Usage des puces en cancérologie

DOSSIER THÉMATIQUE
La médecine personnalisée
Usage des puces
en cancérologie
Microarrays as a tool in oncology
D. Gentien*
P
eut-on prédire la sensibilité au traitement pour
ajuster la chimiothérapie néo-adjuvante d’un
cancer du sein ? Peut-on classifier les tumeurs
du sein en sous-types présentant les mêmes caractéristiques moléculaires ? Comment déterminer
rapidement qu’une tumeur ovarienne est bien une
tumeur ovarienne et non une métastase d’une
tumeur du sein, ce qui supposerait une orientation
thérapeutique différente, surtout pour une femme
jeune ? Ces quelques questions peuvent trouver des
réponses assez simplement aujourd’hui, via l’usage
de puces en cancérologie.
Les puces à ADN sont des supports de verre sur
lesquels sont conçues ou déposées un grand nombre
de séquences correspondant à un génome donné
(figure 1). Ces outils, apparus dans les années
1990, quantifiaient entre 100 et quelques milliers
de marqueurs sur des membranes de nylon (macroarrays) en recourant à des moyens de détection
radioactifs. Rapidement, ces outils ont évolué pour
tester un plus grand nombre de marqueurs, sur une
surface d’environ 1 cm2 (microarrays, ou biopuces),
en utilisant des moyens de quantification fluorescents, plus simples d’emploi (phycoérythrine,
cyanines, etc.). Aujourd’hui, les puces les plus denses
mesurent plusieurs millions de marqueurs en une
seule expérience, à partir de quelques centaines de
nanogrammes (100 à 500 ng) d’acides nucléiques.
Affymetrix, Agilent, Illumina sont par exemple
3 sociétés qui fournissent des outils robustes de
détection et de quantification pour l’analyse de
différentes tumeurs (programme carte d’identité
des tumeurs [CIT] ; International Cancer Genome
Consortium [ICGC], etc.).
Il existe plusieurs types de puces dédiées à l’analyse
globale du génome humain, selon que l’on s’intéresse à sa structure ou à l’expression des gènes
(transcriptome). Ces puces à ADN reposent sur
Fragments d’ARN de l’échantillon à tester
marqués en fluorescence
1,28 cm
1,28 cm
Taille d’une puce
25 nucléotides
6,5 millions d’unités
information par puce
* Institut Curie, Paris.
Figure 1. Puce Affymetrix.
304 | La Lettre du Cancérologue • Vol. XXI - n° 6 - juin 2012
Plusieurs millions
de molécules d’ADN
conçues in situ par unité
d’information
1 seule séquence = 25 bases
Fragments d’ARN hybridés à leur séquence d’ADN
complémentaire sur la puce
Résumé
Les puces à ADN sont des supports de verre, qui ont évolué depuis leur apparition dans les années 1990 pour
devenir capables de tester actuellement plusieurs millions de marqueurs en une seule expérience. Leur usage en
cancérologie a permis d’analyser différentes collections de tumeurs humaines avec le support de plateformes
dédiées. Les puces d’analyse de génome de dernière génération (SNP array) sont aujourd’hui utilisées pour analyser
le génome des tumeurs avec une forte résolution (1 marqueur toutes les 550 bases dans les gènes étiquetés
“Cancer”) permettant la détection de différentes anomalies moléculaires, et ce même lorsque les cellules tumorales sont rares. Les puces permettent de quantifier l’ensemble des ARN messagers (ARNm) exprimés, avec une
résolution autorisant la quantification des ARN jusqu’au niveau exonique pour trouver les gènes différemment
exprimés ou les formes d’ARNm alternatives. Ces approches génomiques et transcriptomiques permettent de
détecter et d’identifier des anomalies récurrentes ou minimales et, ainsi, de mieux classer les tumeurs, de définir
des signatures moléculaires qui prédisent la sensibilité à un traitement ou le risque métastatique. Ces outils sont
actuellement utilisés dans des essais cliniques multicentriques pour des pathologies rares comme fréquentes.
