le diagnostic microbiologique

Apport du laboratoire dans le
diagnostic et le traitement des infections
• Le prélèvement.
• L’examen au laboratoire.
• Les relations entre le laboratoire et le service
demandeur.
Le prélèvement : conditions générales (1)
•
•
•
•
dans les règles de soins et d’hygiène
avant l’administration d’antimicrobiens.
le plus tôt possible dans le processus infectieux
-au plus près du foyer initial (ou des lésions
secondaires )
-éventuellement au niveau de la porte d’entrée
et sur les voies d ’excrétion.
Le prélèvement : conditions générales (2)
• quantité la plus importante possible de
matériel.
• méthodes différentes selon les microorganismes recherchés, les organes à prélever,
le type des lésions, l’enjeu du diagnostic.
Le prélèvement : conditions générales (3)
• éviter la contamination des prélèvements
(bactéries de l’environnement et bactéries
commensales)
-> respect des règles d’hygiène
-> matériel stérile à usage unique.
-> dispositifs spéciaux
-> décontamination de la surface à prélever
Le prélèvement : conditions de recueil
dans un récipient :
• stérile, à usage unique
• étanche et fermé hermétiquement
• identifié : nom et prénom du malade,
nature et site du prélèvement.
date et heure du prélèvement.
• introduit dans un sac plastique étanche et fermé
hermétiquement
Le prélèvement : conditions de transport (1)
• idéalement : prélèvement effectué au laboratoire.
• si transport de < 30 mm pour les petits échantillons ou
de < 2 heures pour les autres : tube sec stérile.
• si transport de > 2 heures :
– inoculation dans un flacon d’hémoculture
anaérobie et dans un tube sec stérile.
– conservation :- tube stérile: à +4°C *
- flacon: à 37°C (ou t° ambiante)
• si transport de >24 heures: milieu de transport
type Portagerm
* sauf échantillons respiratoires et LCR
Le prélèvement : conditions de transport (2)
• cas spéciaux* nécessitant la congélation du
prélèvement : recherche de
- virus enveloppés,
- Bartonella
• * contacter le laboratoire avant de prélever
Le prélèvement : refus d ’analyse
• échantillons
– reçus dans des récipients non étanches
– mal conservés
– non étiquetés
– inappropriés aux analyses prescrites
• même type d ’échantillon qu’un échantillon reçu
le même jour (sauf hémoculture, LCR ou en cas
d ’aggravation de la situation clinique).
Examen au laboratoire
• Diagnostic direct : mise en évidence de l’agent
infectieux
• Diagnostic indirect : mise en évidence de la
réaction de l’organisme à la multiplication de
l’agent infectieux
= sérologie
Les étapes de l ’examen
bactériologique classique
 examen microscopique
 culture
 tests de sensibilité aux antibiotiques
L ’examen microscopique (1)
• effectué directement sur le prélèvement,
• à l’état frais et après coloration de Gram (ou
autre:ex, Z. Neelsen)
• résultats le jour même du prélèvement
• détecte la présence de:
- bactéries (si suffisamment nombreuses)
- polynucléaires neutrophiles
L ’examen microscopique (2): les
bactéries
• flore polymorphe ou monomicrobienne
• cocci ou bacilles, mobiles ou non
• Gram+ ou Gram -> indications pour le choix des milieux à
ensemencer
-> base pour interprétation du résultat des
cultures.
-> indications pour la mise en place du traitement
Coloration de Gram: cocci à gram positif
Coloration de Gram: bacilles à Gram négatif
L ’examen microscopique (3): les
polynucléaires neutrophiles
• la présence de polynucléaires neutrophiles*
± altérés est en faveur d’une infection
bactérienne.
*cas des liquides de ponction : recherche par
coloration cytologique (May Grunwald
Giemsa)
La culture (1)
• sur différents milieux* : solides , liquides, enrichis ,
sélectifs , en aérobiose et parfois en anaérobiose.
• colonies en milieu solide et trouble en milieu liquide
• isolement impératif pour distinguer les différentes
espèces présentes.
