Étude du browning dans le cadre des cancers associés à la cachexie Delphine ALLOUCHE Ophélie LESCAT Guylène RIGNOL Encadrées par Laurence NIETO Master 2 Expression Génique et Protéines Recombinantes Remerciements Nous souhaitons dans un premier temps remercier Laurence Nieto. Un grand merci pour vos conseils avisés, votre bienveillance et le temps que vous avez su nous consacrer malgré votre emploi du temps si chargé. Nous remercions Remy Poupot pour ses conseils lors des différentes présentations orales. Nous remercions Mme Stéphanie BALOR, passionnée par son travail, qui a su répondre à nos questions pour la préparation des échantillons pour la microscopie électronique. Merci pour son accueil chaleureux, c’était un plaisir. Nous remercions l’équipe 13 du Centre Méditerranéen de Médecine Moléculaire (C3M) de Nice, L. Yvan-Charvet et V. Sarrazy pour leurs conseils concernant les souris KrasG12D. Enfin nous remercions Laurent Paquereau, sans qui nous ne serions pas dans ce master. Nous n’aurions pas passé quatre mois inoubliables et fait de ci belles rencontres. Merci à tous les professeurs pour la qualité d’enseignement fourni et pour cette si belle famille qu’est l’EGPR. Pour finir, merci aux étudiants EGPR. Merci pour ces danses, ces fous-rires, ces tarots, cette prise de poids (incontrôlée), cette entraide, cette bonne ambiance. Tout simplement … Merci d’être VOUS ! Bonne lecture à tous Résumé La cachexie est un syndrome multifactoriel représentant près de 20% du taux de mortalité chez les patients cancéreux. L’une des principales conséquences de la cachexie est la perte incontrôlée des masses adipeuses et musculaires. Cet amaigrissement entraîne un affaiblissement profond de l’organisme et une mauvaise réponse aux thérapies anticancéreuses. Le tissu adipeux est principalement affecté lors des cancers associés à la cachexie (CAC). En effet, sous l’effet de différents stimuli un phénomène de browning du tissu adipeux blanc en beige est observé. Ce browning permet d’augmenter la production de chaleur. Ce phénomène est possible grâce à une protéine mitochondriale : UCP1. L’équipe de Serkan Kir, a mis en évidence la présence d’une hormone activant la transcription d’UCP1 chez des souris présentant un modèle de tumeur pulmonaire, il s’agit de la parathyroid hormone related protein (PTHrP). Afin de confirmer certains des résultats de l’équipe de Serkan Kir, la première étape de notre projet sera d’observer les effets de PTHrP ; tant sur la fonctionnalité de la protéine UCP1 que sur le browning. De plus, nous souhaitons déterminer si PTHrP est libéré par d’autres types de CAC. La seconde étape du projet, permettra de caractériser le modèle de souris déficientes pour UCP1, largement décrit dans le cadre de l’obésité et non dans les cancers cachectiques. Sommaire Introduction bibliographique ............................................................................. 1 I/ La cachexie ................................................................................................................ 1 II/ Le tissu adipeux ........................................................................................................ 3 III/ Le browning ............................................................................................................. 4 Présentation d’une publication .......................................................................... 9 Projet de recherche .......................................................................................... 14 I/ Confirmer les effets de PTHrP sur la protéine UCP1 et le browning .............. 14 A/ Sur le modèle C57BL/6 ............................................................................................. 14 1) Les animaux ............................................................................................................................ 14 2) PTHrP et la cachexie ............................................................................................................... 15 3) PTHrP et le browning .............................................................................................................. 15 B/Sur le modèle Kras G12D ............................................................................................. 17 1) 2) 3) 4) Les animaux .............................................................................................................................. 17 PTHrP et la cachexie ................................................................................................................. 17 PTHrP et le browning................................................................................................................ 18 Carctérisation de la tumeur ..................................................................................................... 18 C/ In Vitro sur d’autres modèles de cancers .................................................................. 18 II/ Effets de l’inhibition d’UCP1 sur le browning et la cachexie......................... 20 1) 2) 3) 4) Les animaux ............................................................................................................................ 20 Suivi de la cachexie ................................................................................................................. 21 Analyse du browning .............................................................................................................. 22 Suivi de la tumeur ................................................................................................................... 22 Conclusion et perspectives ............................................................................... 22 Bibliographie Glossaire ACOX1: Peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 1 ACSL1: Long-chain-fatty-acid--CoA ligase 1 AP2: Adipocyte protein 2 ATF-2: Activating Transcription Factor 2 ATGL: Adipose triglyceride lipase ATP: Adenosine TriPhosphate BAT: Brown Adipose Tissue BTC: Betacelluline CAC: Cancer Associated Cachexia cAMP: cyclic Adenosine Mono Phosphate CPT: Carnitine PalmitoylTransferase CRE: cAMP Response Element CREB: cAMP Response Element Binding Protein DIO2: Type II iodothyronine deiodinase EGF: Epidermal Growth Factor EREG: Epiregulin eWAT: epididymal White Adipose Tissue FADH: Flavin Adenine Dinucleotide FBXO32: F-box only protein 32 GLUT1-4: Glucose transporter 1-4 GPCR: G protein–coupled receptors HB-EGF: Heparin-Binding EGF like growth factor HOXC9: Homeobox protein Hox-C9 HSL: Hormone-sensitive lipase iBAT: interscapular Brown Adipose Tissue IF1: ATP synthase Inhibitor Factor 1 IgG : Immunoglobuline G IL-6: Interleukine-6 iWAT: inguinal White Adipose Tissue JAK: Janus kinase LLC: Lung Lewis Carcinoma MAPK: Mitogen-activated protein kinase MSTN: Myostatin MURF1: Muscle-specific RING finger protein 1 MYF5: Myogenic factor 5 NADH: Nicotinamide Adenine Dinucleotide NE: Noradrenaline NRF: Nuclear respiratory factor NTB: Non Tumor Bearing OCR: Oxygen Consumption Rate PGC-1α: Peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 alpha PKA, C: Protein Kinase A, C PPAR-γ: Persoxisome proliferator activated receptor gamma PRDM16: Positive Regulatory Domain 16 PTH: Parathyroid hormone PTH1R: Parathyroid hormone receptor 1 PTHrP: Parathyroid hormone related proteinSHOX2: Short stature homeobox protein 2 STAT: Signal Transducers and Activators of Transcription TA: Tissu Adipeux TG: Triglycérides TGF β-1: Transforming growth factor TGF-beta1 TNFR: Tumor necrosis factor receptor TNFα: Tumor Necrosis Factor α TRE: Thyroid Response Element TRIM63: E3 ubiquitin-protein ligase TRIM63 UCP1, 2, 3: Uncoupling Protein 1, 2, 3 WAT: White Adipose Tissue β3-AR : Récepteur β3- adrénergique Figure 1: Mécanisme général de la cachexie cancéreuse. La cachexie cancéreuse est un syndrome multifactoriel causé par une altération du métabolisme dû à la production de cytokines 2 et la sécrétion d’autres facteurs moléculaires par la tumeur . % 90 80 80 % 70 60 50 % 50 40 % 40 30 20 10 types cancers 0 Gastrique / pancréatique Poumon/Prostate/Colon Sein/Leucémie Figure 2 : Prévalence de la cachexie pour différents cancers. Histogramme représentant le pourcentage de cachexie retrouvée dans différents types de cancers. Adapté de (Argilés, 1 2014) Introduction bibliographique I/ La cachexie Définition La cachexie vient du grec « kakos » et « hexis » qui signifie mauvaise condition. Ce syndrome multifactoriel est caractérisé par une perte incontrôlée des masses adipeuses et musculaires ainsi qu’une augmentation de l’inflammation (Interleukine-6, Tumor Necrosis Factor-α …) menant à un affaiblissement profond de l’organisme (Figure 1). Il ne faut pas confondre la cachexie avec l’anorexie car la perte de poids ne peut ici pas être compensée par un apport nutritionnel. On parle d’état cachectique lorsque la perte de poids est supérieure à 5% en moins d’un an. Une autre caractéristique de la cachexie est une dérégulation du métabolisme, il est alors observé chez les patients cachectiques une balance énergétique négative 1,2. La cachexie est observée dans de nombreux cancers en stades avancés mais également dans des maladies infectieuses tels que le SIDA et la tuberculose, des maladies chroniques rénales et cardiaques3. La cachexie cancéreuse ou CAC (Cancer-Associated Cachexia) Selon l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS), 12,7 millions de cancers sont nouvellement diagnostiqués par an. Il s’avère que, dans près de 50 % des cancers avancés, les patients présentent une cachexie et près de 20 % des patients décèderont directement de cette cachexie. Ceci est en partie dû à la dégradation générale de leur état, entraînant une altération des réponses aux thérapies 4,5. Tous les cancers ne sont pas cachectiques. Cependant, la cachexie est très fréquemment retrouvée dans les cancers gastro-intestinaux (gastrique, pancréatique, prostatique et colique) avec une prévalence allant de 50 % à 80 %. Pour le cancer du poumon, qui est la première cause de mortalité par cancer dans le monde, la fréquence de la cachexie chez ces patient est près de 40% (Figure 2) 1. 