Recherche d`un polymorphisme de marqueurs microsatellites chez
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MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEURE ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE UNIVERSITE D’ORAN ES- SENIA FACULTE DES SCIENCES DEPARTEMENT DE BIOLOGIE Laboratoire de Génétique et Amélioration des plantes Laboratoire de Biotechnologie des Rhizobiums et amélioration des plantes Mémoire en vue de l’obtention du diplôme de Magister Spécialité : Amélioration des plantes Option : Sélection Intitulé ; Recherche d’un polymorphisme de marqueurs microsatellites chez différentes espèces de plantes : cas des espèces annuelles de Medicago Présenté par : BAKHTI ABDELNACER Devant la commission du jury : Président : Pr.BEKKI ABDELKADER Professeur Université d’Oran Rapporteur : Pr. FYAD FATIMA .ZOHRA Professeur Université d’Oran Examinateur : Pr. BENCHEIKH MOHAMED Professeur Université de Khemis Meliana Examinateur : Pr. KACEM MOURAD Professeur Université d’Oran Examinateur : Pr.AOUES ABEDLKADER Professeur Université d’Oran Année Universitaire : 2010-2011 Dédicaces A la mémoire de mon père, A ma très chère mère, pour ses prières et son sacrifice. A vous également : Mes chères sœurs, Mes chers frères, Et de peur d’oublier quelqu’un je ne citerai personne. A mes collègues et amis(es.). REMERCIEMENTS Ce travail a été réalisé au laboratoire de génétique et amélioration des plantes – université d’Oran Es-sénia. J’adresse mes plus vifs remerciements et mon profond respect à mon encadreur Mme FYAD FATIMA .ZOHRA Professeur Université d’Oran pour sa prise en charge, sa discussion très enrichissante et pour sa disponibilité ainsi que sa patience lors de la correction du manuscrit. Je remercie Mr BEKKI ABDELKADER Professeur Université d’Oran pour l’honneur qu’il m’a fait en acceptant de présider le jury. Mes sincères remerciements s’adressent à Mr AOUES ABEDLKADER Professeur Université d’Oran pour avoir accepté d’examiner ce travail. Je tiens à exprimer ma gratitude et mes remerciements à Mr KACEM MOURAD Professeur Université d’Oran pour avoir accepté de faire partie des membres de jury. Je tiens à remercie tout particulièrement Mr BENCHEIKH MOHAMED Professeur à l’université de Khemis Meliana pour avoir accepté d’examiner ce travail. Mes remerciements vont également à monsieur Yahia Noureddine, chargé de cours à l’université d’Oran - Es-Sénia pour ses conseils et son aide technique. Je tiens à remercier aussi : Mr Saadallah mohamed, Mr Amar touiti, Mr Amouri Adel, Melle Boushaba Nadjet, et Melle Lachheb Fayrouse pour leurs précieux conseils. Un grand merci à tous les collaborateurs et collègues du laboratoire d’Amélioration des plantes qui ont pu m’aider de prés ou de loin afin d’accomplir ce travail. Je remercie également toutes les personnes qui ont contribué de près ou de loin à la réalisation de ce travail. Résumé L’objectif de ce travail est d’évaluer la variabilité génétique de populations d’espèces annuelles de Medicago au moyen de marqueurs moléculaires (les microsatellites). Des accessions appartenant à quatre espèces annuelles du genre Medicago (M.aculeata, M.polymorpha ,M.ciliaris et M.truncatual) et deux cultivars de luzerne cultivées (Magali et Mercedes). Dans un premier temps il a fallu mettre au point le protocole d’extraction de l’ADN. Après avoir testé plusieurs protocoles, celui au CTAB a été optimisé et a permis d’obtenir un ADN de bonne qualité et en quantité suffisante. Plusieurs amorces choisies en fonction de leur localisation sur les chromosomes et leurs capacités d’amplifications. Finalement 13 paires d’amorces ont été amplifiées et leurs produits de l’amplification ont été soumis à l’électrophorèse sur gel d’agarose. Les résultats montrent que les populations étudiées présentent peu ou pas de polymorphisme intraspécifique. Le polymorphisme interspécifique chez ces populations étudiées est présent. Mots Clés : Extraction d’ADN, Microsatellites, Medicago, variabilité génétique مهخص انٍذف مه ٌذي انذراست ٌُ تمييم انتىُع انُراثي نخمستاصىبف مه وُع انفصت : Medicago truncatula, Medicago ciliaris, Medicag aculeata, Medicago polymorpha, Medicago sativa عه طريك استعمبل معبنم اندسيئيت (انميكرَسبث) .في بذايت ٌذي انذراست كبن عهيىب ايدبد طريمت انمثهي الستخالص انحمض انىَُِ َبعذ تدريب عذة طرق الستخالص انحمض انىَُِ تم اختيبر طريمت ) (CTABانتي تم تعذيهٍب َأعطتً وتبئح استخالص انحمض انىَُِ بٍذي انطريمت كميت معتبرة مه انحمض انىَُِ انىمي. اخترث عذة إرٌبصبث ببختالف تمُلعٍب عهي انصبغيبث َاختالف لذرتٍب عهي امبهيفبكبسيه 31 .مه أزَاج اإلرٌبصبث تم تدريب مىتُج االمبهيفكبسيه ٌذي األزَاج اإلرٌبصبث عهي االنكترَفُراز خبل االلبرَز. اضٍرث وتبئح أن ٌذي األصىبف انمذرَست ال تمهك اَ بىسبت لهيهت .اختالف َراثي داخهي نكم صىف.أمب االختالف انُراثي مببيه خميع األصىبف فٍُ مُخُد. كهمبث مفتبحيت :استخراج الحمض النووى ,الصغرية ,الفصة ,التباين الوراثي Abstract The objective of this study is to evaluate the genetic variability of populations of annual species of Medicago by means of molecular markers (microsatellites). Accessions belonging to four annual species from the kind Medicago (M.aculeata, M.polymorpha, M.ciliaris and M.truncatual) and two cultivars of alfalfa cultive (Magali and Mercedes). Initially it was necessary to develop the protocol of extraction of the DNA. After having tested several protocols, that with the CTAB was optimized and made it possible to obtain a DNA of good quality and in sufficient quantity. Several primers chosen according to their localization on the chromosomes and their capacities of amplifications. Finally 13 primers were amplified and these products of amplification were subjected to the electrophoresis on gel agarose. The results show that the studied populations present little or not intraspecific polymorphism. Interspecific polymorphism at these studied populations is present. Keywords : Extraction d’ADN, Microsatellites, Medicago, genetic variability Liste des figures Figure 01 : Classification des légumineuses de la famille des Papilionoideae. Figure 02 : Distribution mondiale du genre Medicago. Figure 03 : Distribution géographique de quelques espèces de genre Medicago. Figure 04 : Le cycle de vie de la plante modèle Medicago truncatula. Figure 05 : La technique d’amplification (PCR). Figure 06 : La détection d’un polymorphisme de répétition (SSR). Figure 07 : Développement et application des microsatellites SSR. Figure 08: Carte de comparaison entre deux espèces de genre Medicago truncatula et sativa Figure 09 : Migration d’extraits d’ADN obtenus par différentes méthodes sur gel d’agarose. Figure 10 : Migration d’ADN extrait obtenus par la méthode du Medicago modifié selon le poids de matériel végétal sur gel d’agarose. Figure 11 : Migration d’ADN extraits obtenus par la méthode du Medicago modifié selon le poids 500mg de matériel végétal sur gel d’agarose. Figure 12 : Profil d’amplification de 13 microsatellites sur gel d’agarose. Figure 13 : Profil d’amplification du marqueur MTIC 432 sur gel d’agarose. Liste des tableaux Tableau 01 : Espèces annuelles et pérennes du genre Medicago rencontrées en Algérie. Tableau 02 : Distributions des populations de M. truncatula et M.littoris collectées dans différents pays du monde et les collections mondiales existantes. Tableau 03 : Classification et caractéristiques générales des mutations. Tableau 04 : Classification des techniques de marquage moléculaire. Tableau 05 : Avantages et des inconvénients des marqueurs SSR. Tableau 06 : Fréquences individuelles des microsatellites (le nombre de motif de répétition par un million de paire de base) dans les séquences génomiques des espèces de plantes. Tableau 07 : Fréquences individuelles des microsatellites (le nombre de motif de répétition par un million de paire de base) dans les séquences ESTs des espèces de plantes. Tableau 08 : Ecotypes étudiés et leur site d’origine. Tableau 09 : Caractéristiques des marqueurs SSRs utilisés pour la recherche d’un polymorphisme chez les plantes. Tableau 10 : Les écotypes utilisés pour la quantification d’ADN selon le poids du matériel végétal. Tableau 11 : Mesures des échantillons d’ADN par spectrophotométrie. Tableau 12 : Test d’amplification d’ADN (Acu80 et Tru 62, Magali et Mercedes) par 13 microsatellites. Sommaire Dédicaces Remerciements Liste des figures Liste des tableaux Résumé Introduction …………………………………………………………………………………………… 01 CHAPITRE I : Présentation de la plante………………………………………………………………. 03 I. Présentation de la plante : genre Medicago……………………………………………………………….... I.1. Taxonomie………………………………………………………………………………………... I.2. L’aire de répartition ……………………………………………………………………………… I.2.1. Espèces spontanées du genre Medicago rencontrées en Algérie……………………………. I.3. Description de la plante: Medicago truncatula…………………………………………………………. I.4. Caractéristiques biologiques et agronomiques…………………………………………………… I.4.1. Caractéristiques biologiques………………………………………………………………… I.4.2. Caractéristiques agronomiques……………………………………………………………… I.5. La plante modèle : Medicago truncatula………………………………………………………… I.6. Ressources naturelles d’espèces annuelles du genre Medicago truncatula………………………… I.7. L’intérêt naturel d’espèces annuelles du genre Medicago…………………………………….. I.7.1. L’intérêt biologique………………………………………………………………………….. I.7.1.1. Le système de rotation medicago-céréales………………………………………………. I.8. L’intérêt économique……………………………………………………………………………. I.9. L’intérêt génétique………………………………………………………………………………. I.10. Les ressources génétiques et génomiques chez M.truncatula………………………………………. 03 03 04 06 07 08 08 08 08 10 11 11 11 11 12 13 CHAPITRE II : La variabilité génétique………………………………………………………………. 14 II. Introduction…………………………………………………………………………………………. II.1. La diversité biologique………………………………………………………………………….. II.2. La diversité génétique…………………………………………………………………………… II.3. Les principaux facteurs de la diversité………………………………………………………….. II.3.1. Le transfert des gènes…………………………………………………………………………. II.3.2. Les mutations………………………………………………………………………………….. II.3.3. La transposition……………………………………………………………………………….. II.3.4. La recombinaison homologue…………………………………………………………………. II3.5. Divers processus conservant et favorisant la variabilité……………………………………….. 14 14 14 15 15 15 18 18 18 II.4. La variabilité naturelle chez différentes plantes modèles………………………………………… II.5. Etude de la diversité génétique…………………………………………………………………… II.6. Analyse de la variabilité génétique……………………………………………………………….. II.7. L’estimation de la variabilité génétique par l’utilisation des marqueurs moléculaires…………... II.7.1. Mesure de la diversité génétique……………………………………………………………….. II.7.1.1. Diversité intraspécifique………………………………………………………………….. II.7.1.2. Diversité interspécifique…………………………………………………………………... II.8 Les applications de l’estimation de la variabilité génétique chez les plantes…………………….. 19 20 20 20 21 21 21 22 CHAPITRE III : Les marqueurs moléculaires…………………………………………………………. 23 III.. Les marqueurs moléculaires………………………………………………………………………. III.1..Historique………………………………………………………………………………………... III.2. Marqueurs morphologiques…………………………………………………………………….. III.3. Marqueurs biochimiques………………………………………………………………………... III.3.1. Allozymes…………………………………………………………………………………... III.4. Marqueurs génétiques…………………………………………………………………………... III.4.1. Caractéristiques d’un bon marqueur génétique…………………………………………….. III.5. Marqueurs génétiques moléculaires……………………………………………………………… III.5.1. Les différents types de marqueurs moléculaires…………………………………………….. III.5.2. Marqueurs dominants révélés en masse (marqueur anonyme)………………………………. III.5.3.Marqueurs codominants révélés individuellement…………………………………………… III.5.4. Marqueurs révélé par PCR…………………………………………………………………… III.6. les principales sources de marqueurs moléculaires………………………………………………. III.6.1.Critères de classification……………………………………………………………………… III.6.2.Marqueurs RFLP……………………………………………………………………………… III6.3. Marqueurs RADP……………………………………………………………………………. . III.6.4. Marqueurs ISSR ……………………………………………………………………………... III.6.5. Marqueurs AFLP……………………………………………………………………………... III.6.6. Marqueurs SNP………………………………………………………………………………. III.6.7.Marqueurs Microsatellites ou SSR…………………………………………………………… III.7. La synthénie entre espèces……………………………………………………………………….. III.8. Technique PCR-SSR…………………………………………………………………………….. III.9. les applications des marqueurs microsatellites (SSR) chez les plantes………………………….. III.9.1.Les cartes génétiques et les diversités fonctionnelles………………………………………… III.9.2. Comparaisons et cartographies entre les génomes des plantes………………………………. III.10. Sélection assistée par marqueurs (S.A.M)……………………………………………………… 23 23 23 23 23 24 25 25 25 26 26 26 27 27 28 28 29 29 30 31 33 36 38 39 39 41 CHAPITRE IV : Matériels et méthodes……………………………………………………………….. 42 IV. Matériels et Méthodes……………………………………………………………………………… IV. 1. Matériel végétal………………………………………………………………………………… IV.2.Le choix des marqueurs moléculaires utilisés……………………………………………………. IV.3.L’extraction de l’ADN……………………………………………………………………………. IV.3.1 Quantification d’ADN : Testa de saizing…………………………………………………….. IV.3.2. Dilution des ADN……………………………………………………………………………. IV.4. Amplification in vitro de l’ADN par PCR ……………………………………………………… I.V4.1 Principe. ……………………………………………………………………………………… I.V4.2. Conditions d’amplification de microsatellites……………………………………………….. IV.4.3. Test d’amplification………………………………………………………………………….. 42 42 43 46 46 47 47 47 48 49 CHAPITRE V : Résultats et interprétations…………………………………………………………… 50 V. Résultats et interprétations………………………………………………………………………….. V.1 Résultats d’extraction d’ADN…………………………………………………………………….. V.1.1.Résultats de l’extraction d’ADN selon le poids du matériel végétal………………………….. V.1.2.Résultats de l’extraction d’ADN par le protocole appliqué de Medicago modifié……………. V.1.3.Résultats obtenus par spectrophotométrie…………………………………………………….. V.2. Résultats obtenus de l’amplification par la technique PCR-SSR……………………………….. V.2.1. Test d’amplification de 13 marqueurs SSR…………………………………………………... V.2.2. Test d’amplification marqueur SSR…………………………………………………………... V.2.3. Polymorphisme intraspécifique……………………………………………………………….. V.2.3.1.Polymorphisme intraspécifique chez l’espèce Medicago aculeata………………………. V.2.3.2.Polymorphisme intraspécifique chez l’espèce Medicago ciliaris…………………………… V.2.3.3.Polymorphisme intraspécifique chez l’espèce Medicago polymorpha…………………….. V.2.3.4.Polymorphisme intraspécifique chez l’espèce Medicago truncatula……………………….. V.2.3.5 Polymorphisme intraspécifique chez l’espèce Medicago sativa…………………………….. V.4. Polymorphisme interspécifique 50 50 53 55 56 57 57 59 61 61 61 61 61 61 61 CHAPITRE VI : Discussion…………………………………………………………………………… 62 VI. Discussion………………………………………………………………………………………….. 62 VI.1. Le choix du protocole d’extraction d’ADN végétal…………………………………………… VI.2. L’optimisation de l’amplification des marqueurs SSR………………………………………… VI.3. Etude de variabilité génétique par marqueur SSR …………………………………………….. 62 64 64 Conclusion et perspectives……………………………………………………………………………... 