ARTICLE DE REVUE Progrès en Urologie (1993), 3, 745-751 Moyens d'étude de la réponse immunitaire locale après traitement endovésical par BCG : Revue Jean-Jacques PATARD, Claude ABBOU, Dominique CHOPIN Service d'Urologie, Hôpital Henri Mondor, 94010 Créteil nologiques simplement quantifiables liés à l’action antitumorale du BCG qui pourraient avoir un intérêt potentiel dans la conduite du traitement (dosimétrie et marqueurs pronostiques). Ce travail tentera par ailleurs de situer le rôle de ces paramètres dans les mécanismes d’action du BCG et dans le cadre plus général du rejet des tumeurs. RESUME L’évaluation de la réponse immunitaire après traitement prophylactique des tumeurs superficielles de vessie par BCG a plusieurs objectifs: définir de nouveaux paramètres pronostiques et mettre au point des outils de rationalisation du traitement. Après l’étude initiale de la valeur des infiltrats inflammatoires vésicaux et de la conversion des tests cutanés, plusieurs auteurs s’orientent maintenant vers des techniques plus spécifiques: analyse immunohistochimique et cytofluorométrique des s ous populations lymp h o c y t a i res activées local ement, dosage des cytokines urinaires. MOYENS D'ETUDE 1. Tests cutanés, histologie (infiltrats vésicaux) La première évaluation de la réponse immunitaire au BCG intra-vés ical a porté sur la conversion positive de tests cutanés et l’apparition d’infiltrats inflammatoires vésicaux témoignant d’une activation du sys tème immunitaire locale et générale. Les auteurs ont alors voulu faire de ces tests des marqueurs pronostiques. Ainsi LA M M en 1982, notait que 6% des patients qui avaient une conversion de leurs tests cutanés récidivaient comparés à 38% pour ceux dont les tests restaient négatifs (p=0,022) [20]. KELLEY en 1986, notait que 77% des patients qui avaient une conversion cutanée étaient sans tumeur contre 34% de ceux dont les tests restaient négatifs. De même il montrait que 77% des patients qui avaient des infiltrats vésicaux étaient sans t umeur contre 32% pour ceux qui n’avaient p a s d'infiltrat inflammatoire [18]. Ces résul tats soulignaient le lien qui existe entre la réponse i mmunitaire et la réponse antitumorale mais ne sont pas apparus suffisamment spécifiques pour servir de marqueurs pronostiques. TORRENCE en 1988, montrait qu’avec un recul plus important la réponse granulomateuse locale perdait sa signifi- Cet article fait une revue de ces différentes techniques, discute la signification de leurs résultats et leurs intérêts potentiels dans la conduite du traitement et la compréhension des mécanismes d’action du BCG. Mots clés : cancer de v essie, immunothérapie, BC G, cytokines urinaires. Progrès en Urologie (1993), 3, 745-751 INTRODUCTION L’évaluation de la réponse immunitaire après traitement endo-vésical par BCG a tout d’abord porté sur l’étude de la valeur pronostique des infiltrats inflammatoires vésicaux et de la conversion des tests cutanés. De nouvelles approches tendent à développer des méthodes plus fines d’analyse de la répons e immunitaire locale: immunohistochimie, dosage des cytokines urinaires, cytométrie de flux. Le but de ce travail est de passer en revue ces nouveaux outils et d’identifier des paramètres immu- Manuscrit reçu le 10 janvier 1993 Ad res se p o ur co rres p on dan ce : Dr. J . J . Patard , Serv ice d'Urologie, Hôpital Henri Mondor, 94010 Créteil. 745 Tableau 1. Etude immunohistochimique de la réponse au BCG. Données de la littérature. Auteurs El Demiry Prescott Bohle Leong Patients 7 CIS 9 Ta, T1, CIS 6 Ta, T1 19 Ta, T1, CIS Urothélium normal : Ts > TH avant traitement TH > TS après traitement TH/TS x 4 Urothélium normal TH/TS = 0,68 après traitement TH/TS = 3,13 Avant traitement TH/TS = 1/2 après traitement TH/TS = 2/1 Après traitement TH/TS = 2/1 Infiltrats sous muqueux Infiltrats sous Muqueux Infiltrats sous muqueux Infiltrats muqueux Urothélium normal: (-) avant traitement 9% après traitement 28,2% + dans les infiltrats Urothélium normal : (-) avant traitement (+) après traitement (++) pic 6-12 S persiste à 3 mois TH/TS CD4/CD8 Macrophages Lymphocytes B IL2 R HLDR Urothélium normal: (-) lymphocytes et cellules urothéliales (++) cation statistique et que la signification statistique des test cutanés était trop peu nette pour faire de ce critère un marqueur pronostique [35]. 