Transformation des plastes

Méthodes de transformation des
plastes
Bréard Dimitri; Delecolle Julien; Di Pascoli Thomas
M1 BVP - VRV
Plan
I) Introduction
1) Différents types de génomes
2) Théorie endosymbiotique
3) Les plastes
4) Problèmes rencontrés
III) Applications
1) La « tomate dorée ».
2) Autres exemples remarquables
IV) Discussion
II) Transformations
1) Différentes types de transformations
V) Références
La biolistique
1) Publications
La méthode des PEGs
2) Images
2) Mécanismes d’intégrations et
d’expressions du transgène
Recombinaison homologue
Expression des gènes polycistroniques
Gènes marqueurs de sélection
Expression transitoire
3) Comparaison avec la transformation
nucléaire
1) Distribution génomique
I) Introduction
2) La théorie endosymbiotique
3) Les plastes
Amyloplastes
Oléinoplates
Protéinoplastes
4) Problèmes rencontrés
1) Comment faire passer le transgène dans le
chloroplaste?
2) Aucuns virus ou bactéries de connus pour
infecter les chloroplastes et servir de vecteur de
transfert.
II) Transformations de plastes
Nicotiana tobacum
 Plante modèle pour la transformation des
plastes.
 Chloroplastes = plastes les mieux étudiés
et les plus ciblés pour la transformation.
1) Les différentes transformations
a) La biolistique :
Particules d’or ou de tungstène de
0,4 à 1μM de diamètre.
L’intégration se fait également dans les plastes
 2 régénérations sur milieu sélectif pour n’avoir que des plastes transformés
• Toutes les plantes ne peuvent pas être transformées
directement par des sections de leurs feuilles:
Coton
Soja
 Bombarder les tissus (cellules) méristématiques.
• Les cellules peuvent contenir entre 10 et 14 proplastes
(100aine de chloroplastes pour une cellule de feuille)
 Après divisions, le nombre de plastes transformés augmentera
plus rapidement.
 Les plastes non-transformés vont se « perdre » par dilution.
b) Méthode des PEGs :
Polyéthylène Glycol
(PEG)
Protoplastes
Déstabilisation des membranes plasmiques permettant
l’insertion de transgènes.
• PEG plus cher que la biolistique et mécanismes très peu connus.
• Et Agrobactérium dans tout ça ???
 Peu efficace pour la transformation de plastes.
a) Recombinaison homologue
GOI = gene of
interest
Insertion ciblée à
l’aide de séquences
homologues.
Site d’intégration
choisi:
moins d’impact sur
le développement
et la viabilité.
« Copy correction » :
Intégration dans
séquence répétée
inversée (IR),
duplication dans
l’autre IR.
2) Mécanismes d’intégration
et d’expression du transgène
Augmentation du
nombre de protéines
recombinantes.
D’après Meyers 2010.
b) Expression des gènes polycistroniques
Expression de plusieurs
gènes (comme opéron).
Un promoteur et
un terminateur
pour tous les ORFs.
Simplification de
la transformation
(plusieurs gènes
d’intérêts).
Chaque ORF
nécessite un site de
liaison aux
ribosomes (RBS)
pour pouvoir être
traduits.
Réduction du
nombre d’étapes de
transformation.
Insertion des
RBS entre les
ORFs.
D’après Meyers 2010.
c) Gènes marqueurs de sélection
• Le plus utilisé: gène aadA , résistance à la spectinomycine.
• Gènes de résistance kanamycine, Chloramphénicol également utilisés.
• Le gène de résistance peut être couplé au système Cre/Lox.
Séquences flanquantes au transgène spécifiquement reconnues par une
recombinase codée par le système Cre/Lox. Le gène de résistance sera supprimé
de la construction. Utile pour la transformation de plantes de grandes cultures.
D’après Bock 2011.
d) Expression transitoire
• « Prototypage » du transgène dans Escherichia coli.
• Similarité des mécanismes de transcription et traduction de E.coli et du
plaste.
 Etudes du transgène dans la bactérie.
• Un transgène qui s’exprime bien dans la bactérie devrait bien s’exprimer
dans les plastes.
3) Comparaison avec la transformation
nucléaire.
Noyau
Plaste
1) Agrobactérium = méthode
universelle.
2) Biolistique et
PEG/protoplastes pour les
plantes sans hôtes
naturels
1) Biolistique (la plus
utilisée).
2) PEG/protoplastes
Rendement de
transformation
Avec Agrobactérium, un
disque foliaire donne 10aine de
plantes.
Avec biolistique 1 à 2 disques
foliaires pour 1 transformant.
Vecteurs de
transformation
Le même vecteur binaire
utilisé pour plusieurs espèces.
Séquences homologues
ajustées d’une espèce à
l’autre.
Expression
transitoire
Agroinfiltration.
Biolistique.
Vecteur viral.
Insertion dans E. coli =
évaluation de la construction.
Méthodes de
transformation
D’après Meyers 2010.