la complémentarité de la double hélice d’ADN,
et, selon la quantité de séquences ou de cibles
présente dans l’échantillon étudié, le signal ou le
résultat de l’hybridation permettra de savoir si une
région génomique est surreprésentée ou si un transcrit est surexprimé par rapport à un échantillon
normal. Les outils commerciaux disponibles sont
standardisés et permettent l’analyse simultanée
de plusieurs millions de marqueurs en quelques
jours. L’usage de ces outils nécessite cependant la
standardisation en amont des étapes qui consistent
à extraire le matériel génétique, ainsi que la standardisation des protocoles menant à l’hybridation des puces (préparation des cibles). Ensuite,
l’analyse des mesures des hybridations requiert
des méthodes mathématiques en aval adaptées
pour optimiser l’analyse des puces, car ici plusieurs
millions d’informations seront mesurées simultanément. L’absence de biais de mesure, d’artefacts expérimentaux ainsi que de contaminants
est importante pour le rendu de résultats dans un
contexte thérapeutique par exemple. L’obtention
de biopsies rapidement congelées, l’analyse du
contenu tumoral (pourcentage de cellules tumorales estimé après coloration), l’extraction des
acides nucléiques d’intérêt (ADN génomique, ARN
total), la préparation des cibles, la révélation des
puces ainsi que leur analyse sont autant d’étapes
importantes qu’il faut ajuster et valider pour
standardiser les analyses et comparer les niveaux
d’expression de plusieurs gènes (1).
Préparation
des cibles
Analyse de la structure
du génome à l’aide de puces
Les puces d’analyse de génome, telles que les CGH
array (Comparative Genomic Hybridization array),
permettent l’hybridation compétitive d’un ADN
tumoral et d’un ADN normal marqués avec différents
fluorochromes, sur un support de verre contenant
des régions du génome humain, soit initialement
clonées dans des bactéries (BAC) soit synthétisées
in situ (CGH array, Agilent) [figure 2]. Ces puces ont
permis la mise en évidence de différents remaniements fréquents (2) ou spécifiques de pathologies
rares (3, 4) ou communes.
Les analyses des régions altérées permettent in fine
d’identifier des sous-types moléculaires, d’améliorer la prise en charge et de proposer des cibles
thérapeutiques (5). L’analyse combinée de données
génomiques et transcriptomiques permet de montrer
que les gènes présents dans les régions amplifiées
sont surexprimés, ce qui suggère que leur représentation favorise leur surexpression (5), et ouvre
la possibilité d’utiliser ces gènes ayant une représentation altérée comme cible thérapeutique. Basé
sur ces résultats, l’essai thérapeutique SAFIR01 a été
initié par F. André et mis en place par Unicancer.
Cet essai vise à proposer à des patients atteints
de cancer du sein en situation métastatique une
analyse génomique fine et à les orienter vers un essai
clinique précoce qui cible les anomalies identifiées.
L’analyse de l’ADN tumoral permet de cartographier
Hybridation de la puce
et mesure des intensités
Analyse des données
ADN tumoral
Équilibre
Perte d’une copie
ADN normal
Gain d’une copie
Amplification
Mots-clés
Puce
Génomique
Transcription
Signature
Summary
DNA microarrays are small
glass chips that evolved since
the 90’s and currently measure
millions of markers in a single
experiment. Their use in the
field of oncology, based on
their robustness and reproducibility, characterized various
collections of human tumors
with the support of dedicated
platforms.
Latest versions of microarrays (SNP arrays) are able
to analyze genome of tumors
with a strong resolution (one
marker per 550 bases in
Cancer genes) to detect several
genomic alterations: additional
chromosome, amplifications of
chromosome arms or loci, loss
of one copy or two copies of
a locus, allelic imbalance, loss
of heterozygosity (LOH) even
when tumor cells are rare.
Microarrays used to quantify
all expressed messenger RNA
have also a strong coverage to
quantify mRNA up to the exon
level to find misregulated genes
and alternative spliced forms.
These genomic and transcriptomic approaches make
it possible to detect and to
identify frequent or minimal
regions, to improve tumor
classifications, to setup molecular signatures which predict
the sensitivity to a treatment,
or that predict the risk of metastasis. Microarrays are currently
used in multicenter clinical trials
for rare pathologies as well as
for frequent pathologies.
Keywords
Microarrays
Genomic
Figure 2. Étapes de l’analyse par CGH array.
Transcriptomic
Signature
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Usage des puces en cancérologie
les anomalies moléculaires (recherche de mutations de 3 hot spots et analyse pangénomique sur
CGH array ou SNP [Single Nucleotide Polymorphism]
array) pour lesquelles il existe un médicament en
développement. Cet essai est conduit par 19 centres
de lutte contre le cancer, pour 400 patients, faisant
appel à 4 plateformes de génomique (instituts Curie,
Gustave-Roussy, Paoli-Calmettes, Léon-Bérard).
Les objectifs sont d’accélérer l’usage de traitements
innovants et ciblés pour des patients qui présenteraient les anomalies moléculaires au sein de
leur tumeur, avant leur autorisation de mise sur le
marché, et de découvrir ainsi de nouvelles indications. SAFIR01 est un essai unique multicentrique
en France qui a commencé à l’été 2011. Il montrera
si l’apport de cette approche de médecine personnalisée dans les pratiques cliniques courantes est
efficace (figure 3).
