éléments d’une histoire de la Spectrométrie de Masse Olivier Laprévote CJSM, Saint-Dié, 2007 1 1910 Instrumentation Les prémisses … 1886: Les « raies positives » sont découvertes par Goldstein dans un tube à décharge électrique sous une pression faible: En utilisant une cathode perforée, il observe des flammes lumineuses qui passent à travers des perforations (ou canaux) dans l’espace derrière la cathode. Ils les appelle « Kanalstrahlen ».. •1898, 1902: Wien montre que ces raies sont déviées dans des champs magnétiques et électriques. Elles sont donc caractérisées comme des particules positivement chargées avec des valeurs de charge spécifique bien plus faibles que celle de l’électron. 1926 Ionisation 1968 Applications •1897: Thomson démontre l’existence des électrons. Il s’intéresse donc à la contrepartie « positive » de ces particules et donc aux « raies positives ». 2 1910 Sir Joseph John Thomson (1856 - 1940) Cambridge University Prix Nobel de Physique, 1906: « En reconnaissance des grands mérites de ses études théoriques et expérimentales sur la conduction de l'électricité par des gaz." "Au début très peu ont cru en l’existence de ces corps plus petits que des atomes. Il m’a même été dit, longtemps après par un physicien distingué qui avait été présent à ma conférence de 1897 à l'établissement royal qu'il avait pensé que je m'étais moqué d'eux." J.J. Thomson (1936). Recollections and Reflections. G. Bell and Sons: London. p. 341. Analyse des raies formées par les ions positifs 3 1910 Raies formées à partir d’un tube contenant des vapeurs de mercure (a), d’air (b), de l’hélium (c), et de l’hydrogène (d) C: cathode perforée MM: électroaimant PP: plaques connectées à une batterie S: écran 4 Rays of positive electricity Joseph John Thomson Proceedings of the Royal Society A 89, 1-20 (1913) 1913 1.Dans des champs E et B parallèles, les ions sont séparés en fonction de leur rapport e/m. 2.Dans un champ E de longueur x, l’accélération d’un ion correspond à Ee/m cm.sec-2 3.Si v est la vitesse de l’ion, il traversera le champ E en x/v secondes 4.Il va donc subir un déplacement vertical z : z = ½ (Ee/m)(x/v)2 cm 5. Dans un champ magnétique uniforme B, la particule est déviée selon y avec une accélération de Bev/mc cm.sec-2. 6. D’où: y = ½ Bex2/mcv cm Les raies sont des paraboles telles que y2 = k.z 5 1913… RESULTATS Les raies positives sont constituées de fragments massifs issus de la perte d’un ou plusieurs électrons à partir des atomes ou molécules. Le néon est composé de deux isotopes, l’un de poids atomique 20, l’autre de poids atomique 22. Il existe donc des isotopes même pour des éléments qui sont stables. 6 1919 Francis William Aston (1877 - 1945) Cambridge University Prix Nobel de Chimie, 1922 “Pour sa découverte, au moyen de son spectrographe de masse des isotopes d’un grand nombre d’éléments non radioactifs et de son énonciation de la règle des nombres entiers” Le premier spectromètre de masse 7 1918 Phys. Review, 1918, XI, 316 Spectrographe de masse de Aston Non représenté: tube de décharge (à gauche) S1, S2: fentes fines P1, P2: champ électrique homogène D: diaphragme O: axe du champ magnétique homogène plan G-B : plan focal de l’aimant. 8 1919 9 1919 La règle des nombres entiers s’applique à tous les éléments stables. Les valeurs non entières de leurs poids atomiques ne sont dues qu’à la composition des isotopes qui les constituent. Prout, 1815 10 1917 Arthur Jeffrey Dempster (1886 - 1950) University of Chicago Prémisses: montage expérimental de Classen ayant permis de mesurer la masse de l’électron (1907) Premier spectrographe de masse de Dempster A: zone analytique (aimant); B, C: parois de la chambre à vide; D: diaphragme destiné à l'élimination des ions réfléchis; E: unité de détection; G: source d'ions; S1 et S2 sont respectivement les fentes de la source et du collecteur. 