Cytogénétique moléculaire et DPI par FISH

G49-50 Philippe Gosset
Cours du 23/11/12 de 16h à 18h
M1 Physiopathologie
Pauline Amrouni et Marie Freund
Cytogénétique moléculaire et DPI par FISH
La cytogénétique classique permet d’analyser les chromosomes vus au microscope. En
cultivant des cellules et en les arrêtant en métaphase, on peut faire des analyses du
génome. On colore les chromosomes au Giemsa en général. La cytogénétique permet de
voir des anomalies intermédiaires (de l’étude d’un gène moyen à celle d’un chromosome
entier). On peut également utiliser des techniques particulières pour voir les chromosomes
(bande G, bande R, haute résolution…)
La cytogénétique classique pourra faire apparaitre 400 bandes de quelques Mb, la haute
résolution montrera 850 bandes (5 Mb minimum). Ces deux techniques pourront permettre
l’étude des anomalies de nombres des chromosomes et certaines anomalies de structures.
La biologie moléculaire comprend différentes méthodes et aura en général une résolution
d’une Mb à quelques centaines de bases. On y trouve :
- la PCR : résolution inférieure une centaine de bases. On peut étudier des gènes
(fragments de délétions et de fusions..), ou encore des microsatellites (analyse des
liaisons, recherche de disomie uniparentale)
- le séquençage : résolution d’une base, il permet notamment la recherche des
mutations.
La cytogénétique moléculaire permet de faire des peintures des chromosomes (résolution de
quelques Mb). Elle comprend aussi la technique de FISH (résolution qui dépend de la taille
de la sonde : du chromosome a plusieurs Mb jusqu'à quelques Kb (voire une base). Elle
permet l’analyse des remaniements et des
micro-remaniements.
Selon la résolution recherchée et selon ce que
l’on recherche on préférera une méthode a une
autre.
Pour information quelques points
Historiques :
- découverte des chromosomes : Tjio et
Levan, 1956
- utilisation des Bandes et de la FISH :
• Casperson et coll., 1970
• Dutrillaux et Lejeune, 1971
-Hybridation in situ radioactive :
• Gall et Pardue, 1969
-Hybridation in situ Fluorescente :
• Bauman et coll., 1980
Lichter et coll., 1988 (application) Pinkel et coll., 1988
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I. LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE
A. La technique
Elle repose sur deux principes :
- les propriétés de l’ADN (double hélice à base complémentaire avec un ordre
particulier), on va cibler, choisir la séquence à marquer.
- Les techniques d’imagerie : radioactivité, molécule fluorescente, microscope à
épifluorescence
L’ADN possède quatre bases disposées en double hélice, relié par des ponts hydrogènes.
Son diamètre est d’environ 2nm (donc invisible en microscope optique).
L’hybridation in situ repose sur la complémentarité de l’ADN.
Pour faire de l’hybridation in situ on doit d’abord séparer les deux brins d’ADN pour qu’il
puisse exposer leurs bases à la sonde (c’est la dénaturation).
La cible correspond à l’ADN simple brin, elle est complémentaire à la sonde marqué (ADN,
ARN, système protéique..). La reconnaissance de la cible avec la sonde est appelé
l’hybridation.
Pour info : la première tentative d’hybridation s’est faite avec de l’adn tritié après un
étalement chromosomique. La sonde était du tritium radioactif, après l’hybridation on lavait
pour enlever ce qui n’était pas fixé. On posait un film photographique sur la lame et on
pouvait analyser l’image.
Les molécules fluorescentes :
Elles sont utilisées pour que l’on puisse voir l’adn. Ce sont des molécules naturellement
fluorescentes sous une excitation (irradiation) de longueur d’onde plus courte que celle vue à
la réémission. Les cellules perdent de l’énergie donc la longueur d’onde augmente à la
réémission.
Par exemple on a la fluoréscéine qui a une excitation pour une lumière bleue-verte et une
émission dans le vert.
