Guillou Noëlline
TP de culture cellulaire
Chateigner Aurélien
TP de culture cellulaire
I.
Introduction
Aujourd’hui, l’embryologie est une science qui s’est tournée vers la compréhension des mécanismes
qui permettent le développement des organismes. Pour la plupart des oiseaux, et notamment pour
notre poule, le développement de l’embryon se fait en dehors de l’organisme maternel, à l’abri d’une
protection, vulgairement appelée œuf.
Cet œuf contient toutes les ressources nécessaires au développement de l’embryon, que ce soit au
niveau de l’énergie, de l’eau et de la protection. L’enveloppe externe de cet embryon permet donc la
protection de l’embryon, de par sa composition en 3 parties principales : Vitellus, Amnios et
Allantoïde. Nous verrons les rôles de ces enveloppes dans la première partie.
En ce qui concerne le développement de l’embryon en lui-même, un certain nombre de processus se
mettent en place, que ce soit pour la division cellulaire en elle-même, ou pour la reconnaissance, la
migration et la différenciation cellulaire. Ces mécanismes ont pour finalité de former les tissus et les
organes de la future poule.
Composant ces tissus et organes, un grand nombre de molécules sont aujourd’hui connues, aussi
bien au niveau de la matrice extracellulaire qu’au niveau des membranes. Nous pouvons de plus, à ce
jour, mettre en culture des cellules, et ainsi mieux comprendre les mécanismes biologiques et
cellulaires. Pour notre TP, nous voulons mettre 2 types de cellules en culture, des cellules cérébrales
et des fibroblastes. Pour les mettre en culture, nous utilisons la technique de culture de cellules
adhérentes à un support. Nos observations se font au microscope inversé, sous hotte à flux
laminaire, et donc en conditions stériles.
II.
1ère partie : mécanisme d’adhésion et de migration cellulaire
A.
L’embryon et les annexes embryonnaires
Vésicule Vitelline
Vitellus
Allantoïde
Chorion
Cœlome extra-embryonnaire
Embryon
Cavité amniotique
Amnios
Figure 1 : Schéma de l'embryon de poulet à 7 jours
de développement
1
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Coquille
Embryon
Annexes embryonnaires
Figure 2 : Position relative de l'Embryon dans l'œuf, en vue du dessus, en
ayant coupé du côté du "gros bout"
Vitellus
Allantoïde
Embryon
Amnios
Veine vitelline
Figure 3 : Photo de la position de l'œuf par rapport aux annexes
embryonnaires une fois l’embryon extrait de l’œuf.
2
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Bec
Œil
Hémisphères cérébraux
Lobes optiques
Tête
Cervelet
Moelle épinière
Figure 4 : Zone cérébrale d'un embryon d'œuf de poule
B.
Rôle des annexes
a)
Vitellus
Réserves nutritives de l’embryon, rôle nourricier.
b)
Vésicule vitelline
Entoure la masse de Vitellus, sert d’organe digestif. Elle est parsemée de vaisseaux sanguins, ainsi les
produits sont absorbés par ceux-ci et transportés vers l’embryon.
c)
Allantoïde :
Fonction dans la respiration : la splanchnopleure amène une vascularisation ce qui permet des
échanges gazeux entre l’allanto-chorion et la coquille de l’œuf.
Fonction nutritive sur plusieurs aspects : prend le relais du raphé séro-amniotique pour l’assimilation
du reste de l’albumen et permet de récupérer le calcium de la coquille pour former les os de
l’embryon ce qui fragilise la coquille et ainsi facilite la sortie du poussin.
Fonction excrétrice : la cavité allantoïde est une poubelle de l’embryon, en effet les déchets produits
par les reins seront lâchés dans l’allantoïde. Au moment de l’éclosion l’allanto-chorion reste collée à
la coquille.
d)
Chorion
Couche extra-embryonnaire externe constituée de mésoderme et d’ectoderme.
e)
Cavité générale de l’œuf.
Cœlome extra-embryonnaire
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f)
Amnios
Permet le développement de l’embryon en milieu liquide. Permet l’assimilation de l’albumen par le
raphé séro-amniotique jusqu'à 16 jours d’incubation. Assure à l’embryon une protection contre une
possible dessiccation et d’éventuels chocs mécaniques.
C.
Mise en culture des cellules cérébrales embryonnaires de
poulet
Matériel et méthodes :
1.
Milieu DMEM
a)
DMEM base
Le milieu DMEM base est acheté tel quel.
b)
DMEM 5%
Le milieu DMEM 20% se prépare en suivant la composition suivante :
-
Milieu de base : DMEM
Sérum de veau fœtal (SVF)
Antibiotique
L-glutamine
500 mL
25 mL (5%)
6 mL
6 mL
c)
DMEM 20%
Le milieu DMEM 5% se prépare en suivant la composition suivante :
-
Milieu de base : DMEM
Sérum de beau fœtal (SVF)
Antibiotique
L-glutamine
2.
