PESTE PORCINE CLASSIQUE (hog cholera)
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CHAPITRE 2.8.3. PESTE PORCINE CLASSIQUE (hog cholera) RÉSUMÉ La peste porcine classique (PPC), aussi connue sous la dénomination de hog cholera, est une maladie virale contagieuse du porc. Le virus responsable est un membre du genre Pestivirus de la famille des Flaviviridae, et se révèle très proche des virus de la maladie des muqueuses et de la maladie de la frontière (Border disease). Il n’existe qu’un sérotype de virus PPC. La maladie peut évoluer sous forme aiguë, chronique, latente, ou inapparente selon divers facteurs tenant au virus ou à l’hôte, parmi eux l’âge de l’animal, la virulence de la souche virale et la période d’infection (pré- ou post-natale) jouent un rôle prépondérant. Les porcs adultes sont moins sévèrement atteints que les jeunes et ont de meilleures chances de survie. Chez les truies gestantes, le virus peut traverser la barrière placentaire et atteindre les fœtus. L’infection in utero par des souches virales de basse ou faible virulence peut aboutir à ce que l’on a appelé le syndrome de la « la truie porteuse », entraînant une mortalité pré-natale ou post-natale précoce, la naissance de porcelets malades ou d’une portée en apparente bonne santé mais infectée de façon persistante. Une épizootie de PPC a des répercussions lourdes sur le commerce des porcs et de leurs produits. Le tableau clinique très polymorphe de la PPC interdit le plus souvent la réalisation d’un diagnostic purement clinique ou lésionnel. Les méthodes de laboratoire sont alors essentielles pour un diagnostic précis. La mise en évidence du virus ou de l’acide nucléique dans le sang et des anticorps dans le sérum, constituent les méthodes de choix du diagnostic de la PPC chez le porc vivant, tandis que la recherche du virus, de l’acide nucléique ou de l’antigène dans des prélèvements d’organes, est de loin préférable quand le porc est mort. Identification de l’agent pathogène : l’immunofluorescence (IF) appliquée sur des coupes au cryostat d’organes provenant de porcs atteints, peut être utilisée pour la détection de l’antigène PPC. Une série d’anticorps monoclonaux (AcMs) est utilisée pour déterminer si la fluorescence est due à des antigènes pestivirus PPC ou non PPC. L’amplification en chaîne par polymérase (PCR) est utilisée couramment pour la détection du génome du virus de la PPC. L’isolement du virus PPC peut être tenté sur la lignée cellulaire de rein de porc (PK-15) ou sur une autre lignée sensible. La production virale en culture de cellules est recherchée par coloration en immunofluorescence ou immunoperoxydase ; les isolats positifs sont ensuite caractérisés grâce aux AcMs et par un séquençage génétique partiel. Les protocoles de PCR pour l’identification de l’acide nucléique du virus PPC sont acceptés au niveau international et sont utilisés dans plusieurs laboratoires tant pour la détection du virus que pour le différencier des pestivirus des ruminants. Des épreuves immuno-enzymatiques de capture d’antigène (ELISA) sont aussi très utiles pour le dépistage des élevages mais ne doivent pas être utilisées pour le diagnostic d’un animal isolé. Épreuves sérologiques : la recherche des anticorps spécifiques du virus est particulièrement utile dans les élevages suspectés d’être infectés depuis au moins 21 jours, par le virus de la PPC. Les méthodes sérologiques sont aussi valables pour les enquêtes de contrôle et de détermination de prévalence ; elles sont essentielles si un pays souhaite être reconnu internationalement comme indemne de la maladie en l’absence de vaccination. Dans la mesure où des réactions croisées avec des anticorps Pestivirus de ruminants sont parfois rencontrées chez les porcs d’élevage, les épreuves de dépistage doivent être complétées par des épreuves de confirmation spécifiques du virus PPC. L’ELISA est relativement spécifique du virus Manuel terrestre de l’OIE 2008 1195 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) PPC, mais la méthode définitive de différentiation est l’épreuve de neutralisation comparative qui compare le titre en anticorps vis-à-vis des différentes espèces de Pestivirus. Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique : les vaccins contre la PPC utilisent des virus vivants atténués par passages sur cultures de cellules ou sur des espèces réceptives qui ne sont pas de la famille des suidés. La production de ces vaccins à virus vivants modifiés repose sur la validation du système lot-semence tenant compte de l’identité virale, de la stérilité, de la pureté, de l’innocuité, de la non transmissibilité, de la stabilité et de l’immunogénicité. Si le virus PPC est utilisé pour la production de vaccin ou lors d’épreuves virulentes, les locaux doivent répondre aux normes de confinement de l’OIE correspondant aux agents pathogènes du groupe 4. Des vaccins inactivés de type conventionnel, impliquant le virus entier, ne sont pas disponibles. Des « vaccins sous-unitaires marqués » sont maintenant disponibles, qui, à la différence des vaccins à virus vivants atténués, induisent des anticorps qui peuvent être distingués de ceux induits par le virus naturel en utilisant une épreuve de diagnostic appropriée. Les « vaccins marqués » proposés à l’heure actuelle, utilisent la glycoprotéine majeure de l’enveloppe (E2-sous-unité) du virus PPC et sont produits sur cellules d’insecte grâce à la méthodologie de recombinaison de l’ADN. A. INTRODUCTION Les virus responsables de la peste porcine classique (PPC), de la diarrhée virale bovine (BVD, Bovine Viral Diarrhoea ou maladie des muqueuses) et de la maladie de la frontière (BD, Border Disease) sont des membres de la famille des Flaviviridae, appartenant au genre Pestivirus, et sont très proches au plan antigénique et structurel. Les signes cliniques et les lésions découvertes à l’autopsie de porcs morts de PPC sont très variables en raison de facteurs liés, à la fois au virus et à l’hôte. Bien plus, les infections congénitales de la truie par des pestivirus de ruminants peuvent conduire à une maladie cliniquement indistinguable de la PPC (31, 33, 35). L’atteinte de tous les groupes d’âge, accompagnée de fièvre, d’entassement, d’inappétence, d’abattement, de faiblesse, de conjonctivite, de constipation suivie par une diarrhée et d’une démarche chancelante, sont les signes essentiels. Plusieurs jours après l’apparition des signes cliniques, une coloration pourpre apparaît sur les oreilles, l’abdomen et à l’intérieur des cuisses. La mort survient en 1 à 3 semaines dans la forme aiguë. Une mort brutale, en l’absence de signes cliniques, n’est pas symptomatique de la PPC. Dans certaines circonstances en rapport avec l’âge de l’animal et son état ainsi qu’avec la souche de virus en cause, des atteintes subaiguë ou chronique peuvent se développer et se prolonger sur 2 à 4 semaines ou même des mois. La forme chronique conduit à un retard de croissance avec anorexie, fièvre intermittente et diarrhée. Les infections congénitales persistantes peuvent restées méconnues pendant des mois et peuvent être limitées à seulement quelques porcelets de l’élevage ou affecter un grand nombre d’animaux. Les signes cliniques sont équivoques : dépérissement apyrétique. Les infections chroniques persistantes conduisent toujours à la mort de l’animal. Les taux de mortalité dans un élevage, peuvent être légèrement supérieurs à ceux attendus. La PPC affecte le système immunitaire et la principale caractéristique en est une leucopénie généralisée, qui peut souvent être détectée avant l’apparition de la fièvre. L’immunosuppression peut entraîner l’apparition d’infections secondaires. Dans les formes aiguës, les lésions macroscopiques peuvent être discrètes ou absentes. Dans les cas typiques, les nœuds lymphatiques sont hypertrophiés et marbrés de rouge, des hémorragies apparaissent sur les séreuses oui les muqueuses des organes intestinaux. Des infarctus peuvent être observés dans les reins. Dans les cas chroniques, des ulcères nécrotiques dits « en boutons de culotte » peuvent être observés dans la muqueuse du tractus gastro-intestinal, l’épiglotte et le larynx, en plus des lésions précédentes. Les lésions microscopiques histologiques ne sont pas pathognomoniques. Il peut s’agir de dégénérescence parenchymateuse du tissu lymphatique, de proliférations cellulaires du tissu interstitiel vasculaire, et d’une méningo-encéphalomyélite non suppurée, avec ou sans manchons péri-vasculaires. Une synthèse sur les techniques de diagnostic et la vaccination de la PPC a récemment été publiée par une source autorisée (3) qui, outre des lignes directrices générales, apporte des informations sur la validation et un avis scientifique sur l’applicabilité de certains produits commercialisés dans ces domaines. 1196 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC Le polymorphisme et l’intensité variable des signes cliniques et lésionnels ne permettent pas de poser un diagnostic précis. D’autres maladies, telles que la peste porcine africaine, le syndrome dermatite et néphropathie du porc (PDNS pour porcine dermatitis and nephropathy syndrome), le syndrome de dépérissement post-sevrage (PMWS pour post-weaning multisystemic wasting syndrome), le purpura thrombocytopénique ainsi que diverses infections septicémiques telles que les salmonellose (notamment celles dues à Salmonella choleraesuis), les rougets, la pasteurellose, l’actinobacillose (due à Actinobacillus suis) et les infections à Hemophilus parasuis, peuvent être