*certaines espèces requièrent des milieux et des conditions de
mise en culture spéciaux (mycobactéries, Rickettsies,
Chlamydia).
La culture (2)
• résultats obtenus habituellement en 24 heures
( mais parfois plusieurs jours ou semaines
selon les bactéries).
-> permet de faire
• la détection des bactéries qui n’ont pas été
observées à l’examen microscopique.
• l’appréciation quantitative des bactéries
présentes.
• l ’identification des différentes espèces et si
nécessaire l’antibiogramme.
L ’identification de la culture (1)
• effectuée par étude des caractères
culturaux et biochimiques
• avec des trousses d ’identification
commercialisées (gammes API)
• habituellement en quelques heures ( 24
heures ou moins )
L ’identification de la culture (2): cas des
bactéries à croissance lente et/ou difficile
-> étude des caractères génotypiques
• hybridation avec des sondes spécifiques
• en utilisant des trousses commercialisées (ex:
sonde pour mycobactéries),
• résultats en quelques heures .
Test de sensibilité aux antibiotiques
• effectué par la technique de l’antibiogramme
• résultats en 24 h.
-> aide à la mise en place du traitement spécifique:
-indispensable en cas d’échec du
traitement ou de rechute.
- utile pour les espèces concernées par la
résistance acquise*
*résistance naturelle = partagée par toutes les souches d ’une même espèce.
résistance acquise = concerne seulement certaines souches de l ’espèce.
Techniques de détection rapide
1. recherche d ’antigènes solubles.
2. amplification génique.
Recherche d ’antigènes solubles
• dans les urines, le LCR .
• en utilisant des anticorps connus, spécifiques de la
bactérie recherchée
• résultats rapides (1 à 2 heures)
• pour :
– des infections à bactéries de croissance difficile
(légionelle,pneumocoque)
– des infections décapitées (méningite)
• limites : manque de sensibilité
Amplification génique
• principe : multiplier le génome (une fraction
spécifique) de la bactérie sans multiplier la bactérie
• diverses techniques dont la PCR
• intérêt : rapidité (1 journée) et sensibilité (sauf BK)
• pour la mise en évidence directement dans le
prélèvement de bactéries à croissance lente ou /et
difficile (et de nombreux virus)
• quand des trousses sont disponibles dans la commerce
Relations entre le laboratoire et le service
demandeur
- le service clinique doit fournir les renseignements utiles à
la qualité de l ’analyse: éléments cliniques, traitements
pouvant interférer dans l ’analyse, contexte
épidémiologique …
- l’interprétation des résultats et l’élaboration de la
stratégie thérapeutique doivent être faites après
confrontation des résultats avec les données cliniques.
La sérologie (1)
• = mise en évidence d’anticorps dans le sang
• par formation de complexes antigèneanticorps, en utilisant des antigènes spécifiques
du micro-organisme recherché
• diverses techniques de révélation des
complexes:agglutination, fluorescence…
La sérologie (2)
• sang prélevé sur tube sec stérile
• résultats en 24-48 heures
• 2 prélèvements pour mettre en évidence la montée du
taux des anticorps: un le plus tôt possible et l’autre
environ 15 jours plus tard
•
en bactériologie: réservé aux cas de diagnostic direct
difficile (ex: brucellose, légionellose, mycoplasmes,
chlamydia…)
très utilisé en virologie et parasitologie
Bactéries et antibiotiques
Structure des bactéries
•
•
•
•
•
