TD Cytosquelette
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La plupart des illustrations du TD proviennent UE2 de Molecular Biology of the Cell TD Cytosquelette (cours S. Delbecq) Alberts, Johnson, Lewis et al. Protéines d’adhérence / Jonctions intercellulaires (5ème édition) (T. Maudelonde) N. Boulle Année 2012-2013 Microtubules Définition: Le cytosquelette 25 µm Microfilaments d’actine MF ∅ ≅ 7 nm Microtubules MT ∅ ≅ 25 nm Filaments intermédiaires FI ∅ ≅ 10 nm ∅ ≅ 25 nm Tubuline et Microtubules Les 2 types de Microtubules • MT labiles: MT cytosoliques, Sensibles au froid (0-4°C) et aux agents chimiques (Colchicine, Vinblastine, Taxanes) 13 protofilaments extrêmement dynamiques Instabilité intrinsèque Adaptabilité ! Pas de liaisons covalentes • MT stables: β GTP Stabilisés par des protéines spécifiques Insensibles aux agents physiques ou chimiques : ils ne dépolymérisent jamais α GTP Forment des structures pluritubulaires : Centriole, corpuscule basal Axonème Corpuscule basal de protozaire Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Tubuline et Microtubules QCM 1 QCM 1 Tubuline et Microtubules Les protéines associées aux microtubules Microtubule Associated Protéine = MAP: Les MAP à retenir: - Protéines stabilisatrices: MAP2 et Tau (cellules nerveuses) - Protéines déstabilisatrices: ex: Catastrophine, katanine Séquestre la tubuline - + - Tubuline α - Tubuline β - Vers le centre de la cellule - Vers la membrane plasmique → Vitesse de polymérisation extrémité + > extrémité - + Katanine - Protéines motrices: dynéines (vers -) et kinésines (vers +) - MAP associées aux structures pluritubulaires Catastrophine (+TIP) Tubuline et Microtubules QCM 1 Formation des microtubules cytosoliques : in vitro Croissance in vitro: Tubuline et Microtubules QCM 1 In vitro Equilibre dimères de tubulines / microtubule Notion de concentration critique (Cc) ! Idem microfilaments d’actine équilibre % dimères de tubuline dans les microtubules C dimères de tubuline diminue A l’extrémité, constantes: kon (polymérisation) (M-1sec-1) koff (dépolymérisation) (sec-1) A l’équilibre, à l’extrémité, Cc où :V Polymérisation = V Dépolymérisation kon x Cc = koff → Cc = koff / kon Polymérisation vs dépolymérisation? Le nombre de dimères de tubuline qui s’ajoute à l’extrémité par seconde dépend de la concentration en tubuline (C): = kon x C - Dimères de tubuline > concentration critique (Cc)→ polymérisation. Formation et allongement des microtubules - Dimères de tubuline < concentration critique (Cc) → Pas de microtubules Tubuline et Microtubules QCM 1 QCM 1 Tubuline et Microtubules Liaison forte α GTP Formation des microtubules cytosoliques : Dimères pré-assemblés: tubuline en solution β GTP Activité GAP (GTPase Activating Protein) In vivo, équilibre modifié par: - Coiffe de GTP Extrémité + - COMT Extrémité – Extémité - α GTP β GDP α GTP β GTP - MAP Dimère 1 Liaison faible Dimère 2 Sous unité tubuline β: Activité GTPase Sous unité α: Activité GAP Extémité + Tubuline et Microtubules QCM 1 QCM 2 Tubuline et Microtubules Protofilament droit Forte cohésion entre dimères α GTP β GTP α GTP β GTP α GTP β GTP α GTP β GTP α GTP β GTP Actine (jonctions adhérentes) α GTP β P GD α GTP β GDP α GTP β GDP Filaments intermédiaires α GT P (desmosomes) β GD P Protofilament courbe Faible cohésion entre dimères α GT P β GD P Jonctions cellulaires → QCM 2 Actine / Filaments intermédiaires QCM 3 Tubuline et Microtubules Centriole: appartient au centrosome Fonctions des microtubules cytosoliques: Centrioles ~ Corpuscule basal (cils, flagelles) 9 triplets de microtubules (A, B, C) dont seul A est complet Ponts de nexine entre les triplets Structure protéique "en rayons de roue" relie les microtubules A nexine ! Triplets - Transports intracellulaires Transport de molécules (actine G,…) - Transport d'organites (mitochondries,…) - Transport d'acides nucléiques liés à protéines: ARNm et chromosomes lors des divisions - Transport vésiculaire: endocytose, exocytose, R.E., Golgi… QCM 3 Protéines motrices: kinésines / myosines Kinésines (microtubules) Myosines (microfilaments) Domaine moteur Domaine moteur (ATPase) (ATPase) Tubuline et Microtubules QCM 3 Transports intracellulaires: les protéines motrices Protéines adaptatrices: 1 moteur peut transporter plusieurs « cargo » différents Tige repliée (kinésine en conformation inactive)en absence de « cargo » → évite les déplacements à vide CARGO - Hydrolyse de l’ATP → changement conformationnel → mouvement NB: Dynéine: famille différente QCM 3 Tubuline et Microtubules Tubuline et Microtubules QCM 3 Moteurs moléculaires des microtubules • Kinésines et dynéines : Exocytose, Membrane plasmique - 2 chaînes lourdes (têtes ATPasiques) + plusieurs chaînes légères (tige) - Déplacement des vésicules, molécules et organites le long des MT vésicule KINESINES ⊝ Endocytose, Cours de Biologie cellulaire, P. Cau, Ellipses RE Golgi, Mouvements des cils, flagelles Microtubule DYNEINES vésicule Golgi RE (~ myosines) ⊕ QCM 3 Tubuline et Microtubules Actine et microfilaments QCM 4 Microtubules en rouge Golgi en vert (centre de la cellule) Destruction des microtubules ∅ ≅ 7 nm QCM 4 Actine et microfilaments Actine et microfilaments QCM 4 A connaître! Nucléation (ext -) Séquestre Echange ADP / ATP (- élongation) (+ élongation) Rq: Liaison non covalente entre monomères! Séquestre Echange ADP / ATP (- élongation) (+ élongation) Dégradation (lie actine – ADP) (Ca++) Coupe Fil. Gel → Solution stabilisent Tropomoduline stabilisent Cap Z Actine et microfilaments QCM 4 Actine et microfilaments QCM 4 Dynamique du microfilament Dans les cellules non musculaires ATP ATP ADP ADP ADP ADP ATP ADP ATP Extrémité ADP ADP ADP ADP ADP ATP Ceinture d’adhérence (cellules épithéliales) Microvillosités ATP ATP Extrémité + ATP ADP Coiffe d’ATP • Extrémité + : vitesse de polymérisation > vitesse de dépolymérisation croissance rapide – extrémité la plus dynamique coiffe d'ATP • Extrémité - : vitesse de polymérisation < vitesse de dépolymérisation croissance lente (selon conditions) QCM 4 Actine et microfilaments Le cytosquelette QCM 5 Exocytose: Désagrégation du cortex d’actine: intervention de la gelsoline (« liquéfaction » du réseau type gel) Coiffe de GTP Microtubules > microfilaments Instabilité dynamique Cf Fuseau mitotique Tubuline liée au GDP croissance « catastrophe » Tapis roulant A l’équilibre: Polymères de longueur constante Microtubules / microfilaments Le cytosquelette / Tapis roulant QCM 5 Actine et microfilaments QCM 5 sarcomère Hydrolyse GTP (tubuline) / ATP (actine) → Cinétiques différentes aux 2 extrémités → Polymérisation ext + / Dépolymérisation ext Disque Z titine Cap Z - Ligne M tropomoduline Disque Z Myosine (filament épais) + Extrémité + nébuline Extrémité - Actine (filament fin) À l’équilibre, la concentration en sous-unités libres est telle que: vitesse de croissance (ext +) = vitesse de dépolymérisation (ext -) Polymère de longueur constante = Tapis roulant (« treadmilling » ) Actine et microfilaments QCM 5 Contraction musculaire: - Ca++ - Déplacement des filaments fin d’actine sur les filaments épais de myosine Actine et microfilaments QCM 5 Filament d’actine Les AAP stabilisatrices - • CapZ (= protéine de coiffe – ext +) et Tropomoduline (ext -): associées aux extrémités des MF dans les cellules musculaires striées Rigidité cadavérique + Tête de myosine Filament épais • Tropomyosine / Troponine actine Complexe de troponine tropomyosine 1) attachée: tête de myosine sans nucléotide fixée au MF (état de rigidité) 2) libérée: fixation d’ATP sur la myosine: décrochage du MF 3) armée: hydrolyse de l’ATP entraîne un changement conformationnel: déplacement de 5 nm de la tête de myosine, fixation faible au MF Tropomyosine: interactions avec le sillon de la double hélice d’actine Troponine: interactions avec actine et tropomyosine - + 4) « Coup de force »: fixation forte au MF induit la dissociation de l’ADP liée à la myosine: changement