confondues avec la PPC aiguë. En fait, ces bactéries sont souvent responsables d’infections secondaires et, l’isolement de ces germes peut cacher la cause réelle de la maladie, le virus de la PPC. De même, le PDNS évoluant simultanément peut occulter une PPC sous-jacente. C’est pourquoi, une tentative de diagnostic clinique ou lésionnel doit toujours être confirmée par des recherches de laboratoire. Étant donné que la fièvre est un des premiers symptômes de la PPC et qu’elle est concomitante de la virémie (7), la détection du virus ou de l’acide nucléique viral dans le sang total récolté sur héparine ou acide éthylène diamine tétra-acétique (EDTA) ou dans les tissus prélevés chez des animaux fébricitants est la méthode de choix pour dépister précocement les élevages infectés. Cela est d’autant plus nécessaire à la vue des lourdes conséquences que l’existence d’un foyer de PPC peut causer pour le commerce international des porcs et de leurs produits. Les méthodes de laboratoire pour le diagnostic de la PPC visent la mise en évidence du virus, de son acide nucléique ou de ses antigènes ainsi que des anticorps qui lui sont spécifiques. Pour une interprétation correcte des résultats des épreuves, le vétérinaire doit accorder une attention particulière à l’apparition simultanée et groupée d’au moins 2 signes parmi les plus fréquents de la maladie signalés ci-dessus. La réalisation de prélèvements au hasard ne convient pas au diagnostic. De plus, les prélèvements sanguins destinés à la recherche du virus et les réactions de transcription inverse et d’amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) peuvent être réalisés sur un nombre plus important de porcs. La PPC fait l’objet d’un contrôle officiel et le virus présente un haut risque de diffusion à partir du laboratoire : une analyse de risque doit être effectuée pour déterminer le niveau de biosécurité nécessaire au diagnostic et à la caractérisation du virus. Les locaux doivent répondre aux normes de Confinement correspondant au Groupe déterminé par l’évaluation du risque comme cela est souligné dans le Chapitre 1.1.2., « Biosécurité et Biosûreté au laboratoire de microbiologie vétérinaire et dans les animaleries », de ce Manuel terrestre. Les pays ne pouvant avoir accès à un tel laboratoire national ou régional, devront adresser les prélèvements à un Laboratoire de référence de l’OIE. Les anticorps apparaissent durant la troisième semaine d’évolution de la maladie et persistent toute la vie chez les sujets survivants. Les prélèvements destinés à la recherche des anticorps sont effectués dans des tubes ordinaires non héparinés, chez les porcs convalescents et chez les porcs de l’élevage qui ont été en contact avec le virus, au moins 3 semaines après que le contact avec un foyer avéré a eu lieu. 1. Identification de l’agent pathogène a) Méthodes immunologiques • Épreuve d’immunofluorescence L’immunofluorescence (IF) est rapide et peut permettre de détecter l’antigène du virus PPC sur des coupes au cryostat d’amygdale, de rate, de rein, de nœud lymphatique ou de portion distale de l’iléon. Les tissus doivent être prélevés sur plusieurs animaux fiévreux et/ou malades (4) et transportés sans conservateur, sous froid mais non congelés. Les coupes au cryostat sont colorées directement avec une immunoglobuline anti-PPC conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) ou indirectement à l’aide d’un conjugué FITC secondaire puis examinées au microscope à fluorescence. Au début de l’infection, le tissu amygdalien est le plus propice car il est le premier à être infecté par le virus quelle que soit la voie de pénétration (25). Dans les cas subaiguës ou chroniques, l’iléon est souvent positif et, parfois, constitue le seul tissu révélant une fluorescence. Un résultat négatif en IF ne peut permettre d’éliminer l’infection PPC. Lorsque la suspicion de PPC persiste, il doit être réalisé d’autres prélèvements ou des essais d’isolement du virus en cultures de cellules (par exemple sur rein de porc [PK-15] ou sur d’autres lignées d’origine porcine aussi sensibles et reconnues exemptes de contamination par un Pestivirus). Dans les laboratoires qui ne maîtrisent pas parfaitement la technique IFI, les risques de faux résultats (positifs ou négatifs) sont relativement élevés. L’IFI devrait donc être utilisée uniquement dans les laboratoires ayant une bonne expérience de cette méthode, qui la réalisent en routine et dont le personnel a été formé à l’interprétation de la fluorescence. Manuel terrestre de l’OIE 2008 1197 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) • Protocole Introduire des coupes témoins positif et négatif dans chaque série de prélèvements d’organe à examiner. i) Découper un fragment d’amygdale, de rate, de rein et