2. Immunohistochimie Deux études ont été consacrées à la répartition des lym phocyt es dans la ves sie normale [13, 15]. Ceux-ci se trouvent en pl us grand nom bre au contact de la membrane basale versant chorion et sont essentiellement des lymphocytes de phénotype CD8. On trouve également quelques macrophages et quelques cel lul es NK mais en peti t nombre. Les cellules urothéliales n’expriment que des antigènes de classe I du CMH et pas les antigènes de classe II. Plusieurs études se sont attachées à définir la réponse immunitaire après instillations endovésicales. Des biopsies vésicales, avant et après traitement, avec marquage immunohistochi mique afi n d’étudie r l es sous-popul ations immunocompétentes, ont été réalisées. Des anticorps monoclonaux spécifiques de chacune des sous populations ont été utilisés: anti MHC de 8/18 classe I, anti MHC de classe II, anti CD4, anti CD8 (lymphocytes T), anti CD25 (récepteur à l’IL2), anti CD22 (lymphocytes B), anti CD 68 (macrophages), anti CD 57, anti CD 16 (NK). Il a été montré une inversion de la répartition de ces cellules avec prédominance de lymphocytes T auxilliaires sur les cellules T suppresseurs dans la sous muqueuse (CD 4 > CD 8), la présence de cellules B, de macrophages et de cellules NK en plus petit nombre. Les cellules T exprimaient le récepteur à l’IL2 qui persiste à distance du traitement. Les cellules immunitaires et urothéliales exprimaient des antigènes de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité [3, 14, 22, 28, 29]. Ces données sont résumées dans le Tableau 1. BÖHLE récemment a montré que cette activation locale des cellules immunocompétentes pouvait persister à long terme. Par une technique d’immunohistochimie avec amplificatio n (APAAP) sur du matériel biopsique il a montré que 4 patients sur 8 traités par BCG avaient encore une réactivité contre l’ILl, le TNF, L’IL2 deux ans après le traitement [5]. 746 Tableau 2. Cytokines après BCG : données de la littérature. Auteurs Ratliff Cytokine IL2 Patients Ta, T1, CIS 18 patients Dosage HT2 (IL2 dépendante) Cinétique - Négatif avant traitement - apparaît 3ème semaine - Pic 4-8h - rarement après 24 h Böhle Prescott Dejong Thalman IF gamma IL2 IL8 Ta, T1, CIS 10 patients laser YAG CIS 6 BCG 7 MMC Ta, T1 11 patients Ta, T1, CIS Culture de fibroblastes ELISA RIA CTLL 16 ELISA - Après 3ème semaine - Pic 2-6h 6/13 MMC: taux faible - Après 3ème semaine - Pic 2-6h - jamais après 24 h Pic dans les 24h après BCG et RTU avec différence significative entre les deux groupes IL1, IL2, TNF IL1 : pic 4-8h IL2 : pic 2-8h TNF : pic 2-4h 3. Cytométrie de flux (CMF) féron gamma, et du TNF [24, 25]. Dans l’infection urinaire à E. Coli, le taux d’IL6 urinaire a pu être corrélé au nombre de bactéries [17]. Dans les néphropathies à IgA, le taux d’IL6 urinaire évolue paral lèl ement aux pouss ées de la mal adi e et s’annule sous traitement [12]. De même, dans les greffes rénales, le taux de cytokines urinaires IL2, IL6 a une valeur pronost ique pui squ’il s’élève après l’intervention pour se normaliser en deux à trois semaines, le rejet étant précédé d’une réascension de ces taux [8, 32, 38]. Certains auteurs utilisant la cytométrie de flux se sont attachés à étudier dans les urines le profil cellulaire (9) après BCG-thérapie. Ils ont mis en évidence une forte augmentation du nombre des cellules du culot urinaire. Ces cellules étaient: des granulocytes, des monocytes, des macrophages, des cellules NK et, en plus petit nombre, des lymphocytes. Les lymphocytes ont pu être étudiés grâce à un panel d’anticorps [10], il s’agis sait essentiellement de lymphocytes T auxillaires prédom inant sur les lymphocytes T s uppres seurs, exprimant le récepteur à l’interleukine 2 et les antigènes du CM H de classe II, donc sensibil isés. Cette répartition des sous-populations lymphocytaires après BCG endovésical confirmait les données des biopsies après traitement. Dans les tumeurs