500 mL
110 mL (20%)
6 mL
6 mL
Poly Lysine
Pour 10 boites :
1- Peser l’acide borique dans un bécher de 50 mL et ajouter 40 mL environ d’H2O
2- Ensuite, peser la poly lysine dans un micro bécher à l’aide de 2 pinces et l’ajouter avec
attention à l’acide borique. Agiter le tout.
3- Peser le NaOH 1N dans un bécher de 25 mL et ajouter de l’H2O puis mélanger avec une tige
de verre dans un bain-marie. Ensuite, le transvaser dans une fiole et ajuster à 50 mL. Agiter
et mettre dans un flacon.
4- Le PH étant de 4,75 environ, il faut (0,5 mL environ d’NaOH 1N) pour remonter le pH à 8,4
5- Ensuite ajuster la solution à 50 mL avec H2O
6- Prévoir un bécher de 25 ou 50 mL et une seringue de 10 mL avec un filtre de 0,22 µm et
verser 2,5 mL par boite de Pétri (sous la hotte). Ne plus bouger les boites jusqu’à la mise en
culture.
3.
Tampon borate
Pour les boites « borate », la procédure est la même sauf que l’on n’ajoute pas la poly lysine au
tampon borate.
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4.
Fibronectine
On veut préparer 10 boites de 60 mm de diamètre, ayant donc chacune 28 cm² de surface. On veut 2
µg.cm-2, on a donc besoin de 560 µg de fibronectine.
Pour cela on suit le protocole suivant :
1- Reconstituer avec 1 mL d’eau stérile par mg de protéine. Laisser dissoudre pendant au moins
30 minutes.
2- Diluer la fibronectine dans une solution saline tamponnée (la dilution n’est pas indiquée) et
recouvrir la surface de culture avec un volume minimum.
3- Laisser sécher à l’air pendant au moins 45 minutes à température ambiante. L’excès de
fibronectine sera éliminé par aspiration.
Lors de notre manipulation, nous avons donc mis en culture des cellules cérébrales embryonnaires
de poulet dans des boites de Pétri présentant différents revêtements afin de savoir lequel semblait
être le plus adapté à ce type de culture cellulaire.
Protocole :
Incision
Prélèvement de
l’embryon
Œuf de poule à stériliser à l’alcool
Préparation de la culture
des fibroblastes
Prélèvement des
hémisphères
cérébraux
Préparer les revêtements des
différentes boites
Homogénéiser à l’aide d’une
seringue et d’un trocart
Dans du DMEM 20%
Tampon Borate
Fibronectine
Polylysine
Répartir 1,5 mL de la solution
cellulaire + 3,5 mL de DMEM
20% dans chaque boite
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D.
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Analyse et interprétation des résultats
1.
Tampon borate
Après 1 heure d’incubation à 37°C en incubateur
à CO2, on observe une absence d’adhérence des
cellules sur le fond de la boite. On observe la
présence d’amas cellulaires, sans doute dus à
une mauvaise séparation des cellules lors de la
manipulation.
Figure 5 : Culture de neurones en tampon borate après 1
heure d'incubation
Après 4 jours d’incubation, les cellules n’ont
toujours pas adhéré, on constate l’absence de
croissance cellulaire, et la présence de quelques
corps apoptotiques (cellules mortes).
Figure 6 : Culture de neurones en tampon borate après 4
jours d'incubation
Après 7 jours d’incubation, les cellules n’ont ni
adhéré, ni poussé, et seuls les corps apoptotiques
sont visibles.
Figure 7 : Culture de neurones en tampon borate après 7
jours d'incubation
6
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Donc, le tampon borate n’est pas un milieu approprié pour la croissance des cellules cérébrales
embryonnaires, en effet, dans les conditions expérimentales, nous n’avons observé aucune
adhérence, migration ou croissance de celles-ci.
2.
Polylysine
Après 1 heure d’incubation à 37°C en incubateur à
CO2, on observe l’apparition de petits
prolongements cellulaires sur certaines cellules,
ceci montre que les cellules sont entrain d’adhérer
à la paroi de la boite. Par ailleurs, on peut observer
l’apparition de longs prolongements qui pourraient
traduire un début de croissance cellulaire.
Figure 8: Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur
polylysine après 1h d'incubation.