Ce type d’analyse via les CGH arrays est très utile
pour mettre en évidence des anomalies de gain ou
de perte. Cependant, il arrive que d’autres modifications soient observées (9), comme des pertes
d’hétérozygotie (Loss Of Heterozygosity [LOH])
où 2 copies identiques du même locus sont
présentes, donnant lieu à des disomies uniparentales
(UPD), ou bien des déséquilibres alléliques où plus
de 2 copies sont quantifiées. Connaître la séquence
de l’allèle présent est important pour estimer les
régulations, surtout s’il est muté. Aussi, il est important de connaître l’hétérogénéité du prélèvement
et de la prendre en charge pour mener l’analyse.
En effet, si la biopsie contient peu de cellules tumorales, l’intensité des altérations du génome tumoral
sera diluée par le génome des cellules normales environnantes (stroma, épithélium normal, etc.). Dans
ce contexte, l’usage de puces à SNP est très utile.
Les puces à SNP contiennent plusieurs millions de
séquences (2 à 3 millions) et mesurent le nombre de
copies de séquences comportant un polymorphisme
(SNP) et des régions non polymorphiques dans leur
séquences (Copy Number Variant [CNV]). Connaître
le nombre de copies jusqu’au niveau allélique
permet d’identifier les déséquilibres cités ci-dessus.
De plus, l’adaptation de méthodes statistiques à ces
données permet de mesurer la “contamination” en
cellules normales ou le mosaïcisme des altérations
Thérapie ciblée anti-FGFR1
Figure 3. Exemple de profil moléculaire d’une tumeur du sein (d’après San Antonio Breast Cancer Symposium 2011:
Poster SAFIR01).
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de la biopsie (7, 8) pour ajuster la ploïdie tumorale,
et de définir les réels taux d’amplification de telle ou
telle région génomique. La forte densité de ces puces
à SNP (1 marqueur toutes les 880 bases) permet de
déterminer plus précisément les points de cassure,
et de proposer des dérégulations de l’expression des
gènes concernés si des délétions apparaissent dans
un ou plusieurs exons codant pour des domaines
protéiques importants ou critiques. Prochainement,
l’essai clinique SHIVA, initié par C. Le Tourneau de
l’institut Curie, proposera pour toutes les tumeurs
une analyse génomique large utilisant les puces
Cytoscan HD pour rechercher des altérations fines,
ainsi qu’un séquençage à haut débit sur des gènes
cibles, pour lesquels des thérapeutiques innovantes
et ciblées sont disponibles.
Analyse de l’expression
du génome à l’aide de puces
Le génome humain comporte environ 18 000 gènes
(base Refseq, version 37.3, 9 mai 2012) et plus de
26 000 séquences codantes annotées, donnant plus
de 31 000 ARNm et plus de 1 million de protéines.
Analyser l’ensemble des gènes exprimés à un
instant t permet de quantifier les besoins de cellules,
d’un tissu, et d’appréhender les dysfonctionnements.
L’analyse de l’ensemble des protéines n’est actuellement pas simple pour des raisons techniques ; cependant, celle du transcriptome grâce aux puces est
possible, car elle nécessite peu de matériel : 100 ng
d’ARN au total, soit quelques milliers de cellules.
Les gènes ont une structure complexe, composée de
séquences de régulation de leur expression (régions
promotrices), d’exons correspondant aux séquences
codantes, d’introns (séquences non codantes), dans
lesquels des éléments de régulation alternatifs sont
contenus qui donnent lieu à l’expression de différents
ARNm. La maturation des ARNm conduit également
à différents ARNm composés de tous les exons de
départ ou d’une partie d’entre eux. La quantification
des transcrits nécessite alors des outils adaptés à la
quantification des différentes régions des ARNm, en
utilisant un bon nombre de marqueurs répartis sur
la séquence de l’ARNm.