1 Figure3: Inflammation pour les patients atteints de CAC. La tumeur sécrète des facteurs de l’inflammation en majorité de l’Interleukine-6 (IL-6) et du Tumor Necrosis Factor α (TNFα). Ces cytokines stimulent le tissu adipeux blanc menant à un état cachectique. A l’heure actuelle, on ne sait ni pourquoi ni comment les cancers en stades avancés mènent à ce syndrome. De plus, étant donné que ce syndrome est multifactoriel et que le métabolisme lié au cancer est complexe, il n’existe pas de traitements disponibles pour lutter contre la cachexie. L’inflammation L’inflammation est l’un des facteurs menant à un état cachectique. Deux protéines sont majoritairement responsables de cet état: l’interleukine-6 (IL-6) et la Tumor Necrosis Factor α (TNFα) (Figure 3). Le TNFα était initialement appelé cachectine. Ce facteur est libéré par la tumeur ou par les macrophages présents dans le microenvironnement tumoral. Un des mécanismes potentiels de l’implication du TNFα sur la cachexie est qu’il inhiberait la différenciation des myoblastes en muscles et induirait l’apoptose des pré-adipocytes et des adipocytes.6,7 L’équipe de Tisdale a montré que, lorsque l’on ajoute des doses croissantes en TNFα, on observe une perte de poids et un décès précoce des animaux.8 Cependant, le TNFα n’est pas le seul facteur aggravant l’état cachectique. En effet, on retrouve dans le sérum de ces patients un taux élevé d’interleukine-6. L’interleukine-6 est une cytokine libérée par la tumeur et induit la voie de signalisation Jak/STAT. Elle est responsable d’une réponse hépatique aiguë dans un CAC 7. La présence d’un taux élevé d’IL-6 est souvent corrélée avec une tumeur de grande taille. Laine et al, expliquent dans leur étude que lorsqu’une ablation de la tumeur chez des souris est réalisée on observe une diminution de la concentration en interleukine-6 7. De plus, l’équipe de Petruzzelli, a démontré que le poids des tissus adipeux blancs était augmenté chez des souris KO pour le récepteur à l’IL-6 3.Pour finir, l’équipe d’Uomo s’est intéressée à la cachexie liée au cancer pancréatique. Ils ont observé que ces facteurs inflammatoires étaient surexprimés, ce qui entraînait une augmentation du taux de leptine dans le sang, favorisant donc la lipolyse et une balance énergétique modifiée 9. 2 Figure 4 : Morphologie des différents tissus adipeux. A : Tissu adipeux brun (BAT) : Grand nombres d’adipocytes de petites tailles comportant de nombreuses vacuoles lipidiques. B : Tissu adipeux blanc (WAT) : Adipocytes de tailles supérieures aux adipocytes du BAT. Vacuole lipidique unique est imposante. C : Tissu adipeux beige/ « brite ».Adipocytes de tailles moyennes avec des vacuoles lipidiques uniques ou 10 multiples Microscope optique, coloration hématoxyline-éosine II/ Le tissu adipeux Les différents types de tissus adipeux Le tissu adipeux brun (BAT) Le tissu adipeux brun est majoritairement présent chez les petits rongeurs et tous les mammifères hibernants. Chez l’Homme, il est principalement retrouvé chez les nourrissons et disparaît en partie avec l’âge. La fonction première de ce tissu est de produire de la chaleur par la lipolyse de ses adipocytes grâce à un mécanisme appelé thermogénèse 11. Ce tissu est essentiellement composé d’adipocytes de petites tailles (environ 30µm) Ces adipocytes contiennent un noyau central, de nombreuses vacuoles lipidiques de tailles variables mais relativement petites (comparées à celles des adipocytes blancs). Pour finir, ces adipocytes contiennent un grand nombre de mitochondries qui contiennent du fer, donnant la couleur brune à ce tissu (Figure 4 A) 12. Le tissu adipeux blanc (WAT) Le tissu adipeux blanc est majoritairement présent chez l’Homme adulte puisqu’il représente 20 à 25% du poids corporel chez la femme et 15 à 20% du poids chez l’homme. Son rôle consiste essentiellement à stocker les graisses sous la forme de triglycérides (TG). Il existe deux types de localisation du WAT chez l’Homme comme chez la souris ; le tissu adipeux blanc sous-cutané et le tissu adipeux blanc viscéral 9: Le WAT est caractérisé par des gros adipocytes (100-150µm), contenant une large vacuole lipidique uniloculaire qui occupe la quasi-totalité de la cellule et plaque le noyau contre la membrane plasmique (Figure 4 B). La densité en mitochondries dans ce tissu est relativement basse 9, 12. Le tissu adipeux Beige / « Brite » Récemment, il a été trouvé dans le WAT des « brown-like adipocytes ». Ces adipocytes ont été nommés beiges ou « brite ». En conditions de cultures normales ces adipocytes sont des adipocytes du WAT. Cependant, lorsque des stimuli de la thermogénèse sont apportés, ces adipocytes ont tendance à se rapprocher de la morphologie des adipocytes du BAT 13 . Ces « brite » adipocytes sont caractérisés par des adipocytes de taille moyenne10, une densité en mitochondries plus élevée que dans le WAT et des vacuoles lipidiques soit multiloculaires soit uniloculaires (Figure 4 C). Leur localisation est essentiellement observée dans le WAT souscutané. Lorsque le stimulus thermogénique n’est plus présent, les « brown-like adipocytes » redeviennent des adipocytes blancs 15. 3 Figure 5 : Précurseurs des différents tissus adipeux. + - Une cellule mésenchymateuse donne deux types de précurseurs, les MYF5 ou les MYF5 (myogenic factor 5). Les + précurseurs MYF5 ou lignée myogénique se différencient sous l’action de PRDM16 (PR domain zinc finger protein 16) en pré-adypocytes qui finiront leurs différenciations en donnant des adipocytes bruns. S’il n’y a pas d’induction au PRDM16, des myocytes sont observés. Les précurseurs MYF5 deviennent des pré-adipocytes blancs qui par l’action de PPAR-γ 14 (peroxisome proliferator-activated receptor-γ), se différencient en adipocytes blancs. (Adapté de Park et al,2014) . Les précurseurs Lors du développement embryonnaire, on observe une différenciation en trois feuillets : l’endoderme, le mésoderme et l’ectoderme. Les précurseurs du tissu adipeux (TA) proviennent du mésoderme. A partir d’une cellule mésenchymateuse, différentes étapes de différenciation, mèneront à la formation des tissus adipeux bruns et blancs. Précurseurs du BAT : Ils proviennent du mésoderme paraxial soit la lignée myogénique. Ils expriment l’activateur transcriptionnel MYF5 (myogenic factor 5). La différenciation en adipocytes bruns est contrôlée entre autre par le facteur de transcription PRDM16 (PR domain zinc finger protein 16), le co-activateur transcriptionnel PGC-1α (peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1 alpha) et un régulateur de transcription, appelé PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ) (Figure 5) 11, 14. Une étude a montré que, si des précurseurs d’adipocytes bruns sont déplétés en PRDM16, ils se différencient en muscle squelettique. La différentiation inverse est possible en exprimant PRDM16 dans des myoblastes pour qu’ils deviennent des adipocytes bruns 14. Précurseurs du WAT : Ils proviennent du mésoderme latéral et n’expriment pas MYF5. Les préadipocytes blancs se différencient en adipocytes blancs par l’action de PPAR-γ (Figure 5) 11, 14. III/ Le browning Le métabolisme mitochondrial La mitochondrie est le lieu principal de synthèse de l’énergie sous forme d’ATP. Cette synthèse se fait par différentes voies : le cycle de Krebs, la phosphorylation oxydative et la respiration mitochondriale. Une autre voie alimente le cycle de Krebs et la respiration mitochondriale, il s’agit de la β-oxydation ou hélice de Lynen. La glycolyse apporte du pyruvate au cycle de Krebs, permettant de fournir les cofacteurs NADH2 et le FADH2 nécessaires pour la phosphorylation oxydative (Figure 6) 16. La β-oxydation est la voie principale de dégradation des acides gras. Ils sont transformés en acylCoA pour passer la membrane mitochondriale. Chaque tour d’hélice permet d’alimenter le cycle de Krebs en acétyl-CoA et en cofacteurs NADH2 et le FADH2 (Figure 6) 17. 