66 Références bibliographiques…………………………………………………………………………… Annexe 67 94 Introduction Introduction La flore d’Algérie est particulièrement riche en espèces, la diversité de l’Algérie en climats et sols lui donne une place privilégiée pour la culture et l’exploitation des plantes. Un très grand nombre de ces espèces poussent à l’état naturel et endémique, certaines se révèlent d’une grande valeur agronomique, car elles sont utilisées comme fourrage pour bétail ou sous forme de plantes alimentaires, d’autres ont une application médicinale (Amrani, 2006). Le genre Medicago est un genre qui renferme 34 espèces annuelles et 21 espèces pérennes. Ces dernières présentent un intérêt agro-économique du fait de leur excellente qualité fourragère et de l’enrichissement de la fertilité du sol qu’elles assurent (Lalaoui-Kamal et al., 1997). En Algérie, ces plantes assurent l’amélioration de la flore des jachères pâturées, entrent facilement dans la rotation avec les céréales se régénèrent par auto-semis, et constituent une bonne réserve de semences dans le sol (Chebouti et al., 2000). Par ailleurs, des travaux ont été entrepris pour utiliser des extraits foliaires des luzernes (cas de M.sativa) comme aliment destiné à des populations souffrant de carence alimentaire forte, en particulier chez les enfants (Hireche, 2006). La description de la diversité génétique (variabilité génétique) à différents niveaux hiérarchiques d’organisations peut grandement bénéficier à la biologie des populations et à la biologie de l’évolution. Cette discipline contribue à un concept intégré de la conservation de la biodiversité. Ainsi, l’information génétique est devenue un outil important pour l’étude de la variabilité génétique, et aussi pour la biologie de la conservation, au même titre que les considérations écologiques, éthiques et économiques. Pour maintenir la diversité génétique (intra- interspécifique) il est nécessaire de décrire la diversité actuelle à l’intérieur et entre les populations des différentes espèces de plantes, mais également la dynamique de cette diversité génétique, afin d’appréhender les mécanismes de son évolution (Grivet, 2002). L’amélioration des plantes (Eagles et al ., 2001 ; Dekkers et Hospital, 2002) est basée sur l’utilisation de la variabilité génétique naturelle et sur des méthodes d’exploitation rapides et fiables de cette diversité dans les programmes de sélection. Les marqueurs moléculaires, 1 Introduction directement issus du polymorphisme existant au niveau de l’ADN, sont désormais utilisés fréquemment pour l’analyse des ressources génétiques et dans les programmes d’améliorations des plantes. Les marqueurs utilisés dans ce travail sont les Microsatellites, grâce à leurs caractéristiques (neutralité sélective, hypervariabilité, codominance et leurs reproductibilités) se révèlent être des outils de choix pour identifier et rechercher un polymorphisme chez les plantes. L’objectif de ce travail est à la fois l’optimisation de l’extraction d’ADN pour une bonne amplification, la recherche de microsatellite polymorphe parmi ceux choisis à la suite de l’analyse bibliographique, chez des populations appartenant à des espèces du genre Medicago. 2 Chapitre I Présentation de la plante I. Présentation de la plante : genre Medicago I .1. Taxonomie Les légumineuses forment l’un des groupes de plantes les plus diversifiés, avec plus de 18000 espèces, on y recense des arbres et des arbustes, parmi les Caesalpinioideae, Mimosoideae et certaines Papilionoideae, et un très grand nombre d’herbacées parmi les Papilionoideae. Cette dernière famille est de loin la plus abondante, avec plus de 12000 espèces dont 429 genres La majorité des légumineuses d’intérêt économique appartient aux Papilionoideae que l’on subdivise généralement en deux groupes : les légumineuses dites « Phaséolides » (Phaseolus, Vigna, Glycine, Cajanus…) provenant principalement des zones tropicales, et les légumineuses dites « Galégoïdes » (Trifolium, Medicago, Pisum, Lens…) issues principalement des zones tempérées (Doyle et Luckow, 2003 ; Gepts et al., 2005). Le genre Medicago (tribu des trifloliae, famille des fabaceae) défini par (Lesins et Lesins, 1979), présentant 56 espèces annuelles diploïdes (2n =16) et pérennes tétraploïdes (2n = 4x = 32) et avec trois espèces arbustes. Les espèces annuelles du Medicago ont dérivé des ancêtres pérennes à la fin du l’ère tertiaire (Lesins et Lesins 1979), les espèces annuelles sont strictement autogames par contre les espèces pérennes sont allogames (quiros, 1983) cité par (valizadeh et al., 1996) (Figue 01). Figure 01 : Classification des légumineuses de la famille des Papilionoideae (Zhu et al., 2005) 3 Chapitre I Présentation de la plante Les espèces annuelles de Medicago se retrouvent dans tous les étages bioclimatiques : de l’humide au saharien. Certains espèces sont à large spectre de répartition, d’autres ont une distribution spatiale plus délimitée. M.truncatula et M.polymorpha, présentes dans tous les étages bioclimatiques, sont considérées comme des formes ubiquistes, un ensemble d’espèces formé par M. ciliaris, M. intertexta, M. orbicularis et M. murex, s’étend de l’étage humide au semi-aride. Tandis que M. laciniata et M. minima sont présentes du semi-aride au saharien. Les Medicago pérennes se rencontrent essentiellement sur les rives nord de la Méditerranée et s’étendent jusqu’en Asie centrale ; quelques formes spontanées sont localisées sur les hauts plateaux des chaînes de l’Atlas Nord Africain. Dans le complexe d’espèces pérennes, l’interfertilité est entretenue naturellement entre les différentes formes spontanées qui le composent, ainsi le maintien de types différents (populations naturelles ayant des caractères singuliers) est dû essentiellement à l’isolement géographique. Les Medicago arbustives sont représentées, depuis peu, par trois espèces pérennes ligneuses récemment décrites Medicago arborea (2n = 4x = 32) présente en Méditerranée orientale, la seule espèce ligneuse cultivée, Medicago citrina (2n = 6x = 48) localisée dans le bassin occidental de la Méditerranée, Medicago strasseri, endémique de Crète, est une forme insulaire. I.2. L’aire de répartition Les luzernes annuelles ont parfois des distributions très limitées. Certaines espèces étant endémiques, alors que d’autres sont colonisatrices. Une étude plus précise de la distribution des espèces a été faite à partir des prospections de matériel spontané entreprises depuis de nombreuses années sur l’ensemble du bassin méditerranéen (Prospéri et al., 1991) La plupart des espèces de Medicago sont originaires du bassin méditerranéen et aussi de l’ouest de l’Asie (Lesins et Lesins, 1979). Elles sont naturalisées dans le sud d’Australie où elles ont été introduites accidentellement dans le 19eme siècle. Les espèces de Medicago annuelles ont été également introduites dans d’autres régions du monde surtout dans les régions qui ont un climat ressemblant au bassin méditerranéen par exemple l’Afrique du sud et le Chili. (Figure 02, 03). 4 Chapitre I Présentation de la plante Figure 02 : Distribution mondiale du genre Medicago (Delalande et al., 2007) Figure 03 : Distribution géographique de quelques espèces de genre Medicago (Delalande et al., 2007) 5 Chapitre I Présentation de la plante I.2.1. Espèces spontanées du genre Medicago rencontrées en Algérie Le genre Medicago est représenté en Algérie par de nombreuses espèces annuelles et pérennes (Hireche, 2006)(Tableau 01) Tableau 01 : Espèces annuelles et pérennes du genre Medicago rencontrées en Algérie. Espèces Caractéristique et aire de répartition en Algérie M.sativa plante vivace rencontré un peu partout M.falcata plante vivace très résistante au froid M.lupilina dite lupiline ou minette : plante annuelle ou bisannuelle M.scundiflora plante annuelle ou bisannuelle M.marina plante vivace, elle pousse sur les sables maritimes M.scutellata dite luzerne à écusson : plante annuelle, se rencontre sur les sols argileux du Tell. M.orbicularis plante annuelle du pâturage de Tell M.echuris plante annuelle, elle est assez commune dans les pâturages de Telle (constantinois). M.ciliaris rencontré surtout dans les pâturage et prairies du Tell à sol semi salin M.truncatula plante annuelle très commune dans le Tell. M.littoris plante annuelle, elle est abonde sur les dunes et les littoral et de l’intérieur. Elles constituent des pâturages de bonne qualité M.murex plante annuelle commune dans tout le territoire algérien. M.minima plante annuelle, est souvent rencontré sur les sols pauvres. M.arabica plante annuelle. M.lanciniata plante annuelle M.hispida plante annuelle 6 Chapitre I Présentation de la plante I.3. Description de la plante : Medicago truncatula C’est une plante annuelle herbacée, de taille intermédiaire, 60 cm maximum, ramifiée au port souvent rampant de 15 à 80 cm de long. Elle porte des feuilles trifoliolées avec un nombre variant de 1 à 5 fleurs. Ses petites fleurs jaunes de 5 à 8 mm donnent après autofécondation des gousses cylindriques très dures, en forme de vrilles renfermant 4 à 6 graines. Les spires jointives de la gousse portent des épines recourbées perpendiculaires au plan des spires. Les graines de cette plante ont une durée de vie importante supérieure à 40 ans, et une dormance qui peut être levée facilement (Lesins et Lesins, 1979). Selon ces mêmes auteurs, M.truncatula a un cycle de vie court qui varie de 2 à 3 mois.(Figure 04). Figure 04 : Le cycle de vie de la plante modèle Medicago truncatula (Delalande et al., 2007) A : stade plante. B : stade feuille. C : stade fleur. D : stade gousse. E : stade graine. 7 Chapitre I Présentation de la plante I.4. Caractéristiques biologiques et agronomiques I.4.1. Caractéristiques biologiques Les espèces appartenant au genre Medicago, dont la plupart sont des légumineuses, ayant la capacité de s’associer avec les bactéries du sol, essentiellement du genre Rhizobium par la formation sur la surface de leurs racines des organes spéciaux (nodules) dans lesquels les bactéries réduisent l’azote atmosphérique en ammoniaque qui est assimilé par les plantes pour leur croissance et développement (Long, 1996). I.4.2. Caractéristiques agronomiques Les espèces de Medicago sont adaptés à différents types de texture de sol, sablonneux et argileux, et particulièrement aux sols bien drainés avec un PH neutre ou alcalin, de 6 à 8 (Hackney et al., 2008), notamment quand des éléments chimiques solubles sont présents, entre autre l’aluminium et magnésium (Veatch et al., 2004), ainsi que lorsque les sols présentent une faiblesse en eau et des plantes à système radiculaire non profond. Les conditions de température humide, spécialement le type de climat méditerranéen ; avec des chutes de pluies variant entre 250 à 600 mm par an, avec un été sec et chaud et un hiver moyennement humide agissent sur le comportement de ces plantes, elles ne peuvent tolérer les hivers froids (Brandsaeter et al., 2002). Le nombre des graines produites est très important, ce qui les rend très intéressantes pour les rotations de cultures dans les régions pastorales. I.5. La plante modèle : Medicago truncatula L’Arbidopsis thaliana, modèle végétal classique, appartient à la famille des Brassicacèes. Il est difficilement exploitable comme modèle pour les Légumineuses cultivées car la distance phylogénétique qui sépare les deux familles est trop grande. De plus, il ne présente pas les associations symbiotiques évoquées. Parmi les raisons pour lesquelles le Medicago truncatula a été choisi comme une plante modèle pour une taille génomique qui est de 500-550 millions de paire de base (Mpb), un génome diploïde, une courte génération de graine à graine, une transformation facile, excellente population de mutants, et une grande panoplie de collections d’écotypes (Barker et al., 1990 ; Cook, 1999 ; Oldroyd et Downie, 2008). D’autres caractéristiques biologiques et les différents outils génomiques qu’elle peut offrir (Huguet et Prosperi, 1996 ; Young et al., 2005), dont une importante synthénie avec certaines légumineuse cultivées tels que le trèfle (Gimeno, 2009), le Pois (Kalé et al., 2004), la luzerne 8 Chapitre I Présentation de la plante pérenne (Zhu et al., 2005) et la lentille (Phan et al., 2007). Grâce à cette plante modèle toutes informations acquises peuvent être transférées vers ces légumineuses. Alors ces atouts sont mis à profit pour des études de génomique fonctionnelle et structurelle dans le but d’identifier les gènes d’intérêt agronomique, en plus des études des interactions légumineuses et agents pathogènes et les interactions symbiotiques (Ameline-Torregrosa et al., 2008). 9 Chapitre I Présentation de la plante I.6. Ressources naturelles d’espèces annuelles du genre Medicago Le tableau (02) représente la distribution de deux espèces annuelles du genre Medicago à travers le monde, ainsi que le nombre de populations et le pays d’origine. Tableau 02 : Distributions des populations de M truncatula et M littoris collectées dans différents pays du monde et les collections mondiales existantes. (Source :Medicago truncatula handbook, version 2007) http://www.noble.org/MedicagoHandbook/pdf/WildAccessions_Populations.pdf 10 Chapitre I Présentation de la plante I.7. l’intérêt des espèces annuelles du genre Medicago I.7.1. L’intérêt biologique Les luzernes annuelles peuvent jouer un rôle important dans l’amélioration de la production fourragère en Algérie en produisant un fourrage, en quantité et en qualité supérieure, elles assurent l’amélioration de la flore des jachères pâturés, entrent facilement dans la rotation avec les céréales, se régénèrent par auto-semis, et constituent une bonne réserve de semences dans le sol (Chebouti et Abedlguerfi, 2000). Ces espèces améliorent les qualités physiques et biologiques des sols (réduction des pertes en azote par lessivage, apport de matière organique, diminution de la fréquence de certains parasites) et interviennent dans la dégradation des pesticides. Enfin en raison de leur cycle végétatif court elles n’entrent pas en compétition avec la strate arborée pour l’eau et l’azote. Ces espèces peuvent valoriser les parcours dégradés en zone aride et participer à la revégétalisation des « pare-feu » et des territoires perturbés et marginaux sur l’ensemble du pourtour Méditerranéen (Prosperi et al., 1993). I.7.1.1. Le système de rotation medicago-céréales Presque ignorées en Europe par l’agriculture moderne, introduites involontairement vers 1830, ces medics se sont répandues et ont envahi les jachères lors d’application d’engrais phosphatés destinés aux céréales. Repérées, puis identifiées, les éleveurs ont basé leur système d’exploitation sur la rotation céréales-luzernes annuelles (ley-farming ) grâce à la possibilité qu’ont ces espèces de produire des graines « dures » à germination étalée sur plusieurs années, ce qui évite de semer chaque année. Ainsi la prairie est remplacée dans la rotation d’une jachère classique qui est moins productive. Elles sont à la base du système de production de moutons en Australie dans des zones à climat méditerranéen, pour des raisons à la fois économiques (il s’agit d’augmenter la productivité tout en réduisant les intrants) et environnementales (il s’agit d’augmenter la diversité des espèces dans les systèmes de production agricole et de limiter les engrais azotés couteux en énergie fossile). I.8. l’intérêt économique Les Medicago annuelles, par leur richesse en protéine, peuvent contribuer, d’une manière significative, à améliorer le régime alimentaire humain et animal. On estime que 40-60 millions de tonnes d’azote sont fixés annuellement par les légumineuses cultivées, on peut économiser ainsi 10 milliards de dollars US par an en engrais d’azote (Graham et Vance, 2003). 