conformationnel et retour à l’état (1) - Hydrolyse de l’ATP myosine → changement conformationnel → mouvement Actine et microfilaments QCM 6 Actine et microfilaments QCM 6 Protéines associées à l’actine: Les protéines d'assemblage MF + α-actinine Contacts Focaux (intégrines) MF + fimbrine Dimère de filamine Fimbrine, villine α-actinine filamine QCM 7 Filaments intermédiaires Faisceau contractile Disposition lâche permet d’intercaler la myosine II Faisceau parallèle Disposition serrée ne permet pas d’intercaler la myosine II Réseau type gel Réseau tridimensionnel mécaniquement résistant Filaments intermédiaires QCM 7 6 groupes selon type de sous-unité Homodimères ou hétérodimères: - ex: kératine basique + kératine acide - desmine, vimentine Type I II III IV ∅ ≅ 10 nm V VI Protéine Cytokératines acides Cytokératines neutres ou basiques Vimentine Desmine Protéines fibrillaires acides gliales (GFAP) Protéines de neurofilaments Lamines nucléaires Nestine Localisation / type cellulaire Cellules épithéliales Cellules épithéliales Cellules mésenchymateuses Cellules musculaires Cellules gliales Astrocyte et certaines cellules de Schwann Neurones Noyau Cellules souches neuronales et neurones immatures ! Utilisé en anatomopathologie pour identifier l’origine d’une tumeur QCM 7 Filaments intermédiaires QCM 7 Filaments intermédiaires Polymérisation - Dépolymérisation Renouvellement des sous-unités: - latéral - homogène le long du filament Filament intermédiaire: - 8 protofilaments - structure non polarisée Mise en évidence du renouvellement des sous-unités d’un FI par FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) QCM 7 Filaments intermédiaires Différents types de FI Les lamines (type V): Localisation nucléaire: - réseau sous-membranaire - nucléoplasme Lamine A et C: pas d’ancrage Lamine B: ancrage farnésyl - renouvellement permanent des sous-unités - assemblage spontané (pas d’hydrolyse de nucléotide) QCM 8 Le cytosquelette Exocytose: Désagrégation du cortex d’actine: intervention de la gelsoline (« liquéfaction » du réseau type gel) QCM 8 QCM 8 Le cytosquelette Le cytosquelette Centrosome: COMT = Centre Organisateur des Microtubules Centrosome = COMT principal des cellules animales Remarque: Endocytose: Polymérisation d’actine (Arp 2/3): propulsion sans myosine (« comète » d’actine) Les microtubules croissent à partir des sites de nucléation (anneaux de tubuline γ) (pas des centrioles!) Le cytosquelette QCM 8 QCM 8 Structure des cils / Flagelles Le cytosquelette Cils et flagelles - COMT = corpuscule basal (~ centriole) – 9 triplets de microtubules qui se prolongent dans l’axonème Nexine - Axonème = 9 paires de microtubules entourés de membrane plasmique ± 2 microtubules centraux (9+0; 9+2) + MAP (nexine, dynéine...) ! paires Bras de dynéine externe rayon Gaine interne ATP → ADP nexine Microtubule central (simple) Membrane plasmique Bras de dynéine interne Paire de microtubule périphérique Cours de Biologie cellulaire, P. Cau, Ellipses Dynéine Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Hydrolyse de l’ATP (dynéine) = mouvement vers - QCM 9 Exercice sur le cytosquelette QCM 9 Exercice sur le cytosquelette - Cytosquelette d’actine - Viscosité? Lamellipode = réseau de type gel Liée à la polymérisation de l’actine Cf: = Faisceaux d’actine - Réseau d’actine de type « gel » - Gelsoline: Gel (actine polymérisée) → Solution (actine dépolymérisée) Polymérisation de l’actine Composé X viscosité Composé Y viscosité viscosité Quantité d’actine polymérisée Exercice sur le cytosquelette QCM 10 lamellipode Quantité d’actine polymérisée QCM 10 Exercice sur le cytosquelette Marquage du cytosquelette d’actine par la phalloïdine-AF680 (gris) Composé X viscosité Quantité d’actine polymérisée Composé Y viscosité Quantité d’actine polymérisée Substances affectant la polymérisation de l'actine AAP (Actin Associated protein) (profiline / thymosine) Pharmacologie: - Phalloïdine (+ phallotoxines) : se fixe sur les MF et les stabilise - Cytochalasines : se fixent à l'extrémité + des MF - Latrunculine: séquestre les monomères (dépolymérisation) Bruno SAUBAMEA EA3621 –Service de Biologie Cellulaire Service Commun d’Imagerie Cellulaire et Moléculaire Université Paris Descartes http://www.etsl.fr/Doc_pdf/Imagerie_confocale_09.pdf QCM 11 QCM 11 Exercice 2 sur le cytosquelette Exercice 2 sur le cytosquelette A- Pas de centrosome Analyse de l’assemblage des microtubules in vitro B - En présence de centrosome A- Pas de centrosome Concentration en tubuline –αβ (µM) - Nucléation puis croissance des microtubules aux 2 extrémités Concentration en tubuline –αβ (µM) - A l’équilibre: Vitesse de polymérisation extrémité + = Vitesse de dépolymérisation extrémité – Quantité de microtubules mesurée à l’équilibre → Longueur (donc Masse mesurée) des microtubules stable Détermination de la concentration critique en tubuline-αβ QCM 11 Phénomène du tapis roulant QCM 12 Exercice 2 sur le cytosquelette Exercice 2 sur le cytosquelette Figure 1A B - En présence de centrosome A- Pas de centrosome Concentration en tubuline -αβ Polymérisation du côté + uniquement Equilibre déplacé vers la forme polymérisée Anneau de tubuline γ + Concentration en tubuline -αβ QCM 13 Exercice 2 sur le cytosquelette Cytosquelette Fonctions et organisation: Figure 1B B - En présence de centrosome Concentration en tubuline -αβ Microtubules (tubuline): Microfilaments (actine): Filaments intermédiaires: SU globulaire Filament polarisé SU globulaire Filament polarisé SU fibreuse Filament non polarisé Liaison GTP/GDP Liaison ATP/ADP Pas de liaison aux nucléotides Protéines de coiffe Protéines motrices Protéines de coupure Séquestration des monomères Protéines stabilisatrices Modifications posttraductionnelles Protéines de coiffe Protéines motrices Protéines de coupure Séquestration des monomères Protéines stabilisatrices Modifications posttraductionnelles QCM 14 Protéines d’adhérence – Jonctions Cours T. Maudelonde Pas de protéines de coiffe, motrices ou de coupure Pas de séquestration des monomères Protéines stabilisatrices Modifications posttraductionnelles Protéines d’adhérence QCM 14 1- Les Sélectines: Les protéines d’adhérence: Glycoprotéines membranaires - Toujours hétérophilique Se lient aux sucres (domaine lectine) 1- Famille des Sélectines Cellules spécialisées: Ex: L - E - P- Sélectines E- endothéliales 2- Famille des Cadhérines P- Plaquettes Ex: E-Cadhérine, Desmoglein L- Leucocytes 3- Famille des Immunoglobulines Ex: N-CAM 4- Famille des Integrines Ex: α5β1 QCM 14 1- Les Sélectines: Rôle des sélectines dans les Mouvements du leucocyte Glycoprotéines membranaires - Toujours hétérophilique Sélectines sucres Ca++ Signaux mécaniques et chimiques Exocytose E-Selectine Membrane plasmique Cytosol Cytosol C N Leucocyte C 1- Adressine (sucres) 3- Integrine activée Cellule endothéliale 2- E-Sélectine 4- CAM Ig Rolling (liaison faible) Ouverture jonctions QCM 14 QCM 14 Jonctions cellulaires → Actine / Filaments intermédiaires Cadhérines Actine (jonctions adhérentes) 2- Les cadhérines Distribution des domaines dans différentes cadhérines Cadhérine T Glycosylphosphatidylinositol d’ancrage (GPI) RET Tyrosine kinase ICS Filaments intermédiaires Desmocolline-1a Interaction avec les filaments intermédiaires (desmosomes) Desmogléine-1 ICS Domaine CAD ICS Cadhérine E Fixation de la caténine Contacts focaux QCM 14 Intégrines 2- Les Cadhérines 2- Cadhérines et jonction adhérente (Actine) α- catenine → Interactions cellule / cellule Interactions homophiliques Actine 2- Cadhérines et desmosomes (filaments intermédiaires) 3- Les Immunoglobulines Protéines d’ancrage « boutons » Filaments intermédiaires (ex: cytokératine des cellules épithéliales) 4- Les Intégrines: 3- Les Immunoglobulines Dimère α/β –Toujours hétérophilique Dans les jonctions (homophiliques) Interactions cellule/cellule (hétérophiliques) Intégrine Interactions : - Cellule / Cellule - Cellule / Matrice extracellulaire +++ CAM (Immunoglobuline) - 18 chaine α - 8 chaines β 4- Les Intégrines: 4- Les Intégrines Interaction Cellule / Cellule hétérophiliques Interactions avec la Matrice Extracellulaire: - Contacts focaux → Intégrines / Actine - Hémi-desmosomes → Intégrines / Filaments intermédiaires Intégrine CAM (Immunoglobuline) Cytosquelette: microfilaments d'actine (S. Delbecq) Rôles des microfilaments: 4- Les Intégrines: Dimère α/β – Activation Dans les cellules non musculaires: déplacement d'une cellule « pince » 4- Les Intégrines: 4- Les Intégrines: Contacts focaux / Actine Hémidesmosomes / Filaments intermédiaires Fibronectine Extracellulaire Appartient à la matrice extracellulaire fibronectine Cellule épithéliale Cytokératine (FI) Séquence RGD Cytokératine (FI) Hemidesmosome Protéines d’Ancrage Lame basale Intégrines Actine Signaux cellulaire (cycle cellulaire…) Intracellulaire Jonctions intercellulaires Importance des interactions: Cellule / cellule Cellule / matrice extracellulaire Jonctions intercellulaires Jonctions → signaux intracellulaires Survie, division… La cellule cancéreuse « s’affranchit » de ses jonctions → perturbations +++ des molécules d’adhérence Exemple: perte de E-cadhérine Les jonctions dans la cellule épithéliale Les jonctions dans la cellule épithéliale Complexe de jonction: cellule épithéliale polarisée Jonction étanches (occludines / claudines) Jonction adhérente Jonction Étanche (serrée) Desmosome (en « bouton ») Jonction adhérente Jonction communicante (connexons) Desmosome Contacts focaux Hemi-desmosome actine Filament intermédiaire QCM 15 Espace étroit: Les jonctions étanches QCM 15 Espace étroit: Les jonctions étanches Définit la polarité cellulaire Définit la polarité cellulaire Protéines « spécifiques »: occludines / claudines Protéines « spécifiques »: occludines / claudines tout autour de la cellule Jonctions étanches (serrées) QCM 15 QCM 15 Les jonctions communicantes Les jonctions communicantes Protéines « spécifiques »: connexines Protéines « spécifiques »: connexines Communication entre deux cellules électro-chimique / métabolique Communication entre deux cellules électro-chimique / métabolique Membranes plasmiques des 2 cellules Membranes cellules adjacentes Membranes plasmique Canal Protéines de connexine Fermé Connexon composé de 6 connexines 2 Connexons formant 1 canal aqueux entre les 2 cellules Ouvert Connexon Jusqu’à 1 kD! Espace inter-cellulaire Connexine : 4 hélices transmembranaires Ouverture jonctions communicantes régulée: Ca++, H+, DDP… Mort cellulaire → Entrée de Ca++ → Fermeture des jonctions communicantes Les Jonctions Les molécules d’adhérence Ex Dépendance Ca++ Interactions Homophilic ou hétérophilique Cytosquelette Jonctions cellulaires E-Cadhérine Oui Homophiliques Cadhérines des desmosomes Desmoglein, desmocollin Oui Homophiliques Immunoglobulines N-CAM… Non Les 2 Sélectines Cellules spécialisées: Oui Hétérophiliques Filaments d’actine via les catenines (α et β) Jonction adhérente Filaments intermédiaires (cytokératine....) Desmosomes Filaments d’actine L-E- et P-sélectines Cadhérines « classiques » Desmosomes Cadhérines des desmosomes (desmoglein, desmocollines…) Filaments intermédiaires (cytokératine....) Jonctions étanches Occludines, Claudines, Filaments d’actine Jonctions communicantes Connexines Autres Selectine / CAM Ig / Integrine Adhésion cellule / matrice Intégrines Intégrines α5β1… Oui Hétérophiliques Oui Hétérophiliques Filaments intermédiaires Cytosquelette Jonction adhérente Jonctions serrées, Desmosomes … Filaments d’actine via talin, vinculin, α-actinin… Molécules d’adhérence Adhésion cellule / cellule Adhésion cellule / cellule Cadhérines « classiques » Jonctions cellulaires Filaments d’actine via les caténines (α et β) Polynucléaire / endothelium ; immunité… Adhésion cellule / matrice Contacts focaux Hemi-desmosomes Points d’adhésion focaux Hemi-desmosomes Intégrines α5β1… Intégrines Filaments d’actine via talin, vinculin, α-actinin… Filaments intermédiaires
