Calibration d`une fibre à supercontinuum pour réaliser de l`imagerie

BIOPOLE : Imagerie Cellulaire et Tissulaire
Plate Forme PTIBC IBISA-NANCY
UL -CNRS FR 3209 et IMOPA 7365
Calibration d'une fibre à supercontinuum pour réaliser de l'imagerie CARS
Stage réalisé au PTIBC du 28/11/2016 au 30/12/2016
Mickaël RION – Dominique DUMAS
OBJECTIF
Prototypage d'un système d'imagerie CARS par seul signal d'une fibre à supercontinuum
CARS
ACTIVITES
Web : http://ptibc-imaging.fr
8 équipements performants
25 équipes utilisatrices
12 modules de formation
1200 heures systèmes/an
150 communications
Formation Nationale CNRS
Partenariat Industriel
Participation aux NRs
Cancéropôle Grand-Est
GDR2588 CNRS
RT mfm CNRS
Instrumentation et aspects techniques du laboratoire
Signal d'excitation variable :
Les caractéristiques du laser donnent accès à différents nombres d'onde pour cibler différentes molécules
(tissus adipeux, protéines,..)
Principe de mesures :
1- Excitation d’un échantillon par pulsation laser de l'ordre de la femtoseconde à la picoseconde.
2- Pas de temps de vie de fluorescence à prendre en compte, l'échantillon reste viable dans le temps pour l'imagerie.
3- La combinaison d'une étude spectrale et de l'imagerie microscopique par l'onde anti stockes (AS)
4- Deux faisceaux laser de pulsations ωp pompe (orange) et ωs stokes (rouge) sont combinés et focalisés par un objectif
de microscope de forte ouverture numérique pour assurer le processus de mélange d’onde CARS.
Applications du CARS :
[email protected] - 0383685571
[email protected] - 0383685573
- Imagerie cellulaire non invasive en utilisant les liaisons moléculaires naturellement présente dans la cellule,
- Combinaison entre une imagerie CARS qui est complémentaire et un autre type d'imagerie (ex : fluorescence),
- Réalisation d'images avec une bonne résolution spatiale (~μm).
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MATERIEL ET METHODE
Montage d'injection laser pour microscope confocal à balayage laser monophotonique et multiphotonique
Interface logiciel LEICA
(pour Fluorescence et CARS)
La différence de Wp (en cm-1) et Ws (en cm-1) permet
d'obtenir la fréquence de résonance
Pour obtenir le nombre d'onde, on applique la formule :
2 x ωp - ωs = Was, l'onde anti-Stockes (en cm-1)
Nomenclature, schéma du montage optique
Coupe de vaisseau en multimodale
(Fluorescence, Multiphoton, Seconde Harmonique)
Compresseur optique
Fibre à supercontinuum
Le laser est séparé en 2 faisceaux par la lentille 3 (λ 50/50) :
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1 : pour réaliser de l'imagerie CARS en configuration 1 : signal Stockes ωs par le
Laser de
pompe
50/50
Modulateur électro-optique
Microscope
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Visée : La solution 2 est privilégiée pour l'innovation
du laboratoire afin d'obtenir un nombre d'onde plus
faible avec la même instrumentation et observer de
nouvelles liaisons moléculaires.
Laser femtoseconde
Miroirs
galvano-métriques
Modulateur électrooptique
Filtre optique
séparateur
C. elegans. Lipides à 2840cm-1; Source : http://microscopy.uni-graz.at
Résultats : CARS en configuration 1, multiphotonique
Résultats : CARS en configuration 2, fibre à supercontinuum
Analyse du même échantillon de convallaria
Analyse d’un échantillon de convallaria
Ex : 750-805 nm ; Em : 660-680 nm
Ex : 760-780 nm ; Em : 650-700 nm
735 nm
760 nm
laser MIRA et signal pompe ωp par la fibre,
2 :pour réaliser un prototype d'imagerie CARS en configuration 2 : signal Stockes
et pompe par la fibre par variation du compresseur.
Analyse de microsphères 100% fluo. + non marquées
Ex : 740-780 nm ; Em : R 500-580 nm (fluo) ; Em : V 600-700 nm ; V+R superposition des canaux
802 nm
780 nm
750 nm
766 nm
805 nm
Allure de dispersion du
signal en sortie de fibre
Spectroscopie fibre FSPC 49
Spectroscopie fibre FSPC 200
Analyse spectrale et énergétique des signaux laser en fonction du compresseur
Spectroscopie laser MIRA
Interface logiciel LEICA
Spectroscopie fibre FSPC 45
Spectroscopie fibre FSPC 245
Analyse spectrale et énergétique des signaux laser en fonction de l'offset
Conclusion
Dans cette étude, le PTIBC cherche à diversifier les possibilités d'exploitation d'échantillons par procédé CARS en dispersant un laser pour réaliser un supercontinuum
permettant d'atteindre des fréquences vibrationnelles liées à des éléments inexploitables jusqu'à présent sur le site tel que l'ARN, les liaisons C-C ou encore O-P-O.
Bibliographie : D.DUMAS S.HUPONT, Modules de formation 1, 2 et 3 du PTIBC, 2014 - Nadia Djaker, Didier Marguet, Hervé Rigneault ,Microscopie Raman stimulée (CARS) Principes et applications - Thomas, George J. Jr., "Raman spectroscopy of protein and nucleic
acid assemblies," Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28:1–27 (1999)