11 Chapitre I Présentation de la plante La production de métabolites secondaires spécifiques tels que (les flavonoïdes, les acides phénoliques, les terpénoïdes, les alcaloïdes…) impliqués dans la signalisation symbiotique, dans les réactions de défense, présentent un intérêt pharmaceutique (Dixon., 2004). D’autres classes de métabolites secondaires sont utilisés comme antiherbivore (Papadopoulou et al., 1999), l’introduction de ces substances allelopathiques dans la gestion de l’agriculture réduit l’utilisation des herbicides (Waller et al., 1993). On peut utiliser certains métabolites dans le domaine de l’agriculture pour avoir des cultures bio, anti-microbe (Broeckling et al., 2004), anti-insecte (Tava et Odoardi, 1996). La luzerne cultivée (Medicago sativa) est une plante très importante économiquement puisque elle constitue un précieux aliment de bétail, elle est très riche en acide aminés (éléments de base pour les protéines), mais aussi en minéraux dont le calcium, le fer, le phosphore, le zinc ou cuivre ainsi qu’en vitamines A et K. De plus elle constitue une source importante de chlorophylle. Luzerne cultivée pour sa composition chimique c’est une plante médicinale de choix, elle est tonique et reminéralisante, luttant contre l’acidification, elle a des effets purifiant et désintoxiquant pour les tissus, enfin elle prévient et combat l’excès de cholestérol. Certaines plantes transgéniques de (Medicago sativa) sont utilisées dans la fabrication des protéines médicamenteuses (Schoutteten, 2004). I.9. l’intérêt génétique Diploïde (2n=16) et autogame, très proche de la luzerne cultivée (Medicago sativa). Le M.truncatula produit des graines en abondance avec un temps de génération de10 à 12 semaines (de graine à graine). Un très petit génome de 500-550 (Mpb), c'est-à-dire 03 fois à 04 fois supérieur à celui l’Arabidopsis thaliana et équivalent à celui du riz. La biodiversité de l’espèce Medicago truncatula est caractérisé par une forte variabilité morphologique et génétique intra- et interpopulations et par une importante homozygotie au niveau individuel (Bonin et al., 1996), la régénération par embryogénèse somatique (Barker et al., 1990), présentant, également une aptitude a la transformation par Agrobacterium tumaficiens (Thomas et al., 1992 ; Journet et al., 2001 ). I.10. Les Ressources génétiques et génomiques chez M. truncatula Dans le but de mettre en place un inventaire complet des gènes de Medicago truncatula et leurs fonctions plusieurs ressources ont été et sont encore en cours de réalisation parmi eux un très grand projet de séquençage du génome de Medicago truncatula, une banque de mutants et de données d’expression génomiques. Plusieurs cartes génétiques ont été produites, notamment la carte 12 Chapitre I Présentation de la plante américaine qui touche le polymorphisme entre les lignées de référence A17 et A20 (Choi et al., 2004 ), une carte française aussi a été faite un croisement entre A17 et DZA315.16 (Toquet et al., 2002). D’autres travaux ont pu démontrer que l’organisation du génome de Medicago truncatula est organisé en régions très distinctes : de l’hétérochromatine péricentrométrique, riche en séquences répétées et aux grandes régions euchromatiniennes riches en gènes au niveau des bras chromosomiques (Kulikova et al., 2004). Elle représente environ 60 % de la taille du génome (entre 300 à 320 Mpb ). Avec un nombre de gène estimé à 35000 à 40000 avec une densité estimée à un gène tous les 6,7 kpb (Young et al., 2005). Le projet de séquençage international de Medicago truncatula touche surtout les régions euchromatiniennes riches en gènes. Il a été lancé en 2002 aux Etats-Unis, puis en 2003 l’Union Européenne est rentré en collaboration. La stratégie consistait à développer une carte physique puis adopter une approche BAC par BAC (Bacterial Artificial Chromosome) en utilisant les différentes banques disponibles. Les BACs sont regroupés en contigs, ancrés sur la carte génétique, séquencés et annotés par un comité international (IMGAG International Medicago Genome Annotation Group )(McCallum, 2000 ; Lohar et al ., 2006). Une analyse des séquences microsatellites permet de lier les cartes physiques et génétiques (Mun et al., 2006), une carte physique a donc été établie qui contient à peu près 1370 contigs (de 340 kb en moyenne ) à partir de 44000 BACs et couvre à peu près 93 % du génome. Ces séquences pourraient faciliter le travail de la découverte des bases génétiques et génomiques des nombreux phénotypes observées chez les légumineuses. Plusieurs travaux ont permis de disséquer certains processus et mécanismes de régulation génétiques par la création et l’altération des mutations et cela dans plusieurs domaines tels que le processus de nodulation. Plusieurs banques ont été conçues par mutation ponctuelle, générées dans la plupart du temps par mutagénèse EMS (Ethyle Méthane Sulfonate). D’autres études similaires ont été effectuées mais par différentes techniques, comme la technique de TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes), cette technique permet de cribler les populations EMS dans le but d’identifier des gènes cibles (McCallum et al 2000 ; Tadege et al., 2009). Des mutants par insertion et délétion ont été produits par les rayons gamma (Penmetsa et Cook, 2000), le bombardement fast neutron (Starker et al., 2006), et par l’insertion de T-DNA. 13 Chapitre I Présentation de la plante 3 Chapitre II Variabilité génétique II. Introduction La diversité naturelle des plantes a fasciné l’humanité à travers l’histoire, principalement en raison de la variation énorme qui existe pour la morphologie ainsi que d’autres traits de développement. Les effets de forme physique d’une telle variation naturelle présente parmi des espèces (interspécifiques), ont conduit à l’évaluation de plantes par sélection naturelle, cette diversité de développement étant la base de la taxonomie et phylogénie (Cronk, 2001). En outre, une variation comparable liée au développement existe dans beaucoup d’espèces (intra spécifiques), reflétant probablement des adaptations à différents environnements naturels. Cette variation intra spécifique a été employée pour la domestication et l’amélioration génétique de plus de 100 espèces de plantes (Alonso-Blanco et al . 2005). II.1. La diversité biologique La diversité biologique ou biodiversité désigne la variété des formes de vie comprenant les plantes, les animaux et les micro-organismes, les gènes qu’ils contiennent et les écosystèmes qu’ils forment. Elle englobe à la fois la diversité au sein des espèces (diversité génétique), entre les espèces (diversité d’espèces) et entre les écosystèmes (diversité d’écosystèmes)(Parizeau, 1997). II.2. La diversité génétique La diversité génétique est la variation qui existe au niveau des gènes. C’est la variation de la quantité d’information génétique des individus, des populations, des espèces, des assemblages ou des communautés. Elle est définie par le niveau de similarité ou de différence dans cette composition génétique et représente le fondement de la biodiversité (Parizeau, 1997). C’est la diversité intraspécifique (polymorphisme génétique) qui représente le potentiel et la capacité à répondre aux changements environnementaux, à la fois sur le court terme (faculté d’adaptation) et sur le long terme (potentiel d’évolution). La richesse des espèces est la mesure d’évaluation de la biodiversité la plus largement utilisée (Lewin, 1992). 14 Chapitre II Variabilité génétique II.3. Les principaux facteurs de la diversité La source ultime de la diversité biologique réside dans la variabilité inscrite dans le patrimoine génétique des organismes. C’est au niveau de ce patrimoine que l’on doit rechercher les mécanismes fondamentaux qui sont à l’origine de la diversification du vivant (Lévêque et Mounoulou, 2001). Le degré de subdivision génétique d’une espèce dépend de l’action respective des quatre forces évolutives : mutation, sélection, dérive et migration. Tout facteur intervenant sur l’une de ces forces peut affecter la subdivision génétique de l’espèce elle-même. Les flux de gènes (migration) interviennent directement sur le degré d’organisation de la diversité génétique des plantes. II.3.1. Transfert des gènes Chez les plantes, les flux de gènes n’ont lieu que lors de la dispersion du pollen et des graines. Cependant, il est nécessaire de différencier les composants pollen et graines car leurs rôles dans la dynamique de la diversité des populations ne sont pas identiques. Ils diffèrent d’un point de vue quantitatif car le pollen et les graines contribuent inégalement aux flux de gènes réalisés mais aussi d’un point de vue qualitatif car ils agissent de manière asymétrique dans la contribution de la diversité génétique. Les contributions relatives des graines et du pollen au flux des gènes varient très fortement selon les espèces (Ouborg et al., 1999). Le pollen est souvent considéré comme la composante majeure des flux gènes car ses capacités de dispersion sont plus grandes que celles des graines (Ennos. 1994), la dispersion du pollen à longue distance a été confirmé par des études (Smouse et Sork, 2004 ; Latta et al., 2006). Cependant des études récentes montrent que la dispersion des graines peut être égale ou bien supérieure à celle du pollen chez certaines espèces (Baclers et al., 2006 ; Garcia et al., 2007). Les flux des gènes par graines et par pollen sont à l’origine de la dynamique d’évolution de la diversité génétique chez les plantes (Gerber et al., 2003) II.3.2. Les mutations Les mutations apparaissent toujours d’une manière aléatoire. Lors d’une mutation, l’altération de la séquence des nucléotides engendre une modification de génotype, se traduisent ou non par un changement de phénotype observable chez Arabidopsis thaliana (Alonso-Blanco et al., 2005 ; Loudet et al., 2010). 15 Chapitre II Variabilité génétique Ce changement permet de repérer la mutation, en la rendant perceptible au niveau de l’organisme, les mutations peuvent se produire à trois niveaux différents (Alberts et al., 2002 ; Feuk et al., 2006)(Tableau 03). Les mutations géniques « ponctuelles » impliquent des erreurs de petite taille dues au changement d’une base par une autre ou l’addition ou la délétion de quelques nucléotides dans une séquence d’ADN. Les altérations chromosomiques entrainant des modifications importantes de la structure des chromosomes (telles que des translocations, délétions, inversions) par gain, perte ou réarrangement de segments chromosomique. Les mutations génomiques concernent le changement du nombre de chromosomes sans changement de structure de ces derniers ( aneuploïdies et polyploïdie). 16 Chapitre II Variabilité génétique Tableau 03 : Classification et caractéristiques générales des mutations. (Alberts et al., 2002) 17 Chapitre II Variabilité génétique II.3.3. La transposition Les éléments transposables ou transposons constituent une autre cause essentielle de variation. Ce sont des séquences du génome qui sont mobiles ; elles sont capables de se transposer d’un endroit génomique à un autre à l’aide de translocation. Les transposons provoquent des réarrangements génomiques tels que l’inversion, la translocation, la duplication, la délétion et l’insertion (Singleton et et al., 1994), cas du maïs, d l’Arabidopsis, et de la tomate (Bishop et al., 1996). II.3.4. La recombinaison homologue Elle signifie l’échange génétique entre des séquences homologues. Cela induit des variations dans les séquences des gènes existants plutôt qu’introduire de nouvelles informations génétiques. Les deux types de recombinaisons homologues : le crossing-over qui est une recombinaison réciproque et la conversion du gène qui est une recombinaison non réciproque. C’est la séquence d’ADN d’un segment du chromosome qui est remplacé par une séquence homologue d’un chromosome homologue ou non homologue (Lewin et al., 1992). II.3.5. Divers processus conservant et favorisant la variabilité La reproduction sexuée est le principal moteur de la variabilité génétique des populations. Les mécanismes favorables à l’allogamie encouragent également la variabilité : c’est le cas des allèles d’autoincompatibilités chez les plantes, la diploïdie conserve la variabilité parce qu’elle la protège de la sélection des allèles récessifs rares. Lorsque l’hétérozygote est avantagé, il est sélectionné par rapport à chacun des homozygotes, ce qui conserve dans la population les deux allèles récessif et dominant un des meilleurs exemples d’avantage de l’hétérozygotie est l’hétérosis. Au sein des plantes cultivées et de leurs apparentés sauvages, l’hermaphrodisme est une condition courante et les systèmes de reproduction préférentiellement autogames sont fréquents (blé, riz, orge, soja, etc.). Les espèces autogames présentent, en moyenne, une diversité génétique intra-population plus faible que les espèces allogames et une très forte différenciation inter-populations (Hamrick et al., 1991) ces deux caractéristiques sont des conséquences immédiates du système de reproduction. La dérive génétique et les effets de la sélection sont accentués en régime de reproduction consanguin, et la dispersion du pollen est réduite (Charlesworth et al., 1995). Une caractéristique inattendue, mais qui semble 18 Chapitre II Variabilité génétique néanmoins générale, est l’existence d’importantes variations de diversité entre les populations d’une même espèce, certaines populations présentent des niveaux de variabilité supérieurs à ceux attendus en théorie (Schoen et Brown, 1991). Le maintien de forts niveaux de diversité intra-population reste un sujet de débat et pose le problème du fonctionnement des populations autogames. II.4. La variabilité naturelle chez des différentes plantes modèles La variabilité existe naturellement chez Arabidopsis pour différents caractères (Koonneef et al., 2004) et un gradient latitudinal a été démontré comme influençant la longueur des hopocolytes (Maloof et al., 2001) et le moment de la floraison (Stinchcombe et al., 2004). Le déterminisme génétique de la précocité de floraison, de vernalisation et de photopériodisme est bien connu chez Arabidopsis thaliana, l’analyse de la variabilité génétique de ce caractère quantitatif chez cette espèce est gouverné par des gènes au nombres de trois (Prouteau et colot, 2005 ; Le Corre et al., 2006). Le riz est une plante modèle des poacées (Goff et al., 2002 ; Yu et al., 2002). La diversité génétique du riz est considérée avec plus de 150.000 variétés cultivées dans le monde et 107.000 accessions dans les banque de gènes de l’IRRI (dont 5000 accessions d’espèces sauvages) (Khush, 1987). Chez la plante modèle Medicago truncatula qui est une plante originaire du « Croisant Fertile » recouvrant la Turquie, l’Irak, l’Iran, le sud du Caucase et les pays méditerranéens limitrophes, bien qu’elle soit autogame, il existe une forte variabilité génétique, due notamment à sa dynamique de dispersion (Ronfort et al., 2006). C’est une espèce opportuniste présente dans les biotopes variés (Prosperi et al., 1993). Cette variabilité facilite la création de matériel destiné à des analyses génétiques ; plus de 5700 accessions ont été recensés et conservées dans les principales collections de ressources biologiques : AMGRC-SARDI, INRA,ARS-USDA,LILM-CBBC et Samuel (http/www.nobl.org/Medicago/handbook, 2007). 19 Roberts Noble Foundation Chapitre II Variabilité génétique II.5. Etude de la diversité génétique Historiquement, la recherche de variations génétiques dans les populations naturelles a concerné des caractères directement accessibles à l’observateur (morphologie, couleur, etc). Le développement des techniques de biochimie, de cytogénétique et de biologie moléculaire a permis d’étudier la variabilité génétique à des échelles plus fines, jusqu’au niveau de la séquence d’ADN, permettent même l’étude du polymorphisme des régions non codantes. Cependant, il est très important de réaliser que, dans la plupart des cas, l’utilisation de marqueurs ADN n’élimine pas complètement le besoin de faire des tests phénotypiques sur les plantes (Roldan-Ruiz et al., 2005). II.6. Analyse de la variabilité génétique La valeur phénotypique d’un caractère observé pour un génotype donné dépend des conditions environnementales, pour la plupart des caractères, le phénotype résulte des effets conjoints de 3 composants : le génotype G, l’environnement E, qui contribue toujours pour une part au phénotype et l’interaction entre le génotype et l’environnement IGXE. La valeur pour un phénotype peut se résumer à la formulation additive : P = G+E+ IGXE. Cette interaction entre le génotype et l’environnement est très importante car elle signifie que l’expression d’un gène n’est pas indépendante du milieu. Si le phénotype est la somme d’un effet des gènes de l’environnement et de leurs interactions, alors la variance du phénotype (σ2(p)) est la somme de la variance génétique (σ2(g)), de la variance environnementales (σ2(e)) et du double de la covariance entre les effets génotypiques et environnementaux (2cov(ge)) selon l’équation : (σ2(p)) = (σ2(g)) + (σ2(e))+ 2cov(ge) ( Gallais, 2001). II.7. L’estimation de la variabilité génétique par l’utilisation des marqueurs moléculaires La variabilité génétique ou bien la diversité génétique est le résultat de plusieurs phénomènes dont la sélection, les mutations, la migration et la dérive génétique. Ces forces évolutives ont toutes des effets sur l’importance et l’organisation de la variabilité génétique. 