Noyau
Plaste
Niveau d’expression
des protéines
recombinantes
N’excède pas 1-2% des
protéines solubles totales
(TSP).
5 à 25% de TSP.
Intégration de
plusieurs transgènes
2 à 3 transgènes avec vecteurs
binaires classiques
Expression de plusieurs
transgènes (polycistronique).
Effets de position
Intégration aléatoire  effets
de position et RNA silencing.
Intégration ciblée
 recombinaison homologue
 minimise les effets de
position.
Confinement du
transgène
Nécessites d’autres
transformations pour rendre
la plante stérile.
Hérédité maternelle des
plastes  pas de transmission
par le pollen.
Insertion de gènes de
résistances (herbicide,
insectes).
Insertion d’une voie
métabolique (multiples
transgènes); forte expression
de protéines recombinantes.
Applications
biotechnologiques
D’après Meyers 2010.
III) Applications
1) La « tomate dorée »
β-carotène
ββ-carotène 15,15’ monooxygénase
x2
Vitamine A
Solanum lycopersicum L.
D’après Apel 2009.
Expériences préalables
a) Expression constitutive de la phytoène désaturase de la
bactérie Erwinia uredovora dans la tomate.
Accumulation élevée de β-carotène
Baisse des caroténoïdes totaux
b) Surexpression spécifique de la lycopène-β-cyclase
endogène dans le fruit de tomate.
Accumulation élevée de β-carotène
Taux de caroténoïdes constants
Comment augmenter ce taux?
 La transplastomique
 Augmenter la conversion du lycopène en β-carotène tout en
augmentant les taux de caroténoïdes du fruit.
Le gène de la lycopène-β-cyclase de Narcissus pseudonarcissus
est introduit dans les plastes de tomate:
- Isolement du transgène (gène de la lycopène-β-cyclase)
- Clonage dans un plasmide
- Transformation par biolistique
- Sélection de lignées homoplastomiques
Test d’activité de l’enzyme par un
herbicide (CPTA)
 CPTA = inhibiteur spécifique de la lycopène cyclase
Résistance  Activité de la lycopène-β-cyclase très fortement
augmentée chez les plantes tranplastomiques
D’après Apel 2009.
Analyse du phénotype
 Transformation du lycopène (rouge) en β-carotène (orange)
D’après Apel 2009.
Teneur en caroténoïdes dans les
plastes par HPLC
 Augmentation du β-carotène, diminution du lycopène ET
augmentation de 52% des caroténoïdes totaux
D’après Apel 2009.
Composition en caroténoïdes dans les
feuilles par HPLC
 Orientation vers les caroténoïdes de type xanthophylle à la place
de la lutéine.
 Pas d’augmentation des caroténoïdes totaux
D’après Apel 2009.
Conclusion
 Augmentation de la teneur en β-carotène dans le
fruit
Augmentation des caroténoïdes totaux de 52%
 Approximativement 1mg de β-carotène /g de poids
sec (AJR de 10mg/jour)
La 2eme transformation de plastes dans une plante de
culture (après le tabac)
AJR = apport journalier recommandé
2) Autres exemples remarquables
• Expression de somatotropine (>7% des TSP)
dans les plastes de tabac avec formation
correcte des ponts disulfures.
• Expression de toxine Bt de 3 à 5% des TSP
(issue de Bacillus thuringiensis) dans les
plastes de tabac.
TSP = Total Soluble Protein
IV) Discussion
Perspectives:
- Insertion d’une RUBISCO plus efficace dans les
plantes de cultures.
- Production de molécules pharmaceutiques avec
de forts rendements.
- Production de bioéthanol par augmentation du
contenu lipidique synthétisé par les plastes.
V) Références
1) Publications
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Transgenic Plastids in Basis Research and Plant Biotechnology - Review Article; Journal of
Molecular Biology, Volume 312, Issue 3, 21 September 2001, Pages 425-438.
Ralph Bock
Taming plastids for a green future – Review Article; Trends in Biotechnology, Volume 22,
Issue 6, June 2004, Pages 311-318.
Ralph Bock; Muhammad Sarwar Khan
Chloroplastic photorespiratory bypass increases photosynthesis and biomass production in
Arabidopsis thaliana; Nature Biotechnology, Volume 25, Issue 5, May 2007, Pages 593-599.
Rashad Kebeish, Markus Niessen, Krishnaveni Thiruveedhi, Rafijul Bari, Heinz-Josef Hirsch,
Ruben Rosenkranz, Norma Stäbler, Barbara Schönfeld, Fritz Kreuzaler & Christoph
Peterhänsel
Enhancement of carotenoids biosynthesis in transplastomic tomatoes by induced lycopeneto-provitamin A conversion; Plant physiology, Volume 51, Septembre 2009, Pages 59-66.
Wiebke Apel, Ralph Bock
Plastid biotechnology: food, fuel and medicine for the 21st century; Plant Physiology
Preview, January 2011, Pages 1-27.
Pal Maliga, Ralph Bock
2) Images
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