d’iléon d’environ 1 × 1 × 0,5 cm, et le placer soit avec un composé de cryo-montage, soit avec de l’eau distillée, sur le support de tissu du cryostat. ii) Congeler le fragment d’organe sur le support du cryostat. iii) Effectuer des coupes ne dépassant pas 4 à 8 µm d’épaisseur et les étaler sur des lamelles couvre-objet (10 × 32 mm) dégraissées et dont un coin est coupé. Toutes les coupes sont montées avec le coin coupé de la lamelle dans la même direction (par exemple angle supérieur droit). iv) Après séchage, fixer les coupes ainsi montées, pendant 10 min à la température ambiante, dans de l’acétone (qualité analytique), ou à l’air pendant 20 min à 37 °C. v) Immerger rapidement les coupes dans une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS), éliminer le fluide en excès à l’aide d’un papier filtre, et les placer (angle supérieur coupé à droite) sur un support dans une chambre humide dont le fond renferme une petite quantité d’eau. vi) Répartir l’immunoglobuline anti-PPC à la dilution recommandée, sur la totalité de la surface de la coupe et incuber pendant 30 min à 37 °C dans la chambre humide close. Si le conjugué FITC secondaire est nécessaire, laver la coupe 5 fois, pendant 2 min chacune, dans du PBS à la température ambiante, puis ajouter le conjugué FITC à la dilution requise et incuber comme précédemment. vii) Laver les coupes 5 fois, pendant 2 min chacune, dans du PBS, à la température ambiante. viii) Éliminer le PBS restant par contact de la lamelle avec un papier filtre fin, et monter la lamelle (avec la coupe entre la lamelle et la lame) avec un tampon de montage, sur une lame pour examen microscopique. ix) Éliminer l’excès de fluide de montage avec du papier filtre et examiner les coupes pour rechercher les foyers fluorescents, en utilisant un microscope à lumière ultra-violette. Une coupe PPC-positive montre des cellules émettant une fluorescence verte brillante. Dans les amygdales, la fluorescence de la bordure épithéliale des cryptes est particulièrement marquée. Dans le rein, la fluorescence est plus intense dans les tubules proximaux et distales du cortex rénal et les tubes collecteurs de la médulla. Dans l’iléon, la fluorescence est plus accusée dans les cellules épithéliales des glandes de Lieberkün, tandis que dans la rate, la réactivité est plus diffuse avec des concentrations de cellules lymphoïdes dans les gaines lymphoïdes péri-artérielles (PALS). L’IF utilise une immunoglobuline anti-PPC préparée à partir d’un anticorps polyclonal du virus PPC incapable de distinguer les antigènes des différents pestivirus. Les conjugués utilisés pour l’IF sur les coupes au cryostat ou les cultures de cellules inoculées, doivent être élaborés à l’aide de gamma-globulines obtenues chez des porcs exempts d’agents pathogènes spécifiques (EAPS). La dilution de conjugué utilisée (au moins 1/30) doit ménager un maximum de brillance sur un minimum de coloration de fond. La réaction ne doit être réalisée que sur des échantillons prélevés sur des animaux morts depuis peu, car l’autolyse et la contamination bactérienne entraînent souvent une coloration parasite. Les souches vaccinales de virus vivant modifié (VVM) se multiplient surtout dans les nœuds lymphatiques régionaux et dans l’épithélium des cryptes amygdaliennes. Les porcs vaccinés avec des souches VVM peuvent produire une IF positive durant les 2 semaines suivant la vaccination (22, 28). L’inoculation du lapin est utilisée pour différencier les souches de PPC lapinisées des souches sauvages. À l’opposé des souches sauvages, les souches lapinisées, inoculées par voie intraveineuse, entraînent une réaction fébrile et induisent une réponse immunitaire chez le lapin. Maintenant que le séquençage de l’acide nucléique est devenu une technique fiable, l’inoculation aux animaux n’est plus nécessaire pour faire la distinction entre les souches sauvages et les souches vaccinales du virus de la PPC. Les porcs infectés par les pestivirus des ruminants peuvent donner, en IF, des réactions faussement positives. Les infections congénitales dues aux pestivirus des ruminants peuvent entraîner des signes cliniques et des lésions identiques à ceux et à celles de la PPC chronique (31, 33, 35). Les infections par le virus PPC ou les pestivirus des ruminants peuvent être différenciés en soumettant les sérums de la truie et de la portée, ou des autres sujets en contact avec un porcelet IF positif, à une épreuve de séroneutralisation vis-à-vis de chacun des virus. Si le virus a été isolé, ou si l’acide nucléique a été détecté à l’aide de la RT-PCR, un séquençage ultérieur représente un outil précis et rapide pour faire la distinction entre les pestivirus des ruminants et le virus de la PPC. Une autre méthode de différentiation de ces virus consiste en l’inoculation de porcelets séronégatifs avec une suspension du matériel suspect, suivie, 4 semaines plus tard au moins, d’épreuves de séroneutralisation pratiquées sur leur sérums pour la recherche des anticorps respectifs. Cependant, les épreuves de séroneutralisation peuvent prendre plusieurs jours et les méthodes d’inoculation à l’animal réclament plusieurs semaines. 