20 Chapitre II Variabilité génétique Les effets de ces forces portent sur l’ampleur et l’organisation du polymorphisme : la mutation et la migration augmentent la diversité alors que la sélection et la dérive la diminuent. L’utilisation de la diversité génétique dans un programme de sélection passe inévitablement par son estimation et par le choix du type de marqueur susceptible de la traduire le plus fidèlement possible. Les marqueurs génétiques sont des caractéristiques héréditaires qui renseignent sur le génotype qui le porte (De Vienne, 1998). Trois types de marqueurs sont largement utilisés pour l’évaluation de la variabilité génétique, à savoir les marqueurs morphologiques, les marqueurs biochimiques et les marqueurs de l’ADN. II.7.1. Mesure de la diversité génétique L’étude de la diversité génétique est une des applications les plus répandues pour les marqueurs moléculaires. Le choix du marqueur approprié dépendra en partie du matériel au sein duquel on cherche à mesurer la diversité génétique. Selon le but de l’étude, on peut être intéressé à mesurer la diversité entre des espèces (niveau interspécifique) ou encore entre divers individus ou populations au sein d’une même espèce (niveau intraspécifique). II.7.1.1. Diversité intraspécifique La diversité intraspécifique est la diversité à l’intérieur d’une même espèce. Cette diversité est à l’origine de la création de nouvelles variétés. Plusieurs marqueurs moléculaires ont été utilisés pour l’évaluation de cette diversité au sein d’un matériel génétique et lorsqu’on opte pour un type de marqueur moléculaire, il faudra s’assurer que celui-ci soit utile en raison du nombre de locus polymorphes disponibles ainsi que de la diversité allélique présente à ces locus. L’indice de diversité génétique de Nei sert à décrire combien un marqueur moléculaire est informatif au sein d’un matériel génétique (Allinne et al., 2009). II.7.1.2. Diversité interspécifique Pour décrire la diversité génétique des populations, Wright (1951) a développé l’indice FST qui est la corrélation entre deux gamètes tirés au hasard et provenant de deux souspopulations différentes. Cet indice s’applique aux locus bialléliques et en absence de sélection. Lorsque les locus sont multialléliques, on utilise une généralisation de cet indice, dénommé GST de Nei (1973). L’analyse de la structuration hiérarchique des populations peut être abordée à l’aide de différents paramètres. Le principe général repose sur la décomposition de la variabilité 21 Chapitre II Variabilité génétique observée entre les différents niveaux de regroupement des individus. L’analyse de variance sur les données moléculaires, AMOVA ( Excoffier et coll, 1992). Elle facilite l’identification des niveaux qui procurent le plus de variabilité et aussi elle permet la décomposition de la diversité qui est présente à chaque niveau hiérarchique. Les analyse multivariées conduites sur les données alléliques ou génotypiques sont de bons outils pour représenter la variabilité observée. Elles permettent d’exploiter les génotypes individuels et donc d’évaluer la diversité intrapopulation et la différenciation interpopulation par des analyses hiérarchiques menés sur chaque axe. Les analyses multivariées sont aussi de bons outils pour révéler la différenciation génétique entre sous-population pour des caractères quantitatifs en tenant compte des corrélations entre caractères (Lamara, 2010). II.8. Les applications de l’estimation de la variabilité génétique chez les plantes Les études sur les systèmes de reproduction et la diversité génétique, ont fourni des prédictions claires sur l’effet des systèmes de reproduction sur les patrons de la diversité génétique. En particulier, les espèces autogames devraient être moins diverses, plus structurées génétiquement, et présenter un plus fort déséquilibre de liaison que les espèces allogames. Ces études ont été vérifiées à l’aide de marqueurs enzymatiques (Hamrick et Godt, 1996), ADN (Microsatellites, AFLP ou RAPD)( Nybom et al., 2004), les espèces autogames présentent de plus fortes pertes de diversité que les espèces allogames (Glémin et al., 2006). D’autres mécanismes de domestication des espèces chez les végétaux ont été analysés par l’estimation de la diversité génétique, c’est le processus de domestication qui a eu des conséquences importantes sur la diversité génétique des espèces cultivées au cours de la domestication. Les fortes pressions de sélection ont entrainé des modifications phénotypiques et génétiques importantes au moins chez les espèces propagées par graines qui ont subi de nombreux cycles de reproduction/sélection de courtes échelles évolutives (Zohary et al., 2004). 22 Chapitre III Marqueurs moléculaires III. Marqueurs moléculaires III.1. Historique Historiquement, les premiers marqueurs disponibles ont été les marqueurs morphologiques. Chez les légumineuses, la couleur des fleurs chez la luzerne (Medicago sativa), le trèfle violet (Trifolium pratense) et le lotier cornicule (Lotus corniculatus), le nanisme chez la luzerne, le sens d’enroulement des gousses chez M.truncatula, les taches foliaires chez le trèfle violet et chez M.truncatula servent de marqueurs. Puis les marqueurs biochimiques (ou isoenzymes) basés sur des différences de poids moléculaires de protéines ayant une activité enzymatique ont été mis au point. Ils ont l’avantage d’être codominants et l’inconvénient d’être peu nombreux (Julier et al., 2003). Durant les années 80, les marqueurs moléculaires (marqueurs génétiques) liés à l’ADN ont remplacé progressivement les marqueurs visuels ou enzymatiques. Ils offrent en effet plusieurs avantages : ils peuvent être utilisés tout le long de l’expérimentation et sont observable à n’importe quel stade de développement de la plante et sur n’importe quel organe (Vedele et Loudet, 2001). III.2. Marqueurs morphologiques Dans les programmes de sélection des plantes, les caractères morphologiques sont les premiers à être observés. Ces caractères intéressent diverses parties de la plante, par exemple longueur des tiges, surface foliaire, initiation de la floraison (Cui et al., 2001 ; Gomez et al., 2004). Ces caractères sont utilisés également pour estimer la variation intra et interpopulations. Ils sont généralement limités en nombre de caractères relevés et directement influencés par l’environnement. Néanmoins, ils fournissent des informations utiles pour décrire et identifier le matériel biologique (Andersson et al., 2006). III.3. Les marqueurs biochimiques Les marqueurs biochimiques ont été les premiers marqueurs a voir été mis en œuvre pour étudier la variabilité génétique (Harry, 2001). III.3.1. Les Allozymes Les marqueurs biochimiques dont les allozymes, ont été utilisés pour caractériser la diversité génétique de plusieurs plantes. Les allozymes sont des formes moléculaires distinctes d’une enzyme chez un même organisme et ayant la même activité catalytique. Leur 23 Chapitre III Marqueurs moléculaires origine est due à une mutation au niveau de l’acide aminé qui affecte la charge totale de la protéine sans affecter le site catalytique. Leur révélation se fait par séparation electrophorétique des protéines et puis une coloration des enzymes. Des populations naturelles tunisiennes de M.ciliaris et M.intertexta ont été évaluées pour leur polymorphisme génétique à l’aide de 7 systèmes enzymatiques. Six locus polymorphes ont été distinguées permettant une analyse du polymorphisme génétique existant entre ces deux espèces annuelles (Abdelkefi et al ., 1997). La diversité génétique d’espèces annuelles de pois chiche à été étudiée par (Labadi et al., 1996) à l’aide de marqueurs enzymatiques. Ces marqueurs ont également été utilisés en combinaison avec des marqueurs morphologiques pour comparer la structuration de la diversité génétique chez M.sativa (Jenczewski et al., 1999). Les allozymes ont l’inconvénient d’être lourds et difficiles à manipuler, de même qu’ils présentent une reproductibilité assez faible. Vu le faible niveau de polymorphisme révélé par les marqueurs biochimiques et sa variabilité en fonction des conditions environnementales, il est souvent nécessaire d’utiliser les marqueurs moléculaires pour compléter l’évaluation et l’étiquetage des ressources génétiques. III.4. Marqueurs génétiques On appelle un marqueur génétique tout marqueur biochimique, chromosomique ou moléculaire qui permet de révéler un polymorphisme. L’analyse biochimique des protéines ou moléculaire du gène donne accès à des polymorphismes sans traduction perceptible à l’échelle morphologique ou physiologique et permet de percevoir, à cette échelle, un polymorphisme génétique non perceptible à l’échelle de l’organisme (Serre, 2006). L’identification de formes de polymorphismes dans les espèces peut aider à comprendre leur distribution et leur évolution historique et aussi bien leurs mécanismes d’interaction et leur coévolutions avec les autres espèces (De Moraes et al., 2007). 24 Chapitre III Marqueurs moléculaires III.4.1. Les caractéristiques d’un bon marqueur génétique Un marqueur génétique « idéal » doit être polymorphe ( la matière première du généticien est la variabilité), multialléliques, codominants (l’hétérozygote présente simultanément les caractères des deux parents homozygotes), non épistatique (son génotype peut être lu à partir de son phénotype quel que soit le génotype des autres locus), neutre (les substitutions alléliques au locus marqueur n’ont pas d’autres effets phénotypiques), insensible au milieu (le génotype peut être inféré a partir du phénotype quel que soit le milieu) (De vienne, 1998). III.5. Marqueurs génétiques moléculaires Les marqueurs moléculaires correspondent à des différences nucléotidiques existant au niveau de la molécule d’ADN (d’où le terme moléculaire), des techniques de biologie moléculaire permettent de révéler ce polymorphisme de séquences. Ces différences entre allèles peuvent correspondre à des mutations ponctuelles (substitutions, insertion, délétion), des réarrangements chromosomiques, ou des mutations silencieuses (sans effet sur l’expression du locus), comme elles peuvent se trouver dans des régions codantes ou non codantes. Les possibles variations tissulaires temporelles ou environnementales de l’expression des séquences sont sans effet sur leur détectabilité. Elles sont en majorité sans effet phénotypique (Samouelian et al., 2009). Les caractères moléculaires sont de bons marqueurs génétiques : ils révèlent directement la nature génétique de l’information. Ceci les différencie des caractères morphologiques, physiologiques et plus généralement de tous les caractères phénotypiques, dus à une addition d’effets génétiques et non-génétiques. Cet aspect génétique leur confère un avantage du point de vue de la reconstruction de la phylogénie, par rapport aux caractères classiques utilisés en systématique. III.5.1. Les différents types de marqueurs moléculaires Il existe plusieurs types de marqueurs que l’on peut classer en fonction du polymorphisme qu’ils détectent. Certaines techniques ont l’avantage de révéler de nombreux fragments simultanément, ce sont des techniques de révélation en « en masse » de polymorphisme. Il existe aussi des stratégies permettant de détecter du polymorphisme de façon individuelle. Elles nécessitent une certaine connaissance de la séquence d’ADN, comme pour la fabrication des sondes RFLP. 25 Chapitre III Marqueurs moléculaires Les marqueurs moléculaires se divisent en deux catégories, indépendamment de la technique utilisée, les marqueurs dominants et les marqueurs codominants (Falque et Santoni, 2004). III.5.2. Marqueurs dominants révélés en masse (marqueurs anonymes) Les marqueurs révélés en masse sont très utilisés puisque ils permettent de découvrir de nombreux locus sans nécessiter au préalable de connaissance concernant la séquence du génome. De plus, ils sont faciles et rapides a mettre en œuvre. Outre les marqueurs AFLP (Amplifed Fragment Length Polymorphism), basés sur le polymorphisme de position de sites de restriction d’enzymes (Colwyn et al., 1995), les plus utilisées sont les marqueurs RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), sont basés sur l’amplification PCR à partir d’une amorce arbitraire, révélant ainsi un polymorphisme de séquence (Williams , et al., 1990 ; Vroh Bi et al., 1997). Les marqueurs RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) peuvent détecter un polymorphisme de séquence lié à l’emplacement de sites de restriction et ils nécessitent des techniques d’hybridation de sondes (Bodstein et al., 1980). III.5.3. Marqueurs codominants révélés individuellement Les marqueurs RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) peuvent détecter un polymorphisme de séquence lié à l’emplacement de sites de restriction et ils nécessitent des techniques d’hybridations de sondes (Bodstein et al., 1980). Alors que les marqueurs SSR (Short Sequence Repeat) renferment les deux catégories de marqueurs, selon la technique utilisée pour leur révélation. Un autre type de marqueur appelé SNP (single Nucleotide Polymorphisme) vient d’être mis en point et permet de rechercher un polymorphisme d’un seul nucléotide. III.5.4. Marqueurs révèles par la technique PCR Le développement de la technique « réaction chaine polymérase » ou PCR offre l’avantage d’analyser les marqueurs moléculaires en un temps court tout en utilisant des concentrations faibles d’ADN. Les marqueurs basés sur la technique PCR tendent a remplacer les systèmes classiques (les marqueurs morphologiques, isoenzymes et RFLP). Parmi les marqueurs moléculaires qui peuvent être révélés par la technique PCR, on note les SSR ou bien les microsatellites qui font l’objet de ce travail. 26 Chapitre III Marqueurs moléculaires III.6. Les principales sources de marqueurs moléculaires III.6.1. Critères de classification Sur le plan moléculaire, on peut classer le polymorphisme en trois catégories : Le polymorphisme de séquence, d’insertion-délétion, et de nombre d’unités de répétitions dans les régions répétés (De vienne, 1998)(Tableau 04). Tableau 04 : Classification des techniques de marquage moléculaire En dehors du cas particulier des ADN répétés (colonne de droite), il n’y a pas de technique spécifique pour révéler le polymorphisme d’insertion-délétion : celui-ci est mis en évidence par les techniques de révélation des différences de séquences. Lorsqu’un polymorphisme est observé, on ne peut donc savoir quelle est son origine sans expériences complémentaires. Sur le plan génétique, cette ambiguïté n’a aucune importance, l’essentiel étant d’avoir accès à des locus polymorphes, quelle que soit l’origine de ce polymorphisme. 27 Chapitre III Marqueurs moléculaires III.6.2. Les marqueurs RFLP Les marqueurs RFLP ou polymorphisme de longueur des fragments de restriction constituent des marqueurs moléculaires basés sur les techniques d’hybridation. Les RFLP sont les premiers marqueurs moléculaires développés et ont été utilisés en 1980 dans la construction de la carte génétique humaine (Bostein et al., 1980). Quelques années plus tard, ces marqueurs sont adoptés pour la cartographie du génome végétal (Helentjaris et al., 1986) et particulièrement celui du blé Triticum aestivum (Chao et al., 1989 ; Nelson et al., 1995). Cette technique à pour base l’utilisation des enzymes de restriction (endonucléase) sur des ADN en vue de détecter des séquences courtes spécifiques. Les fragments d’ADN obtenus sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose et ensuite transférés sur une membrane selon la procédure de southern blot. La taille des fragments est déterminée par hybridation des membranes avec des sondes (fragment d’ADN) marquées. Les sondes peuvent être des séquences d’ADN courtes et simples, de faibles copies d’ADN génomique ou encore des clones d’ADN complémentaire. Les mutations dans le génome entraînant la modification de certains sites de restriction d’où la génération de différents profils de restriction entre différents échantillon. Chaque fragment de taille différent engendré est considéré comme allèle et peut être utilisé en analyse génétique. III.6.3. Les marqueurs RADP L’amplification des ADN par des marqueurs RADP ou Random amplified polymorphism DNA (Williams et al., 1990 ; Welsh et Mac Clelland, 1991) constitue l’amplification de séquences sélectionnées au hasard dans le génome par l’utilisation d’amorces non spécifiques. Sa principale variante consiste a utiliser comme amorce un seul oligonucléotide d’une dizaine de bases qui permet d’amplifier par PCR un ou plusieurs segments d’ADN de l’échantillon. Chaque bande de l’amplifiât correspond à l’existence sur chacun des brins d’ADN d’un motif complémentaire à l’amorce. Sur le plan génétique, cette technique permet de révéler un polymorphisme de présence /absence. Ainsi pour un locus donné, il a ou il n’y a pas d’amplification du fragment. Dans le domaine végétal la technique RADP se caractérise par rapport à d’autres techniques (Mini satellites, SSR, RFLP, AFLP…..etc) par sa grande simplicité, rapidité de 28 Chapitre III Marqueurs moléculaires manipulation et la nécessité d’une faible quantité d’ADN, néanmoins les RADP présentent l’inconvénient d’être faiblement reproductibles. Néanmoins, les marqueurs RADP permettent de générer un taux élevé de polymorphisme qui a été largement utilisé chez les populations (Chalmers et al., 1992) et espèces comme le haricot, le pois et le pois chiche (Nesbitt et al., 1995 ; Weder et al., 2005). Ces marqueurs ont aussi contribué chez les plantes à la construction de plusieurs cartes génétiques (Reiter et al., 1992), à l’identification des cultivars (Nybom, 1994) et aux études phylogénétiques chez plusieurs espèces comme le palmier