4 Figure 6 : Schéma général des différentes voies métaboliques dans la mitochondrie. Le pyruvate produit à partir du glucose via la glycolyse est transporté à travers la membrane interne mitochondriale par un système de transport spécifique. Une fois dans la mitochondrie, le pyruvate est oxydé en acétyl-CoA et intègre le cycle de Krebs pour générer des cofacteurs réduits (Nicotinamide Adenine Dinucleotide réduite [NADH2] ; Flavin Adenine Dinucleotide réduite [FADH2]) et du GTP. Ces cofacteurs sont utilisés dans la chaîne respiratoire mitochondriale pour générer un gradient de protons et ainsi former de l’ATP. Les acides gras libres sont transformés en acyl-CoA et passent la membrane interne de la mitochondrie grâce à la carnitine et aux CPTs (Ccarnitine PalmitoylTransferases). Ces acyl-CoA subissent la β-oxydation et produisent de l’actétyl CoA qui entre dans le cyle de Krebs. La protéine UCP, qui permet de 16 dissiper le gradient de protons, est active lors de la thermogénèse Figure 7 : Schéma général de la thermogénèse adaptative dans le tissu adipeux brun. L’exposition prolongée au froid stimule les récepteurs β3-adrénergiques (β3-AR), permettant à l’AdénylateCyclase (AC) de convertir l’ATP en AMPc. Ce second messager induit la transcription d’UCP1 dans le tissu adipeux brun (BAT). L’AMPc active également la proteine-kinase A (PKA) menant à une augmentation de la lipolyse. Une mitochondriogénèse est également 18 observée. (Adapté de Divakaruni et al, 2011) . La chaine respiratoire mitochondriale est composée de cinq complexes protéiques. Le complexe I oxyde le NADH2 qui libère un électron. Ce dernier est capté par le Co-enzyme Q. Au niveau du complexe II, on a également oxydation d’un autre cofacteur, le FADH2, permettant aussi la libération d’un électron. Tout cela génère un gradient de protons dans l’espace intermembranaire. Le complexe V également appelé ATP synthase, capte ces protons pour les transférer dans la matrice mitochondriale, permettant ainsi la production d’ATP (Figure 6) 18. Lors de la thermogénèse dans le BAT, la protéine UCP1 (UnCoupling Protein1) est activée au niveau de la membrane interne de la mitochondrie. Cette protéine permet le découplage mitochondrial, en détournant le gradient de protons. En effet, les protons ne vont plus être utilisés pour fabriquer de l’ATP mais de la chaleur 19, 20. Lors d’une exposition prolongée au froid on observe un autre type de thermogénèse dite la thermogénèse adaptative, processus également appelé browning. La thermogénèse adaptative est activée après action d’un stimulus (exposition prolongée au froid, signalisation β-adrénergique…). Le stimulus envoie un signal au système nerveux sympathique induisant la libération de catécholamines dont la noradrénaline. La noradrénaline se lie sur son récepteur β3-adrénergique. Cette fixation active l’adénylate cyclase qui transforme l’ATP en AMP cyclique (second messager). La production d’AMPc dans un premier temps, favorise la transcription de la thermogénine ou UCP1 dans le noyau des adipocytes. Dans un second temps, l’AMPc induit la voie des protéines kinases A (PKA) qui phosphoryle la protéine HSL (hormone sensitive lipase) menant à une augmentation de la lipolyse. Ceci entraine une augmentation de la concentration en acides gras libres. La PKA induit un autre phénomène qui est la mitochondriogénèse, soit la division d’une mitochondrie et de son patrimoine génétique pour en donner deux. Pour pallier à l’exposition au froid, l’ensemble de ces changements mène à une production de chaleur en découplant la chaine respiratoire mitochondriale diminuant ainsi la synthèse d’ATP. Ce phénomène est appelé browning et se passe dans le tissu adipeux brun ou encore dans le tissu adipeux « brite » issu du WAT (Figure 7) 18, 22. 5 Figure 8 : Régulation transcriptionnelle d’UCP1 dans le tissu adipeux brun. Lors d’un stimulus par des récepteurs β-adrénergiques, la voie des PKA est activée, induisant la transcription d’UCP1. La transcription d’UCP1 se fait grâce à différents co-activateurs transcriptionnels, qui interagissent à proximité de son promoteur. Parmi ces séquences, deux sites CRE sont retrouvés et un site PPRE. Pgc1α= Ppar coactivator 1 α; PPRE= Ppar Response Element, FA= Fatty Acid; PPAR= Peroxisome Proliferator-Activated Receptor; PRDM16= PR zinc finger protein containing 16; CRE= cAMP Response Element; CREB= cAMP Response Element Binding Protein; ATF-2= Activating 21 Transcription Factor 2 ; MAPK= Mitogen-activated protein kinase.( Adapté de Bonet et al, 2012) . La thermogénèse adaptative Les facteurs du browning UCP1: uncoupling protein 1 UCP1 est une protéine de 33kDa localisée dans la membrane interne de la mitochondrie des adipocytes bruns. Elle permet la production de chaleur à partir d’un gradient de protons. Cette protéine « court-circuite » la respiration mitochondriale et diminue donc la production d’ATP dans la cellule. UCP1 est activée lors de la thermogénèse adaptative ou browning. La production d’UCP1 dans les « brite » est équivalente à celle des adipocytes du BAT et ceci après une exposition prolongée au froid 23 . La biosynthèse d’UCP1 est finement contrôlée au niveau transcriptionnel, par de nombreux co-régulateurs transcriptionnels ou facteurs de transcription tels que PGC-1α, PRDM16 et PPAR-γ (Figure 8) 21. PGC-1α : Avant l’identification de PRDM16 dans les adipocytes bruns, PGC-1α était considéré comme le marqueur du BAT. C’est un co-activateur de PPAR-γ. Son expression étant stimulée après exposition prolongée au froid, il constitue le marqueur de la thermogénèse dans le BAT ou le « brite ». Ce co-régulateur transcriptionnel forme un complexe avec PPAR-γ et induit, grâce à la voie de la PKA (protéine kinase A), la mitochondriogénèse via l’expression de NRF (nuclear respiratory factor). Ce complexe induit également la transcription d’UCP1 (Figure 8) 22,24. PRDM16 : Protéine de 140kDa permettant la différenciation en BAT en stimulant les gènes spécifiques du BAT et en inhibant ceux du WAT 25 . Lors de l’induction en adipocytes bruns, PRDM16 s’associe à d’autres co-activateurs transcriptionnels tels que PGC-1α et PPAR-γ 26. PPAR-γ : Facteur de transcription indispensable pour la différenciation des tissus adipeux, on le retrouve donc dans les trois types de TA 24,27. UCP2 et UCP3 : uncoupling protein 2-3 Ces protéines possèdent respectivement 59 et 57% d’homologie avec UCP1. UCP2 est exprimée dans plusieurs tissus comme le système nerveux central, les reins, le pancréas ou le tissu adipeux blanc 28,. UCP3 est exprimé principalement dans les muscles squelettiques et dans le BAT 29. Malgré une forte homologie avec UCP1, l’activité découplante de ces protéines reste encore à déterminer. 6 A B 1-36 88 1-36 139 Figure 9 : Structure général de PTHrP. A : Après maturation, PTHrP ((ParaThyroid Hormone Related Protein) peut produire différents peptides. La partie 1-36 est homologue à la partie 1-36 de l’hormone PTH (ParaThyroid Hormone), la partie 38-94 donnera la midregion et la partie 107-139 46 correspondra à l’ostéostatine. (Adapté d’Abdelsayed et al, 2004) B : Homologie en 1-36 des séquences N-terminales de PTH et PTHrP. Cette homologie leur confère une fixation sur le même récepteur (PTH1R : ParaThyroid Hormone Receptor 1) HOXC9 : homeoprotein C9 Un autre marqueur du browning est la protéine HOXC9. Cette protéine a récemment était observée dans le WAT. L’équipe de Walden a montré, que lorsqu’une culture d’adipocytes blancs issus du WAT sous cutané, était exposée au froid de façon prolongée, les adipocytes « brite » présentaient une augmentation de l’expression d’HoxC9. Ce marqueur, n’est cependant pas retrouvé dans le BAT 30 . Ainsi, HoxC9 jouerait un rôle clé dans la différenciation des adipocytes « brite » à partir d’adipocytes blancs 31,32. SHOX2: short stature homeobox protein 2 Chez le rongeur, ce régulateur transcriptionnel est plus exprimé dans le WAT sous-cutané que dans d’autres TA. Cependant son expression n’est pas ubiquitaire, il est retrouvé majoritairement dans le flanc et le dos plutôt que dans la région abdominale 33. Le taux d’ARNm de SHOX2 est élevé dans le « brite » après exposition au froid, de ce fait, SHOX2 constitue un bon marqueur du TA beige. 30,32. PTH/PTHrP: parathyroid hormone /Parathyroid hormone-related protein PTH et PTHrP sont deux hormones appartenant à la grande famille des PTH. L’une comme l’autre jouent un rôle dans le développement des os ainsi que dans l’homéostasie du phosphate et du calcium. Cependant, ces deux hormones ne sont pas codées par les mêmes gènes (Figure 9) 31 . PTH est une hormone endocrine produite principalement par les glandes parathyroïdiennes, sécrétée dans la circulation sanguine. Elle est codée par le gène PTH, c’est un polypeptide de 88 acides aminés obtenu après plusieurs hydrolyses successives. 34 PTHrP est un polypeptide codé par le gène PTHLH. Il est principalement sécrété par certaines tumeurs causant ainsi une hypercalcémie. Ce facteur paracrine contrôlant la formation osseuse endochondrale permet également le transport d’ions calcium Il est cependant synthétisé par certains tissus sains mais son rôle dans ces différents tissus est à ce jour peu compris 33 . La pré-hormone [1-139] est obtenue après clivages endoprotéolityques. Cette hydrolyse entraine la production de 3 peptidiques différents appelés, PTHrP [1-36] ; Midregion [38-94] ; Ostéostatine [107-139] (Figure 9 A) 33. Les parties N-terminale [1-36] de PTH et PTHrP sont hautement homologues car elles partagent 8 des 13 premiers acides aminés (AA) et leurs structures secondaires est similaire sur les 21 AA suivants (Figure 9 B) 33 Ce fragment [1-36] permet l’interaction avec le récepteur PTH1R. Le récepteur PTH/PTHrP est un récepteur couplé aux protéines fortement exprimé au niveau des os et des reins 35. Ce récepteur est associé à au moins deux systèmes de transduction du signal, les voies des PKA et PKC (Protéines Kinases A et C).32. 