Bactérie = Cellule procaryote
Paroi
Membrane cytoplasmique
Cytoplasme
Chromosome circulaire
Les antibiotiques
• Cible: les différentes voies
métaboliques des bactéries
ANTIBIOTIQUES
INTERVENANT DANS LA
SYNTHESE DE LA PAROI
-LACTAMINES
GLYCOPEPTIDES
FOSFOMYCINE
BACITRACINE
Cible d’action des béta-lactamines
ANTIBIOTIQUES ACTIFS SUR
LES MEMBRANES
POLYMYXINES
ANTIBIOTIQUES INHIBANT LA
SYNTHESE OU L'EXPRESSION
DE L’ADN
 QUINOLONES
 RIFAMPICINE
 INHIBITEURS DE LA SYNTHÈSE DES
FOLATES : SULFAMIDES ET
TRIMETHOPRIME
 5-NITRO-IMIDAZOLÉS
 NITROFURANES
ANTIBIOTIQUES INHIBANT
LA SYNTHESE DES
PROTEINES
 MACROLIDES ET APPARENTES
 TETRACYCLINES
 AMINOSIDES
 CHLORAMPHENICOL
 ACIDE FUSIDIQUE
Synthèse des protéines
Synthèse des protéines
Synthèse des protéines
Les champignons et les anti fongiques
Caractéristiques des champignons
• Cellules qui produisent de l’énergie
(glycogène), se reproduisent (spores)
• Paroi rigide (polysaccharides)
• Membrane cytoplasmique
(ergostérol)
• Noyau avec membrane nucléaire
• Cytoplasme avec des mitochondries
Les virus
Structure virale
• Un acide nucléique , ADN ou ARN
• Un complexe protéique protecteur, la
capside
• Une enveloppe (membrane lipidique)
facultative
La multiplication virale
• Virus = être très simple incapable de se
multiplier seul
•
•
•
•
Pas de matières premières
Pas de sources d’énergie
Pas d’enzymes
Seulement l’information génétique
• → pour la réplication: utilisation de la
machinerie de la cellule infectée
LA MULTIPLICATION DU VIRUS DANS LA
CELLULE CIBLE
A
B
C
D
E
:
:
:
:
:
Attachement
Pénétration
Décapsidation
Réplication
Synthèse des protéines virales
(par traduction des ARNm viraux)
F : Assemblage
G : Libération des virions néoformés
par bourgeonnement ou fusion-lyse
Les antiviraux
• Ne visent pas les virus eux-mêmes qui
sont métaboliquement inertes
• Bloquent le cycle de multiplication des
virus, à différentes étapes
PRINCIPAUX ANTIVIRAUX
PÉNÉTRATION ET DÉCAPSIDATION
T-20 ou pentafuside= FUZEON®
 Produit actif sur le virus de l’immunodéficience
humaine : inhibiteur de fusion
Amantadine = (MANTADIX®)
= Chlorhydrate d'amino-L-adamantane
Action sur les virux grippaux (Influenzavirus A
et B)
Amantadine
RÉPLICATION
incorporation au cours de la synthèse de l’acide nucléique viral
1. Inhibiteurs par compétition avec un nucléotide naturel
ou par terminaison de chaîne
= Analogues nucléosidiques (analogues de base ou de sucre de l’acide
nucléique)
ex: - aciclovir ou ZOVIRAX® (herpes virus)
- ganciclovir ou CYMEVAN® (cytomégalovirus)
- zidovudine (AZT) ou RETROVIR*® (Hiv)
-lamivudine (3TC) ou EPIVIR®,….
2. Inhibiteurs non nucléosidiques d’enzyme virale
Névirapine (VIRAMUNE®)
Efavirenz ou SUSTIVA®,…
 Action sur le VIH
Névirapine
3. Incorporation directe à l’ADN viral
Acide phosphonoformique (FOSCAVIR®)
= PFA = foscarnet
 Action sur les virus herpes simplex, varicelle-zona, cytomégalovirus…
MATURATION
inhibiteurs de protéases
Nelfinavir ou VIRACEPT®
Saquinavir ou INVIRASE
 Action sur les virus de l’immunodéficience humaine
LIBÉRATION
Inhibiteurs de la neuraminidase
 4- guanidino-Neu5Ac2en = Zanamivir ou RELENZA®
 Oseltamivir ou TAMIFLU®
 Action sur les virus grippaux (Influenzavirus A et B)
Zanamivir
Schéma de
multiplication du
VIH et cibles
thérapeutiques
Les interférons
• Dégradation des ARN messagers par
activation d’une ribonucléase
• → arrêt de la production des
protéines virales