Xylella fastidiosa : Etat des connaissances et axes de recherche Philippe Reynaud (Anses Montpellier) avec l’aide de J.Y. Rasplus et al. (INRA) et F. Poliakoff et al. (Anses Angers) Anses - Laboratoire de la santé des végétaux Unité Nématologie Rennes Laboratoires de référence Siège Unité Mycologie Nancy et Unité Bactériologie, virologie, OGM Angers Unité Quarantaine ClermontFerrand Unité Entomologie et plantes invasives Montpellier Unité Ravageurs et agents pathogènes tropicaux La Réunion • Etat des connaissances • Axes de Recherche Xylella fastidiosa • Bactérie du xylème Epiderme Cortex Moelle Xylème Cambium Phloème Xylème Phloème Cambium Xylella fastidiosa • Produit des biofilms qui obstruent les vaisseaux • 0,1-0,5 x 1-5 µm Modélisation du mouvement de X. fastidiosa dans le xylème Bactérie Signal chimique Karyn L. Newman et al. PNAS 2004;101:1737-1742 XXXXX: • - Découverte • “California Vine Disease”: Première détection à Anaheim (Ca) en 1884 (Pierce 1892) Newton B. Pierce Découverte • 1949 : virus? (Hewitt et al.) • Premier isolement sur milieu en 1978 (Davis et al.) • Nommée en 1987 (Wells et al.) • 1987 : Chlorose panachée des Citrus au Brésil • Fin des années 1990 : maladie de Pierce, California Xylella fastidiosa : distribution Ontario 1880 Canada USA Mexico Italie Costa Rica Venezuela Equateur Brésil Brésil Paraguay Argentine 1987 Xylella fastidiosa : distribution interceptions en 2012, 2014 et 2015 sur plants de caféier Ontario 1880 2014 Canada USA 2013 Mexico 2013 Italie Italie Iran Foyers Costa Rica Venezuela Equateur Brésil Brésil Paraguay Argentine Iran 1987 Taiwan Taxonomie et spectre d’hôte 5 sous-espèces généralistes (env 300 plantes/60 familles au total) Lignées génétiques avec spectres d’hôte plus réduits (à confirmer) Xf fastidiosa (PD, ALS) : vigne, amandier, 42 familles Xf sandyi (OLS) : laurier rose, caféiers Xf morus : muriers (fastidiosa x multiplex) Xf multiplex (PDD, PLS) : Prunus, Quercus, oliviers, Polygala etc Xf pauca (CVC) : agrumes, oliviers, caféiers PD = Pierce’s di sease ALS = Almond leaf scorch di sease PDD = Phony peach di sease PLS = Plum leaf scorch OLS = Oleander leaf scorch CVC = Citrus variegated chlorosis X. fastidiosa : distribution des sous espèces subsp. fastidiosa subsp. multiplex subsp. pauca subsp. sandyi Ontario Canada USA Italie Mexico Italie Iran Costa Rica Venezuela Equateur Brésil Paraguay Brésil Argentine Iran Identification des souches X. fastidiosa en France 2 profils différents de Xylella fastidiosa, présents à la fois en Corse et en région PACA: X. fastidiosa subsp. multiplex profil A (ST7) profil B (ST6) Distinctes de la souche CoDiRO X. f. subsp. pauca présente en Italie ST7 ST6 MLSA/MLST (Scally et al., 2005 / Yuan et al., 2010) 11 Les insectes vecteurs Les espèces vectrices potentielles Cicadidae Lyristes plebejus 4 familles d’Hémiptères (51 spp F, 119 UE) Aphrophoridae (15 sp F, 29 sp UE) Cercopidae (7 sp en F et UE) Cicadellidae (9 sp en F et UE) Cicadidae et Tibicinidae (20 sp en F et 74 en UE) Piqueurs-suçeurs de xylème Mal connus Globalement polyphages Cercopidae Pour la plupart communs Populations importantes Déplacement relativement faible En général une génération par an Passe l’hiver sous forme d’œufs ou de larves (cigales) Cicadella viridis Graphocephala fennahi USA => UE Cicada orni Aphrophoridae Cicadellidae Aphrophora alni Philaenus spumarius Cercopis larve Cercopis intermedia Cycle biologique type d’un Cicadellinae Adulte Œufs Larves vectrices Adultes vecteurs Les vecteurs nord-américains Piqueurs-suçeurs de xylème Appartiennent à des genres et des groupes différents Bien connus, mais connaissance