7 Tumeur Inflammation IL-6 Inflammation + + Browning Lipolyse IL-6 / TNFα Cachexie Hypothermie Figure 10 : Représentation des interactions entre la tumeur, le browning et la cachexie. La tumeur sécrète des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNFα ou l’IL-6. L’IL-6 est impliquée dans la stimulation du browning. Le TNFα contribue à l’accentuation de l’état cachectique. Browning et cachexie sont intimement liés, la lipolyse est augmentée lors du browning conduisant à une aggravation de la cachexie. De plus, l’hypothermie induite par une immobilité peut être compensée par le browning. En conclusion, la cachexie et le cancer sont intimement liés et l’étendue de la littérature sur ce sujet le démontre. Le browning a longtemps été étudié dans le contexte de l’obésité. Pourtant, depuis quelques années, la communauté scientifique s’intéresse à ce processus dans le cadre des cancers et plus récemment de la cachexie. La tumeur sécrète des médiateurs de l’inflammation (IL-6 ) qui stimulent le browning 3. L’Il-6 ainsi que d’autres cytokines inflammatoires comme le TNFα sont également libérés par la tumeur et accentue l’état cachectique 3,7. Lorsque le browning est induit par la tumeur, une augmentation de la lipolyse est observée 18,22 . Ce catabolisme lipidique entraine un état cachectique 36 . De plus, l’équipe de Petruzzelli démontre que l’affaiblissement induit par la cachexie, entraine une immobilité des souris. La production de chaleur étant alors réduite, une hypothermie est observée chez ces souris cachectiques. Le browning permettrait ainsi de compenser cet état hypothermique 3. Pour finir, dans cette étude des marquages d’UCP1 ont été effectués sur des prélèvements d’adipocytes blancs de patients atteint de différents cancers. De manière intéressante, UCP1 est constitutivement retrouvée sur des échantillons de patients atteints de cancers CAC. Cependant, le seul cancer non cachectique ici étudié (colon sans cachexie, probablement en stade précoce) ne présente quasiment pas de protéine UCP1. Ainsi, le browning et les CAC paraissent étroitement liés 3. L’équipe de Kir et al 37 a mis en évidence une nouvelle hormone libérée par la tumeur , le PTHrP. Cette hormone jouerait un rôle dans l’induction du browning. Nous allons à présent vous présenter les résultats de cette étude. 8 A B C D E F G H FIGURE 11 : LA TUMEUR LLC INDUIT UNE CACHEXIE ET UN PHENOMENE DE BROWNING DANS LE TISSU ADIPEUX 6 5x10 cellules LLC sont injectées dans le flanc des souris. Elles sont suivies pendant 21 jours (n=6 pour chaque groupe) NTB=Non Tumour Bearing. Le poids des carcasses (calculé en soustrayant le poids de la tumeur au poids total) (A) et les poids des tissus adipeux et musculaires (B) sont mesurés. Les taux d’expression des ARNm dans les iWAT (C), eWAT (D), iBAT (E) et dans le muscle gastrocnémien (F) ont été déterminés par RT-PCR quantitative. Les souris saines (WT) et les souris Prdm16-Knockdown (KO) ayant reçu les cellules LLC sont sacrifiées au jour 11 (n=5 pour le groupe KO-LLC et n=6 pour les autres groupes) (G). Le poids des tissus adipeux et musculaires (G) ainsi que la masse tumorale (H) ont été mesurés. Les valeurs sont des moyennes ± l’écart-type de la moyenne (SEM). L’analyse statistique a été effectuée avec un test t bilatéral. *, P<0,05 ; **,P<0,005 ; ***,P<0,0005 comparé avec le groupe NTB. d, jour. (A-F) *, **, *** pour comparer le groupe NTB au groupe LLC. #, ##, ###, pour comparer le groupe WT au groupe KO. *, P<0,05 ; **, P<0,005 ; ***,P<0,0005 ; #,P<0,05 ; ##,P<0,005 ; ###,P<0,0005. (G, H) Présentation d’une publication Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia37 Comme expliqué en introduction, la cachexie est un syndrome particulièrement dévastateur caractérisé par une augmentation de l’inflammation, une perte des masses adipeuses et musculaires ainsi qu’un dérèglement de la balance énergétique. Elle constitue donc un facteur négatif pour les thérapies anti cancéreuses envisagées chez les patients. Les mécanismes moléculaires liés à la cachexie sont complexes et peu compris. Une élévation des cytokines inflammatoires est observée lors de ce syndrome. Pourtant, les thérapies anticytokines ne sont pas efficaces 37. Une activation du BAT a été décrite chez des souris et certains patients atteints de CAC. Il n’est à ce jour par déterminé comment la tumeur induit la thermogénèse ni comment ceci entraine une perte des masses adipeuses et musculaires. Pour comprendre de quelle manière la tumeur stimule le browning l’équipe de Serkan Kir a utilisé un modèle murin de cancer du poumon: Lewis Lung Carcinoma (LLC) provoquant la cachexie des souris cancéreuses. Les auteurs ont dans un premier temps étudié les effets de la tumeur sur l’induction du browning et de la cachexie. Pour ce faire, des cellules LLC sont injectées en sous-cutanée à des souris syngéniques C57BL/6, on obtient alors l’induction d’une tumeur présente sous la peau avec des caractéristiques d’une tumeur pulmonaire et le développement d’une cachexie. Toutes les souris cancéreuses perdent du poids au cours des trois semaines avant sacrifice (Figure 11 A), incluant une diminution des tissus adipeux et musculaires (Figure 11 B). Différents tissus adipeux (TA) sont étudiés, le iWAT est le tissu adipeux inguinal (type sous cutané), le eWAT est le tissu adipeux épididymaire (type viscéral). Pour finir, l’iBAT est le TA brun inter-scapulaire, localisation majoritaire de ce tissu chez les rongeurs. La cachexie des souris cancéreuses est aussi caractérisée par une augmentation de l’expression des gènes impliqués dans l’atrophie musculaire comme MSTN, FBXO32 et TRIM63 (Figure 11 F). MSTN (myostatine) est anciennement connue sous le nom de Growth différentiation factor 8 (GDF8). C’est un facteur de croissance qui limite la croissance des tissus musculaires. Elle fait partie de la famille des TGF β-1. FBXO32 est également connu sous le nom d’atrogin1. Cette protéine est grandement exprimée lors de l’atrophie musculaire. C’est un composant d’un complexe d’ubiquitination favorisant l’adressage aux protéasomes pour la dégradation de certaines protéines. 9 TRIM63 est également nommé MURF1. Lors d’une privation en acides aminés cette protéine adresse des protéines musculaires aux protéasomes pour alimenter les autres organes en acides aminés. De plus, elle inhibe la synthèse de nuovo de protéines musculaires. En réponse à la progression tumorale, tous ces types de TA présentent une augmentation de l’expression des gènes impliqués dans la thermogénèse comme UCP1, DIO2 et PGC1a (Figure 11 C-E). PGC1α : (Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1- α) est un co-activateur de PPAR-γ (Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ). Son expression étant stimulée après une longue exposition au froid, il constitue le marqueur de la thermogénèse dans le TA. De plus, il participe à la régulation transcriptionnelle d’UCP1 22,24 (Figure 8). DIO2: (Type II iodothyronine deiodinase) est responsable de la transformation de l’hormone thyroïdienne T4 (3,5,3',5'-tetraiodothyronine) en T3 (3,5,3'-triiodothyronine). La T3 en se fixant sur la région promotrice « Thyroid Response Element » d’UCP1 permet une activation de la transcription d’UCP1 (Figure 8) 20. Parallèlement, Serkan Kir et al, étudient d’autres gènes impliqués dans le métabolisme énergétique et ces derniers voient également leur expression augmenter (Figure 11 C-E). ACSL1 joue un rôle dans la lipogenèse permettant d’augmenter le pool de lipides disponibles. HSL et ATGL sont des lipases de la lipolyse permettant ainsi de libérer les acides gras à partir des triglycérides pour alimenter la β-oxydation. Pour finir, ACOX1 au cours de la β-oxydation convertit les acides gras en Acétyl Co-A pour alimenter le cycle de Krebs. GLUT 1-4 sont les récepteurs du glucose permettant une augmentation intracellulaire du glucose pour une conversion en pyruvate menant à une intégration dans le cycle de Krebs. Pour déterminer si le browning aggrave l’état cachectique, les chercheurs ont utilisé des souris déficientes pour le facteur PRDM16 38 Elles sont caractérisées par une diminution accrue de leur potentiel thermogénique et sont résistantes au browning. Comme précédemment 5x106 cellules LLC sont injectées dans le flanc droit des souris. La perte de TA est significativement inhibée chez les souris cancéreuses et déficientes pour PRDM16 tandis que le volume tumoral n’est pas statistiquement différent. Par ailleurs, les masses musculaires ne sont pas affectées (Figure 11 G, H). Nous émettons une réserve quant à l’analyse sur les masses musculaires, en effet, les auteurs ont sacrifié ces souris à 11 jours. Ce temps d’induction du cancer et de la cachexie n’est peut être pas le plus meilleur pour déterminer un lien entre browning et cachexie. L’ensemble de ces résultats démontre que la tumeur induit une cachexie et un phénomène de browning dans les tissus adipeux. 10 A B C D FIGURE 12 : LA TUMEUR LLC SECRETE DES FACTEURS QUI STIMULENT L’EXPRESSION DES GENES DE LA THERMOGENESE DANS LES ADIPOCYTES. Les cellules LLC sont mises en culture pendant 24h (n=3) puis les surnageants sont filtrés, plus ou moins concentrés et ajoutés à des cultures d’adipocytes primaires pendant 24h (A). 