L’œil ne voit que les longueurs d’onde entre 400 et 700 nm (en sachant que 8% des
hommes ont un déficit des couleurs). Il faut donc que les molécules émettent dans le
domaine du visible mais certaines nécessitent une analyse informatique, en effet elles
émettent dans l’infra rouge ou le domaine UV. Il faudra donc sélectionner suffisamment de
lumière pour activer la fluorescence mais sans perturber l’image. En France on colore en
bleu, dans les pays anglo-saxons plutôt en rouge.
Pour info : la courbe de fluorescence de la fluoréscéine : elle absorbe la lumière de 495nm et
réemet à 515-525 nm.
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B. Le microscope à épifluorescence
On a un premier filtre qui sélectionne la
lumière qui excite la fluorescence. Cette
lumière rebondit ensuite vers la lame grâce à
un miroir dichromique (élément qui fait miroir
sous un angle et qui est transparent selon un
autre angle (laisse passer la lumière). La
lumière arrive donc à la lame, la
fluorescence s’active et passe au travers du
miroir dichromique qui cette fois agit comme
un élément transparent et non plus comme
le miroir. Elle passera au travers d’un
deuxième filtre et elle sera vue.
Résumé :
source=>1er
filtre=>
miroir
ème
dichromique=>lame=> miroir dichromique=>2
filtre=> œil.
On peut utiliser plusieurs molécules fluorescentes en même temps grâce à un système de
filtre qui laisseront passer que la lumière d’excitation dans un sens et celle de la réémission
dans l’autre sens.
II. LES SONDES
A. Nature des sondes
on peut trouver :
- de l’adn (génomique total (CGH), des hybrides somatiques, de l’adn cloné (plus ou
moins spécifique et de tailles variables), des oligonucléotides..)
- de l’arn
- des systèmes protéiques
remarque : les hybrides somatiques sont des cellules hybrides entre 2 espèces, c’est
instable car on perd des chromosomes qui sont jugés inutiles par la cellule. On fait la
sélection une fois les cellules dans des puits. On prend un hybride et on la cultive.
Exemple : hybride entre des cellules de rongeurs et d’hommes : on perd des chromosomes
humains dans ce cas.
On peut faire de la peinture chromosomique également, soit partielle soit totale.
La peinture spécifique peut cibler un locus, plusieurs locus, des télomères (région
télomérique ou sub-télomérique), les centromères, les chromosomes acrocentriques (dans
lesquels on trouve de l’adn sans gènes donc non codante, mais on a des séquences
répétées).
On peut trouver des sondes dans le commerce :
- des centromères
- des télomères
- spécifiques à des locus (micro délétion, remaniement ou gêne de fusion)
On peut également fabriquer nos propres sondes :
- idem à celles du commerce plus celles fabriquées à partir de l’ADN du patient (CGH
array et puces à ADN)
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B. La fabrication
Pour préparer de nouvelles sondes, on doit effectuer plusieurs étapes :
- la sélection d’un clône ou un criblage
- faire une culture des clônes
- extraire l’ADN
- effectuer une vérification (STS, profil de restriction) pour vérifier que l’on a bien l’ADN
que l’on cherche
- effectuer une marquage
- test par la FISH pour la validation de la sonde
Pour fabriquer un clone, on incorpore une molécule d’ADN spécifique dans une cellule hôte
(souvent une bactérie) puis on la met en culture.
Plusieurs types de fragment d’ADN peuvent être incorporés dans une cellule hôte :
- un hybride somatique (dans une cellule hôte de mammifère)
- YAC (dans une levure), pour les ADN de grande taille (~1M paires de bases)
- PAC, BAC, cosmides, phages, plasmides (dans des bactéries)
C. Le principe du marquage
Pour rendre visible l’ADN, il faut incorporer un nucléotide marqué (dNTP) par :
- un haptène (petite molécule comme par exemple la biotine ou la digoxigénine),
facilement manipulable
- un fluorochrome
- un agent radioactif
- un enzyme sur l’ADN
Pour la visualisation de ces nucléotides marqués, il existe plusieurs techniques (la PCR, nick
translation, random prining)
On va extraire l’ADN double brin du clone et faire agir un enzyme pour couper un des deux
brins au hasard : la DNase1
Puis la DNApolymérase1 va venir recopier l’autre brin pour recréer la partie précédemment
coupée. Pour cela, elle a besoin de nucléotide, et utilisera donc les nucléotides marqués que
l’on aura au préalable intégrés dans la solution.