11 1917 Arthur Jeffrey Dempster (1886 - 1950) University of Chicago 1. Dempster impose une tension d’accélération V0 aux ions issus de la source: Faisceau monoénergétique: Ec = ½ mv2 = qV0 2. Dans le champ magnétique force centrifuge et centripète s’équilibrent: qvB = mv2/r d'où: r = mv/qB 3. Donc : m/q = B2r2 / 2 V0 En gardant B constant et en adoptant différentes valeurs de V0, on obtient un spectre de masse ! 12 1917-1922 RESULTATS Découverte des isotopes de: Li, K, Ca, Zn, Mg puis ... de 235U. 13 1934 Zeitschrift fur Physik, 1934, 89, 786 Principe de l’utilisation d’un « filtre » en énergie: le champ électrostatique: Si un ion incident de vitesse v, de masse m, et de charge q, subit l'effet d'un champ électrostatique E, il adopte une trajectoire circulaire uniforme telle que la force centrifuge (mv2/r') équilibre la force centripète (qE): mv2/r' = qE Josef Mattauch Richard Herzog d'où: E = 2Ec/qr' En conséquence, l'ajout d'un champ électrostatique sur le trajet ionique joue le rôle de filtre d'énergie cinétique à la condition que r' demeure constant (on impose r' par construction du tube de vol). Par ailleurs, si le faisceau ionique est préalablement accéléré par une différence de potentiel V0, ce qui est généralement le cas, le paramètre q n'intervient plus dans l'équation. On obtient en effet: E = 2V0/r' Spectromètre de masse à double focalisation 14 1934 Spectromètre (E-B) de Mattauch et Herzog La détection est réalisée sur le plan focal de l’aimant. Principe: la dispersion en vitesse liée au champ electrostatique est compensée par le champ magnétique. La dispersion en direction dans l’aimant (liée à l’énergie cinétique) est compensée par le champ électrostatique. Autres groupes: Hugues et Rojanski (1929), Barber (1933), Henneberg (1934), Stephens (1934), Brüche et Scherzer (1934), Smythe (1934), Dempster (1935), Bainbridge et Jordan (1936) 15 Ernest Lawrence et le calutron (Oak Ridge, Tn) 1942-1944 Le calutron, spectromètre de masse dérivé de l’instrument de Dempster fournit l’uranium-235 nécessaire à la construction de la première bombe atomique. (Manhattan project) 16 1942-1944 Ernest Lawrence (1935) 17 Le calutron 1944 18 Alfred O. C. Nier (1911 - 1994) Université du Minnesota 1940-1945 Les spectromètres “magnétiques” prennent toute leur importance au début de la seconde guerre mondiale. Parallèlement à sa participation au projet Manhattan, les instruments magnétiques à double focalisation développés par Nier permettent la séparation des isotopes 235U et 238U. Nier isole par ailleurs le premier échantillon de plutonium (10-9 g). SM préparative ! 19 1953 1. Focalisation en 1 point. 2. Balayage de l’aimant à champ electrostatique constant 3. Performances en résolution accrues par rapport au procédé de Mattauch-Herzog 20 1955 Determination of Isotopic Masses and Abundances by Mass Spectrometry Alfred O. C. Nier Science 27 May 1955: 737-744 John Beynon + Metropolitan Vickers AEI MS8, MS9, MS50, MS80 JEOL Spectromètres Mat (Finnigan) Kratos VG, puis Fisons, puis 21 Micromass, puis Waters 1971-1973 R. Graham Cooks Design and performance of a mass-analyzed ion kinetic energy (MIKE) spectrometer J. H. Beynon, R. G. Cooks, J. W. Amy, W. E. Baitinger, T. Y Ridey Anal. Chem., 45 (12), 1023A-1031A Spectromètre de masse à double focalisation inversée (B-E) Analyse des décompositions métastables ou induites par collision Mesure de m/z des fragments (E* = (m2/m1).E0) Principe: Sélection de l’ion précurseur par le secteur magnétique Dissociation en 2nde région sans-champ Analyse des fragments par balayage du secteur électrique 22 Analyse structurale (précurseur de la MS/MS) 1971-1973 Spectres CID-MIKE de deux composés stéréoisomères (IE, 20 eV, collision 8 KeV) Défaut de résolution ?? 