superficielles de vessie la cinétique des cytokines urinaires après instillations de BCG endovésical a été bien étudiée. Les cytokines mises en évidence ont été ILl, IL2,TNF, IFNγ, IL6, IL8 [4, 11, 30, 31]. Le Tableau 2 résume ces études. Les méthodes de dosage ont été le plus s ouvent des tests biologiques, des techniques RIA ou ELISA. Les cinétiques retrouvées ont été comparables: I’ILl et l’IL6 avaient une élévation précoce dès les premières insti ll ations, I’IL2, I’IFNγ et l e TNF n’étaient retrouvées qu’à partir de la troisième instillation. Le pic était en général observé à la 6ème heure. L’IL8 a été mise en évidence dans les urines des patients traités par résection seule ou par BCG avec néanmoins des taux significativement plus élevés dans le groupe BCG [34]. 4. Dosage des cytokines (Bioassay, RIA, ELISA) La réponse immunitaire met en jeu des cellules qui interagissent et communiquent entre elles grâce à des facteurs solubles appelés cytokines. Des cytokines ont été mises en évidence dans les urines dans certaines circonstances normales et pathologiques. Un inhibiteur du récepteur à l’interleukine 1 est détectable dans les urines normales [19], de même que des récepteurs solubles de l’interleukine 2 [23], de l’interleukine 6, de l’inter- 747 DISCUSSION La présence de récepteurs solubles aux cytokines dans l es ur i nes s em bl e cor re s pondre à un phénomène général de régulation immunitaire dans les fluides. On a attribué à ces récepteurs des rôles d’inhibiteurs, de transporteurs ou encore de ligants [25]. Leur présence n’a pas été explorée durant le traitement endovésical par BCG. Les cytokines peuvent maintenant être dosées dans les urines par des techniques simples et reproductibles. En effet les techniques ELISA (immunoenzymatiques) sont plus simples à mettre en oeuvre que les tests biologiques initialement utilisés (cultures cellulaires cytokines dépendantes) ou encore RIA (radioimmunologiques) plus contraignantes car nécessitant l’utilisation de produits radioactifs. Différents kits ELISA commercialisés permettent donc une approche quantitative simple des différentes cytokines libérées dans les urines par les cellules immunitaires activées. Les techniques immunohistochimiques pratiquées sur du matériel biopsique après trai tement fourniss ent une analys e semi-quantitative des différents évènements immunitaires importants à considérer (CD4 / CD8, CMH CLII). L’analyse en cytométrie de flux de ces tissus ou encore du culot urinaire pourrait permet tre d’évaluer ces critères sur le plan de la dosimétrie et de la réponse au traitement. Parmi les différentes cytokines qui ont été mises en évidence dans les urines après BCG, toutes ne semblent pas avoir la m ême signification. L’ILl, l e TNFα, I’IL6, I’IL8, s ont libérés par les macrophages dans un certain nombre de circonstances non spécifiques: maladies inflammatoires, infection urinaire, intervention chirurgicale. La présence d’IL2, de TNFβ, d’IFNγ en revanche traduit l’activation lymphocytaire. Ces cytokines pourraient être au centre de l’activité antitumorale du BCG par leur cytotoxicité directe mais aussi par leur capacité à s timuler certai nes populati ons cytotoxiques . L’interféron gamma à cet égard est un bon exemple puisque cette cytokine a des capacités d’immunomodulation et des propriétés cytotoxiques. En effet l’IFNγ entraîne une surexpression des antigènes associés aux tumeurs dans certains modèles tumoraux [26, 36] et module l’expression des antigènes de classe II [2, 16]. Cette expression des antigènes de classe II du CMH signifie pour les cellules urothéliales la capacité acquise par immunostimulation 748 de présenter un antigène aux cellules effectrices. L’ I F Nγ a, de plus, des capacit és cytotoxi ques directes comme cela a été montré sur des lignées tumorales vésicales [16] et indirectes par activation synergique avec d’autres cytokines de populations cytotoxiques (macrophages, LAK, NK, CTL) [37]. La prédominance des cellules de phénotype CD4 (lymphocytes T auxiliaires) au sein des infiltrats inflammatoires vésicaux coïncide avec des travaux expérimentaux récents [21] qui