1198 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) • Épreuve d’immunoperoxydase pour la différentiation des pestivirus par les anticorps monoclonaux Le recours à une série de 3 anticorps monoclonaux (AcMs), soit conjugués à la peroxydase de raifort (HRPO) ou à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC), soit utilisés en association avec un conjugué anti-souris et détectant de façon spécifique respectivement toutes les souches PPC sauvages, les souches vaccinales PPC et les pestivirus des ruminants, permettrait une différentiation précise entre les souches sauvages et vaccinales PPC, d’une part, et entre virus PPC et les autres pestivirus, d’autre part (11, 36, 38). Une condition essentielle est que l’AcM anti-virus PPC reconnaisse toutes les souches sauvages et que l’AcM anti-vaccin reconnaisse toutes les souches vaccinales utilisées dans le pays. Aucun AcMs ne réagit sélectivement avec tous les pestivirus de ruminants (11). Le recours à un AcM différenciant la souche vaccinale PPC n’est pas nécessaire dans les zones où l’on ne vaccine pas. Une immunoglobuline polyclonale anti-PPC conjuguée à la peroxydase (HRPO) sert de témoin positif. Des précautions doivent être prises lorsque l’on utilise un seul AcM en confirmation unique de la nature PPC d’un isolat. • Protocole i) Réaliser au cryostat au moins 8 coupes (4 à 8 µm) d’amygdale positive en IF ou d’un autre organe positif si l’on ne dispose pas d’amygdale. ii) Fixer les coupes sur des lamelles couvre objet dans l’acétone (qualité analytique) pendant 10 min et laisser sécher à l’air. iii) Préparer des dilutions appropriées des différents conjugués AcMs-peroxydase en PBS + 0,01 % de Tween 80 + 5 % de sérum de cheval, pH 7,6 (un FITC-AcMs peut aussi être utilisé, aussi bien qu’un AcM non conjugué, pourvu qu’un second conjugué soit utilisé). iv) Après rinçage en PBS, recouvrir 2 coupes avec la dilution des conjugués monoclonaux respectifs et 2 coupes avec la dilution du conjugué polyclonal (témoins). v) Incuber à 37 °C pendant 1 h en chambre humide. vi) Laver les coupes pendant 10 s, 6 fois, en PBS. vii) Colorer les coupes avec la solution de substrat chromogène1 fraîchement préparée, pendant 5 à 15 min à température ambiante. viii) Rincer les coupes dans une solution en eau distillée d’acétate de sodium 0,05 M, pH 5,0, et les monter sur des lames pour examen microscopique. ix) Examiner les coupes au microscope. Une coloration rouge foncé du cytoplasme des cellules épithéliales bordant les cryptes amygdaliennes indique la mise en évidence d’un virus par le conjugué correspondant et est considéré positive. x) Interprétation de l’épreuve : Anticorps polyclonale Anticorps monoclonal spécifique de Interprétation Souche PPC Souche vaccinale PPC Souche BVD/BD ! ! – – Souche sauvage PPC ! ! ! – Souche vaccinale PPC ! – – ! Souche BVD/BD ! – – – Autre pestivirus non-PPC* * L’existence de nouvelles souches de PPC doit toujours être prise en compte et tout isolat de cas où la PPC est encore suspectée doit être envoyé à un Laboratoire de référence de l’OIE. 1 Solution de substrat chromogène A. Solution stock de chromogène : 0.4 % de 3-amino-9-ethyl carbazole ; N,N-dimethyl-formamide (1 ml). Prendre garde aux composés toxiques. Les deux produits chimiques sont cancérigènes et irritants pour les yeux, la peau et l’appareil respiratoire. B. 0,05 M d’acétate de sodium, pH 5,0 ; 19 ml (filtré stérilement à travers une membrane). C. Solution stock de substrat (30 % de peroxyde d’hydrogène). Conserver les solutions stock A et C dans l’obscurité et à 4°C et la solution B à température ambiante. La solution stock A peut être conservée à 4°C Durant au moins 6 mois et la solution C durant au moins 1 an. Juste avant d’utiliser les solutions, diluer 1 ml de la solution A dans 19 ml de la solution B. Ajouter alors 10 µl de la solution stock C. Mélanger bien et colorer les coupes. Manuel terrestre de l’OIE 2008 1199 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) • Méthode immuno-enzymatique de capture Pour un diagnostic rapide de la PPC chez des porcs vivants, des épreuves immuno-enzymatique (ELISA) de capture ont été mises au point pour détecter les élevages suspects d’avoir été récemment infectés. Les ELISAs sont du type sandwich double-anticorps, avec des anticorps monoclonaux et/ou polyclonaux dirigés contre diverses protéines virales et