Attention : La DNApolymérase1 est également une exonucléase, et donc agrandi le trou
formé
dans
l’ADN.
III. LES METHODES D’ANALYSE
A. La FISH (hybridation in situ fluorescente)
Elle montre les petites anomalies.
Technique :
- dénaturation : On a un tube avec la solution de la sonde fluorescente (souvent de
l’ADN double brin), et une lame avec la cible ; on dénature les deux éléments en
chauffant à 95°C pour former de l’adn simple brin.
- Hybridation : on mélange le tube et la lame en contrôlant la température et en
ajoutant des agents dénaturants (pour éviter les températures trop élevées : 37°C au
lieu de 95). Le formamide est souvent utilisé comme agent dénaturant. C’est grâce à
cela que l’on va contrôler la spécificité de l’hybridation
- Lavage : on laisse agir quelques heures et on élimine les sondes non fixées.
- Révélation : soit la fluorescence est déjà présente et l’on fait directement une
lecture, soit on doit procéder à une révélation pour l’étude avec possibilité
d’amplification.
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Exemple : La biotine avec une sonde à l’avidine On peut rajouter un anticorps à
biotine avidine pour amplifier la fluorescence.
B. La PRINS (PRimed IN Situ labelling)
Il faut synthétiser de l’ADN marqué à partir d’une amorce in situ (la PCR nécessite 2
amorces). On peut avoir une amorce spécifique d’un site, annealing, un allongement avec
incorporation de dUTP marqué à la fluorescence (nécessitant de travailler à 72°C).
Il faut attendre une heure d’extension, on lave et on monte. C’est simple, rapide et sensible,
mais l’on a qu’un seul site de visualisation à la fois.
C. La fiber FISH
C’est une technique de FISH sur une fibre à
ADN « peignée » (étirée). Il faut étaler l’ADN
pour allonger les fibres (on a un ADN de haut
poids moléculaire en suspension), on fait
réagir la sonde. La technique est ensuite
semblable à la FISH.
L’ADN étiré permet d’analyser sur de petites
distances (de l’ordre du kb), les fibres sont
régulièrement étirées, ce qui permet une
précision sur la distance, mais certaines
visualisations sont impossibles, comme celles
des délétions.
La fiber FISH est réservée pour la
cartographie
et
l’analyse
des
microduplications.
D. La CGH (Hybridation génomique comparative)
On marque l’ADN du patient
d’une couleur et un ADN témoin
d’une
autre
couleur.
L’hybridation est compétitive
sur des métaphases normales.
On
incorpore
de
l’ADN
compétiteur qui va bloquer les
régions
répétées
(satellite,
télomère, séquence Alu = trace
d’un rétrovirus qui a été actif
dans la lignée humaine et est
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désormais quasiment inactif) pour éviter les artefacts. Si l’on a plus d’ADN d’un côté, on aura
alors une fixation plus rapide, et la prédominance de la couleur correspondante. Au
contraire, si l’ADN du patient est tout à fait normal, on aura une répartition équilibrée des
couleurs (le ratio est alors de 1). S’il manque de l’ADN (ou des gènes) à un patient, le ratio
est de 2. Si au contraire il y a des éléments surnuméraires, le ratio est de 3 pour 2.
Ratio = ADN du patient / ADN témoin
Exemple : Comparaison des chromosomes
X et Y entre une femme et un homme. Une
femme n’a pas de Y, le ratio est alors de 0
pour 1 pour Y. En revanche, elle possède
2 X, donc le ratio est de 2 pour 1 pour X.
Remarque : La zone bleue correspond à la
zone bloquée par l’ADN compétiteur. Le
vert correspond à l’ADN du patient, et le
rouge, à l’ADN témoin.
La CGH permet la comparaison entre
l’ADN d’un témoin et l’ADN du patient pour
observer d’éventuelles anomalies.