dattier et le blé (Gupta et al., 2000). III.6.4. Les marqueurs ISSR Les ISSR ou Inter Simple Sequence Repeat sont une variante de la PCR. Cette technique exploite l’abondance aléatoire des SSR dans le génome des plantes. Les SSR étant des séquences répétés en tandem des motifs mono-, di, tri- ou tetranucléotidique générant un système de marqueurs multi locus très intéressant qui permet d’exploiter la distribution abondante et aléatoire des SSRs dans le génome des plantes. L’intérêt de cette technique est qu’elle ne nécessite aucune connaissance préalable de la séquence utilisée. Cependant cette technique a connu plusieurs variations dans sa méthodologie avec l’utilisation des gels d’acrylamides ou agarose et la révélation au nitrate d’argent ou au bromure d’ethidium. Les marqueurs ISSR ont été largement utilisés pour les analyses du polymorphisme génétique au niveau intra- et inter- spécifiques chez plusieurs espèces, citons le cas du maïs (Kantety et al., 1995), du riz (Joshi et al., 2000) de la banane (Godwin., et al., 1997), la pomme de terre (Huang et Sun, 2001) du sorgho (Yang et al., 1996) et du lupin (Talhinhas et al., 2003). Ces marqueurs ont contribué à l’évaluation de la diversité génétique chez le genre Lupinus et ont permis une séparation claire des espèces du nouveau et de l’ancien monde. III.6.5. les marqueurs AFLP La technique AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism) est une variante de la PCR développé par Vos et ces collaborateurs en 1995. Cette technique est basée sur la détection par des amplifications sélectives de fragments d’ADN génomique digérés. Les ADN génomiques sont doublement digérés par des endonucléases et les fragments obtenus sont sujets à une ligation avec des adaptateurs spécifiques. Les produits de la ligation sont ensuite 29 Chapitre III Marqueurs moléculaires amplifiés sélectivement moyennant des amorces complémentaires aux adaptateurs utilisés. Les produits de la PCR sont séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturé et révélés par radiographie ou bien avec le nitrate d’argent. Ces marqueurs se sont révélés très informatifs et ont permis de révéler jusqu’à 16 fois plus de loci que les marqueurs RFLP. Cette technique a été largement utilisée pour la détection du polymorphisme génétique et la détermination des liaisons en analysant des individus de populations isolées. Les AFLP ont été largement utilisés dans l’étude de plusieurs plantes cultivées, comme le cas de l’orge (Becker et al., 1995 ; Qi et al., 1998 ; Shan et al., 1999), le riz (Mackill et al., 1996)…etc. Les marqueurs AFLP ont contribué à l’étude de la diversité génétique chez plusieurs espèces de tournesol (Ebrahimi, 2008). Ces marqueurs ont permis de révéler quatre fois plus de polymorphisme que les marqueurs RAPD et ISSR et aussi de séparer les espèces du nouveau monde et ceux de l’ancien monde (Talhinhas et al., 2003). Les marqueurs AFLP ont été aussi utilisés dans les études de relations phylogénétiques entre deux espèces de lupin L.lupinus et L.cosentinii et les résultats obtenus suggèrent que cette technique est très efficace pour la caractérisation du germplasme de lupin (Qi et al ., 1998). III.6.6. Les marqueurs SNP Les marqueurs SNP (Single Nucleotide Polymorphism) sont une source importante de polymorphisme de l’ADN. Le changement d’un nucléotide par un autre est un processus biallélique codominant. Ceci peut être un processus synonyme n’entraînant pas de changement de l’acide aminé, ou encore non synonyme entraînant la substitution d’un acide aminé par autre. Le changement au niveau d’un nucléotide peut aussi provoquer la création/abolition d’un site d’épissage ou encore un stop précoce (mutation non sens). Chez les plantes, les SNP sont des marqueurs génétiques utilisés dans plusieurs études de populations, dans le marquage de germplasme, dans la cartographie de gènes et dans les associations génotype/phénotype (Giancola et al., 2006 ; Brunel et al., 2009). Chez les plantes, le maïs est considéré très polymorphe avec une moyenne d’un SNP par 104 pb (Tenaillon et al., 2001) ; le blé présente un SNP tous les 200 pb (Ravel et al., 2004) ; le soja présente un SNP par 273 pb (Zhu et al., 2003) ; le colza présente un SNP présente un SNP tous les 600 pb (Fourmann et al., 2002) et chez les Arabidopsis thaliana, un 30 Chapitre III Marqueurs moléculaires SNP est rencontré tous les 336 pb (Schmid et al., 2003). Le niveau de variation dépend hautement du locus considéré et peut être encore plus important. III.6.7. Les marqueurs Microsatellites ou SSR Dans l’étude du polymorphisme de l’ADN, l’outil le plus récent est celui qui fait appel aux microsatellites ou bien STR (Short Tandem Repeats), SSR (Short Sequence Repeat). Ce sont des motifs simples, constitués de quelques paires de bases répétées en tandem, montrant une variation de leur longueur. Ces marqueurs sont dispersés de façon assez dense sur l’ensemble du génome des Procaryotes et Eucaryotes (Weber et al., 1990 ; Field et Wills, 1996). Ils permettent de détecter un polymorphisme de répétition, au sein du génome, de répétitions en tandem dont le motif de base est très court de 1 à 6 nucléotides. Ils sont très présents dans le génome des plantes et des animaux, ils peuvent être localisés dans les régions codantes et non codantes du génome (Toth et al., 2000). Les motifs de répétition des microsatellites sont crées par l’accumulation des mutations successive lors de la réplication, la recombinaison ou bien la réparation de l’ADN (Ingvarssan et al., 2008). Les microsatellites de 2 nucléotides sont répartis tous les 30 à 100 kb dans le génome des végétaux supérieurs (Peakell, et al., 1998), alors que les microsatellites de 4 nucléotides sont plutôt localisés au niveau des centromères et des télomères. La technique SSR se base sur l’amplification par PCR de l’ADN génomique moyennant des amorces spécifiques flanquant les séquences répétées. Les SSR se sont révélé des marqueurs moléculaires très utiles dans la sélection assistée par marqueurs, l’analyse de la diversité génétique et l’analyse de la structure génétique des populations chez plusieurs espèces (Gupta, 2000 ; Budak et al., 2003). Chez les légumineuses, des marqueurs microsatellites ont été massivement mis au point chez Medicago truncatula et Lotus japonicus, deux espèces modèles des légumineuses, en utilisant des données de séquences produites dans des programmes de séquençages d’EST (fragment des gènes exprimés) ou d’ADN génomique. Dans le genre Medicago le nombre de marqueurs microsatellites disponibles dépasse le millier (Diwan et al., 2000 ; BaquerizoAudiot et al., 2001 ; Eujayl et al., 2004 ; Chu et al., 2009). Les marqueurs RFLP, nécessite une certaine technicité et un coût élevé, et limitent le nombre d’individus analysés, alors que les 31 microsatellites permettent d’analyser des Chapitre III Marqueurs moléculaires populations dix fois plus grandes que celles couramment utilisées avec les RFLP (Ribaut et al., 1997). Ces marqueurs ont été très utiles pour des recherches concernant la diversité génétique chez l’orge (Struss et Plieske, 1998), la construction de cartes génétiques chez le pois chiche (Hüttel et al., 1999), le blé (Roder et al., 1998), le pommier ( Maliepaard et al., 1997), la canne à sucre (Rae et al., 2000), le riz (Temnykh et al., 2000), le kiwi (Testolin et al., 2001) et le tournesol (Tang et al., 2002, 2003b ; Mokrani et al., 2002 ; Yu et al., 2002, 2003; Micic et al., 2005 ; Poormohammad et al., 2007). On les a également utilisé dans l’identification de marqueurs liés à des gènes de résistance, comme le gène Yr15, conférant la résistance à la rouille chez le blé (Chargué et al., 1999)(Tableau 05). Tableau 05 : Avantages et inconvénients des marqueurs SSR Marqueur Avantages Inconvénients SSR - les microsatellites sont des marqueurs - la répartition des microsatellites est codominants. assez lourde car il faut cribler une - Ils sont très largement utilisés. banque génomique enrichie avec une - Il y a une grande fréquence de SSR dans le sonde microsatellite, séquencer les clones génome. positifs, synthétiser les - Les microsatellites sont bien répartis à travers amorces oligonucléotidiques et tester les tout le génome. paires d’amorces échantillon d’individus. - Ils sont reproductibles. - Les microsatellites sont faciles à manipuler. - On observe un polymorphisme élevé de SSR dans la population humaine 32 dans un Chapitre III Marqueurs moléculaires III.7. La synthénie entre espèces On l’analyse à deux niveaux : la macrosynthènie correspond à la conservation de l’ordre des marqueurs et des gènes le long des chromosomes alors que la microsynthènie analyse la conservation de la séquence nucléotidique, à une échelle plus courte (Salse et al., 2004). Il existe une forte synthénie (conservation de l’ordre d’alignement des marqueurs ou des séquences le long des chromosomes) entre le génome de M.truncatula et de plusieurs autres légumineuses, notamment de M.sativa et du pois (Zhu et al., 2005 ; Aubert et al., 2006). Les différentes séquences des ESTs des BACs de M.truncatula sont largement exploitées dans la recherche, la découverte des marqueurs moléculaires et l’établissement des cartes de linkage entre différents espèces de légumineuses. Comme par exemple, le cas des SSRs (simple séquence de répétition en tandem) ou microsatellites de Medicago truncatula (Dale Young et Udvardi, 2009). Le développement des marqueurs génétique SSR (microsatellites) chez Medicago truncatula et après examen de profil des microsatellites a permis d’identifier les microsatellites parfaits dans le génome de Medicago truncatula. Il à été comparé à celui de deux catégories de plantes les dicotylédones et les monocotylédones (Lotus japonicus, Glycine max , Arabidopsis thaliana, Oryza sativa). La comparaison de la fréquence des motifs répétés et de leur taille chez chaque espèce, le long de leur génome dans les séquences transcrites et non-transcrites a montré qu’il existe 16 catégorie de motifs répétés (mononucléotide, dinucléotide et trinucléotide). D’après cette étude le motif le plus abondant est celui du dinucléotide (AT) notamment dans les régions génomiques (séquences génomiques) si on compare entre ces cinq espèces. Les résultats démontrent une répartition des motifs répétés (AT)n et (AG)n entre les régions codantes et non codantes, alors que les motifs de di nucléotides (GC)n sont rarement détectés dans les génomes de toutes les espèces analysées (Tableau 06, 07). 33 Chapitre III Marqueurs moléculaires Tableau 06 : Fréquences individuelles des microsatellites (le nombre de motif de répétition par un million de paires de bases) dans les séquences génomiques des espèces de plantes (Mun et al., 2006) Motif répété Séquences génomiques M.truncatula G.max L.japonicus A.thaliana A/T 18,40 05,80 01,00 11,50 00,80 C/G 01,30 00,30 00,10 00,10 01,50 AT/TA 27,20 52,90 15,70 16,50 18,40 AG/GA/CT/TC 08,10 06,60 07,00 04,10 09,10 AC/CA/TG/GT 02,20 03,40 01,30 00,80 02,10 GC/CG 00,00 00,10 00,00 00,00 00,10 AAT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT 05,10 39,30 03,70 00,70 01,70 AAG/AGA/GAA/CTT/TTC/TCT 02,00 01,50 03,30 04,60 01,50 AAC/ACA/CAA/GTT/TTG/TGT 00,90 ,1,10 00,90 01,20 00,30 ATG/TGA/GAT/CTA/ATC/TCA 00,70 00,70 01,10 01,60 00,40 AGT/GTA/TAG/ACT/CTA/TAC 00,10 00,00 00,00 00,10 00,20 AGG/GGA/GAG/CCT/CTC/TCC 00,40 00,40 00,70 00,40 02,1000, AGC/CGAACG/GCT/CTG/TGC 00,10 00,00 00,10 00,10 10 ACG/CGA/GAC/CGT/GCT/TCG 00,10 00,00 00,00 00,00 00,90 ACC/CCA/CAC/GGT/GTG/TGG 00,20 00,00 01,60 00,30 00,70 GGC/GCG/CGG/GCC/CCG/CGC 00,00 00,00 00,00 00,00 05,0034, Sequence riche en AT 68,20 117,00 42,90, 47,10 90 Sequence riche en AT/GC 11,20 10,60 11,00 05,50 13,40 Sequence riche en GC 03,50 01,20 05,20 01,90 19,50 34 O.sativa Chapitre III Tableau Marqueurs moléculaires 07 : Fréquences individuelles des microsatellites (le nombre de motif de répétition par un million de paires de bases) dans les séquences ESTs des espèces de plantes (Mun et al., 2006) Motif répété Séquences EST M.truncatula G.max L.japonicus A.thaliana O.sativa A/T ---- --- --- --- -- C/G 00,70 00,80 00,00 01,30 01,70 AT/TA 02,40 07,00 01,70 02,50 02,10 AG/GA/CT/TC 13,60 12,50 18,50 05,30 07,40 AC/CA/TG/GT 00,60 00,60 00,10 00,30 00,50 GC/CG 00,00 00,00 00,00 00,00 00,10 AAT/ATA/TAA/ATT/TTA/TAT 01,80 01,70 00,00 00,20 00,50 AAG/AGA/GAA/CTT/TTC/TCT 06,80 02,90 14,00 05,80 02,80 AAC/ACA/CAA/GTT/TTG/TGT 00,90 02,30 03,90 01,30 00,20 ATG/TGA/GAT/CTA/ATC/TCA 01,60 02,00 03,40 03,50 00,40 AGT/GTA/TAG/ACT/CTA/TAC 00,10 00,20 00,50 00,10 00,10 AGG/GGA/GAG/CCT/CTC/TCC 00,30 00,40 05,10 00,40 03,80 AGC/CGAACG/GCT/CTG/TGC 00,60 00,70 00,60 00,30 01,90 ACG/CGA/GAC/CGT/GCT/TCG 00,00 00,30 00,40 00,00 01,50 ACC/CCA/CAC/GGT/GTG/TGG 00,50 01,30 07,00 00,30 01,20 GGC/GCG/CGG/GCC/CCG/CGC 00,00 00,60 00,60 00,00 11,70 Séquence riche en AT 25,80 23,20 35,90 17,00 11,80 Séquence riche en AT/GC 17,50 15,90 29,30 05,90 11,20 Sequence riche en GC 03,10 07,50 19,30 02,90 31,30 35 Chapitre III Marqueurs moléculaires III.8. Technique PCR-SSR Grâce à la technique PCR et l’automatisation de cette dernière, l’utilisation de ces marqueurs SSR a considérablement augmenté, ainsi que leur détection (Schlotterer, 2004)(Figure 05). Figure 05 : La technique d’amplification (PCR) (Moullet et al., 2009) La plupart du temps, des polymorphismes de séquence sont révélés au sein d’un fragment d’ADN amplifié par PCR à partir de l’ADN génomique total de l’individu à analyser, à l’aide d’une paire d’amorces spécifiques des extrémités de la région à étudier. 36 Chapitre III Marqueurs moléculaires La PCR, est basée sur l’utilisation d’une enzyme l’ADN polymérase thermorésistante. Un très grand nombre de copies d’un fragment d’ADN est synthétisé si l’enzyme dispose de petits morceaux d’ADN simple brin (amorces) complémentaires des deux extrémités de la séquence que l’on veut copier. La réaction est rendue cyclique grâce à des variations de température, et chaque brin néoformé peut servir de matrice pour synthèse au cycle suivant. L’amplification de cette séquence est donc exponentielle. Ces éléments sont uniformément répartis sur l’ensemble du génome d’une espèce et présentent un taux de polymorphisme élevé. Ce polymorphisme repose sur la variation du nombre d’unités de répétitions constituant le microsatellite. Les séquences bordent ces éléments répétées permettent de définir les amorces pour l’amplification par PCR. La taille des produits amplifiés est estimée par électrophorèse sur gel d’agarose ou d’acrylamide (Figure 06). Figure 06 : La détection d’un polymorphisme de répétition (SSR) (Moullet et al., 2009) 37 Chapitre III Marqueurs moléculaires III.9. Les applications des marqueurs Microsatellites (SSR) chez les plantes La figure (07) représente les différentes applications des marqueurs microsatellites (SSR) chez les plantes. Caractérisation et annotation des gènes Séquences intégrales des clones Cdna Séquençages des ESTs Singletons Les tentatives des consensi Unigenes Banque de données publiques NCBI et EMBL Information disponible sur les séquences des gènes et les ESTs Exploitation de base de données identification des séquences SSR (ESTs et gènes ) Amplification des Loci (gènes) Applications Analyses des fonctions génomiques Et des QTLs (taging gènes ) Cartographie et synthénie entre génomes Analyses de la diversité et comparaison des cartes génétiques Cartographie des génomes Figure 07 : Développement et application des microsatellites SSR (Varshneyet al., 2005) 38 Chapitre III Marqueurs moléculaires III.9.1. Les cartes génétiques et les diversités fonctionnelles Les marqueurs SSR développés à partir des banques génomiques, peuvent appartenir à la région transcrite ou à la région non transcrite du génome, en revanche, grâce au marqueurs microsatellites on peut identifier certaines fonctions putatives de certains gènes et aussi détecter l’emplacement de ces gènes sur la carte génomique et cela par la localisation des motifs répétés (Anderson et Lubberstedt, 2003), les EST-SSR sont considérés comme une classe de marqueurs qui contribuent dans la sélection directe des allèles (Sorrels et al., 1997). Par exemple, le gène DAG 1 gène qui contrôle la germination des graines chez l’Arabidopsis thaliana (Papi et al., 1997), et deux gènes (ppd) responsable du photopériodisme chez le blé par l’utilisation des marqueurs EST-SSR (Kyu et al., 2004), finalement, par ces marqueurs SSR on peut facilement établir des cartes des gènes candidats et leur alignement sur leur génome et à travers des espèces relativement éloignées (Varshney, et al., 2005). chez le riz la recherche de variation du nombre de répétitions de type GA et CT dans la région 5 UTR, a permis la détection du gène waxy qui présente une corrélation avec l’amylose (Rajendrakumar et al., 2007 ). Chez le maïz, le gène responsable de l’augmentation de la régulation et la fertilisation a pu être détecté par un marqueur SSR (motif de répétition (CCG)n) (Dresselhaus et al., 1999). III.9.2. Comparaison et cartographie entre les génomes des plantes L’atout le plus important pour des marqueurs génétiques SSR est que ces derniers sont transmissibles entre espèces relativement éloignées ; la transférabilité des marqueurs entre espèces et genres a été démontrée dans plusieurs études. Les marqueurs SSR sont très utiles dans le développement de la conservation et l’analyse des gènes orthologues (deux séquences homologues de deux espèces différentes sont orthologues si elles descendent d’une séquence unique présente dans le dernier ancêtre commun aux deux espèces) pour la sélection. Par exemple, un ensemble de 12 EST-SSR chez l’orge ont été identifiés et il existe une homologie avec les ESTs de quatre espèces de monocotylédones (blé, maïs, sorgho et riz) et deux autres genres de dicotylédones (Arabidopsis et le Medicago)( Varshney, et al., 2005). Chez le Medicago truncatula, 96 % des amorces peuvent se retrouver chez 06 espèces de Medicago (Saha et al ., 2004). Au sein du genre Medicago, pour toutes les cartes portant des marqueurs communs, l’ordre des marqueurs le long des chromosomes est très conservé. Ce fort niveau de synthénie 39 Chapitre III Marqueurs moléculaires a été surtout constaté entre M.truncatula et la luzerne (M.sativa)(Juliet et al., 2003 ; Choi et al., 2004a)(Figure 08 ). Figure 08 : Carte de comparaison entre deux espèces du genre Medicago truncatula et Medicago sativa (Julier et Barre, 2005) Pour chaque groupe de liaison, numéroté de 1 à 8 le chromosome de gauche appartient à M.truncatula et celui de droite à la luzerne (M.sativa). 