gln 204 (Gln 200 chez Gt-alpha) Galpha-i1-GDP-RGS Ras-GDP-AlF3-GAP Figure 5a. Figure 5b. dans la liaison de GAP avec Ras, GAP oriente Gln 61 à travers une interaction entre un carbonyle du squelette peptidique de GAP o et il y a insertion par la « finger loop » de GAP d'un résidu Arg 789 (vert) dans le site actif de Ras (voir figure 6a, Ras montré en cyan) RAS AlF3 Arg 178 Arg 789 finger loop GAP Figure 6a. BCM 2505 GAP Figure 6b. Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme Page 9 / 10 o et ceci dans une position quasiment identique par rapport à Arg 178 dans le site actif d'Galpha (voir figure 6b, Galpha-GDP-AlF4 montré en rouge) chez Ras, qui possède un pouvoir catalytique nettement moindre que celui de Galpha, le résidu Arg est absent et celui fourni par GAP, Arg 789, augmente considérablement son activité GTPase o cependant la mutation d'Arg 789 en Lys dans GAP ne change pas l'activité catalytique de façon importante; il était attendu que l’interaction faite par Lys à l’état de transition sera moins efficace (le résidu Lys étant plus court qu’Arg par ~1.5Å) et devrait donner une réduction importante en activité catalytique o ce qui indique que la stabilisation de l'état de transition par une charge positive voisine explique seulement une partie de l'activité catalytique le supplément en pouvoir catalytique nécessaire doit donc avoir une origine autre l’explication réside dans la réduction de flexibilité aux régions "switch I et II" due à la liaison par GAP et RGS o la stimulation de Ras et Galpha provient non seulement de la capacité par GAP et RGS à fournir des résidus aux sites actifs respectifs, mais réside aussi dans la capacité par GAP et RGS à stabiliser des conformations complémentaires à l'état de transition o les études démontrent en effet une plus forte liaison par Ras et G alpha en état activé (complexé avec GTPγS par exemple) à des facteurs stimulateurs BCM 2505 Signalisation cellulaire par GTPases – Mécanisme Page 10 / 10