difficilement transposable Plusieurs générations par an en région chaude Certaines espèces passent l’hiver à l’état adulte Un vecteur introduit récemment en CA a eu un impact fort sur la propagation de la maladie (Homalodisca vitripennis) Graphocephala sp Draeculacephala sp Philaenus spumarius UE => USA Neophilaenus lineatus UE => USA Homalodisca liturata Cicadellidae Draeculacephala minerva Graphocephala atropunctata Xylème Cibarium / précibarium X. fastidiosa ne passe pas d’un stade à l’autre Plantes hôtes identifiées en Corse • • • • • • • • • • • Acer pseudoplatanus Artemisia arborescens Asparagus acutifolius Cistus monspeliensis Cistus salviifolius Coronilla valentina Cytisus racemosus Genista ephedroides Pelargonium graveolens Lavandula angustifolia Lavandula dentata • • • • • • • • • Lavandula stoechas Myrtus communis Hebe sp. Polygala myrtifolia Prunus cerasifera Quercus suber Rosa x floribunda Rosmarinus officinalis Spartium junceum En vert: nouvelles plantes hôtes (genre et/ou espèce), non listées précédemment par l’EFSA (Scientific opinion 2015). Scientific report EFSA 2016 : 359 espèces hôtes / 75 familles botaniques Méthode de référence MA039 version 1 Détection de X. fastidiosa sur plantes hôtes par PCR en temps réel : Méthode évaluée et validée Méthode disponible sur : www.anses.fr Extraction d’ADN automatisée avec le kit QuickPick™ Plant DNA (BioNobile) et l’automate KingFisher™ mL PCR en temps réel Harper et al., 2010, Erratum 2013 Méthode de référence MA039 version 1 Xylella fastidiosa: bactérie du xylème Analyse réalisée sur tissus fortement vascularisés de plantes en végétation: pétioles et/ou nervures centrales 1 échantillon 0,5 à 1 g par échantillon: soit 5 à 100 pétioles 2 prélèvements pour extraction d’ADN 4 amplifications géniques • Etat des connaissances • Axes de Recherche La problématique Xylella est complexe Cultures ? Prunus Olive ? Co Vecteurs ? Cs ? Réservoirs Asymptomatique Xfp Xfm Maladie Ps ? Axes de Recherche Identifier les vecteurs, diagnostiquer la bactérie et identifier la souche concernée Travaux d’identification des souches de Xylella Travaux pour la détection de Xylella sur les vecteurs Surveillance des vecteurs potentiels Evaluation des types de piégeage Collection de référence Création de clés d’identifications Test de pathogénicité Prévision et gestion du risque par la modélisation 26 Anses – INRA : Travaux d’identification des souches de Xylella Identification des sous-espèces par MLSA Phylogénie par MLST Séquençage partiel des gènes CysG, gltT, holC, leuA, malF, nuoL, petC Centre International de Ressources Microbiennes Xylella fastidiosa est très difficile à isoler de plantes contaminées. L’unité BVO (Angers) a néanmoins réussit à isoler sur milieu artificiel : 17 souches sur échantillons de Corse 3 souches sur échantillons de PACA 7 souches sur caféiers interceptés Afin d’identifier rapidement les sous-espèces en présence sans réaliser d’isolement, l’Unité BVO a optimisé les PCR Hernandez-Martinez et al. (2007) et Pooler et Hartung (1995) permettant de discriminer les quatre principales sous-espèces (fastidiosa, multiplex, pauca, sandyi), confirmées par MLSA (séquençage de 7 gènes de ménage) (collaboration avec équipe INRA (Emersys). 