ont montré que la cellule urothéliale tumorale était capable de présenter par l’intermédiaire des antigènes de classe II du CMH les antigènes du BCG à des lymphocytes de phénotype CD4. Ces lymphocytes auxilliaires en réponse libéraient un certain nombre de cytokines dont l’IL2 et l’IFNγ, activant d’autres populations cytotoxiques et pourraient en eux même avoir des propriétés cytotoxiques. Ces différents éléments s’intègrent bien dans les connaissances actuelles des phénomènes de présentation antigénique et de rejet des tumeurs. En effet, on sait que le récepteur T reconnait un complexe constitué par un petit fragment peptidique antigénique et une st ructure codée par le com plexe majeur d’histocompatibilité (CMH) [39]. Le CMH code pour deux types de molécules membranaires: les molécules de classe I qui sont exprimées sur toutes les cellules de l’organisme et les molécules de classe II qui ne sont exprimées que sur les cellules class iquement présent atrices d’ant igènes (APC). Les antigènes des peptides exogènes sont habi tuellement présentés aux cellules T par les macrophages et les autres cellules présentatrices (macrophages, lymphocytes B, lymphocytes T activés) en association avec les molécules de classe II. La présentation de ces peptides nécessite une endocytose de la protéine et une dégradation endosomale en courts peptides [l]. Ces peptides se lient aux molécules de classe II et le complexe est présenté à la surface cellulaire [7]. Ces complexes CMH-peptide sont reconnus par les lymphocytes CD4 [33]. Les peptides endogènes sont habituellement présentés en association avec les molécules de classe I du CM H. Les lymphocytes T qui reconnaiss ent l’association peptide endogène molécules de classe I sont de phénotype CD8 [27]. L’imm unothérapie par B CG s e prés ent e donc comme un modèle d’immunothérapie non spécifique: un antigène bactérien après dégradation est présenté par des cellules spécialisées ou encore par les cellules urot héliales par l’i ntermédiaire des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité de class e II aux lymphocytes T auxili aires (CD4). Ces lymphocytes CD4 activent les autres populations cytotoxiques notamment par la libération de cytokines. En revanche certains des peptides présentés par les molécules de CMH ont été identifiés comme antigènes de rejet des tumeurs (TRA). L’identification de ces antigènes de rejet des tumeurs a été réalisée en particulier dans le mélanome humain (antigène Mage) et permet d’envisager une immunothérapie cette fois spécifique: vaccination, génération de clones de lymphocytes T cytolytiques spécifiques par immunosélection [6]. recognized by two T-cell hybridomas. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 2489-2493. 2. BASHAM T.Y., M ERIGAN T.C. 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CONCLUSIONS, PERSPECTIVES On peut donc maintenant disposer d’outils quantitatifs permettant d’évaluer la réponse immunitaire locale après BCG endovésical. La cytométrie de flux sur des urines ou encore sur des prélèvements tissulaires vésicaux pourrait quantifier les différentes populations immunitaires mises en jeu: le rapport CD4/ CD8, l’expression des antigènes de classe II du CMH, notamment au vu de la littérature semblent intéressants à mesurer. Le dosage des cytokines spécifiques dont le rôle semble important dans l’activit é antit umorale du BCG: IL2, TNF, IFNγ, peut être réalisé par technique ELISA. Ce dosage pourrait fournir un moyen simple de suivi et de rationalisation du traitement : adaptation des doses et de la durée du traitement en fonction du profil de réponse de chaque malade. Ces critères enfin devraient être évalués comme marqueurs pronostiques. L’utilisation du BCG comme agent antitumoral sur un modèle de tumeurs immunogéniques telles que les tumeurs de vessie est une bonne approche des phénomènes d’immunité antitu morale. L’identification d’antigènes de rejet des tumeurs dans les tumeurs urot héliales devrait permettre de développer des méthodologies d’immunothérapie spécifique. 