23 Oui, mais … 1971-1973 Mesure de l’energy release liée à des processus de dissociation métastables 24 1948 Et pendant ce temps là, … la mesure du temps de vol (TOF) Principe: mv2 = zeV 2 t= m xL 2zeV 25 1955 Premier TOF avec accélération à 2 étages + extraction retardée 26 1964 Premier TOF commercial : « Bendix » TOF (conception Wiley) 27 Soviet Physics – Technical Physics, 16 (7), 1177 (1972) 1972 Gain de 2 ordres de grandeur sur la résolution 1 6 2 5 3 4 Un ion focalisé sur le plan 1 traverse la région sans champ 2 , est ralenti par le champ du premier condensateur 3, est réfléchi par le champ du second condensateur 4, est réaccéléré par le champ du premier condensateur 3 , traverse la région sans champ 5 puis arrive sur le plan du collecteur 6. « L’idée du système est que les variations du temps de transit dans les espaces libres de champ 2 et 5 dues aux variations des énergies des ions sont compensées par les variations correspondantes du temps de transit des ions dans les régions de décélération et de réflexion 3 et 4.» 28 1973 Soviet Physics – JETP, 37 (1), 45 (1973) M/ΔM = 3500 !! 29 Et les quadripôles ? Wolfgang Paul (1913 - 1993) Université de Bonn 1953 Prix Nobel de Physique, 1989 « Pour le développement de la technique des pièges à ions." Il n’y a pas encore d’expérience, rien que des calculs ! 30 Et la résonance cyclotronique ionique ? 1949 Phys. Rev., 1949, 76(12), 1877 1. Un champ magnétique permanent 2. Une tension électrique Rf variable 3. Les ions résonants sont portés à une orbite de 1 cm de rayon et détectés par impact sur les parois. 31 25 ans plus tard … 1974 1. Ions CH4+ formés dans la cellule 2. Pulse 20 mV, 307 kHz durant 2,8 msec 3. Aimant de 0,32 T 4. Enregistrement sur bande magnétique (102 msec) 5. Transformée de Fourier 32 33 Formation des ions 1886 - 1965 - Dès 1886, les ions proviennent de décharges dans des gaz à faible pression (Goldstein) - En 1918, Dempster met au point l’ionisation de surface à partir de sels déposés sur des filaments - La source d’ionisation par impact électronique est développée par Bleakney (1929) puis Nier (1940 & 1947), elle ouvre la voie à l’analyse des substances organiques et devient, de loin, la méthode la plus utilisée … 34 L’ionisation chimique 1966 35 Abondance des ions réactifs en fonction de la pression 1966 Réactions conduisant à la formation des ions réactifs du méthane Dépendance à la pression des ions formés 36 Du spectre du propionate d’heptyle… 1966 Aux mécanismes d’ionisation et de fragmentation 37 1968 1968 Échantillons : polystyrène de PM moyen 51000 à 411 000 Mode d’ionisation négatif Solvant: benzène/acétone 3:2 (v:v) Le courant ionique est mesuré par une cage de Faraday précédée par des grilles portées à des potentiels négatifs (repousseurs). En assumant une vitesse des ions identique à celle du jet supersonique émergeant du système nozzleskimmer, la mesure de l’énergie des ions conduit directement à celle de la masse. 