30 clones de cellules LLC sont mis en culture pendant 24h puis leurs surnageants sont ajoutés à d’autres cultures primaires d’adipocytes pendant 24h (B). L’expression des gènes de la thermogénèse est suivie par RT-PCR quantitative (A, B). Ap2 et Pparg sont des contrôles de la différenciation des adipocytes. L’analyse du transcriptome avec des sondes, (GeneChip MouseGenome 430 2.0 arrays -Affymetrix) représentant le génome murin, donne la carte d’expression de gènes codant pour des facteurs de sécrétion (C). Des adipocytes primaires sont traités avec les protéines identifiées en C à 1µg/mL pendant 24h (n=3) (D). Les valeurs sont des moyennes ± l’écart-type de la moyenne (SEM). L’analyse statistique a été effectuée avec un test t bilatéral. *, P<0,05 ; **,P<0,005 ; ***,P<0,0005 comparé avec le groupe contrôle. Pour comprendre comment la tumeur induit le browning du TA, l’équipe souhaite identifier les facteurs responsables d’une augmentation de l’expression des gènes de la thermogénèse. Pour ce faire, le surnageant de culture LLC est filtré sur membrane de 3-KDa et différentes fractions sont testées sur des cultures primaires d’adipocytes (prélevés à partir du TA blanc inguinal ou du BAT inter scapulaire). Seules les fractions retenues sur filtre de 3kDa stimulent l’expression des gènes de la thermogénèse tels qu’UCP1 et DIO2 (Figure 12 A). Ces résultats suggèrent que les facteurs sécrétés par la tumeur LLC sont des macromolécules. De plus, ces résultats démontrent que l’induction du browning ne nécessite pas un dialogue entre la tumeur et les adipocytes (Figure 12 A). D’autre part, pour identifier les facteurs qui stimulent la thermogénèse l’équipe a généré une série de clones afin de déterminer le profil d’expression des gènes. A partir de cellules LLC en culture, 30 clones sont obtenus et les surnageants sont récupérés pour produire 30 milieux conditionnés indépendant puis testés sur cultures primaires d’adipocytes. De manière intéressante les chercheurs observent une hétérogénéité induite par le microenvironnement tumoral (UCP1 différemment exprimé en fonction des clones observés) (Figure 12 B). Les auteurs ont choisi huit clones présentant des activités thermogéniques plus ou moins importantes (quatre clones avec UCP1 très exprimé, quatre clones avec UCP1 moins exprimé). Le profil d’expression de ces derniers est analysé avec des sondes (GeneChip MouseGenome 430) représentant le génome murin. Les ARNm fortement exprimés dans les clones les plus thermogéniques sont identifiés (Figure 12 C). Ensuite, les protéines correspondantes sont testées sur cultures primaires d’adipocytes. Certaines induisent l’expression d’UCP1 (Figure 12 D). Ces protéines ainsi identifiées sont des membres de la famille des EGF (Epidermal Growth Factor) comme la Betacelluline (BTC), l’Heparin-Binding EGF like growth factor (HB-EGF) et l’Épireguline (EREG) ainsi que des protéines relatives aux hormones parathyroïdiennes (parathyroid-hormone-related peptide: PTHrP). Comme expliqué en introduction, PTHrP a plusieurs isoformes dont PTHrP (1-34). La PTH (parathyroid-hormone) et la PTHrP sont homologues aux extrémités N-term (PTH 1-34, PTHrP 134) leur conférant une fixation sur le même récepteur. 31-33 Ces résultats indiquent que les cellules tumorales LLC sécrètent des facteurs qui stimulent l’expression des gènes de la thermogénèse dans les adipocytes, potentiellement les membres de la famille des EGF et PTHrP. 11 A B C D E F FIGURE 13 : LE BROWNING DES ADIPOCYTES INDUIT PAR LA TUMEUR LLC EST DÛ AUX PTHrP. Des cultures d’adipocytes primaires du tissu adipeux inguinal (n=3 pour chaque groupe) sont traités avec 1 µM d’AST-1306 en présence ou en absence de 100 ng/mL de BTC, EREG ou HBEGF (A) ou en présence de milieu conditionné LLC pendant 24h (B). Les adipocytes primaires (n=3 pour chaque groupe) sont traités avec 10 µg/mL d’IgG ou d’anticorps anti-PTHrP et avec 10 ng/mL de PTHrP pendant 4h (C) ou pendant 24h avec du milieu conditionné LLC (D). Des adipocytes primaires du tissus adipeux inguinal sont privés de sérum pendant 2h et prétraités avec 50 µM d’H89 pendant 1h puis 100 nM de NE, 100 ng/mL de PTHrP ou 100 ng/mL de PTH sont ajoutés pendant 30 min pour analyser la phosphorylation des protéines par Western blot (E, F). L’expression des gènes de la thermogénèse est suivie par RT-PCR quantitative. Les valeurs sont des moyennes ± l’écart-type de la moyenne (SEM). L’analyse statistique a été effectuée avec un test t bilatéral *, **, *** pour comparer les groupes au groupe contrôle IgG. #, ##, ###, pour comparer le groupe PTHrP au groupe LLC. *, P<0,05 ; **,P<0,005 ; ***,P<0,0005 ; #,P<0,05 ; ##,P<0,005 ; ###,P<0,0005. (A-D) *,P<0,05 ; **,P<0,005 ; ***,P<0,0005 comparé avec le groupe contrôle (F). Aux vues de ces résultats, les chercheurs souhaitent aller plus loin en déterminant quels facteurs sont impliqués dans cette induction de la thermogénèse. Dans un premier temps, pour déterminer la contribution de BTC, EREG et HBEGF sur le browning, l’équipe utilise un inhibiteur irréversible (AST-1306) des récepteurs aux EGF sur des adipocytes primaires en culture. Cette inhibition empêche l’expression des ARNm d’UCP1 exprimés par des adipocytes non traités au milieu LLC après induction par la famille des EGFs (Figure 13 A). Cependant, l’expression d’UCP1 n’est pas inhibée lorsqu’ AST-1306 est ajoutée aux adipocytes cultivés en présence de milieu conditionné LLC (Figure 13 B). Ces résultats suggèrent que les membres de la famille EGF n’ont pas de rôle crucial dans le browning induit par la tumeur LLC. Dans un second temps, un anticorps inhibiteur de PTHrP est utilisé pour déterminer son implication dans l’induction des gènes de la thermogénèse en présence de la tumeur. Cet anticorps inhibe entièrement les effets de PTHrP sur l’induction d’UCP1 et DIO2 en absence de milieu LLC (Figure 13 C). De manière intéressante, quand les adipocytes sont traités avec le milieu conditionné LLC et l’anticorps anti-PTHrP, l’expression d’UCP1 et DIO2 est également inhibée (Figure 13 D). Ces résultats indiquent que PTHrP montre un rôle dans l’induction des gènes de la thermogénèse et donc un possible effet sur la thermogénèse. Le récepteur aux PTHrP est couplé à une protéine G et active la voie des Protéines Kinases A (PKA). La noradrénaline (NE) se fixe sur les récepteurs β-adrénergiques, également connus pour activer cette voie et pour induire l’expression des gènes de la thermogénèse. Ainsi, l’équipe a décidé d’observer cette voie de signalisation. Le traitement des cultures primaires d’adipocytes avec NE et PTHrP stimule la phosphorylation des substrats de la PKA CREB et HSL (Figure 13 E). Un inhibiteur de cette PKA, le H89, bloque la voie de signalisation de PTHrP, induisant une perte de l’expression des gènes de la thermogénèse (Figure 13E, F). Ces résultats démontrent que le browning des adipocytes induit par la tumeur est dépendant des PTHrP. Ces derniers utilisent la voie des PKA pour induire l’expression d’UCP1 et DIO2 et partagent des mécanismes moléculaires communs avec la voie β-adrénergique. 12 A C B D E Figure 14 : IN VIVO, PTHrP AFFECTE LE BROWNING ET LA CACHEXIE. Les souris reçoivent les cellules LLC et 10 mg/kg de souris d’IgG ou d’anticorps anti-PTHrP tous les 3 jours du jour 6 au jour 15. Elles sont sacrifiées au jour 16 (n=4, 5 et 6 pour les groupes NTB (Non Tumor Bearing), IgG et anti-PTHrP respectivement) (A, B, D, E). L’expression des gènes de la thermogénèse est suivie par RT-PCR quantitative. (A, B) Mesures des taux plasmatiques de PTHrP des souris portant la tumeur LLC au cours du temps jusqu’au jour 21 (n=6) (C). Les tissus adipeux et musculaire sont pesés (D). La masse tumorale est montrée (E). Les valeurs sont des moyennes ± l’écart-type de la moyenne (SEM). L’analyse statistique a été effectuée avec un test t bilatéral *, **, *** pour comparer le groupe NTB au groupe contrôle IgG. #, ##, ###, pour comparer le groupe anti-PTHrP au groupe IgG. *, P<0,05 ; **, P<0,005 ; ***, P<0,0005 ; #, P<0,05 ; ##, P<0,005 ; ###, P<0,0005. (A-D) Afin de confirmer leurs résultats, l’équipe a étudié l’effet de l’inhibition de PTHrP in vivo chez la souris. Cette inhibition bloque l’expression des gènes de la thermogénèse dans les eWAT et iBAT (Figure 14 A, B). De plus, près de 500 pg/mL de PTHrP plasmatique sont mesurés chez les souris LLC après 3 semaines d’induction de la tumeur (Figure 14 C). L’anticorps (Ac) anti-PTHrP (ou un contrôle IgG) est ensuite injecté à ces dernières. De manière intéressante, les souris LLC ayant reçu l’Ac antiPTHrP ne perdent pas de poids, tandis que les souris LLC contrôles (IgG) démontrent une cachexie (Figure 14 D). De surcroit, le traitement anti-PTHrP inhibe la perte des masses adipeuses et musculaires sans changer la masse tumorale (Figure 14 E). En partant du principe que l’inhibition des effets de PTHrP par l’anticorps n’est probablement pas totale (présence de faux négatifs), ces résultats démontrent un rôle clé de PTHrP sur la cachexie induite par la tumeur LLC. L’ensemble de ces résultats démontre que PTHrP est un facteur clé de l’induction de la cachexie associée au cancer. Qu’il est libéré par la tumeur LLC et qu’il stimule l’expression des gènes de la thermogénèse du tissu adipeux. L’inhibition de PTHrP bloque le browning et la perte de masses adipeuses. Ainsi, l’ensemble de ces données suggère un modèle selon lequel PTHrP agirait seul pour induire le browning des tissus adipeux. Afin de confirmer certains des résultats obtenus par l’équipe de Serkan Kir, nous proposons d’utiliser le même modèle de souris LLC. Nous souhaitons aller plus loin en observant UCP1 au niveau protéique et en approfondissant la caractérisation du browning. De plus, pour renforcer l’étude sur PTHrP, il est indispensable d’utiliser un modèle de souris portant une réelle tumeur pulmonaire. Nous souhaitons également déterminer si PTHrP est libéré par d’autres types de tumeurs. En seconde partie de projet, nous avons pour objectif d’étudier l’inhibition d’UCP1 avec un modèle de souris KO UCP1. Ces souris devraient être déficientes pour le browning, ce qui nous permettra d’appréhender le lien entre cancer, browning et cachexie. 