40 Chapitre III Marqueurs moléculaires III.10. Sélection assistée par marqueurs A partir de la cartographie de gènes ou de QTL, on peut définir le génotype « idéal » celui qui aura le maximum de gènes ou de segments chromosomiques favorables. Les marqueurs peuvent alors être utilisés pour revenir dans un même génotype (Gallais, 1997). Le principe de la sélection assistée par marqueurs comparé à celui d’autres types de sélection est le suivant : - Il n’y a pas à se soucier de l’appréciation de la valeur il suffit de « lire » les marqueurs portés par les plantes pour en déterminer la valeur. - Les recombinaisons entre gènes non homologues peuvent être sélectionnées dans la génération F2 de croisement entre parents complémentaires ; les génotypes transgressant (cumulant les gènes favorables de deux parents) peuvent être identifiés et sélectionnés pour être à nouveau croisés avec d’autres génotypes. - Le contournement de corrélations génétiques négatives, les QTLs détectés permettent de « disséquer » finement certains caractères complexes et de faire la part entre les gènes pléiotropes et ceux qui ne le sont pas. - L’introgrèssion de gènes assistée par marqueurs, permet un gain de temps par rapport aux méthodes de rétrocroisement. 41 Chapitre III Marqueurs moléculaires 42 Chapitre IV Matériels et Méthodes IV. Matériels et méthodes IV.1. Matériel végétal Le matériel végétal étudié correspond à différentes espèces du genre Medicago (chaque espèce renferme plusieurs populations ou écotypes) (Tableau 08). Le matériel végétal est semé dans des pots sous serre (05 plants par écotypes). Les feuilles coupées au niveau de la base du limbe, sont pesées immédiatement (poids frais). Tableau 08 : Ecotypes étudiés et leur site d’origine (Source ITGC) Espèces Ecotypes Pays d’origine M.aculeata Acu 150 Algérie Acu 209 Algerie Acu 15679 Australie du sud Acu 45 Algérie Acu 80 Syrie Cil 252 -- Cil 255 -- Cil 123 Algérie Cil 126 Algérie Cil 124 -- Tr 26 Algérie Tr 62 Algérie Tr 210 Algérie Pol 213 Algérie Pol 42 Algérie Pol 57 Algérie Pol 54 Algérie Pol 136 Algérie M.ciliaris M.truncatula M.polymorpha Medics Ecotype spontané Algérie M.sativa Magali France M.sativa Mecedes France 42 Chapitre IV Matériels et Méthodes IV. 2. Le choix des marqueurs moléculaires utilisés D’après une recherche bibliographique, la plupart de ces marqueurs SSR (microsatellites) choisis ont fait l’objet de plusieurs publications (Julier et al., 2003 ; Julier et Barre, 2005 ; Badri et al., 2008). Les marqueurs SSR proviennent, en leur grande majorité, des banques d’ESTs (Espressed Sequence Tags), c'est-à-dire que les séquences qu’elles contiennent sont des séquences du génome exprimée et donc elles correspondent à des séquences codantes. Plusieurs critères ont guidé le choix des marqueurs (Tableau 09.10). La répartition des marqueurs sur les 08 groupes de liaison de M.truncatula. La localisation du marqueur dans une séquence exprimée ou non exprimée du génome. La variation du motif répété du microsatellite : di et tri nucléotidique. Le polymorphisme pour les lignées de référence. La bonne résolution sur gels d’agarose. 43 Chapitre IV Matériels et Méthodes Tableau 09 : Caractéristiques des marqueurs SSRs utilisés pour la recherche d’un polymorphisme chez les plantes (Medicago) Locus marqueur Séquence des primer (5’—3’) T(C°) LG Motif de répétition MT13-MTP66B L : GATGAGAAAATGAAAAGAAC R : CAAAAACTCACTCTAACACAC 50C° 01 (GA)2GG(GA) MTIC 451 L : GGACAAAATTGGAAGAAAAA R : AATTACGTTTGTTTGGATGC L : ATCGGCGTCTCAGATTGATT R : CGCCATATCCAAATCCAAAT L : TCCCCTTAAGCTTCACTCTTTTC R : CATTGGTGGACGAGGTCTCT L : AAGCTGTATTTCTGATCCAG R : CGGGTATTCCTCTTCCTCCA L : CCCTGGGTTTTTGATCCAG R : GGTCATACGAGCTCCTCCAT 55C° 02 (TC)11 129 55C° 02 (AG)6 123 55C° 03 (CTT)5 146 55C° 03 (AG)7 121 55C° 04 (CTT)8 124 L : GGGTTTTTGATCCAGATCTT R : AAGGTGGTCATACGAGCTCC 55C° 04 (TTC)8 125 MTIC 365 MTIC 338 MTIC 131 MTIC 332 ATPase 456 44 Taille attendue 132 N° : origine (espèce) Montpellier Medicago truncatula Toulouse Medicago truncatula Toulouse Medicago truncatula Toulouse Medicago truncatula Toulouse Medicago truncatula Toulouse Medicago truncatula Montpellier Medicago truncatula Chapitre IV Matériels et Méthodes Tableau 10 : Caractéristiques des marqueurs SSRs utilisés pour la recherche d’un polymorphisme chez les plantes (Medicago) Locus marqueur Séquence des primer (5’—3’) T(C°) LG Motif de répétition MTIC 079 L : AAAATCCAAAGCCCTATCACA R : AGCGTGAGATTTTTCCATCG 55C° 05 (TC)10 B14BO3 L : GCTTGTTCTTCTTCAAGCTC R : ACCTGACTTGTGTTTTATGC 55C° 05 (CA)9 151 Toulouse Medicago truncatula MTIC 134 L : GCAGTTCGCTGAGGGACTTG R : CAATTAGAGTCTACAGCCAAAAATC L : TCCGATCTTGCGTCCTAACT R : CCATTGCGGTGGCTACTCT L : TGGAATTTGGGATATAGGAA R : GGCCATAAGAACTTCCACTT L : CACTTTCCACACTCAAACCA R : GAGAGGATTTCGGTGATGT 60C° 06 (AG)9 176 55C° ? (GAA)8 134 50C° 07 (AG)5 163 55C° 07 (TC)11 132 Toulouse Medicago truncatula Toulouse Medicago truncatula Toulouse Medicago truncatula Toulouse Medicago truncatula Enod20 L : CGAACTTCGAATTACCAAAGTC R : TTGAGTAGCTTTTGGGTTGTC 55C° 08 (AAT)9 165 Toulouse Medicago truncatula MTIC 135 L : GCTGACTGGACGGATCTTGAG R : CCAAAGCATAAGCATTCATTCA 55C° 08 (AG)10 123 Toulouse Medicago truncatula MTIC 343 MTIC 432 MTIC 082 45 Taille attendue 117 Origine (espèce) Toulouse Medicago truncatula Chapitre IV Matériels et Méthodes IV.3. L’extraction de l’ADN L’extraction de l’ADN a été réalisée sur des jeunes feuilles de plantes d’écotypes d’espèces annuelles de genre Medicago. Plusieurs protocoles d’extraction d’ADN ont été utilisés afin d’optimiser les paramètres et conditions d’extraction, parmi ces protocoles : -la méthode au CTAB décrite par (Vroh Bi et al., 1996) issue d’un protocole de base de Murray et Thomson 1980 (Protocole 01 : P1) (voir annexe 01 ). -Protocole d’extraction utilisé pour Medicago truncatula décrit par le comité international de Medicago (www.medicago.org) (Protocole 02 : P2) (voir annexe 01). -Protocole de Medicago avec une légère modification (Protocole 03 : P3) (voir annexe 01). . - Kit d’extraction d’ADN (MO BIO Laboratoire)(Protocole 04 :P4)(voir annexe 01). IV.3.1. Quantification de l’ADN La concentration de l’ADN est déterminée par spectrophotométrie avec une DO à 260 nm, alors que pour la détection d’une éventuelle contamination protéique est effectué par une seconde mesure de DO à 280 est nécessaire. Un ADN pur doit avoir un rapport DO260/DO280 compris entre 1,8 et 2,0. Une valeur inférieure à 1.8 témoigne une contamination par des protéines, alors qu’une valeur supérieure à 2.0 témoigne une contamination par des sels. Dans les conditions standard, une unité de Do (260nm) d’ADN est égale à 50 ug /ml. IV.3.2. Qualité d’ADN : Test de sizing L’analyse du produit d’extraction est effectuée par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 % (la concentration est par apport à la taille des fragments d’ADN étudiés,) (10 ul d’ADN + 05ul bleu de bromophénol). Le tampon de migration utilisé est le TBE 1X (Tris/Hcl 0,089 M, EDTA Na2 2,5 M ; Acide borique 0,089 M, Ph 8.0). Le gel est ensuite visualisé sous illumination aux ultraviolets à une longueur d’onde de 360 nm après coloration au bromure d’éthidium (BET), à une concentration de 0.1mg/ml dans le gel d’agarose 2 %. 46 Chapitre IV Matériels et Méthodes IV.3.3. Dilution des ADN Pour réaliser les différentes amplifications, il faut que les échantillons (ADN) aient la même concentration. Pour cela une dilution a été effectuée pour une concentration finale de 50ng/ul. La majorité des échantillons d’ADN sont dilués dans un volume de 200ul. Les échantillons d’ADN dilués ont été conservés à – 20°C. IV.4 . Amplification in vitro de l’ADN par PCR IV.4.1. Principe Cette technique, a été mise au point en 1985 par K.Mullis. C’est une technique qui permet d’amplifier in vitro un segment d’ADN double brin, compris entre deux régions de séquences connues, en des millions de copies. L’amplification est assurée par la polymérase de bactérie thermophile des sources chaudes Thermus aquaticus (Taq polymérase), par un procédé d’extension de deux amorces oligonucléotidiques de synthèse de 20 à 25 nucléotides complémentaires des extrémités 3’ des deux brins d’ADN. Ces amorces encadrent la séquence à amplifier, l’une avec le brin sens et l’autre avec le brin antisens. Cette amplification comprend 03 phases : Une phase de dénaturation de l’ADN double brin à 95 °C. Elle permet de séparer les deux chaines complémentaires en ADN simple brin qui vont servir de modèle à la synthèse de nouveaux brins ; Une phase d’hybridation (55°C – 65°C) de ces chaines avec de courts segments d’ADN de 20 à 25 nucléotides. Ces derniers sont des oligonuléotides synthétiques, appelés amorces, qui encadrant la séquence cible en 3’. Et une phase d’élongation à 72 °C par l’ADN polymérase et les quatre desoxyribonucléotides triphosphate (dATP, dGTP, dCTP et dTTP), qui ajoutent à l’extrémité 3’OH de l’amorce appariée à la cible, les unités monomères complémentaires à celle de la séquence cible. Chaque amorce est ainsi allongée dans le sens 5’P vers 3’OH d’une séquence complémentaire du brin recopié. Ce processus aboutit à un doublement de la quantité d’ADN cible au bout d’un cycle. Alors que le cycle suivant, les brins néosynthétisés serviront eux-mêmes de matrice pour initier l’étape de polymérisation par l’ADN polymérase. La répétition du cycle permet 2 47 Chapitre IV Matériels et Méthodes une amplification exponentielle de la séquence génomique cible, soit une amplification théorique égale à 2n fois par génome haploïde ou n représente le nombre de cycles d’amplification effectués, alors que le rendement réel d’une réaction d’amplification de l’ADN est estimé a environ 70%. IV.4.2. Conditions d’amplification des microsatellites Dans cette étude, les conditions d’amplification des microsatellites (MTIC 432, MTIC 451, MTIC 365, MTIC 338, MTIC 332, B14B03, MTIC 343, MTIC 82, Enod20, MTIC 135, MTIC 131, MTIC 079, FMT13, MTIC 134) sont les suivantes: Les ADN génomiques (50ng) des écotypes étudiés ont été amplifiés chacun dans un mélange réactionnel d’un volume final de 10 ul(microlitre), composé de 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de chaque désoxynucléotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 0,2 uM de chaque amorce, 0,0625 U de Taq polymérase et enfin du tampon 1X de réaction de l’enzyme. Un tube « blanc »dépourvu d’ADN est nécessaire à chaque amplification, afin de s’assurer de l’absence de contamination. L’amplification a été réalisée dans un thermocycleur (TECHNE 312). Elle a été effectuée pour chaque microsatellite étudié selon le programme suivant : 1ére étape : 05 min à 94 °C (phase de dénaturation et servant à activer la taq) pendant un cycle ; 2eme étape : 35 cycles comprend : - 30 secondes à 94°C (phase de dénaturation) - 45 secondes à 55°C (phase d’hybridation) - 30secondes à 72°C (phase d’élongation) 3eme étape : une dernière élongation est réalisée pendant 6 min pour un cycle. Enfin, une étape de fin d’amplification à 20°C (Hold Temp) qui correspond à la température de conservation des produits d’amplification. Les conditions d’amplifications sont les même pour l’ensemble des amorces sauf pour le MTIC 079 (2 mM de Mgcl2), MTIC 134 la température d’hybridations ( Tm : 60°), FMT13 (Tm :50°). 48 Chapitre IV Matériels et Méthodes IV.4.3. Test d’amplification L’analyse du produit d’amplification est effectuée par électrophorèse sur gel d’agarose à 1.2 % (la concentration est par rapport à la taille des fragments d’ADN étudiés). Le tampon de migration utilisé est le TBE 1X (Tris/Hcl 0,089 M, EDTA Na2 2,5 M ; Acide borique 0,089 M, Ph 8.0). 08 ul de l’ADN amplifié de quelques échantillons, 02 ul de bleu de bromophénol comme indicateur de front sont déposés sur le gel d’agarose 1,2 %. Un marqueur de taille (DNA Ladder) approprié de poids moléculaire allant de 100 à 1500 pb a été aussi déposé dans le gel. Il permet d’évaluer la taille des fragments d’ADN amplifiés. La migration est effectuée sous une tension de 100 volts pendant 50 minutes. Le gel est ensuite visualisé sous illumination aux ultraviolets à une longueur d’onde de 360 nm après coloration au bromure d’éthidium (BET) à une concentration de 0.1mg/ml dans le gel d’agarose. 49 Chapitre IV Matériels et Méthodes 50 Chapitre IV Matériels et Méthodes 51 Chapitre IV Matériels et Méthodes 52 Chapitre V Résultats et interprétations V. Résultats et interprétations V. 1. Résultats d’extraction d’ADN La recherche d’un moyen plus efficace pour extraire de l’ADN de bonne qualité et avec un meilleur rendement a conduit à l’élaboration d’une gamme de protocoles. Les bases de l’extraction de l’ADN reste les mêmes, afin d’extraire un nombre plus élevé d’échantillon en même temps et obtenir un ADN propre et de bonne qualité et bien sûr le moins coûteux. C’est pour cette raison que nos premiers efforts ont porté sur la mise en point d’une technique d’extraction capable de donner un ADN pouvant être utilisé comme support pour une éventuelle amplification par PCR. De nombreux protocoles et des techniques d’extraction d’ADN ont été testés. Quatre protocoles d’extraction ont été testés pour évaluer celui qui permet d’obtenir un bon rendement et une bonne qualité et sans contamination par l’ARN et aussi les inhibiteurs de l’amplification par PCR. Par cette étude on a visé l’estimation et l’évaluation de plusieurs paramètres dont le poids du matériel végétal utilisé, la pureté d’ADN, la dilution et le cout de chaque protocole, la rapidité et bien sur l’amplification par PCR ; - Protocole d’extraction d’ADN selon la Méthode de CTAB (Bromure d’hexadécyltriméthylammonium) (Protocole 01 : P1). - Protocole de CTAB décrit par le comité international de Medicago (Protocole 02 : P2). - Protocole de CTAB décrit par le comité international (www.medicago.org) avec une légère modification (Protocole 03 : P3). - Protocole d’extraction d’ADN selon le Kit (Protocole 04 : P4). 