La Génomique
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Vérifier la carte de restriction d’une insertion d’ADN Objectifs Générer une carte théorique (Bioinfo) Vérifier expérimentalement la carte Déterminer l’orientation Déterminer quel gène vous avez (Bioinfo) Cartographie des plasmides inconnus Vecteur pUC19 Clonage dans pUC19 SCM Digéré avec X Clonage dans pUC19 Insertion + Déterminer le site d’insertion Insertion Couper avec X + X Delimites la droite & la gauche Ex. Si Pst est le site d’insertion: Bam est à la gauche Si Xba est le site d’insertion, alors Bam est à la droite Déterminer l’orientation relative Orientation 1 AX A X Orientation 2 AX A X Analyse de restriction d’ADN complexe Buts Trouver la position d’une séquence dans des gros fragments d’ADN Déterminer le nombre de copies d’un gène Trouver des séquences similaires dans d’autres organismes Analyse d’ADN non-séquencé dans un organisme inconnu Digestion d’ADN complèxe Le nombre de fragments rend l’analyse impossible Analyse Southern Séparer les fragments d’ADN d’après leurs tailles Dénaturer Hybridation avec une sonde simple brin qui représente la région d’intérêt La sonde permet de visualiser seulement la région d’intérêt Southern Sonde Hybridation à la sonde Gel d’agarose Réplication & Amplification d’ADN La Réaction de la Polymérase en Chaîne Polymérases Amorce Extrémité 3’OH -OH 5’…GTACT TACGACGTAAACGCCCGTAATGAG Polymérase 3’…CATGAATGCTGCATTTGCGGGCATTACTC…5’ Matrice d’ADN ou ARN La Réaction de la Polymérase en Chaîne Réplication répétitive d’une région donnée d’ADN Permet l’amplification exponentielle d’une région donnée d’ADN Augmente la représentation relative d’une région d’intérêt Permet l’isolation d’une région donnée d’ADN 15 PCR-1ier Cycle 5’ 3’ 3’ 5’ Dénaturation (95oC) 5’ 3’ 3’ 5’ Appariement des amorces (Tm) <3’GGAACGGTACCGT5’ 5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ 3’GTATGGCACCCCACGA………..TGCGCAACGCTACCGT5’ 5’CCGTGGGGT3’> Extension (72oC) <3’GGAACGGTACCGT5’ 5’CATACCGTGGGGTGCA………..ACGCGTTGCGATGGCA3’ 5’ 3’ -------------------------------- 3’ ---------------------------------- 5’ 3’GTATGGCACCCCACGA………..TGCGCAACGCTACCGT5’ 5’CCGTGGGGT3’> 17 PCR-2e Cycle 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ --------------------------------------3’ 5’ ---------------------------------- Dénaturation ------------------------------- 5’ 3’ ---------------------------------- 5’ 3’ Appariement /Extension --------------- 5’ -------------------------------------- 3’ 3’ 5’ ---------------- ---------------------------------- PCR- Cycles Subséquents -------------------------------------- Seulement cette matrice est amplifiée de façon exponentielle : ----------------------------------------------- ----------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------- --------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 32 fois totale 2n fois Survol des Cycles du PCR Amorces: Courte séquence nucléotidiques simple brins complémentaires aux cibles 15-30 nucléotides Utilisée en excès comparativement à la cible afin de favoriser l’appariement des amorces plutôt que l’appariement des matrices Survol des Cycles du PCR Appariement: Température à laquelle les amorces s’apparient aux séquences complémentaires Dois être sous le Tm des amorces Dois être une température qui permet aux deux amorces de s’apparier Habituellement entre 55-75oC Extension: Fait à la température optimale pour la polymérase ADN Habituellement 72-75oC pour la polymérase Taq Amorces Caractéristiques: Courts oligonucléotides complémentaires aux séquences qui bordent la région d’intérêt Établis le point d’initiation de la réplication Établis le point de terminaison de la réplication 22 Conception d’Amorces Complémentarité 5’ Matrice 3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’ CCATAACCGG-OH3’ Complémentarité 3’ Matrice 3’…………….ATGGGTATTGGCC…………………..-5’ TACCCATAACC 23 Conception d’Amorces 5’ 3’ 3’ Région d’intérêt 3’ Région d’intérêt 3’ 3’ 3’ Bonne orientation Mauvaise orientation 24 5’ Problème 5’-AAAAAAAAAAAA GGGGGGGGGGGGG-3’ Vous désirez amplifier la séquence représentée par la boite. Quelle paire d’amorces est dans la bonne orientation pour accomplir ceci? 1234- AAAAAA TTTTTT GGGGGG CCCCCC 25 Utilité le la PCR Amplification et isolation d’une région donnée en changeant sa représentation relative Criblage pour déterminer la présence d’une séquence d’intérêt Entre 100pb et 10Kpb Présence ou absence d’un produit d’amplification Mutagenèse dirigée Utilisé pour ajouter ou enlever des nucléotides sur la matrice originale 26