13 A C57BL/6 + PBS C57BL/6 + LLC Anti-PTHrP IgG B LLC / PBS * 0 Anti- PTHrP ou IgG 8 11 8 Semaines 14 Sacrifice * 17 * Calorimétrie indirecte 20 21 Jours Figure 15 : Modèles expérimentaux et chronologie du programme expérimental. 6 A : Une injection de 5x10 cellules cancéreuses LLC (Lung Lewis Carcinoma) est réalisée en sous cutanée à dix mâles âgés de 8 semaines au niveau du flanc droit (pour le groupe « tumeur LLC »). Une injection contrôle de solution saline (PBS) est réalisée de façon identique à dix autres mâles (pour le groupe « sans tumeur »). Une injection en intra péritonéal de 10 mg d’anti-PTHrP par gramme de souris à dix mâles est effectuée (pour les groupes « avec ou sans tumeur LLC »). Pour finir, une injection contrôle de 10 mg d’IgG par gramme de souris est faite sur dix autres mâles (pour les autres groupes « avec ou sans tumeur LLC »). B : A J0, une injection des cellules LLC ou PBS est administrée. A J1, huit souris (deux par groupe) sont placées en cages de calorimétrie indirecte pendant 24h. Les anticorps sont injectés tous les trois jours, du jour 8 au jour 20. A J20 une seconde série d’expériences de calorimétrie indirecte est menée sur les mêmes souris qu’en J1. Le sacrifice des souris est effectuée 21 jours après injection des cellules LLC ou PBS. Le poids des souris est contrôlé quotidiennement. Projet de recherche I/ Confirmer les effets de PTHrP sur la protéine UCP1 et le browning A/ Sur le modèle de souris C57BL/6 Comme décrit précédemment, l’équipe de Serkan Kir observe une augmentation de l’ARNm UCP1 après stimulation aux PTHrP. Cette augmentation est observée dans les WAT épididymaires et inguinaux ainsi que dans le BAT. Cependant ces résultats n’ont pas étés confirmés au niveau protéique. De plus, la caractérisation du browning doit être approfondie. En effet, seule une étude morphologique des adipocytes a été réalisée et aucune analyse fonctionnelle des mitochondries n’a été effectuée 37. Ainsi, dans un premier temps, nous avons pour objectif de confirmer les effets de PTHrP sur la protéine UCP1 et la régulation du browning. 1) Les animaux Vingt souris mâles C57BL/6 commandées chez Jackson Laboratory seront étudiées. Toutes les études sur les souris seront réalisées en accord avec les directives et provisions de la Commission pour les Expérimentations Animales du Ministère Scientifique Français et les recommandations du comité éthique local. Nous travaillerons sur des mâles maintenus dans un cycle circadien à température ambiante (≈22°C) et leur prise alimentaire sera contrôlée. Une injection de 5x106 cellules cancéreuses LLC (Lung Lewis Carcinoma) sera réalisée en sous cutanée à dix mâles âgés de 8 semaines au niveau du flanc droit. Ces souris constitueront notre modèle d’étude de la cachexie cancéreuse. Pour les souris contrôles, une injection de solution saline (PBS) sera administrée (Figure 15 A, B). Les cellules LLC auront préalablement été mises en culture dans du milieu Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) 10% SVF, en présence de pénicilline et streptomycine 37 . Afin d’étudier les effets de PTHrP, des anticorps neutralisants seront injectés en intra péritonéal à dix mâles (avec ou sans tumeur LLC). Les administrations seront réalisées tous les trois jours, du jour 8 au jour 20 (après injection des cellules LLC) à raison de 10 mg d’anti-PTHrP par gramme de souris. Un groupe de dix mâles (avec ou sans tumeur LLC) recevra 10 mg d’IgG par gramme de souris. Le sacrifice des souris sera réalisé par dislocation cervicale 21 jours après l’injection des cellules LLC (Figure 15 A, B). 14 WAT Sous cutané Inguinal WAT Viscéral Rétro péritonéal Coloration Marquage Marquage H&E UCP1 IF1 Coloration Marquage Marquage H&E UCP1 IF1 BAT Inter scapulaire Coloration Marquage Marquage H&E UCP1 IF1 Figure 16 : Programme expérimental des analyses histologiques. Trois séries de coupes histologiques sont effectuées pour les différents groupes de souris (Figure 16 A). Trois types de tissu adipeux (TA) sont étudiés. Deux types de tissus adipeux blancs (WAT, White Adipose Tissue), sous-cutané (inguinal) et viscéral (rétro péritonéal). Un type de tissu adipeux brun (BAT, Brown Adipose Tissue), l’inter scapulaire. Chaque type de tissu adipeux est prélevé du côté droit (péri tumoral) et gauche pour comparaison. Les séries de coupes ne sont pas traitées de la même façon. Les protocoles diffèrent pour la coloration H&E et les marquages par immunohistochimie d’UCP1 et d’IF1. 2) PTHrP et cachexie L’évolution de la cachexie sera suivie au cours du temps par des pesées journalières. Au sacrifice les tissus adipeux blancs viscéraux (rétro péritonéaux) et sous cutanés (inguinaux) ainsi que le tissu adipeux brun inter scapulaire seront pesés. Chaque tissu adipeux blanc sera prélevé à partir du côté droit (péri tumoral) et du côté gauche des souris. Ces deux prélèvements nous permettrons de déterminer si la cachexie est plus accentuée en péri tumoral. La cachexie étant également caractérisée par une perte des masses musculaires, nous procéderons également à la pesée des muscles gastrocnémien (mollets droit et gauche). 3) PTHrP et browning Après sacrifice, les tissus adipeux récupérés précédemment pour les différentes pesées, seront utilisés pour effectuer des analyses histologiques. Les tissus seront fixés dans un tampon PBS à 3,7% formaline, inclus en paraffine, déshydratés et des sections de 6 µm seront effectuées avec un microtome. Ces expériences seront effectuées comme expliqués dans la publication de Petruzzelli,et al3. Une première partie des différentes de coupes effectuées seront colorées à l’hématoxyline-éosine. Cette étape nous permettra de caractériser les adipocytes (tailles, morphologies et nombres). La taille (diamètre) et les quantités relatives des adipocytes de chaque type de TA, seront déterminées manuellement grâce au logiciel Image J, à raison de 50 adipocytes par coupe. Cette première étude nous permettra de comparer les différents types de TA de souris cachectiques cancéreuses ayant reçu (ou non) un anticorps neutralisant de PTHrP. Nous nous attendons à observer, chez des souris cachectiques traitées sans anticorps antiPTHrP, des différences de tailles, nombres et morphologies des adipocytes du TA inguinal. Certains adipocytes devraient tendre vers une morphologie du BAT soit des adipocytes plus nombreux, plus petits avec présence de multiples vacuoles lipidiques. Les TA des souris cachectiques traitées avec les anticorps anti-PTHrP devraient tendre vers une morphologie du WAT viscéral (lieu non préférentiel du browning) (Figure 16). Une seconde et troisième partie des coupes seront dédiées à une analyse immunohistochimique des protéines UCP1 et IF1 (anticorps commandés chez Abcam). IF1 (ATP synthase Inhibitor Factor 1) est connu pour bloquer l’ATP synthase mitochondriale dans sa configuration inactive pour éviter que cette dernière hydrolyse l’ATP lorsque le potentiel membranaire est trop faible. IF1 constitue donc un second marqueur du découplage mitochondrial 40. 15 Les sections devront être déparaffinées, une étape de démasquage de l’antigène (UCP1 ou IF1) devra être effectuée pour ensuite ajouter les anticorps anti-UCP1 et anti-IF1. Finalement, les coupes seront contre colorées à l’hématoxyline 3 (Figure 16).. Lors de la mise en place du projet nous souhaitions observer le découplage mitochondrial par analyses en microscopie électronique à transmission. Après une rencontre avec Mme Stéphanie BALOR, responsable de la plateforme METI (microscopie électronique intégrative), nous avons pris conscience de l’ampleur du travail tant sur la préparation des échantillons que sur l’analyse des données. En effet, chaque échantillon doit être soumis à différents traitements répartis sur une semaine. De plus, les tissus adipeux ne peuvent pas être conservés et doivent être traités au moment du sacrifice pour les analyses histologiques. En effet, la congélation peut entrainer une destruction de la vacuole lipidique. Cette information est loin d’être négligeable pour une mise en place d’un aussi grand nombre d’analyse histologiques. Pour toutes ces raisons, une seule analyse des mitochondries sera effectuée ici pour l’ensemble du projet. Cette étape devrait nous permettre d’observer une différence de nombre des mitochondries selon le type de TA observé en fonction que les souris aient été traitées avec ou sans anti-PTHrP. De plus, la microscopie électronique nous informera sur la densité en électrons des mitochondries après ajout d’un contrastant (osmium). Une mitochondrie active voit son nombre de crêtes mitochondriales augmenter, et apparait plus denses aux électrons. En comparant, les mitochondries de TA inguinaux de souris cancéreuses ayant reçu des injections d’anticorps anti-PTHrP, par rapport à des TA inguinaux de souris contrôles (sans anticorps antiPTHrP) ; nous pourrons confirmer de façon fonctionnelle l’effet inhibiteur de PTHrP sur le browning. Pour cette étude, nous procéderons de la même manière que l’équipe d’Ozaki Kiyokazu dans le cadre de leur étude de la fonction et du phénotype du BAT 39. Pour finir, le métabolisme général des souris sera suivi par des expériences de calorimétrie indirecte (Figure 15 B). Cette étude nous permettra de déterminer la dépense énergétique ainsi que la production de chaleur des souris avec ou sans inhibition des effets de PTHrP (en présence ou en absence de tumeur). La dépense énergétique ainsi que la production de chaleur seront calculés grâce aux mesures des échanges gazeux (consommation d’O 2 et production de CO2). Les expériences seront réalisées comme indiqué dans l’étude de Julie Marcotorchinoa 41. 