Avantages :
- Analyse globale du génome
- Création de marqueurs pour des chromosomes non reconnus (souvent de
l’hétérochromatine et parfois euchromatine, ce qui émet un signal).
- Indépendante de l’index mitotique.
Inconvénients :
- Technique délicate avec un équipement et un logiciel onéreux.
- Limite de détection (taille de moins de 5Mb)
- Mosaïque d’au moins 50% (les ratios changent. Pour une trisomie, il est de 2,5 pour
2 au lieu de 3 pour 2. Pour une monosomie, 1,5 pour 2 au lieu de 1 pour 2)
E. Multi FISH
Très utilisée en oncologie. Chaque paire de chromosome va être peinte différement. Cette
technique permet une analyse globale du génome. Elle repose sur une combinatoire de
fluorescence.
L’œil ne pourra pas percevoir toutes les nuances, on aura donc une conversion informatique
qui va transformer chacun des signaux en des couleurs visibles.
Il existe deux types de multi FISH :
- la M-FISH : 1 filtre par fluorochrome + 1 filtre DAPI. On fait une superposition
d’images
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-
la SKY (Sectual KarYotiping) : 1 spectromètre à interférences. C’est un spectre de
lumière
calculé
à
chaque
pixel.
Avantages :
- Analyse globale du génome
- On voit les anomalies complexes
- L’origine du marqueur peut être vu
- On peut l’utiliser sur des métaphases de mauvaise qualité
Inconvénients :
- Technique onéreuse
- La technique ignore les remaniements intra-chromosomiques
- Elle ne précise pas les bandes
La technique Rx-FISH (ou Harlequin-FISH), ce
sont des chromosomes peints sur bande, et elle
indique la bande en cause.
F. Les puces d’ADN = ADN Arrays (= CHIPS)
On fixe une sonde sur une lame et les
chromosomes vont se fixer dessus.
Si l’ADN marqué du patient trouve son
correspondant sur la lame, il s’accroche.
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On élimine ce qui n’est pas accroché par des lavages. On a donc hybridation puis lavages.
On fait la lecture avec des scanners automatiques. Dans le temps la lecture était manuelle
au microscope.
On mesure l’intensité de la fluorescence à chaque point. La relation entre la fluorescence et
la concentration de l’ADN n’est pas optimale, on peut utiliser des témoins de concentration.
On va analyser l’intensité du signal et on va mettre ça sous forme de base de données. On
va voir s’il y a plus ou moins présence ou absence de mutation selon si l’ADN est marqué.
Le type d’ADN fixé peut correspondre à : oligonucléotides (SNP), de l’ADN complémentaire
(ADNc),
de
l’ADN
génomique
cloné.
L’ADN hybridé peut correspondre à de l’ADNc, des produits de PCR ou de l’ADN
génomique.
On va pouvoir effectuer des analyses de mutations, d’expressions augmentée ou diminuées
de gènes, de délétions ou d’amplifications (chromosomes répliqués un certain nombre de
fois dans la cellule, c’est souvent des problèmes de cancer ou de leucémie, c’est anormal
chez l’homme).
Avantages :
- Permet le criblage multiple
- Petit volume de réaction (relativement économique)
- Indépendant de l’index mitotique (on n’a pas besoin d’être en métaphase)
- Etude d’homozygtie
Désavantages :
- Information limitée (on n’est que sur l’ADN du patient)
G. Arrays – CGH
Au lieu de faire la CGH sur métaphase, on le fait
sur des puces. On va avoir les mêmes puces
mais on va hybrider dessus un mélange de l’ADN
du patient et de l’ADN témoin.
On fait un lavage après hybridation.
On va mesurer le ratio de fluorescence entre
l’ADN témoin et l’ADN du patient point par point.
La sensibilité est meilleure que pour la CGH, le
ratio
obtenu
est
plus
précis.
On a également une meilleure résolution : pour la CGH on a 10 Mb – 2 Mb tandis que pour
les puces on a quelques paires de bases avec les oligos et 30 kb avec BACs.
L’inconvénient est que c’est non global, on n’étudie que les cibles fixées.