38 1968 1968 Mesure des potentiels d’arrêt Ions multichargés et agrégats Puis … presque 20 ans d’oubli… 39 Une technique qui, elle, ne sera pas oubliée: la désorption de champ 1966-1969 1966-1969 Research/Development, 1969, 20(11), 26 !!! Vue d’un émetteur FI-FD 1. Une anode recouverte de dendrites organiques est placée à 2 mm d’une cathode (ddp 10 kev) 2. Le champ local (5.107 V/cm) ionise les molécules par effet tunnel (FI) et les ions sont désorbés sous le double effet du champ et 40 d’un chauffage modéré (FD) État de l’art en 1970 1910 Instrumentation en développement Spectromètres EB Nier-Johnson Spectromètres BE Quads FTICR TOF MS/MS 1926 Ionisation 1968 Applications IC IE SM isotopique Chimie structurale Molécules naturelles volatiles (M+. ± stables) Molécules volatiles (M+. non stables [M+H]+ ± stables ) FI/FD-MS ESI Chimie structurale Molécules non volatiles polaires Macromolécules 41 Développement des sources à pression atmosphérique Objectif: le couplage LC/MS 1975 1975 Anal. Chem., 47 (14), 2369 (1975) - Aucune technique n’existe encore pour l’analyse directe de macromolécules biologiques. - La première source APCI ne s’adresse encore qu’à des composés volatils séparés par HPLC en phase normale -On sent bien, pourtant, que les sources API peuvent être la 42 solution … APCI M+. APCI 1975 [M-H]+ 1975 IE IE benzène hexane APCI !!! 43 Dès le début des années 1960, Klaus Biemann comprend l’intérêt que peut représenter la spectrométrie de masse pour l’analyse des peptides… 1966 K. Biemann J. Am. Chem. Soc., 88 (23), 5598 (1966) -Les échantillons sont des di- à pentapeptides diversement acylés en position N-terminale -Les composés sont ionisés par IE -Les spectres sont interprétés selon une nomenclature précise … … sans que les mécanismes de fragmentation ne soient encore proposés. 44 Fragment « aminoacyle » Fragment « amine » Première assistance informatique à l’interprétation: 1966 45 1976 Science, 191, 920-925 (1976) 46 1976 47 1974 Mode d’ionisation: IE Énergie de collision: 10 eV Temps de résidence des ions dans la cellule de collision: 5.10-5 sec Tolérance aux hautes pressions de gaz de collision (5.10-4 Torr) Peu de perte due à la dispersion angulaire Modification de l’énergie de collision aisée. Outil versatile, idéal pour l’analyse structurale et l’étude de mélanges complexes 48 1981 1981 Nature, 293, 270-275 (1981) Dilution de l’échantillon dans une matrice liquide, polaire, à faible tension de vapeur: la volatilisation de l’échantillon préalablement à l’ionisation n’est plus nécessaire. Bombardement par des atomes rapides (Ar, Xe) compatible avec les sources d’ions haute tension (spectromètres à secteurs magnétique et électrique). sucres… Le faisceau d’ions secondaires peut être stable plusieurs dizaines de minutes et permettre des expériences de MS/MS Les ions formés (molécules protonées, déprotonées, cationisées) sont relativement stables, donc abondants, donc permettent une49 grande sensibilité de l’analyse. Nucléotides … (NAD) 1981 1981 50 1981 Peptides … 1981 51 1981 porphyrines … La voie est ouverte … mais la compétition aussi … 1981 52 1981 1981 Ions primaires: métaux alcalins déposés sur un filaments et pulsés à 5-10 KHz, 25 KeV, durant 5-50 nsec. Brian T. Chait 53 Nucléotides … (AMP) 1981 1981 54 La LC/MS n’est plus un rêve … 1983 1983 55 1983 1983 (le spectromètre est un quadripôle) 56 1984 J. Phys. Chem., 88, 4451-4459 (1984) les prémisses d’un prix Nobel… Bien que citant Dole à de nombreuses reprises et notamment au sujet des « macro-ions », ce sont les agrégats (clusters) qui retiennent l’attention de