16 KrasG12D Adéno vide A KrasG12D Adéno CRE Anti-PTHrP IgG Culture Adipocytes B Inhalation Adénovirus 0 Anti- PTHrP ou IgG Sacrifice Prélèvements sanguins 1 2 3 4 5 Agés de 8 semaines 6 7 8 Semaines Figure 17 : Modèles expérimentaux et chronologie du programme expérimental. G12D A : Toutes les souris portent la mutation Kras comportant une cassette stop bordée de deux sites LoxP reconnus par 7 l’enzyme CRE recombinase. Une solution d’adénovirus à 2,5x10 PFU exprimant l’enzyme CRE recombinase est administrée G12D par inhalation à dix mâles Kras âgés de 8 semaines (groupe cancer du poumon). Les souris sont anesthésiées au Vetflurane 5% et inspirent la solution par inhalation réflexe au réveil. Une solution contrôle d’adénovirus sans CRE G12D recombinase est administrée par inhalation à dix autres mâles Kras âgés de 8 semaines (groupe sans cancer). 10 mg d’anti-PTHrP par gramme de souris sont injectés en intra péritonéal à dix mâles (groupe avec ou sans cancer du poumon). Pour le contrôle, 10 mg d’IgG par gramme de souris sont injectés à dix autres mâles (avec ou sans cancer du poumon). B : A S0, les inhalations d’adénovirus sont effectuées. Aux semaines 0, 2, 4, 6 et 8 différents échantillons sanguins à partir de la veine saphène sont prélevés. Les anticorps sont injectés tous les trois jours, de la semaine 6 à la semaine 8. Le sacrifice des souris est effectué huit semaines après l’inhalation de l’adénovirus. Au sacrifice, le tissu adipeux blancs inguinal de deux souris contrôle est prélevé pour cultures primaires d’adipocytes. Le poids des souris est contrôlé chaque semaine. B/ Sur le modèle de souris KrasG12D L’objectif de cette partie, est de vérifier que PTHrP agit sur UCP1 et donc influe le browning à partir d’un modèle présentant une tumeur localisée, cette fois ci aux poumons. 1) Les animaux Pour des raisons budgétaires, deux couples de souris KrasG12D transgéniques seront commandés chez Jackson Laboratory 42. L’élevage sera effectué en interne afin d’obtenir vingtdeux mâles. Ces souris portent la mutation KrasG12D comportant une cassette stop bordée de deux sites LoxP reconnus par l’enzyme CRE recombinase. L’inhalation d’un adénovirus exprimant l’enzyme CRE recombinase nous permet d’induire une tumeur localisée au poumon (Genecust, Luxembourg). Dix mâles âgés de huit semaines seront anesthésiés au Vetflurane 5% et inspireront une solution d’adénovirus à 2,5x107 PFU par inhalation réflexe à leur réveil. Ces mâles « KrasG12D/Adéno-CRE » constitueront notre modèle de souris cancéreuses cachectiques. Afin d’être dans un état de cancer avancé et ainsi d’observer une cachexie plus marquée, les souris seront sacrifiées huit semaines après inhalation. Comme en partie I/A, dix souris (5 KrasG12D/Adéno-CRE + 5 KrasG12D/Adéno-vide) recevront des injections d’anticorps neutralisant PTHrP six semaines après inhalation de l’adénovirus. Les injections seront réalisées tous les trois jours de la semaine 6 à la semaine 8 à raison de 10 mg d’anti-PTHrP par gramme de souris. Le groupe contrôle recevra 10 mg d’IgG par gramme de souris (Figure 17). Deux souris contrôles seront dédiées à des cultures primaires d’adipocytes, que nous décrirons plus tard (Figure 17). 2) PTHrP et cachexie La cachexie sera étudiée comme précédemment (suivi du poids corporel chaque semaine et pesées des tissus adipeux et musculaires au sacrifice). Nous avons également souhaité suivre l’inflammation, qui est une des caractéristiques indispensables pour confirmer une cachexie. Pour ce faire, des prélèvements sanguins réalisés à partir de la veine saphène seront effectués toutes les deux semaines (Figure 17). Le sang sera centrifugé et le plasma conservé à -80°C pour effectuer des dosages de TNFα et IL-6 par test ELISA. 17 3) PTHrP et browning La caractérisation du browning sera effectuée comme précédemment (Figure 16). Des coupes histologiques seront faites pour étudier la morphologie des TA et marquer UCP1 et IF1. Pour aller plus loin dans la caractérisation du browning, nous souhaitons étudier deux marqueurs moléculaires des adipocytes beiges: Hoxc9 et Shox2. Ainsi, après sacrifice, environ 100 mg de TA blancs (viscéraux et sous cutanés) et brun seront prélevés et conservés à -80°C pour réaliser l’extraction des ARN en temps voulu. Les RT-qPCR seront effectuées comme décrit par l’équipe de Waldén30. Le plasma récolté pour le suivi de l’inflammation sera également utilisé pour doser PTHrP. Nous pourrons ainsi suivre son évolution en fonction de l’avancé du cancer par test ELISA. D’après l’étude menée par Serkan Kir et Al, sur le modèle de souris LLC, la concentration plasmatique en PTHrP atteint environ 500 pg/mL 21 jours après injection des cellules LLC aux souris 37. Comme nous ne travaillons pas sur le même modèle, il nous est difficile de comparer les temps de développement des cancers. Il faudra donc vérifier que la concentration plasmatique en PTHrP soit supérieure ou égale à 500 pg/mL avant de procéder à son inhibition en semaine six. Si les concentrations plasmatiques correspondent, les anticorps seront injectés pendant 14 jours à partir de la semaine 6 (Figure 17). Si besoin est, nous attendrons. 4) Caractérisation des tumeurs Nos analyses sur ce modèle seront complétées par une observation des tumeurs développées par les souris ayant reçu les traitements précédemment décrits. Au sacrifice, les poumons seront pesés, les nodules comptés puis les poumons seront inclus en paraffine pour des analyses immunohistochimiques avec un marquage au KI67. C/ In vitro, sur d’autres types de cancers Pour des raisons éthiques et pratiques, nous n’effectuerons pas cette étape in vivo mais travaillerons sur des cultures primaires d’adipocytes à partir de deux souris contrôles sacrifiées en partie I/B. La membrane plasmique de l’adipocyte étant très fragile et vulnérable à la pression mécanique, l’adipocyte mature éclate au bout de 24 à 48 heures en condition de culture classique. Par conséquent, la plupart des études sur les adipocytes sont réalisées sur des préadipocytes différenciés in vitro 43. Nous procéderons de la même manière que l’équipe de Serkan Kir, le WAT sous-cutané (inguinal) et le BAT seront récupérés pour réaliser des cultures primaires d’adipocytes 37 18 LLC Mélanome Pancréas Prostate Colon Cultures lignées cancéreuses Surnageants (ELISA: PTHrP) Contrôle Cultures primaires d’adipocytes Western Blot UCP1 et IF1 Seahorse sur les cultures primaires Figure 18: Schéma général des analyses in vitro. Cinq lignées cancéreuses sont mises en culture: pancréas, colon, prostate, mélanome et culture de cellules LLC. Les surnageants sont filtrés par sur membrane de 3 kDa. La présence de PTHrP est observée par dosage ELISA puis des cultures d’adipocytes sont traitées avec ces différents surnageants pendant 24h. Pour contrôle, une culture d’adipocyes primaires sera traitée par du tampon DMEM. Après les 24h de traitements, les quantités d’UCP1 et d’IF1 sont observées par Western Blot. Le découplage mitochondrial est suivi par la technique du Seahorse Parallèlement, différentes lignées tumorales seront mises en culture. Comme expliqué en introduction, les cancers du pancréas, de la prostate, du colon ainsi que les mélanomes évoluent vers une cachexie 1,36. Pour contrôle positif, nous étudierons également la lignée tumorale LLC 37. Nous utiliserons la lignée « LTPA » pour l’étude du cancer pancréatique. La lignée « PNEC30 » pour l’étude du cancer de la prostate. La lignée « B16 » pour le mélanome et enfin, la lignée « CT26, CL25 » pour l’étude du cancer du colon. Les lignées tumorales seront commandées chez LGC Standards-ATCC. Les cellules seront maintenues dans du milieu DMEM à 10% SVF, en présence de pénicilline et streptomycine 37 . Au bout de 3 jours, ce milieu sera filtré sur membrane de 3 kDa comme expliqué dans l’étude de Serkan Kir 37 . Les milieux conditionnés obtenus contiendront donc les molécules solubles et les vésicules sécrétées par les cellules tumorales, dont PTHrP. Les cultures d’adipocytes seront traitées avec ces différents milieux conditionnés pendant 24h (Figure 18). Dans un premier temps nous observerons la présence de PTHrP par dosage ELISA à partir des surnageants des différentes lignées cellulaires cancéreuses avant dépôt sur les cultures d’adipocytes primaires. 