Depuis les années 2000, un très grand nombre de
tumeurs ont été analysées sur des puces d’expression
interrogeant l’extrémité 3’ des ARNm pour caractériser leur transcriptome (6). Plus particulièrement,
dans les tumeurs du sein, ces analyses ont permis
d’identifier 4 grands groupes (10, 11) pour définir
des marqueurs pronostiques au regard des données
de survie et des traitements délivrés. L’équipe de
Laura J. van’t Veer a été la première à proposer un test
MammaPrint utilisant 70 gènes, et un essai clinique
européen, MINDACT, pour choisir le traitement adjuvant selon le risque métastatique prédit. L’objectif
de l’essai MINDACT est de confirmer que le risque de
rechute évalué par cette signature est plus précis que
si l’on se base sur des critères cliniques standard (taille
de la tumeur, récepteurs hormonaux), cela pour éviter
une escalade thérapeutique. “D’après les résultats
actuels de l’essai MINDACT en cours, la signature
d’Amsterdam permettrait d’éviter une chimiothérapie
postopératoire superflue à 15 à 20 % de femmes”,
a déclaré S. Delaloge, de l’institut Gustave-Roussy,
responsable de cet essai en France.
De façon dérivée, l’analyse de l’expression des
gènes peut être utilisée pour reclasser les tumeurs
du sein de grade 2 (12) en grade 1 ou 3 selon le
niveau d’expression de 97 gènes impliqués dans la
prolifération et dans la régulation du cycle cellulaire.
Le test Genomic Grade Index (GGI) a été développé
dans les tumeurs du sein par l’équipe de C. Sotiriou
et permet de classer les grades 2, qui représentent
30 à 60 % des tumeurs du sein, et dont l’analyse
histopathologique est sujette à variation selon le
pathologiste. Récemment, une étude menée par
l’institut Curie (13) et Ipsogen, qui propose le test du
GGI sous le nom de MapQuant™, a montré l’intérêt
de ces analyses par puce : cette approche apporte
plus d’informations que le seul grade génomique
(22 000 transcrits dosés). Il apparaît que les puces
sont des outils plus robustes et standardisés. Cependant, le coût d’une analyse reste élevé et nécessiterait une évolution vers un test par PCR, et ce, à partir
d’échantillons fixés et inclus en paraffine (FFPE), car
tous les centres ne disposent pas actuellement de
biopsies congelées. Le test Oncotype Dx, proposé
par Genomic Health aux États-Unis, est un test similaire, définissant un score de métastase. Ce test a été
adapté pour des FFPE et repose sur une quantification par PCR et non par puce. La comparaison de ces
données avec celles de l’essai Transbig (Mindact), et
GGI permettra bientôt de sélectionner le meilleur
prédicteur pronostique selon les données de survie.
En plus des signatures pronostiques, des signatures prédisant la sensibilité aux molécules dans un
contexte néo-adjuvant de cancer du sein ont été
définies (14). Les résultats de L. Pusztai, basés sur
l’analyse de 133 tumeurs du sein sur puce Affymetrix,
ont montré que 30 transcrits suffisaient à prédire la
sensibilité au paclitaxel et au 5 fluoro-uracile + doxorubicine + cyclophosphamide (T/FAC). Afin de tester
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cette hypothèse, et sur la base des résultats du MD
Anderson Cancer Center (États-Unis), l’essai clinique
randomisé REMAGUS04 a été initié par F. André et
conduit à l’institut Gustave-Roussy et à l’institut
Curie. Cet essai s’adressait à des patientes atteintes
d’un cancer du sein (tumeur de plus de 2 cm) HER2−,
dans un contexte néo-adjuvant ; son objectif principal
était de proposer une chimiothérapie sur mesure plus
efficace à toutes les patientes et donc d’accroître le
nombre de femmes bénéficiant de la préservation de
leur sein. Des études antérieures ont en effet mis en
évidence 2 signatures génomiques prédictives d’une
meilleure réponse à des chimiothérapies spécifiques :
➤ la signature 1 semble prédictive d’une meilleure
réponse à une chimiothérapie à base de paclitaxel
hebdomadaire puis de FEC 100 ;
➤ la signature 2 semble prédictive d’une meilleure
réponse à une chimiothérapie à base d’anthracyclines
puis de docétaxel ;
➤ pour les patientes dont la tumeur n’exprime ni
la signature 1 ni la signature 2, une chimiothérapie
à base de docétaxel puis de capécitabine semble
être la mieux adaptée.
Cet essai est clos, et les résultats sont en cours
d’exploitation pour tester la performance du DLD30,
et évaluer son intérêt pour guider ou non la chimiothérapie avec une approche pharmacogénomique.
Il semble que cette approche est possible dans un
contexte clinique.
Enfin, il apparaît dans les tumeurs du sein plusieurs
signatures transcriptomiques, dont l’usage comme
outils décisionnels délivre les premiers résultats
pour des patients présentant un risque métastatique élevé. Des signatures de deuxième génération
restent à définir pour améliorer les performances
en utilisant des outils de dernière génération (exon
arrays, splice arrays, RNAseq) [15-17].
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