4 INRA/Anses : Test de pathogénicité : Projet régional SapAlien Test de pathogénicité en cours Plantes hôtes potentielles • Olea europaea • Vitis vinifera • Nerium oleander • Coffea arabica • Malus domestica • Polygala myrtifolia (programme sur deux ans 2015- 2017) Souches de X. fastidiosa • • • • • • • • • • X. f. subsp. multiplex ST6 (Corsica) X. f. subsp. multiplex ST7 (Corsica) X. f. subsp. pauca (CoDiRO) X. f. subsp. pauca (from intercepted Coffee tree) X. f. subsp. fastidiosa/sandyi (from intercepted Coffee tree) X. f. subsp. fastidiosa (USA) X. f. subsp. multiplex (USA) Medicago sativa Nocotania tabacum Catharanthus roseus 9 Anses : Travaux pour la détection de Xylella sur les vecteurs Optimisation, évaluation et validation de méthodes moléculaires pour la détection sur insectes (ex: Philaenus spumarius) Janvier - mars 2016: Démarrage de l’optimisation de la méthode Comparaison de méthodes d’extraction d’ADN Utilisation de la PCR en temps réel (Harper et al., 2010) Premiers résultats: bonne sensibilité avec le kit d’extraction ADN QuickPick Plant DNA Besoin d’insectes contaminés (d’Italie) pour valider la méthode (collecte possible en avril) Evaluation de méthode sur autres insectes vecteurs potentiels (cicadelles) Second semestre 2016: test de la méthode NGS proposée par l’UMR CBGP (JY. Rasplus) Comparaison de méthodes d’analyses sur échantillons artificiellement contaminés: NGS et PCR en temps réel (Harper et al., 2010), optimisation. Test sur échantillons naturellement contaminés Préparation d’un projet CASDAR pour application de ces méthodes à l’étude comportementale des vecteurs potentiels sur cultures d’intérêt (novembre 2016) INRA : Identifier les vecteurs de Xylella, diagnostiquer la présence de la bactérie et identifier la souche concernée par méthode NGS Utilisation d’approches haut-débit 1 run de séquençage => 20 M de séquences • • • • 1 marqueur pour l’identification du vecteur 1 marqueur pour détecter toutes les bactéries portées par le vecteur 1 ou 2 marqueurs pour identifier la plante d’alimentation Les 7-9 marqueurs diagnostiques de Xylella Jusqu’à 1500 individus sur une douzaine de marqueurs. On peut savoir qui est qui, qui porte quoi, qui a mangé quoi (applicable sur les plantes) Recherche du/des vecteurs potentiels de Xylella fastidiosa : Faible prévalence, vecteurs inconnus => nécessité du volumique • • • • Identifier qui porte quoi dans une communauté de vecteurs ? Assurer la biosurveillance du vecteur et du vecté à haut-débit Mesurer la prévalence du vecté dans des populations de vecteurs Identifier des liens entre microbiome et phénotype ou vecté INRA : Prévision et gestion du risque par la modélisation Comprendre la diffusion Xylella (dispersion, climat, paysage). Cartographie des zones à risque potentiel. Informations écologiques Cicadelle Homalodisca vitripennis sud USA, puis Californie vecteur de Xylella fastidiosa Maladie de Pierce Informations climatiques Modèle statistique défavorable Estimation favorable Anses : projet H2020 POnTE (Pest Organisms Threatening Europe) Collection de souches, pathogénicité sur Citrus – Caféier – Pervenche, Luzerne et plantes ornementales, étude de la colonisation des plantes hôtes Ateliers pour améliorer la capacité des partenaires à la détection précoce d’émergence de Xylella fastidiosa Génétique de Xylella Validation d’anticorps pour l’IF, technique d’extraction d’ADN par automate sur plantes et insectes, validation de PCR pour identification des souches (RT PCR, HRM) Projet H2020 : Novembre 2015-Novembre 2019 Identification des vecteurs effectifs et proposition de méthodes d’échantillonnage Anses : projet Euphresco VECTACROP WP 2 : Surveillance des vecteurs potentiels dans et autour des cultures cibles Evaluation des types de piégeage Collection de référence des vecteurs potentiels Création de clés d’identifications VECTACROP : Tracking vectors of bacteria and phytoplasmas threatening Europe’s major crops WP 3 : Recherche de Xylella dans les insectes (avec l’aide de l’Anses Angers) Projet : Mars 2016 - Mars 2018 Merci