7 Après les 24h de traitement des adipocytes par les surnageants de cultures cancéreuses, les quantités relatives d’UCP1 et d’IF1 seront observées par western blot de façon identique que Serkan Kir et al 30. Pour finir, nous caractériserons le découplage mitochondrial des adipocytes blancs et bruns présents dans les cultures primaires par la technique du Seahorse. Cette expérience nous permettra de mesurer la consommation d’oxygène (OCR) en temps réel. Pour n’observer que les effets de la β-oxydation, il est nécessaire de bloquer la glycolyse par ajout d’iodoacétate. Nous procéderons de la même manière que l’étude en cours de publication de L. Nieto (communication personnelle). En conclusion, cette première partie de notre projet nous permettra de confirmer que PTHrP active la transcription d’UCP1 et que cet ARNm est bien traduit en protéine. Nous saurons également si PTHrP est libéré par une tumeur localisée aux poumons tout en conservant ses propriétés (modèle KrasG12D). Enfin, nous pourrons déterminer grâce aux différentes lignées tumorales en culture si PTHrP est cancer spécifique. Pour finir, la caractérisation du browning après inhibition des effets de PTHrP nous permettra de confirmer les conséquences d’une réduction du browning sur l’état cachectique des souris cancéreuses présentant une tumeur localisée au poumon (modèle Kras G12D). 19 KO UCP1 + PBS A KO UCP1 + LLC Sacrifice 21 jours Sacrifice 42 jours B Prélèvements sanguins LLC / PBS * 0 1 Sacrifice Sacrifice * * 2 3 4 5 8 Semaines * Calorimétrie indirecte 6 Semaines Figure 19 : Modèles expérimentaux et chronologie du programme expérimental. 6 A : Toutes les souris sont invalidées pour le gène UCP1. L’njections de 5x10 cellules cancéreuses LLC (Lung Lewis Carcinoma) est réalisée en sous cutanée pour dix mâles âgés de 8 semaines au niveau du flanc droit (groupe « KO UCP1/tumeur LLC »). L’injection contrôle de solution saline (PBS) est administrée de façon identique à dix autres mâles (groupe « KO UCP1 sans tumeur »). B : A S0, une injection des cellules LLC ou PBS est effectuée. Le lendemain, huit souris (deux par groupe) sont placées en cages de calorimétrie indirecte pendant 24h. Toutes les semaines, différents échantillons sanguins sont prélevés à partir de la veine saphène. Deux temps de sacrifices seront effectués en semaines 3 et 6. D’autres expériences de calorimétrie indirecte sur les mêmes souris qu’en J1 seront mises en place ces deux temps de sacrifices. Le poids des souris est contrôlé trois fois par semaines. II/ Effets de l’inhibition d’UCP1 sur le browning et la cachexie Pour cette seconde partie de notre projet, nous souhaitons déterminer si UCP1 joue un rôle majeur dans le browning et plus particulièrement, si une inhibition du browning améliore l’état cachectique des souris. Pour ce faire, nous étudierons des souris KO UCP1. D’après la littérature, ces dernières sont largement étudiées dans le cadre de l’obésité44 mais aucun de ces modèles n’a été étudié pour les cancers associés à la cachexie. Si nos résultats démontrent qu’un KO UCP1 entraine l’inhibition complète du browning, ces souris pourront être utilisées comme modèle de choix pour étudier les effets de l’altération du browning dans le cadre des CAC. 1) Les animaux Pour des raisons budgétaires, deux couples de souris KO UCP1 seront commandés chez Jackson Laboratory. L’élevage sera effectué en interne afin d’obtenir vingt mâles. Puisque nous souhaitons observer l’effet de l’inhibition d’UCP1 sur la cachexie cancéreuse, l’induction d’un cancer aux souris KO UCP1 est nécessaire. Les croiser avec une lignée KrasG12D représenterait un élevage beaucoup trop important dans le cadre de notre projet. Nous avons donc décidé d’injecter 5x106 cellules LLC dans le flanc droit de dix souris mâles âgées de 8 semaines en sous cutané, comme décrit en partie I/A/1. Dix autres mâles recevront des injections de PBS et constitueront notre groupe « KO UCP1/sans tumeur LLC ». Pour finir, un premier temps de sacrifice sera effectué trois semaines après injection des cellules LLC (5 souris KO UCP1/sans tumeur LLC et 5 souris KO UCP1/ tumeur LLC) ; un second temps de sacrifice six semaines après injection (5 souris KO UCP1/sans tumeur LLC et 5 souris KO UCP1/ tumeur LLC) (Figure 19). En effet, lors de l’étude dirigée par Serkan Kir les souris C57BL/6 ayant reçu les cellules LLC étaient sacrifiées 16 ou 21 jours après injection. Lors des pesées, les muscles gastrocnémiens ne présentaient pas de différences significatives de poids avant et après induction de la tumeur 37. Nous pensons que le temps de sacrifice choisi était un peu tôt pour observer une cachexie prononcée. C’est pour cela que nous mettons en place deux temps de sacrifice pour cette seconde partie du projet. 20 2) Suivi de la cachexie L’évolution de la cachexie sera suivie au cours du temps à raison de trois pesées par semaine. Au sacrifice, nous procéderons à la pesée des tissus adipeux blancs viscéraux et sous cutanés (côtés gauche et droit, péri tumoral) et du tissu adipeux brun inter-scapulaire. Nous pèserons également les muscles gastrocnémiens (mollets gauche et droit). L’état inflammatoire sera caractérisé à partir de prélèvements sanguins effectués toutes les semaines. Le sang sera centrifugé et le plasma conservé à -80°C pour procéder aux dosages de TNFα et IL-6 par test ELISA en temps voulu. 3) Analyse du browning Dans un premier temps nous devons nous assurer que les souris KO UCP1 sont bien déficientes pour le browning. En effet, Jackson Laboratory (le seul laboratoire à commercialiser ces lignées) décrit cette lignée comme étant sensible au froid, démontrant un métabolisme altéré et étant résistante à l’obésité induite par l’alimentation. Les TA blancs viscéraux (rétro péritonéaux) et sous cutanés (inguinaux) ainsi que le TA brun seront récupérés après sacrifice pour procéder à des analyses histologiques. Comme en partie I/A/3, trois séries de coupes histologiques seront effectuées. Nous déterminerons la morphologie des TA et nous étudierons la présente d’UCP1 et d’IF1 (Figure 16). Les résultats obtenus seront comparés avec les résultats obtenus en partie I/A sur les souris cancéreuses LLC n’étant pas déficientes pour UCP1. D’autre part, nous avons pour objectif de déterminer si UCP1 est la seule protéine responsable du browning. En effet, comme expliqué dans notre introduction, il existe deux autres protéines découplantes, UCP2 et UCP3. Ainsi, si nous observons un maintien du browning même après le KO d’UCP1, nous effectuerons des Western Blot d’UCP2 et d’UCP3. Pour finir, le métabolisme général des souris sera suivi par des expériences de calorimétrie indirecte. Cette étude nous permettra de déterminer la dépense énergétique ainsi que la production de chaleur des souris KO UCP1 (plus ou moins cancéreuses). La dépense énergétique et la production de chaleur seront calculées grâce aux mesures des échanges gazeux (consommation d’O2 et production de CO2). Les résultats obtenus seront comparés avec les résultats de la partie I/A. Les expériences seront réalisées comme indiqué dans l’étude de Julie Marcotorchinoa et. Al 41. 21 4) Suivi de la tumeur La tumeur sera suivie au cours du temps par palpation et sera pesée après sacrifice des souris. L’observation de la tumeur nous permettra de déterminer si une inhibition du browning entraine une diminution de la masse tumorale. Nous pourrons ainsi, à partir du modèle KO UCP1, confirmer ou infirmer les résultats de l’équipe de Serkan Kir où la progression tumorale était inchangée 37. Conclusion et perspectives A la fin de notre projet, nous devrions pouvoir mettre en évidence l’effet de PTHrP sur la protéine UCP1. La caractérisation du browning devrait nous permettre d’affirmer que PTHrP stimule bien le browning en activant UCP1. Il nous paraissait également indispensable de confirmer l’action de PTHrP dans le cadre d’une tumeur localisée aux poumons, tant sur le browning que sur l’état cachectique des souris. Enfin, le projet permettra de déterminer si PTHrP est une hormone cancer spécifique. De plus, la caractérisation de souris KO UCP1 devrait permettre de déterminer si cette protéine est la seule responsable du browning. Et de ce fait, si ces souris KO UCP1 sont bien déficientes pour le browning. Longtemps observé dans le cadre de l’obésité, le browning parait être une voie d’étude prometteuse pour les cancers associés à la cachexie. De nombreuses études cliniques portent sur PTHrP dans le cadre de l’hypercalcémie et de l’ostéoporose (clinicaltrials.gov). Cependant, l’étude de son rôle dans l’induction du browning et par conséquent l’aggravation de la cachexie est très récente 45. Suite à l’inhibition (ou du moins la diminution) du browning, l’état général des souris devrait être amélioré. Il parait indispensable de tester différentes thérapies anti-cancéreuses sur les souris KO UCP1 afin de voir si celles-ci répondent mieux aux traitements. Ces résultats permettraient alors de confirmer la pertinence des recherches sur le browning et la cachexie. Enfin, l’enjeu public de cette étude est d’inhiber le browning de patients atteint de cancers associés à la cachexie pour améliorer leurs réponses aux thérapies. 22 Bibliographie 1. Argilés, J. M., Busquets, S., Stemmler, B. & López-Soriano, F. J. Cancer cachexia: understanding the molecular basis. Nat. Rev. Cancer (2014). doi:10.1038/nrc3829 2. Argilés, J. M. et al. Targets in clinical oncology: the metabolic environment of the patient. Front. Biosci. 12, 3024–51 (2007). 3. 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