Fenn. Pourtant … 57 1984 58 1984 L’électronébulisation permet: ¾D’analyser l’échantillon en solution, ¾De former des ions stables … ¾Qui peuvent être activés par collision à l’interface de la source ¾D’ioniser des molécules polaires (de préférence)… ¾Y compris de haute masse grâce à la multiprotonation John FENN (Nobel 2002) 59 1988 Premiers spectres ESI présentés par Fenn et col. en 1988 au congrès de l’ASMS. En mai 1988, les méthodes de nébulisation (APCI, puis thermospray, puis ESI) semblent avoir gagné la partie et l’avoir emporté, en tous cas, sur les techniques d’ionisation par désorption d’ions secondaires (SIMS, puis PDMS). 60 1985 61 1988 62 1988 Ces spectres, publiés dans Anal. Chem. en octobre 1988 avaient été présentés en Aôut lors de l’IMSC de Bordeaux. 63 Mais au même moment … 1988 K. Tanaka Prix Nobel 2002 64 Les années 90 sont celles qui voient l’explosion des applications à la biologie de la spectrométrie de masse 1990 J. Am. Chem. Soc., 112, 9012-9013 (1990) Etude de la conformation des protéines par ESI Cytochrome c dans: a- 4% acide acétique, pH 2,6 b- 0,2% acide acétique, pH 3,0 c- H2O, pH 5,2 65 1991 J. Am. Chem. Soc., 113, 6294-6296 (1991) Analyse de complexes non covalents par ESI 66 1991 J. Am. Chem. Soc., 113, 8534-8535 (1991) Analyse de complexes non covalents par ESI Myoglobine de cheval: a- pH 3,35 b- pH 3,90 Le pH est ajusté par ajout d’acide acétique (sans acétate d’ammonium) 67 1993 Les débuts de la protéomique … 68 1993 Spectre de masse MALDI Interrogation des banques 69 1998 Les ions formés par ESI sont piégés dans la cellule d’une FT-ICR. Les électrons, formés initialement par irradiation laser (193 nm) de plaques métalliques peuvent être piégés par des plaques portées à -1V. Les spectres obtenus montrent un décalage de 1 u des massifs isotopiques par rapport aux spectres enregistrés sans laser. Un filament opposé à la source ESI servira par la suite de source d’électrons. 70 1998 F. W. McLafferty 71 Hypothèse mécanistique: 1998 -Les chaînes latérales des résidus protonés (K, R) sont engagées dans des liaisons hydrogène avec les fonctions des liaisons peptidiques - Si un électron s’approche d’une espèce pontée de type A…H+….B, sa capture se traduira par la formation de A.-H et B si l’affinité électronique de A+-H est supérieure à celle de B+-H. Or l’AE d’une amine protonée est de l’ordre de 4eV contre 6 eV pour un carbonyle protoné. - Si cette hypothèse est exacte, le radical se trouve sur la liaison peptidique, ce qui rend compte de la formation des ions c et z: -Cette dissociation est à la fois plus rapide que les réactions de transfert d’électrons et de scrambling d’hydrogène. -Ceci suggère des réactions de fragmentation locales, précoces avant que l’énergie de recombinaison (6 eV) ne soit redistribuée sur l’ensemble de la structure de l’ion. Réactions non-ergodiques Top-Down proteomics… 72 2004 PNAS, 101, 5928-5933 (2004) Motivations: 1. favoriser la localisation des sites de phosphorylation 2. Proposer une alternative à 73 l’ECD/FT-ICR 2004 74 1999 Quantification relative des taux d’expression de protéines dans des cultures cellulaires (en milieu 14N ou en 15N) 75 1999 La même stratégie peut être appliquée avec succès pour quantifier les taux relatifs locaux de phosphorylation. 76 1999 Nature Biotechnology, 17, 994-999 (1999) Spectre de masse partiel (nano-LC/MS, ion 2+) Chromatogramme « reconstruit » des ions d’intérêt 77 1999 Le marquage est compatible avec la MS/MS 78 2001 Nature Medicine, 7, 493-496 (2001) 79 2001 …. À suivre …. 80