Cette courbe correspond au
résultat d’analyse.
Le patient est en vert et le témoin
est en rouge.
On peut faire un moyenne entre
les deux lectures.
En haut à doite les deux courbes
sont sur le même ration 1/1 donc
on a la même quantité d’ADN.
Et en bas à droite on voit que le
ratio n’est plus le même.
Cela dénote une anomalie
(délétion ou duplication).
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H. Les PADLOCKS
Padlock = cadenas.
C’est une technique récente.
Les sondes sont particulières, leur synthèse est spéciale.
Elle reconnaît une séquence spécifique de l’ADN. La spécificité va jusqu’à la paire de base.
Donc on peut rechercher une anomalie de l’ADN à une base prête (recherche de mutation
ou de polymorphismes).
Cette technique a un fort potentiel, mais reste une technique de laboratoire surtout
(particulièrement aux Etats-Unis).
Principe :
On a l’ADN cible, avec son complémentaire qui correspond à
la sonde avec deux extrémités spécifiques de 20 pb (paires
de bases) et un « pont » non spécifique de 80 pb (poly-dT)
au centre, capable de fixer des fluorochromes.
On ajoute de la ligase.
Si les bases sont bien correspondantes, la
ligase peut « fermer » le padlock entre les
deux extrémités spécifiques.
Si ça ne correspond pas, le padlock ne peut
pas fermer.
On fait lavage et les padlocks non fermés
partent et ceux fermés restent.
On peut faire de la révélation au microsocope
en utilisant des anticorps marqués qui
s’accrocheront sur les fluorochromes.
On peut faire de la synthèse d’ADN à l’intérieur
du padlock. On prend une amorce qui s’enroule
à l’intérieur, on ajoute des enzymes de la PCR
et on a une synthèse d’ADN.
Il existe une enzyme spéciale ᶲ29 (« phi 29 »)
qui déplace la chaîne d’ADN. Cela permet de
continuer la synthèse à l’intérieur de la boucle
car la chaîne sera déplacée au fur et à mesure
de sa synthèse. On obtient une pelote d’ADN
qui peut servir à faire des mesures…
Cette technique est peu utilisée.
IV. APPLICATIONS

Syndrome de Williams :
Anomalie du chromosome 7q11.2
Engendre des problèmes cardiaques et cognitifs avec par exemple une dissociation entre la
parole et le dessin.
On utilise une sonde rouge de williams qui correspond à l’élastine et un témoin vert.

Syndrome de Di-George :
Délétion 22q11.2
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Engendre des problèmes cardiaques, des anomalies du deuxième arc branchial. On a
également
une
atteinte
intellectuelle.

FISH : « Télomères » :
On a délétion du télomère en 1q (chromosome 1 bras
long)

FISH sur noyau interphasique :
Hybridation sur spermatozoïdes chez un patient qui a
une translocation robertsonnienne 13 :14.
On a 13 normal + 14 normal + 13 et 14 collés
ensemble.
On aura des problèmes de ségrégation.

Hybridation sur des tissus :
On peut faire des hybridations sur tissus. Par exemple
on peut faire des sondes du X et du Y qui permettent de retrouver le sexe des cellules du
tissu.
Exemple chez un patient masculin qui a reçu une greffe d’intestin d’origine féminine.
On fait cet examen car on était à la jonction entre le greffon et l’hôte et on avait un problème
de récidive de de la pathologie sur le greffon. On voulait savoir si c’était un envahissement à
cause des cellules hôtes.
V. LE DIAGNOSTIC PRE-IMPLANTATOIRE (DPI) PAR FISH
A. Les indications du DPI en cytogénétique
-
-
-
« Le sexage » : pour les maladies liées à l’X (sauf si on est capable de faire l’analyse
par
biologie
moléculaire.
Le « Social sexing » pour choisir le sexe de l’enfant, c’est interdit en France.
Aneuploïdies : quand on sait qu’il y a un risque, aneuploïdies avérée (avec par
exemple
un
chromosome
marqueur).
Les
aneuploïdies
gonosomiques,
par
pour
le
DPI
en
France.