50 de Medicago Chapitre V Résultats et interprétations Les extraits d’échantillons d’ADN obtenus après extraction par le protocole ou la méthode de CTAB ( Vroh Bi et al 1996) (Protocole P1) à partir d’un gramme de jeunes feuilles de plantes appartenant a des écotypes d’espèce du genre Medicago (AC 209, écotype spontané) donnent un extrait peu clair. A la fin de l’extraction on obtient un culot blanchâtre qui peut être facilement dissous soit dans un tampon TE soit dans l’eau ultra pure. Ces extraits d’échantillons d’ADN ont été testés visuellement sous rayons ultraviolets après leur migration sur minigel d’agarose 2 %. Une bande de faible intensité est observée dans les puits (puits 1, 2, 4, 5). Cependant on remarque qu’il n y a pas de trainée, ni de bande en flamme de feu qui signifie que les extraits ne sont pas contaminés par l’ARN et aussi les composés polyphénoliques. Par la faible intensité da la bande on déduit que il y a une faible quantité d’ADN, donc ce protocole bien qu’il donne des extraits purs et de bonne qualité, la quantité d’ADN obtenue est faible. (Figure 09). - 0 1 02 03 04 05 06 07 08 + Figure 09 : Migration d’extraits d’ADN obtenus par différentes méthodes sur gel d’agarose. - P 1 : Puits 01, 02, 04, 05 -P 2 : Puits 03 -P 3 : Puits 06,07 - P 4 : Puits 08 Les extraits d’échantillons d’ADN (écotypes spontanés) obtenus après extraction par le protocole 02 de CTAB publié (www.medicago.org) par le comité international de Medicago à partir d’un gramme de jeunes feuilles de plantes appartenant à un écotype d’espèce du genre Medicago (écotype spontané) donnent un extrait clair. Après migration de ces extraits d’échantillons d’ADN sur un mini gel d’agarose 2%, on observe une bande d’intensité moyenne (puits 3), pas de trainée ou bien une bande en flamme de feu 51 Chapitre V Résultats et interprétations D’après l’intensité de la bande on déduit qu’il y a une quantité d’ADN satisfaisante, et des extraits purs et de bonne qualité. Les extraits d’échantillons d’ADN obtenus après extraction par le Protocole P3 à partir d’un gramme de jeunes feuilles de plantes appartenant à des écotypes d’espèce du genre Medicago (Cil 252, écotype spontané) donne un extrait clair. A la fin de l’extraction on obtient un culot blanchâtre qui peut être facilement dissous soit dans un tampon TE soit dans l’eau ultra pure. Le résultat montre une bande avec une forte intensité (puits 6, 7), pas de trainée ou de bande en flamme de feu. Une bande de forte intensité et de l’ADN qui reste dans le puits de migration signifie que la quantité obtenue par ce protocole est très importante. Les extraits d’échantillons d’ADN obtenus après extraction par le Kit MO Bio (Protocole P4) à partir de 50 mg de jeunes feuilles de plantes appartenant a un écotype d’espèce du genre Medicago (écotype spontané) donne un extrait très clair. A la fin du protocole, on obtient une solution 50 ul qui contiennent l’extrait d’ADN. Le résultat montre une bande avec une importante intensité (puits 08), pas de trainée, ni de bande en flamme de feu Une bande de forte intensité et de l’ADN qui reste dans le puits de migration signifie que la quantité obtenue par ce protocole est très importante. 52 Chapitre V Résultats et interprétations V.1.1. Résultat de l’extraction d’ADN selon le poids du matériel végétal Le protocole P3 choisi il est utilisé pour l’extraction de l’ADN. Cependant il est nécessaire d’opter pour un poids du matériel végétal afin de choisir quel est le poids idéal de matériel végétal, à la fois qui permet d’avoir une quantité suffisante d’ADN et en même temps d’avoir cette quantité à un stade précoce du développement de la plante. Plusieurs mesures on été effectuées sur des feuilles de plantes appartenant à plusieurs écotypes d’espèces du genre Medicago (Tableau 11). Tableau 11 : Les écotypes utilisés pour la quantification d’ADN selon le poids du matériel végétal Ecotypes Poids du matériel végétal Acu 209 100 mg Acu 209 200 mg Acu 80 300 mg Acu 80 400 mg Cil 252 500 mg Cil 252 600 mg Cil 255 700 mg Cil 255 800 mg Tr 26 900 mg Tr 26 01g 53 Chapitre V Résultats et interprétations Les extraits d’échantillons d’ADN obtenus, sont mis en migration sur un minigel d’agarose 2 %. Les extraits donnent différents profils de migration des puits (01, 02, 03) qui correspondent a un poids de 100 mg, 200 mg, 300 mg de matériel végétal donne une bande d’une très forte intensité avec absence de trainée (pas de contamination ou dégradation d’ADN) (Figure 10). Le puit 04 qui correspond à un poids de 400 mg de matériel végétal donne une fine bande d’une faible intensité par rapport aux autres bandes mais on observe qu’il y a absence de trainée, alors que le puit 05 qui correspond à un poids de 500 mg de matériel végétal donne un profil de migration similaire à celui des trois premiers puits. - 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 + Figure 10 : Migration d’ADN extrait obtenus par la méthode du Medicago modifié selon le poids de matériel végétal sur gel d’agarose. - P 3+: Medicago modifié, Puits 01, 02 (Acu 209), Puits 03,04 (Acu 80), Puits 05,06 (Cil 252), Puits 07, 08 (Cil 255), Puits 09, 10 (Tru 26). Les puits (06, 07) qui correspondent à un poids de 600 mg et 700 mg de matériel végétal donne un profil presque identique avec une bande de forte intensité mais on observe qu’il y a des trainées ce qui signifie qu’il y a soit une contamination ou soit une dégradation d’ADN. 54 Chapitre V Résultats et interprétations Pour les trois derniers puits (08, 09, 10) qui correspondent à un poids de 700 mg, 800 mg et 01 gramme on note un profil identique avec deux bandes de migration de forte intensité avec présence de trainé qui signifie qu’il y a eu dégradation d’ADN. V.1.2. Résultat de l’extraction d’ADN par le protocole de Medicago modifié Les extraits d’échantillons d’ADN obtenus après extraction par le protocole de Medicago modifié (Protocole P3) à partir de 500 mg de jeunes feuilles de plantes appartenant aux différents écotypes d’espèces du genre Medicago (Acu 80, Tru 26, Pol 57, A 15679, Pol 54 A 15679, Cil 123), sont mis en migration sur un minigel d’agarose 2 %, la plupart de ces extrais d’ADN donne une bande de forte intensité pas de trainé synonyme de la pureté de l’ADN, c'est-à-dire que ces extraits d’ADN ne sont pas contaminés par l’ARN et les composés polyphénoliques (inhibiteur d’amplification par PCR). On remarque qu’il reste de l’ADN dans les puits de migration, cela veut dire qu’on a obtenu une très grande quantité d’ADN, sauf pour le puit 6 on observe une faible intensité. Il semblerait que le poids du matériel végétal utilisé soit adéquat vu l’intensité des bandes qui signifie qu’on a une quantité importante d’ADN (Figure 11). - 0 1 02 03 04 05 06 07 08 + Figure 11 : Migration d’ADN extraits obtenus par la méthode du Medicago modifié selon le poids 500mg de matériel végétal sur gel d’agarose. - P 3 : Medicago modifié - Poids utilisé 500 mg. 55 Chapitre V Résultats et interprétations V.1.3. Résultats obtenus par spectrophotométrie D’après la quantité d’ADN obtenue par spectrophotométrie, on observe une quantité très importante qui permet à la fois d’amplifier et aussi de stocker les échantillons, Concernant la contamination par des protéines, le rapport nous indique une légère contamination (Tableau 12) Tableau 12 : Mesures des échantillons d’ADN par spectrophotométrie. Ecotypes Do 260 nm A45 A 15678 A 15679 A 80 C 123 C 124 C126 T 62 T 26 T210 P 54 P 57 P 42 P 213 P 136 A 372 témoins 0,2356 0,5930 0,4215 0,5031 0,4743 0,6800 0,7852 0,4218 0,5214 0,6161 0,4989 0,6793 0,4734 0,7328 0,4923 0,3243 Do 280 nm 0,1697 0,4952 0,3697 0,3987 0,4233 0,5430 0,6218 0,4076 0,4899 0,4854 0,4961 0,5633 0,4590 0,6014 0,5216 0,3805 Concentration Le rapport ADN ug/ul A260/A280 1,1780 1,388 2,9650 1,197 2,1075 1,140 2,1075 1,260 2,3715 1,120 3,4000 1,250 3,9260 1,262 2,1090 1,034 2,6070 1,064 3,0805 1,269 2,4945 1,205 3,3965 1,205 2,3670 1,031 3,6640 1,218 2,4615 0,943 1,6215 0,852 56 Quantité d’ADN ug 53,01 133,425 94,83 113,197 106,71 153,000 176,670 94,905 117,315 138,622 112,250 115,840 106,515 164,880 110,767 72,967 Chapitre V Résultats et interprétations V.2. Résultats de l’ amplification par la technique PCR-SSR V.2.1. Test d’amplification de 13 marqueurs SSR Les tests d’amplification pour 13 microsatellites ont été effectués, sur l’ADN de deux écotypes (Acu 80 et Tru 62) et deux cultivars (Magali et Mercedes), appartenant à trois espèces du genre Medicago (M.sativa, M.aculeata et M.truncatula). Le produit d’amplification est testé sur gel d’agarose 1,2 %, en présence du marqueur de taille 100pb. M 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 01 02 03 04 M + Figure 12 : Profil d’amplification de 13 microsatellites sur gel d’agarose. - M : marqueur de taille, 01 : Magali, 02 Mercedes, 03 : Acu 80, Tru 62, La figure 12 montre que les quatre échantillons d’ADN ont été amplifiés par la majorité des microsatellites. Les microsatellites amplifiés ont produits des profils ayant une seule bande après migration d’ADN sur gel d’agarose 1,2 %. 57 Chapitre V Résultats et interprétations Le profil de migration pour chaque microsatellite amplifié montre que les bandes ont migré à la même distance pour les quatre échantillons d’ADN appartenant aux individus des trois espèces du genre Medicago étudiés. Les microsatellites amplifiés sont (MTIC 451, MTIC 365, MTIC 332, MTIC 343, MTIC 135, MTIC 131, FMT13, MTIC 134, B14B03, MTIC082, MTIC 338). Les microsatellites (MTIC 079, Enod20, MTIC 082) n’ont pas été amplifiés, mais pour le microsatellite MTIC 079 on observe une bande de faible intensité dans le puits 04 (Tru 62). Pour les microsatellites amplifiés, l’intensité de bandes obtenues varie d’un microsatellite à un autre. On peut déterminer le degré d’amplification des microsatellites par l’intensité des bandes obtenues (voir tableau 12). Tableau 12 : Test d’amplification d’ADN (Acu80 et Tru 62, Magali et Mercedes) par 13 microsatellites. Marqueurs M.sativa M.sativa M.aculeata M.truncatula Magali Mercedes Acu 80 Tru 62 MTIC 451 Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié ++ MTIC 365 Amplifié ++ Amplifie ++ Amplifié ++ Amplifié ++ MTIC 338 Amplifié +++ Amplifié +++ Amplifié +++ Amplifié +++ B14B03 Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié ++ MTIC 332 Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié ++ MTIC 343 Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié ++ MTIC082 Pas amplifié Pas amplifié Pas amplifié Pas amplifié Enod20 Pas amplifié Pas amplifié Pas amplifié Pas amplifié MTIC 135 Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié Amplifié MTIC131 Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié++ Amplifié++ MTIC 079 Pas amplifié Pas amplifié Pas amplifié Amplifié+ FMT13 Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié ++ MTIC134 Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié ++ Amplifié ++ - Bande intense : +++, bande moins intense ++, bande faible intensité : + 58 Chapitre V Résultats et interprétations V.2.2. Test d’amplification de marqueur SSR La figure 13, représente le résultat du test d’amplification de 17 ADN de différentes espèces du genre Medicago (M,aculeata, M.ciliaris, M.polymorpha, M.truncatula, M.sativa) après migration électrophorétique des ADN amplifiés sur gel d’agarose 1,2 % et en présence d’un marqueur de taille 100 pb. La figure montre la présence d’une bande entre 100 et 200 pb pour les ADN amplifiés (Acu 80 individu 01 et 02, Acu 15679, Acu 45, Cil 123 individu 01 et 02, Cil 124 individu 01 et 02, Pol 213 individu 01 et 02, Pol 42 individu 01 et 02, Tru 26, Magali et Mercedes), tandis qu’il y a absence d’amplification pour les ADN (Tru 62 et Tru 2010). 0 1 02 03 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 09 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 h 1500 pb 1000 pb 900 pb 800 pb 700 pb 600 pb 500 pb 400 pb 300 pb 200 pb 100 pb + Figure 13: Profil d’amplification du marqueur MTIC 432 sur gel d’agarose. 01 : Acu 80 (01 individu), 02 : Acu 80 (02 individu), 03 : Acu 15679, 04 : Acu 45, 05 : Cil 123(01 individu), 06 : Cil 123(02 individu), 07 : Cil 124 (01 individu), 08 : Cil 124 (02 individu), 09 : Pol 213 (01 individu), 10 : Pol 213 (02 individu),11 : Pol 42 (01 individu) 12 : Pol 42 (02 individu), 13 : Tru 62, 14 : Tru 26, 15 : Tru 210, 16 : Magali, 17 : Mercedes 18 : Témoin (eau), 19 : Marqueur de taille 59 Chapitre V - Chez l’espèce Medicago aculeata, Résultats et interprétations l’ADN de tous les individus appartenant aux différents écotypes ou populations (Acu 80, Acu 15679, Acu 45) est amplifiée, le produit d’amplification (ADN amplifiée) pour chaque individu des trois écotypes a donné une seule bande après migration sur gel d’agarose 1,2%. Les bandes des différents écotypes ont migré à la même distance, l’intensité des bandes est variable. - L’espèce Medicago ciliaris, l’ADN de tous les individus appartenant aux deux écotypes (Cil 123 et Cil 124) est amplifiée, après migration sur gel d’agarose 1,2 %. L’ADN amplifié de chaque individu de ces deux écotypes a donné une seule bande. La taille des bandes (poids moléculaire) obtenue de ces deux écotypes est similaire puisque ils ont migré à la même distance, l’intensité des bandes est variable. - Pour l’espèce Medicago polymorpha, l’ADN de tous les individus appartenant aux deux écotypes (Pol 213, Pol 42) est amplifiée, le produit d’amplification après migration sur gel d’agarose 1,2 % a donné une seule bande pour chaque individu de ces deux écotypes, la taille des bandes entre écotype est différente, elles n’ont pas migré à la même distance. - Chez l’espèce Medicago truncatula, l’ADN d’un seul écotype (Tru 26) est amplifié, le produit d’amplification obtenu donne une seule bande de forte intensité. L’ADN des écotypes (Tru 62, Tru 210) n’a pas pu être amplifié. - Chez l’espèce Medicago sativa, l’ADN de tous les individus appartenant aux deux cultivars (Magali et Mercedes) est amplifié, le produit d’amplification de chaque individu de ces deux cultives a donné une seule bande après migration. La taille des bandes de tous les individus est du même poids moléculaire parce qu’ils ont migré à la même distance, une forte intensité des bandes est observeé. 60 Chapitre V Résultats et interprétations V.2.3 Polymorphisme intraspécifique V.2.3.1 Polymorphisme intraspécifique chez l’espèce Medicago aculeata Le polymorphisme intraspécifique n’est pas détecté chez Medicago aculeata, la présence d’une seule bande d’un poids moléculaire identique chez les trois écotypes de cette espèce le confirme. V.2.3.2 Polymorphisme intraspécifique chez l’espèce Medicago ciliaris Chez les deux écotypes de Medicago ciliaris étudiées aucun polymorphisme intraspécifique n’est observé. V.2.3.3 Polymorphisme intraspécifique chez l’espèce Medicago polymorpha Le polymorphisme intraspécifique chez Medicago polymorpha peut être suspecté et cela par la présence de deux bandes d’un poids moléculaire différents chez les deux écotypes de cette espèce. V 2.3.4 Polymorphisme intraspécifique chez l’espèce Medicago truncatula Le polymorphisme intraspécifique chez Medicago truncatula n’est pas observé due à l’absence d’amplification d’ADN de deux écotypes (manque d’information). V 2.3.5 Polymorphisme intraspécifique chez l’espèce Medicago sativa Le polymorphisme intraspécifique chez Medicago sativa n’est pas détecté. V 2.4. Polymorphisme interspécifique Le polymorphisme interspécifique est détecté entre les quatre espèces (M.aculeata. M.sativa, M.ciliaris, M.polymorpha et M.truncatula) du genre Medicago. 