utilisables sur du sérum, la fraction leucocytaire sanguine, ou du sang total prélevé sur anticoagulant ; en outre, des kits de diagnostic peuvent être utilisées pour tester des homogénats de tissu centrifugés (8). La technique est relativement simple à effectuer, ne réclame pas d’équipement nécessaire à la culture de tissu, est automatisable et peut donner des résultats en une demijournée. L’inconvénient d’être moins sensible que l’isolement viral, spécialement chez le porc adulte et lors de formes modérées ou sub-cliniques, est compensé par la possibilité de tester tous les porcs fiévreux suspects d’un élevage. Néanmoins, la faible spécificité de ces épreuves doit aussi être considérée. Le test ne convient pas pour le diagnostic de la PPC chez un seul animal. b) Isolement du virus L’isolement du virus en cultures de cellules est une méthode plus sensible mais plus lente pour le diagnostic de la PPC que l’immunofluorescence sur coupes en congélation. L’isolement est, au mieux, réalisé en cellules à division rapide PK-15 ensemencées sur des lamelles simultanément avec une suspension d’amygdale à 2 % dans le milieu de culture. D’autres lignées de cellules de porc peuvent être utilisées, mais elles doivent avoir démontré qu’elles sont au moins aussi sensibles que les cellules PK-15 pour l’isolement du virus PPC. Les cultures sont examinées par IF pour recherche des foyers fluorescents après 24 à 72 h, ou sont fixées pour coloration à l’immuno-peroxydase après 4 ou 5 jours d’incubation. L’amygdale est le tissu de choix pour l’isolement du virus chez les porcs morts ou sacrifiés en vue du diagnostic. A défaut, la rate, le rein, l’iléon ou les nœuds lymphatiques peuvent aussi être utilisés. Un protocole d’isolement est détaillé ci-dessous : i) Préparer une solution stock glutamine-antibiotiques concentrée 100 fois : dissoudre la glutamine (2,92 g) dans 50 ml d’eau distillée (solution A) et la stériliser par filtration. Dissoudre chacun des antibiotiques suivants dans 5 à 10 ml d’eau distillée stérile : pénicilline (106 Unités Internationales [UI]) ; streptomycine (1 g) ; mycostatine (5 × 105 U) ; polymyxine B (15 × 104 U) ; et kanamycine (1 g). Mélanger ces solutions d’antibiotiques (solution B). Mélanger stérilement les solutions A et B, ajuster à 100 ml avec de l’eau distillée stérile, et stocker en aliquots de 5 ml à –20 °C. La composition exacte du mélange d’antibiotiques n’est pas essentielle, pour autant que la stérilité est garantie et que les cellules ne sont pas contaminées. ii) Couper 1 à 2 g de tissu en petits fragments et, en utilisant un mortier et un pilon ou tout autre appareil, les broyer dans une petite quantité de milieu de culture en présence de sable stérile, pour obtenir une pâte homogène. À défaut, utiliser un broyeur mécanique approprié à 4 °C. iii) Faire une suspension à 20 % (poids/volume) en ajoutant de la solution saline de Hanks (BSS, Balanced Salts Solution) ou du milieu essentiel minimum de Hanks (MEM) ; 1 ml de la solution stock glutamine-antibiotiques est ajouté pour chaque 10 ml de suspension. Le mélange est conservé 1 heure à la température ambiante. iv) Centrifuger à 1 000 g pendant 15 min. v) Une monocouche de cellules PK-15 est trypsinisée, la suspension de cellules est centrifugée à 160 g pendant 10 min, et les cellules sont reprises à la concentration d’environ 2 × 106 cellules/ml dans du milieu de croissance (MEM d’Eagle avec des sels de Earle ; 5 % de sérum fœtal de veau exempt de pestivirus ruminants et d’anticorps anti-pestivirus ; et 0,2 ml de solution stock glutamine-antibiotiques 2 par 10 ml de suspension cellulaire). Par exemple, un flacon de 75 cm donne environ 50 ml d’une suspension cellulaire à la bonne concentration. vi) Deux possibilités, soit : Inoculation d’une suspension : mélanger 9 parties de suspension cellulaire (étape v) à une partie du surnageant tissulaire (étape iv) et ensemencer 1,0 à 1,5 ml dans 6 à 8 tubes de Leighton avec lamelles ou tout autre dispositif de culture de cellules appropriées. Trois tubes reçoivent 1,0 à 1,5 ml de suspension cellulaire seule en tant que témoins. Après achèvement de l’ensemencement des prélèvements, 3 tubes sont inoculés avec le virus PPC comme témoins positifs. Des précautions doivent être prises pour éviter une contamination croisée avec la suspension virale positive connue. Des cultures négatives doivent aussi être préparées. Incuber à 37 °C. Ou : Inoculation d’une monocouche pré-établie : pour chaque tissu inoculer 1 à 1,5 ml de la suspension cellulaire (préparée à l’étape v) dans 6 à 8 tubes de Leighton avec lamelles ou tout autre flacon de 1200 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) culture cellulaire approprié. Incuber à 37 °C pendant au moins 4 h et au plus 36 h. Retirer