Les aneuploïdies potentielles en rapport avec l’âge maternel (interdit également en
France).
Translocations : robertsonniennes, réciproques
Inversions, (micro)délétions …
B. Techniques du DPI cytogénétique :
-
-
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Caryotype de blastomère : on prend du sang, on fait une culture des cellules pour
avoir de belles métaphases. C’est difficile et souvent incomplet. Technique
pratiquement abandonnée
PRINS : permet d’analyser le génome de l’embryon (présence ou absence de
quelque chose mais pas plus). A été abandonnée car on n’a qu’un seul site visible à
la fois.
FISH : Méthode de choix, en interphase surtout
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-
CGH : après amplification du génome entier, c’est très long (2 ou 3 jours) et couteux.
Ce n’est pas parfait sur les chromosomes et relativement aléatoire.
Array-CGH : idem mais la qualité de l’analyse est meilleure on peut voir des choses
plus petites. On l’utilise pour rechercher les anomalies de quantités de chromosomes
dans les cellules.
C. Préparation de l’analyse :
On va analyser les sondes qui ont été préparés sur les chromosomes du couple.
On fait des tests sur les lymphocytes. Les témoins auront au moins deux spots sur 95% des
noyaux sur 200.
On fera des tests sur des blastomères lors de fécondations in vitro et qu’il nous restera des
embryons en pas assez bon état pour être utilisé pour une grossesse. On récupère leurs
noyaux.
On peut également faire une biopsie embryonnaire. Sur une ou deux cellules, on effectue
une lyse cellulaire en utilisant une solution hypotonique qui fera éclater la cellule et on fixera
le noyau sur la lame et après on met les mélanges de sondes dessus (hybridation puis
lavage).
D. Translocations Robertsonniennes
Mécanisme :
On a fusion entre deux chromosomes acrocentriques
(13, 14, 15, 21 ou 22) au niveau des centromères.
On aura une formule anormale à 45 chromosomes.
Fréquence : 1 pour 1000 nouveau-né.
Origine : parentale ou de novo (on cherche les
antécédents familiaux)
Symptomatologie :
C’est très souvent asymptomatique (les bras courts du chromosome acrocentrique contient
de l’ADN satellite donc on ne perd rien d’important).
Seulement cela reste gênant pour la méiose et peut poser des problèmes de fertilité.
Chez l’homme la méiose est très surveillée au point de vue cellulaires, il y a de nombreux
check-point. Les cellules anormales seront détruites et cela va poser problème à la
spermatogénèse. On aura une asthénotératozoospermie (peu de spermatozoïdes, peu
mobiles et malformés) pour l’homme.
Pour la femme c’est variable, mais il y a moins d’implications dans l’ovogénèse et il y aura
moins d’infertilité. Mais ces femmes auront des fausses couches plus fréquentes à cause de
ces translocations.
Diagnostic : caryotype simple
Dépistage/Prévention : bilan de stérilité, enquêtes familiales, DPN (diagnostic prénatal), DPI,
par hasard…
Ségrégation alterne :
Au moment de la méiose les chromosomes de la
même paire s’associent et il y a des échanges
d’ADN, puis on a séparation/ségrégation.
La ségrégation alterne donne un gamète avec les
chromosomes normaux et un gamète avec la
translocation (ici on voit ça pour le spermatozoïde,
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chez l’ovocyte c’est un peu différent). Ce sont des formes équilibrés car on a le même
matériel.
Ségrégation adjacente :
On aura un chromosome non fusionné dans le
gamète : donne une monosomie.
Et un gamète avec la translocation et le
deuxième chromosome normal : donne une
trisomie.
Les monosomies ne sont pas viables.
Le risque principal : naissance d’un enfant
trisomique 13 ou 21 (les autres trisomies ne
sont pas viables).
Exemples de transmission :
Famille où il y a eu trois fausses-couches (FC).
Au bout de deux ou trois FC, normalement on
fait un bilan.
La nièce est née avec une trisomie 21.
On va mettre des sondes sur chaque
chromosome de couleur différente.