61 Chapitre V Résultats et interprétations 62 Chapitre VI Discussion VI. Discussion VI.1. Choix du protocole d’extraction d’ADN Les méthodes d’extractions par CTAB décrite par Vroh Bi et al (1996) et par le comité international de Medicago, et sa version modifiée ainsi que la méthode employée par kit d’extraction, ont donné des résultats différents. Les paramètres du premier protocole (P1) ont été optimisés pour l’extraction de l’ADN chez le cotonnier considéré comme plante récalcitrante, c'est-à-dire une plante qui contient une quantité importante de contaminants de l’ADN tels que les polysaccharides et les composées polyphénoliques (Paterson et al., 1993), ce qui n’est pas chez espèces du genre Medicago qui contiennent un taux très élevé de protéines. La différence entre ces les méthodes au CTAB (Protocole P1 et P2) réside dans la concentration de quelques produits utilisés dans la préparation du tampon d’extraction et la concentration de Nacl qui a été augmentée dans la méthode de Vroh Bi et al (1996) à 2 M alors que dans la méthode de CTAB, celle décrite par le comité international de Medicago elle est de 1,4 M. Une concentration molaire élevée de Nacl augmente la solubilité des polysaccharides dans l’éthanol, ce qui réduit effectivement la co-précipitation des polysaccharides et l’ADN (Fang et al., 1992). Le Nacl permet une séparation efficace des polysaccharides de l’ADN parce que la co-précipitation de ces derniers avec l’ADN dans la procédure d’extraction inhibe la digestion de l’ADN et la PCR (Zhang et Mc Stewart, 2000). En ce qui concerne les solutions de prélavage la différence entre les deux méthodes de CTAB est l’utilisation du phénol en plus du chloroforme et l’isoamyl-alcool dans la méthode décrite par le comité international de Medicago alors que dans la méthode Vroh Bi et al (1996) seuls le chloroforme et l’isoamyl-alcool sont utilisés. Bien que le phénol soit considérer comme un produit inhibiteur de la PCR a une certaine concentration, cependant son utilisation du phénol dans la solution de prélavage avec le chloroforme et l’isoamylalcool, forment un composé très efficace pour fixer et éliminer les protéines et les lipides fortement présentes chez les espèces du genre Medicago. Tous ces protocoles classiques bien qu’ils donnent un ADN pur à la fin de l’extraction, ils sont gourmands en temps et en produits consommables tels que (les microtubes, les produits chimiques etc...). L’inconvénient majeur est qu’ils nécessitent 62 Chapitre VI Discussion une grande quantité de matériel végétal, pour cela on est obligé d’attendre que la plante soit à un stade très avancé pour avoir une quantité suffisante. De plus, ce qui rend la méthode d’extraction un peu difficile, ce sont les composés et les métabolites secondaires que la plante peut contenir à un stade très avancé de son développement, donc il est préférable d’utiliser un kit d’extraction. Parmi les avantages de l’utilisation de kits d’isolement d’ADN sur les méthodes classiques, ils sont rapides, simples ne contiennent pas de produits chimiques nocifs tels que le phénol ou le chloroforme et impliquent un minimum de manipulation. L’utilisation de kits d’extraction permet d’extraire de l’ADN à un stade très jeune de la plante cela permet d’éviter les contaminations (champignons, insectes, acariens…) et à ce stade la plante n’a pas encore produit de métabolites secondaires. L’ADN obtenu est généralement plus pur et plus propre que l’ADN isolé par la méthode classique (brute), peut être le seul inconvénient de ces kits est le coût très élevé pour un nombre d’essais (miniprep) très limités. Le protocole (P3) est issu à partir de quelques légères modifications du protocole (P2) mais sans interférer avec le protocole de base de l’extraction d’ADN. L’extraction d’ADN par le protocole (P3) a permis d’économiser du temps par rapport aux deux protocoles (P1) et (P2), d’avoir un ADN de bonne qualité et en grande quantité. Le protocole (P3) à l’inverse du kit d’extraction, est moins couteux (prix) pour un nombre d’essais (miniprep) très élevé. Tous ces critères ont permis de choisir le protocole P3. D’après les résultats obtenus, bien qu’on ne puisse faire de l’extraction uniquement à partir de 100 mg de matériel végétal, il est préférable d’opter pour un poids de matériel végétal de 500 mg pour avoir une quantité suffisante pour l’amplification et le stockage des extraits d’ADN afin de les utiliser ultérieurement. Cependant, on a remarqué qu’au delà de ce poids (500 mg de matériel végétal) on obtient des extraits d’ADN trop dégradés. Les mesures de quantification d’ADN par spectrophotométrie de nos échantillons d’ADN obtenus par le protocole 03 montrent que la quantité d’ADN est très importante. 63 Chapitre VI Discussion VI.2. L’optimisation de l’amplification des marqueurs SSR Le test d’amplification des microsatellites (13 microsatellites) montre que les conditions et les paramètres de l’amplification pour les microsatellites (MTIC 451, MTIC 365, MTIC 332, MTIC 343, MTIC 135, MTIC 131, FMT13, MTIC 134, B14B03, MTIC082, MTIC 338) sont adéquats. Mais pour les microsatellites (MTIC 079, Enod20, MTIC 082) ils ne le sont pas. Une nouvelle optimisation des conditions d’amplification pour ces trois microsatellites est nécessaire. Un gradient de température d’hybridations doit être testé pour les microsatellites (MTIC 082, Enod20) afin d’optimiser la bonne température d’hybridation, mais pour le microsatellite (MTIC 079), une gamme de test pour l’optimisation de la concentration de certains paramètres de l’amplification tels que (Mgcl2) est indispensable. L’amplification des marqueurs microsatellites, par la technique PCR, nécessite une grande attention expérimentale basée sur la variation et l’optimisation de chaque paramètre pour la réalisation des réactions de la PCR (quantité d’ADN, les d’NTP, les amorces, le mixe), et la sélection d’un programme pour chaque amorce (la durée du programme, la température d’hybridation des amorces et aussi la température de dénaturation de l’ADN génomique). VI.3. Etude de la variabilité génétique par les marqueurs SSR Le microsatellite MTIC 432 utilisé pour l’étude de la variabilité moléculaire dans ce travail s’est révélé monomorphe (un seul allèle) pour la majorité des espèces étudiées du genre Medicago (M, aculeata, M.ciliaris, M.polymorpha, M.truncatula, M.sativa). Toutefois, il faut rappeler que ces résultats sont obtenus à partir d’une plante ou deux par écotype de chaque espèce et lorsque le marqueur SSR (MTIC 432) n’amplifie pas : c’est du, peut être, à une question de génotype ou à un allèle nul (ces allèles nuls peuvent surgir lorsque les mutations se produisent dans les régions flanquantes, empêchant l'une ou l'autre des amorces de se lier (Pemberton et al, 1995;. Jones et al, 1998;. Holme et al, 2001). 64 Chapitre VI Discussion La recherche d’un polymorphisme intraspécifique par le marqueur MTIC 432 chez les différentes espèces étudiées du genre Medicago (M, aculeata, M.ciliaris, M.polymorpha, M.truncatula, M.sativa) n’a pas donné de résultat. Par contre, on peut suspecter un polymorphisme intraspécifique chez Medicago polymorpha dû à la différence de tailles des bandes obtenues des deux écotypes (Pol 213 et Pol 42). Bien que, les microsatellites soient des marqueurs très polymorphes, la recherche d’un polymorphisme intraspécifique chez les espèces annuelles du genre Medicago entre les populations de la même espèce est très difficile à mettre en évidence. Cela, est dû surement à leur système de reproduction (autogame) où le taux de l’homozygotie est très élevé, à l’inverse des populations qui appartiennent aux espèces allogames du genre Medicago où le taux de l’hétérozygotie est plus important. Cependant l’étude de Badri (2003), a mis en évidence une importante variabilité intraspécifique par l’utilisation de 07 marqueurs SSR chez des populations annuelles appartenant à deux espèces du genre Medicago (M.truncatula et M.laciniata)(Badri et al., 2003). Une autre analyse de la variabilité intraspécifique chez des populations pérennes appartenant à une espèce du genre Medicago (M.sativa) par l’utilisation 02 marqueurs SSR a démontré l’existence d’une variabilité génétique très élevée (Petolescu et Nedelea, 2009). Dans cette étude un polymorphisme interspécifique du marqueur MTIC 432 entre quatre espèces étudiées du genre Medicago (M.aculeata, M.sativa, M.ciliaris, M.truncatula et M.polymorpha) a été mis en évidence. Ce résultat est confirmé par le travail de Diwan (1997), effectué sur différentes populations pérennes et annuelles appartenant à des espèces du genre Medicago (M.sativa, M.truncatula, M.polymorpha, M.intertexta et M.littoliris) et qui a montré l’existence d’une forte variabilité interspécifique par l’utilisation des marqueurs SSR (Diwan et al., 1997), Afin de mieux décrire et d’interpréter les profils de migration sur gel d’agarose, il est nécessaire de travailler avec une concentration plus élevé de 3 ou 4 % où bien d’utiliser un gel de polyacrylamide. 65 Chapitre VI Discussion 66 Conclusion et Perceptive Conclusion et Perceptives Cette étude du polymorphisme génétique par l’utilisation de marqueurs moléculaires au sein des espèces annuelles du genre Medicago a permis de mettre au point une technique d’extraction d’un ADN de très bonne qualité à partir des feuilles de Medicago et aussi d’optimiser la technique PCR-SSR. L’utilisation des Microsatellites (SSR) pour déterminer le polymorphisme génétique chez les différentes espèces du genre Medicago paraît un très bon choix. Par cette étude on a pu mettre en évidence un polymorphisme génétique entre les différentes écotypes appartenant à une même espèce (cas de M.polymorpha), ainsi qu’un polymorphisme inter spécifique. Enfin comme perspective, pour pouvoir mettre en évidence un polymorphisme quelconque chez les espèces annuelles de Medicago, il serait préférable d’augmenter le nombre de microsatellites, ainsi que l’effectif des échantillons étudiés (écotypes). 66 Références Bibliographiques -Abdelkafi, A., et Marrakchi, M., (2000). Les ressources phytogénétiques fourragères et pastorales : De l‘érosion à la conservation. Cah. Options Méditerr., 45 : 15-27. -Abdelkefi, A., Biborchi, A., Boussaid, M., Marrakchi, M., (1997). 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ANNEXE 01 Protocole d’extraction de l’ADN pour le Medicago truncatula décrit par comité internationale de Medicago) (www.medicago.org) Tampon d’extraction CTAB 1- 02% CTAB (p/v), on peut y aller jusqu'à 03 % pour les espèces qui contiennent un taux supérieur de polysaccharides. 2- 1.4 M Nacl. 3- 0,2 % (v/v) B-mercaptoethanol. 4- 20mM EDTA (solution mère 0.5 M, pH 8,0). 5- 100 mM Tris-Hcl, pH : 8,0 6- 01 % (p/v) de (PVP-40) polyvinylpyrollidone. Solution ou tampon de prélavage 1- Phénol : chloroforme : isoamyl-alcool 25 :24 :1(v/v). Solution ou tampon de lavage 1- 1/10 volume de NaOac (0,3 M, pH : 5.2), 75 % Ethanol, 0,6 Volume de isopropanol. Rnase 20 ug/ml Procédé d’utilisation 1) Préchauffer le tampon d’extraction dans un bain marie à 65°C. 2) Broyer 01 gramme de tissu frais (feuilles) dans l’azote liquide et ajouter 06 ml de tampon d’extraction préchauffé rapidement (ne pas laisser la poudre obtenue dégeler par risque d’avoir un ADN dégrader). 3) Remuer gentiment la mixture et incubation à 60°C pendant 30 minutes. 4) Ajouter un volume de phénol : chloroforme : isoamyl-alcool (25 :24 :1), agiter manuellement (par inversement de tubes), centrifuger pendant 10 minute à 16300 g à 4 °C (si nécessaire cette étape est répétée sur le surnageant pour clarifier la phase aqueuse). 5) Récupérer la phase supérieure (le surnageant) et ajouter une concentration final 20 ug/ml d’Rnase A et incubé à 37 °C pendant 15 minute. 6) Répéter une autre fois l’opération de prélavage avec phénol : chloroforme : isoamylalcool (25 :24 :1) et centrifuger jusqu'à l’obtention d’une interphase aqueuse claire. 7) Extraire la phase aqueuse une autre fois avec un volume égale de chloroforme et récupérer la phase aqueuse suivi d’une centrifugation. 8) Précipiter l’ADN on ajoutant 1/10 de volume NaOac (0.3M, pH : 5.2) et 0.6 Volume de isopropanol. (tenir à -20°C pendant une heure). 9) Récupérer le culot et centrifuger pendant 5 minute, lavé le culot une autre fois avec de l’alcool 75 %. 10) Centrifuger une autre fois le culot et éliminez l’éthanol (par séchage à l’air libre pendant 20 minutes) suspendre le culot dans un tampon TE (10 mM /1Mm EDTA, pH : 8,0) Le Protocole d’extraction celui préparé par Vroh Bi et al., 1996 à partir de la méthode CTAB de Murry et Thompson Tampon d’extraction 1- 2 % (p/v) CTAB (bromure d’hexadécyltriméthyammonium). 2- 2 % (p/v) (polyvinylpyrollidone). 3- 2,0 M Nacl, 4- 20 mM EDTA 5- 100 mM Tris-Hcl (pH 8,0) 6- 5% (v/v) B-mercaptoethanol Solution ou tampon de prélavage 1- chloroforme : isoamyl-alcool 24 :1(v/v). Solution ou tampon de lavage 1- 80% d’éthanol, 10 mM d’ammonium acétate Rnase A 10 ug/ul Procédé d’utilisation 1) Préchauffer le tampon d’extraction dans un bain marie à 60°C. 2) Broyer les échantillons de feuilles dans l’azote liquide. 3) Ajouter au broyat 7,5 ml de CTAB par g de jeunes feuilles broyées. 4) Ajouter 10-15 mg/g du charbon actif et 375 ul/g B-mercapthoéthanol sous hotte et bien vortexer. 5) Incuber pendant une heure a 65°C avec agitation. 6) Ajouter 7,5 ml/g de feuilles broyées dans une solution de chloroforme : alcool isoamylique (24 :1) à température ambiante et agiter manuellement (par inversement de tubes) pendant 5 min. 7) Centrifuger pendant 10 min à 16300 g à 4 °C pour accélérer la phase de séparation, si nécessaire cette étape est répétée sur le surnageant et ajouter 2/3 du volume prélevé d’isopropanol conservé à 4 °C, inverser les tubes doucement puis laisser précipiter au moins 30 min à – 20 °C. 8) Centrifuger pendant 5 minutes à 13000 g à 4°C. 9) Eliminer le surnageant. 10) Ajouter 10 ml de tampon de lavage par g de feuilles broyées et placer en agitateur vertical pendant 30 min. 11) Centrifuger pendant 5 minutes à 13000 g à 4°C. 12) Eliminer le surnageant et sécher l’ADN à l’air libre 100 à 300 ul de TE 1x. 13) Incuber l’ADN pendant 10 à 60°C. 14) Traiter la solution avec 08 ul de Rnase par 100 ul d’ADN et incuber pendant 30 minutes à 37°C. Protocole d’extraction de l’ADN par Kit (Mo Bio Laboratoire). 1) On prend les tubes qui contiennent des perles (the power plant), et on ajoute 50 mg de l’échantillon (tissu végétale), suivi d’addition de 550 ul de la solution power plant (bead solution). 2) Mélanger doucement avec le vortex. 3) Vérifiez la solution PB1 si la solution PB1 a précipité (il faut mettre cette solution a une température de 60°c jusqu'à quelle dissoudre avant l’emploi). 4) Ajoutez 60ul de la solution PB1 et inversez plusieurs fois ou vortex brièvement. 5) Placez les tubes à perle (the powerplant) dans le bain d'eau à 65° c pendant 10 minutes. 6) Fixez les tubes a perle (the powerplant) horizontalement lorsque vous utiliser le vortex ou bien fixez les tubes horizontalement sur une garniture à plat de vortex avec la bande, vortex à la vitesse maximum pendant 10 minutes. 7) Assurez-vous que les tubes a perle (the powerplant) tourne librement dans votre centrifugeuse sans frottage, centrifuger les tubes à 10.000 x g pour 30 secondes à la température ambiante. (Attention : assurez-vous de ne pas dépasser 10, 000 g sinon les tube peuvent se casser). 8) Transférez le surnageant à un tube propre de collection de 2 ml (fournie). Note : prévoyez entre 400 à 500 ul de surnageant, le surnageant peut encore contenir quelques particules de tissu végétal. 9) Ajoutez 250 ul de la solution PB2 et inversez les tubes pour mélanger le contenu, incubez à 4°c pendant 5 minutes. 10) Centrifugez les tubes à la température ambiante pendant 1 minute à 10.000 x g 11) En évitant le granule, transférez le volume entier du surnageant à une collection propre de 2.2 ml (fournie) 12) Ajoutez 1 ml de la solution BP3 et inversez les tubes au moins 5 fois pour bien mélanger le contenu, incubez à la température ambiante pendant 10 minutes. 13) Centrifugez les tubes à la température ambiante pendant 15 minutes à 13, 000 x g 14) Jetez le surnageant et resuspendre le granule à 100 ul de la solution PB6. Note : les tubes ne doivent pas être exposé l’air sec pour éviter que les résidus d’'isopropanol d’affecter le processus. 15) Secouer la solution PB4 pour la mélanger, ajoutez 500 ul de la solution PB4 et ensuite vortex brièvement le mélange. 16) Chargez le volume entier (600ul) sur un filtre et une centrifuger à 10, 000 x g pendant une minute. 17) Enlevez le panier de filtre de rotation, jetez l'écoulement partout, et remplacez le dos de panier de filtre de rotation dans le tube. 18) Ajoutez 500 ul de la solution PB5 et la centrifugez à la température ambiante pendant 30 secondes à 10.000 x g. 19) Jetez l'écoulement partout du tube de collection de 2 ml. 20) Centrifugez encore à la température ambiante pour 1 minute à 10.000 x g . 21) Placez soigneusement le filtre de rotation dans une collection propre de 2 ml (fournie). Evitez d'éclabousser la solution PB5 sur le filtre de rotation. 22) ajoutez 50 ul de la solution PB6 au centre de la membrane blanche de filtre. Alternativement, l’eau stérile (qui est utilisé pour la PCR- DNA - Free) ma soit employée pour l'élution de la membrane de filtre de rotation de silice à cette étape. 23) Centrifugeuse à la température ambiante pendant 30 secondes à 10, 000 x g Remarque : Secure : bloqué Elution : séparation de corps adsorbés par lavage progressif. Annexe 02 Compositions des tampons CHLOROPHORME : ALCOOL ISOAMYLIQUE 21/1 Chlorophorme 24ml Alcool isoamylique 01ml ISOPROPANOL Qualité pour analyse (99,7 % minimum) prêt à l’emploi ETHANOL 70% Ethanol 96 % 100 ml Eau 40,85 ml TAMPON DE CHRGE (pour 1 ml) Saccharose phénol 0,4g Bleu de bromo phénol 0,0025g Eau 1 ml Tampon TE (pH :8,0) 10 mM Tris 1mM EDTA
