II - Visualiser les molécules dans les cellules vivantes Généralités • Techniques de microscopie optiques (les moins traumatisantes) • Marquage fluorescent des molécules à suivre 2 Concentrations ioniques • Microélectrodes (H+, Na+, K+, Cl-, Ca++) mais pas rapide • Indicateurs sensibles aux ions – luminescents (aequorine de la méduse) – fluorescents 3 Autres indicateurs fluorescents • Autres ions 6 Injection intra-cytoplasmique de molécules marqueur • Anticorps • Protéine cellulaire purifiée marquée • Exemple tubuline 7 Fig 18-21 tubuline 8 Fig 16-12 tubuline 9 Injection intra-cytoplasmique de molécules pour bloquer une fonction • Anticorps anti myosine-II dans un œuf d'oursin bloque la division sans bloquer la mitose 10 Quatre méthodes d'introduction de molécules dans la cellule • Microinjection • Électroporation • Vésiculation • Projection à haute vitesse… 11 Fig 9-40 (AB) 12 Fig 9-40 (CD) 13 Molécules captives • Synthèse d'une forme inactive de la molécule • Introduction dans la cellule • Activation à un temps et moment donné par un faisceau lumineux • eg : molécules captives pour Ca++, AMPc, GTP, IP3 14 Fig 9-41 Caged molecules • La molécule X devient active après le flash d'UV 15 Application • Molécules fluorescentes piégées • Grosse modification de la molécule qui doit rester active grosse difficulté • Tâtonnement pour créer de nouvelles molécules • eg : tubuline 16 Avant UV Après UV juste à gauche de la plaque métaphasique Après 1,5 mn Après 2,5 mn Fig 9-42 Caged tubuline fluorescéine • Tubuline rhodamine (rouge) • Dapi ADN (bleu) • Tubuline flourescéine piégée (mélangée aux autres et 17 invisible avant le rayon d'UV) 18 19 20 21 Desai,A1998 22 23 Green Fluorescence Protein 24 Fig 9-43 GFP 25 GFP 3D 26 GFP GFP Topol 27 GFP mice 28 GFP 30 III - Culture cellulaire • Isolement • Séparation (FACS) • Culture primaire et secondaire • Milieu de culture • Lignée cellulaire • Transformation • Congélation • Clone • Hybride 32 Facs 33 Hybride cellulaire 34 Production AC monoclonaux 35 Culture SEM 36 Immuno gold en ME ME Immuno-gold 37 Pistage de molécules dans la cellule • Pulse-chase • Patch-Clamp • Molécules « piégées » • Les anticorps – immunofluorescence directe – immunofluorescence indirecte 38 Fig 9-46 39 Autoradiographie en microscopie électronique 5 mn de pulse de 3HLeucine dans cellules B de pancréas Fig 9-47 Après 10 mn de chasse Après 45 mn de chasse 40 Fig 9-48 41 IV - Fractionnement des cellules et analyse des molécules • Techniques biochimiques 42