Après 4 jours d’incubation, on constate la présence
de corps apoptotiques. Les cellules vivantes
adhèrent à la paroi. De plus, les cellules ont
poussé, de nombreux prolongements (axones et
dendrites) sont apparus. On remarque aussi les
synapses entre différents neurones.
Figure 9 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur
polylysine après 4 jours d'incubation.
Après 7 jours d’incubation, les corps apoptotiques
sont toujours présents. Les neurones ont
davantage poussé, ils adhèrent toujours à la paroi
de la boite et des nombreux prolongements
supplémentaires sont apparus.
Les neurones font tous des synapses les uns avec
les autres.
Figure 10 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur
polylysine après 7 jours d'incubation.
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La polylysine est un polymère de L-lysine, acide aminé présentant sur sa chaine latérale un
groupement amine. Le pH de notre solution étant à 8.4, la polylysine est chargée positivement ce qui
lui permet de se lier à des groupements chargés négativement par des interactions électrostatiques.
Notre culture a bien adhéré à la paroi de la boite de Pétri, sans doute grâce à des liaisons
électrostatiques, les cellules ont bien poussé et migré. Il semblerait donc que dans ces conditions
d’expérimentations ce type de support soit approprié à la culture de neurones.
3.
Fibronectine
Après 1h d’incubation à 37°C en incubateur à CO2,
on remarque l’apparition de petits prolongements
sur quelques cellules, celles-ci sont sans doute
entrain d’adhérer à la paroi de la boite de Pétri.
Figure 11 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur
fibronectine après 1h d'incubation.
Après 4 jours d’incubation, les cellules ont bien
adhéré à la paroi, elles ont émit des
prolongements (axones et dendrites), quelques
synapses sont apparues. On ne voit pas de corps
apoptotiques.
Figure 12 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur
fibronectine après 4 jours d'incubation.
Après 7 jours d’incubation, les cellules ont très
fortement adhéré à la paroi, elles ont émit une
multitude de prolongements et de nombreuses
synapses sont visibles. De plus, les grossissements
sont les même sur toutes les photos présentées et
on constate que sur celle-ci, les cellules sont
beaucoup plus grosses. On n’observe que peu de
corps apoptotiques.
Figure 13 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur
fibronectine après 7 jours d'incubation.
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La fibronectine est une glycoprotéine dimérique de 440 kDa présentant de nombreux sites de liaisons
pour les récepteurs membranaires de certaines cellules, le collagène... In vivo, elle joue un rôle
important dans la migration et la différenciation cellulaire.
Notre culture a bien adhéré à la paroi de la boite de Pétri, en se fixant à la fibronectine. Les cellules
ont bien poussé et migré. De plus, la croissance cellulaire est plus importante que sur la polylysine.
Peu de corps apoptotiques sont présents.
E.
Conclusion
Dans nos conditions expérimentales, il apparait que le meilleur revêtement à utiliser pour la mise en
culture de cellules cérébrales embryonnaires de poulet soit la fibronectine. En effet, les cellules
poussent et migrent mieux que sur polylysine et peu de corps apoptotiques y sont observés.
Par ailleurs, le soma des neurones ne présente pas de structure particulière.
III. 2ème partie : marquages subcellulaires de cultures primaires de
fibroblastes
A.
1ère séance : Mise en culture des fibroblastes de poulet
Afin de mettre en culture des fibroblastes, nous avons travaillé sur le corps de l’embryon de poulet.
Nous avons éliminé les membres, les viscères et la colonne vertébrale. Nous avons ensuite broyé et
dispersé le reste des tissus dans du milieu DMEM 5% puis mis en culture à 2 concentrations
différentes : une boite contenant 1 mL de suspension cellulaire et 4 mL de DMEM 5%, et l’autre
contenant 0,2 mL de suspension cellulaire et 4,8 mL de DMEM 5%.
Nous avons observé les cellules le jour même, à 7 jours et à 14 jours, en ayant réalisé un passage à 7
jours.
Figure 15 : Observation d'une culture de fibroblastes
(0,2 mL de culture + 4,8 mL de DMEM) à 7 jours
Figure 14 : Observation d'une culture de fibroblastes (1
mL de culture + 4 mL de DMEM) à 7 jours
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On observe sur chacune des photos plusieurs types cellulaires morphologiquement différents. Après
7 jours, on observe que dans la boite à 0,2 mL, les cellules qui ont le plus poussé sont les fibroblastes.
Nous avons mis en culture un mélange de cellules contenant entre autre des fibroblastes. Les
fibroblastes sont des cellules qui ont besoin d’un support d’adhérence pour croitre, et il se trouve
que dans la boite à 1 mL, la présence d’autres types cellulaires à gêné leur adhérence, les empêchant
ainsi de se multiplier et de croitre. Dans la boite à 0,2 mL, moins de cellules ont été ensemencées, les
fibroblastes ayant une croissance plus rapide que la moyenne, ils ont surpassé les autres cellules en
fixation et en croissance. Ceci nous a permis de réaliser un enrichissement en fibroblastes.