le milieu et inoculer 0,2 ml du surnageant (préparé à l’étape iv), incuber 1 h à 37 °C, rincer et recouvrir avec 1 ml de milieu de culture et incuber à 37 °C. vii) 1, 2 et 3 jours après l’ensemencement, 2 cultures, ainsi qu’une culture témoin positive et négative, sont lavées 2 fois, pendant 5 min chaque fois, dans du BSS Hanks, MEM Hanks ou du PBS, fixées à l’acétone froid (qualité analytique) pendant 10 min, et colorées directement avec un conjugué anti-PPC à la dilution appropriée ou indirectement, comme décrit à la Section B.1.a. Si la suspension d’amygdale à 2 % se révèle toxique pour les cellules, l’épreuve sera renouvelée en utilisant une plus forte dilution ou un autre organe. Réaliser le test sur une monocouche préformée permettra d’éviter ce problème. viii) Après 3 lavage en PBS, de 5 min chacun, les lamelles sont montées en tampon carbonate/bicarbonate glycériné à 90 %, pH 8,0, et examinées pour recherche de foyers fluorescents. À la place des tubes de Leighton, des plaques à 6 puits avec lamelles peuvent être utilisées. À défaut, il est possible d’utiliser pour l’isolement viral, des plaques de micro-titrage à fond plat ou des plaques M24. Dans ce cas, les plaques sont fixées et colorées comme décrit plus loin dans l’épreuve de neutralisation utilisant la peroxydase (NPLA). Le sang total (sur héparine ou EDTA) des porcs cliniquement atteints est un bon prélèvement pour le diagnostic précoce de la PPC. La fraction leucocytaire ou d’autres composants peuvent être utilisés, mais pour des raisons de sensibilité et de simplicité, le sang total est préféré (10). Le protocole est le suivant : i) Congeler un échantillon de sang total à –20 °C puis, le décongeler au bain-marie à 37 °C. ii) Ensemencer 300 µl de sang hémolysé sur une couche monocellulaire de PK-15 parvenue à environ 75 % de confluence2 dans une plaque M24, et laisser absorber pendant 1 h à 37 °C. iii) Éliminer l’inoculum, laver la monocouche cellulaire, une fois, avec du BSS Hanks ou du MEM Hanks, et ajouter le milieu de culture. iv) Après 3 à 4 jours d’incubation, les plaques sont lavées, fixées et colorées comme décrit plus loin pour le NPLA, en utilisant à chaque étape, un volume de 300 µl pour tenir compte d’une surface cellulaire plus large. Note : cette méthode est moins sensible que celle, conventionnelle, d’isolement du virus pour la détection de la forme aiguë de PPC. • Transcription inverse couplée à une amplification en chaîne par polymérase De nombreuses méthodes de RT-PCR ont été décrites et sont encore développées (20). Cette alternative internationalement admise est rapide et plus sensible que les ELISAs de capture ou de l’isolement viral, ce qui la rend particulièrement efficace pour le diagnostic pré-clinique. Plusieurs protocoles de PCR en temps réel ont été décrits (14, 20, 24, 26, 27) et des exemples de protocole peuvent être obtenus par la littérature ou auprès des Laboratoires de référence de l’OIE pour la PPC (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre). En raison de sa rapidité et de sa sensibilité, la RT-PCR constitue une approche utile pour l’étude des cas suspects de la maladie et est désormais acceptée par de nombreux pays et l’Union Européenne (UE) (1). Cependant, il convient de garder présent à l’esprit qu’une contamination au laboratoire peut entraîner des résultats faussement positifs et que des résultats faussement négatifs peuvent être dus à des inhibiteurs présents dans l’échantillon. Tout résultat positif enregistré lors de premiers foyers doit systématiquement être confirmé par d’autres épreuves. Il est indispensable d’inclure dans l’épreuve un nombre adéquat de témoins positifs et négatifs ; il est aussi recommandé d’inclure des témoins internes. Pour plus de détails sur les épreuves de PCR, voir le Chapitre 1.1.5., « Validation et contrôle de qualité des épreuves d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) pour le diagnostic des maladies infectieuses ». Cette épreuve peut être appliquée sur des échantillons de sang individuels ou de mélange aussi bien que sur des organes et a été utilisée avec succès pour le contrôle des épizooties. L’épidémiologie moléculaire de la PPC repose sur la comparaison des différences génétiques existant entre les isolats de virus. L’amplification en RT-PCR de l’ARN PPC suivi du séquençage des nucléotides, est la voie la plus simple d’obtenir les données « séquence » pour faire ces comparaisons. Un certain nombre de régions différentes du génome PPC peut être ciblé pour les études épidémiologiques (23). Deux régions ont été très étudiées et fournissent une large série de données « séquence » avec lesquelles les nouveaux isolats peuvent être comparés. Une de ces régions se trouve dans la région 5’-non codante (5’NCR) du