Chez le patient normal on aura 46
chromosome et chez l’anormal on aura 4
chromosomes.
Le parent atteint donne ses deux
chromosomes normaux.
Formule à 46 chromosomes normaux,
on a deux spots rouges et deux spots
verts (on repère le nombre de noyaux
non pas de chromosomes).
Le caryotype est normal et l’embryon
est équilibré.
et
Le parent atteint donne seulement la
translocation mais on aura un embryon
équilibré avec un caryotype à 45
chromosomes.
Le parent atteint donne la translocation et
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le chromosome normal. On aura un caryotype à 46 chromosomes mais on aura un
déséquilibre (2 spots rouges et 3 spots verts)
E. Translocations Réciproques
Mécanisme :
Echange d’une partie de chromosome entre deux chromosomes différents.
Fréquence : 1 sur 1000 nouveau-né
Origine : parentale ou de novo
Translocation équlibrée :
Asymptomatique à 95%, car 95% de l’ADN est non codant, on peut
avoir une baisse de fertilité.
Symptomatique si on casse des gènes importants.
Translocation déséquilibrée :
Trisomie partielle ou monosomie partielle (car on a un bout de
chromosome en plus ou en moins).
Les symptômes dépendent de la quantité de chromosome
transloquée. Plus c’est grand et plus il y aura de symptômes.
Peut provoquer une absence de développement embryonnaires, des
malformations multiples, un retard mental ou une dysmorphie, une
hypo/infertilié ou peut éventuellement être asymptomatique.
C’est grossièrement proportionnel à l’étendue de l’échange.
Infertilité :
 Perturbation de la méiose :
Donc pour l’homme : oligospermie, azoospermie…
 Femme : dysovulation (plus rare), arrêts d’évolution de l’embryon, FC + :- tardives.
Risque principal :
Naissance d’un enfant avec une translocation déséquilibrée.
Diagnostic :
Caryotype simple +/- haute résolution, + :- FISH.
Traitement : symptomatique
Prévention/Dépistage :
Caryotype (retard mental, dysmorphie…)
DPN (peut provoquer des FC dans 23% des cas à cause du geste), enquêtes familiales, DPI
Pour la technique de FISH il faut au moins 3
sondes : un chromosome avec deux sondes
différentes de part et d’autre du point de
cassure et sur l’autre chromosome une
troisième sonde.
L’embryon peut hériter des chromosomes
normaux. Il y aura un caryotype normal et
ce sera équilibré.
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Ou alors l’embryon peut hériter de la translocation
réciproque et avoir un caryotype anormal mais être
équilibré
Ou alors il peut hériter un chromosome normal et un
chromosome avec la translocation de la part du parent
atteint, et cela donnera un caryotype anormal, (trisomie +
monosomie partielles) et un embryon déséquilibré.
Exemple : Un embryon qui a hérité d’une translocation
entre les chromosomes 8 et 21 sur le bras court du 8 et
le bras long du 21 : t(8 ;21)(p ;q).
Mais :
-
DPI par FISH :
Technique OK pour :
- Translocations robertsonniennes : 2 sondes
- Translocations réciproques : 3 sondes
- Sexage : sondes X et Y (la PCR peut le faire
mais moins de régularité dans les résultats)
Inversions, microdélétions, marqueurs…
Difficultés de stimulation ovarienne
OATS (moins de spermatozoïdes chez les hommes)
Moins d’embryons qui évoluent
Taux de réussite plus faible que la biologie moléculaire.
A venir :
Puces / CGH-Array :
Potentiel : mise en évidence des déséquilibres (de grande taille ou de petite taille selon la
densité de la puce)
Mais il y a naturellement des régions des génomes chez l’embryon qui sont en plusieurs ou
un exemplaire (CNV : Copy Number Variation). Il est important de savoir si c’est
pathologique ou non. On chercher les régions dupliquées chez les parents pour connaitre
leurs CNV.
On explore le génome en entier, on peut mettre en évidence des anomalies : ceci n’est pas
utilisable pour l’instant en France. On n’a pas le droit de chercher autre chose que l’anomalie
visée.
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