7. BUUS S., SETTE A., COLON S., MILES C., GREY H.M. The relatio n between major his tocompatib ility co mplex (MHC) restriction and the capacity of Ia to bind to immunogenic peptides. Science, 1987, 235,1353-1358. 8. CORNABY A., SIMPSON M., VANN RICE R., DEMPSEY R., JE NKINS R., M ONACO A. In terleu kin 2 levels and urine cytolog y distinguish between cy closporine to xicity and rejectio n in renal an d liver a llo graft rec ip ients. Transplant. Proc., 1988, 20, 827-830. 9 . DE BOE R E.C., DE JONG W.H, VAN DER MEIJ DEN A.P.M., STEERENBERG P.A., WITJES F., VEGT P.D.J., DEBRUYNE F.M.J., RUITENBERG EJ. 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Then some investigators using immunohisto-chemical methods showed that some lymphocyte phenotypes where predo minant in such infiltrates and that HL A DR antigens w h e re strongly e xpresse d follow ing BC G the rapy. Similar results where obtained in urine using flow cyto metric analysis. Additionaly some cytokines where found at signifiant levels in urine afte r BCG instillations. In this paper we reviewed these studies, we discussed the me aning of these re sults and the potential v alue for treatment monitoring. Key words : vesical cancer, immunotherapy, BCG, uri nary cytokines. ____________________ ZUSAMMENFASSUNG Untersuchungstechnik en zur Bestimmung der lokale n Imm un an t wor t n ac h in t r ave si ka le r B CG Behandlung : eine Übersicht. Die Erfassung der Immunantwort nach prophylaktischer Behandlung des oberflächlichen Blasenkarzinoms durch BCG hat als Ziel, neue prognostische Parameter und die Entw ick lung v on Ra tionali sier ungste c hnik en zur Therapie zu definieren. Nach der initialen Untersuchung bezüglich der Bedeutung entzündlicher Infiltrate in der Blase und der Konversion von Hauttests orientieren sich jetzt me hre re Autore n in Richtung sppe zifische re r Techniken, nämlich der immunhistochemischen Abalyse, de r F lo w z y to m e tr i e v o n l o k al a k ti v i e r t e n Lymphozytensubpopulationen und der Bestimmung von Zytokininen im Urin. Diese Arbeit besc hre ibt die ver sc hie denen Techniken, diskutie rt die Bedeutung der E rgebn isse und ihr p oten tiel les In tere sse für die Be han dl ung sst rat eg ie u nd das Ver stä ndn is de r Wirkungsweise des BCG. ____________________ RESUMEN Medios de estudio de la respuesta immunitaria local despu ès de tr at amien to en dove sic al con e l BCG : revista. Varios son los objetivos de la evaluacion de la respuesta immunitaria despuès de un tratamiento profilàctico de los tumores superficiales de la vejiga con el BCG : defi nir nuevos paràmetros pronosticos y poner a punto her ramientas de racionalizacion del tratamiento. Despuès 751 del estudio inicial del valor de los infiltrados inflamato rios vesicales y de la conversion de los tests cutaneos, varios autores se orientan en la actualidad hacia técni cas màs espe cificas : anàlisis immunohistoquimico y citofluorimè trico de las subpoblaciones linfocitarias localmente activadas, dosificacion de las citoquinas uri narias. El presnete articulo pasa en revista estas diferentes tèc nicas, disc ute el significado de sus re sultados y sus intereses potenciales para la conduccion del tratamiento y la comprension de los mecanismos de accion del BCG. ____________________ RIASSUNTO Me zzi d i studio d ella risposta immu nitaria locale dopo trattamento endovescicale con BCG : rivista. La valutazione della risposta immunitaria dopo tratta mento profilattico dei tumori superficiali della vescica con BCG ha div ersi scopi : definire nuov i parametri pronostici e mettere a punto dei mezzi di razionalizzazio ne del trattamento. Dopo lo studio iniziale del v alore degli infiltrati infiammatori vescicali e della conversio ne dei tests cutanei, i diversi autori si rientano attual mente verso delle tecniche più specifiche : analisi immu noistochimica e citofluorometrica delle sotto-popolazio ni linfocitarie attivate localme nte, dosaggio delle cito chine urinarie. Quest'articolo passa in rivista queste differenti tecniche, discute il significato dei loro risultati e il loro interesse potenziale nella direzione del trattamento e la compren sione dei meccanismi d'azione del BCG. ____________________