Contrairement au premier jour d’observation, à 7 jours, les fibroblastes présentent une organisation
spécifique, les cellules sont allongées et disposées parallèlement les unes par rapport aux autres.
B.
2ème séance : Entretien de cultures cellulaires
Protocole corrigé :
-
-
Prendre boite 0,2, éliminer le milieu avec une P1000
Faire délicatement un rinçage avec 2 mL de milieu PBS pour éliminer le sérum, piège pour
l’action de la trypsine (attention à ne pas tout décoller)
Décoller les cellules en faisant agir 1,5 mL de trypsine : la trypsine dégrade les protéines
extracellulaires qui interagissent avec la matrice. Il ne faut pas la laisser agir trop longtemps,
sinon elle s’attaque aux protéines cellulaires, et dégrade alors la cellule en elle-même.
Surveiller les cellules à l’œil et au microscope (transparence, peut prendre entre 2 et 5
minutes)
Quand les cellules sont décollées, ajouter 0,2 mL de SFV (la trypsine se fixe alors aux
protéines de la SFV)
Homogénéiser et prendre 1 mL, à mettre dans un tube Eppendorf
Mettre 50µL + 450 µL de DMEM base
Placer 50 µL sur une cellule de Malassez
Comptage
On observe en moyenne 4,5 cellules pour 1/100 µL, soit 450 cellule/µL.
Notre solution a été diluée au 10ème, on a donc 10 fois plus de cellules par
µL, ce nous donne 4500 cellules par µL. On veut ensuite ensemencer les
cellules sur les lamelles de verre de la façon suivante :
Lamelle
1- 2500 cellules/cm²
2- 10000 cellules/cm²
3- 15000 cellules/cm²
Dans un volume final
de 500 µL de CEF
4- 40000 cellules/cm²
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Le diamètre de chaque puits fait 1,5 cm, la surface S = π x r² = π x 0,75² = 1,77 cm². On veut donc :
1234-
2500 cellules par cm², donc pour 1,77 cm², on voudra 4425 cellules.
17700 cellules dans le puits
26550 cellules dans le puits
70800 cellules dans le puits
Sachant qu’on a 4500 cellules par µL, on devra prendre :
1- 2,95 µL de la suspension cellulaire q.s.p. 1,5 mL de CEF (on prépare 1,5 mL car la quantité de
suspension à prélever pour un volume de 500 µL serait trop petite)
2- 11,8 µL q.s.p. 1,5 mL de CEF
3- 17,7 µL q.s.p. 1,5 mL de CEF
4- 47,2 µL q.s.p. 1,5 mL de CEF
On prélève ensuite 500 µL de chaque préparation que l’on dispose dans les puits 1 à 4. On laisse
ensuite pousser pendant 1 semaine à 37°C en incubateur à CO2.
C.
Séance 3 : marquage subcellulaire de l’ADN à l’acridine orange
L’acridine orange est une fluorescéine. Elle se fixe préférentiellement à l’ADN et permet ainsi de
mettre en évidence les noyaux et les mitochondries. On observe donc une fluorescence dans le vert.
Pour cela, on utilise un microscope à fluorescence, qui dispose d’une lampe à arc et de filtres
permettant la sélection de longueurs d’ondes précises.
Figure 16 : Molécule d'acridine orange
Principe du microscope à fluorescence :
Oculaire
Filtre d’émission
Filtre
d’excitation
Lampe à arc
Miroir
Dichroïque
Objet
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Absorbance
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Excitation
Emission
Longueur d’onde (nm)
450
520
On excite notre molécule dans le bleu, dont l’absorbance est maximale à 450 nm, et on utilise un
filtre d’émission qui permet de mettre en évidence les émissions à partir de 520 nm dans le vert.
Après avoir marqué nos cellules à l’acridine orange, nous les avons observé au microscope et avons
obtenu les photographies suivantes :
Figure 17 : Photographie de fibroblastes colorés à l'acridine orange et observés au microscope à fluorescence
D.
Conclusion
La coloration à l’acridine orange permet de mettre en évidence la structure du noyau des
fibroblastes, en effet, ils sont constitués de plusieurs nucléoles.
Cette manipulation nous a permis de mettre en évidence la morphologie et l’organisation des
fibroblastes, effectivement, ce sont des cellules adhérentes, qui s’organisent parallèlement les unes
aux autres, ne supportent pas la confluence, et ont des noyaux constitués de plusieurs nucléoles.
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