génome (150 nucléotides) et l’autre, dans le gène de la glycoprotéine majeure E2 (190 nucléotides). En bref, 2 L’inoculation simultanée, tout en étant légèrement plus sensible, convient moins du fait que l’anticoagulant peut gêner l’adhésion des cellules à la surface de la plaque. Manuel terrestre de l’OIE 2008 1201 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) la méthode retenue consiste à extraire l’ARN viral de cultures infectées de cellules PK-15, à effectuer la RT-PCR pour amplifier une des deux cibles dans la région 5’NCR ou dans le gène E2, puis à déterminer la séquence nucléotidique des produits et à la comparer avec les informations séquentielles déjà stockées dans les bases de données. Une base de données de ces séquences peut être obtenue auprès du Laboratoire de référence de l’OIE pour la PPC (Hanovre, Allemagne). Des découvertes récentes lors de l’étude des séquences de pestivirus de ruminants mettent en évidence le besoin d’analyser par cette méthode de nombreuses régions du génome pour typer les souches de façon précise (15). Les isolats de virus PPC provenant de foyers primaires, doivent être envoyés à un Laboratoire de référence de l’OIE pour les études en épidémiologie moléculaire. Une autorisation d’importation doit être obtenue avant l’expédition. 2. Épreuves sérologiques La mise en évidence des anticorps spécifiques du virus est particulièrement utile dans les élevages suspects d’infections par des souches de basse virulence. En raison de l’effet immunosuppresseur du virus PPC, les anticorps ne peuvent être révélés avant 21 jours post-infection. Les recherches sérologiques visent à détecter les foyers résiduels d’infection, tout particulièrement parmi les nouveau-nés de l’élevage, mais sont aussi utiles en phase terminale d’éradication. Puisque l’incidence de l’infection par les pestivirus des ruminants peut être élevée dans les élevages, seuls les épreuves capables de différencier les anticorps PPC des anticorps BVD/BD sont appropriées. La séroneutralisation virale et l’ELISA utilisant des AcMs, satisfont l’exigence de sensibilité, mais les résultats positifs en ELISA doivent être confirmés par une épreuve comparative en séroneutralisation. Les épreuves de séroneutralisation sont réalisées en cultures de cellules selon la méthode virus constant/sérum variable. Comme le virus PPC n’est pas cytopathogène, tout virus non neutralisé doit être détecté, après sa multiplication, par un système révélateur. L’épreuve de NPLA (29) et l’épreuve de neutralisation virale en immunofluorescence (FAVN) (18) sont les techniques les plus utilisées. Ces deux épreuves peuvent être conduites en plaques de micro-titrage. À l’heure actuelle, le système NPLA est préféré car sa lecture est plus facile et les résultats peuvent être obtenus à l’aide d’un microscope inversé, bien qu’une estimation puisse être réalisée également à l’œil nu. a) Épreuve de neutralisation en immunoperoxydase (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) La NPLA est réalisée en plaques de micro-titrage à fond plat. Les sérums sont d’abord inactivés à 56 °C pendant 30 min. Dans le cadre des échanges internationaux, il est recommandé d’utiliser une dilution sérique initiale de 1/5 (dilution finale au 1/10). Pour les contrôles de surveillance dans un pays, une dilution de 1/10 peut suffire. Les témoins appropriés de spécificité et de sensibilité des réactions, doivent être incorporés dans chaque épreuve. • Protocole i) Répartir des dilutions de sérum en milieu de croissance (MEM Eagle avec 5 % de sérum de veau fœtal et des antibiotiques) sous un volume de 50 µl, chacune dans 2 puits d’une plaque de micro-titrage. Le sérum de veau fœtal doit être exempt de virus BVD et d’anticorps correspondants. Un troisième puits peut être inclus pour chaque échantillon. Ce puits contient du sérum mais pas de virus et est utilisé comme témoin sérum (cyto-toxicité et/ou coloration non spécifique). ii) Ajouter 50 µl de suspension virale à chaque puits, diluée en milieu de croissance pour contenir environ 100 DICT50/50 µl, et mélanger les contenus sur un agitateur de plaques pendant 20 s. iii) Incuber les plaques dans une étuve à CO2 pendant 1 h à 37 °C. iv) 5 Ajouter dans tous les puits, 50 µl de milieu de culture contenant 2 × 10 cellules/ml. v) Laisser les cellules se multiplier à 37 °C en atmosphère à 5 % de CO2 jusqu’à la confluence, obtenue habituellement en 3 à 4 jours. vi) Éliminer le milieu de culture et rincer les plaques une fois en NaCl 0,15 M. vii) Éponger les plaques en les tapotant sur une serviette. viii) Les couches monocellulaires peuvent être fixées de plusieurs façons, soit 1202 • les plaques sont incubées pendant 45 min à 37 °C, puis pendant au moins 45 min à –20 °C. Les plaques sont retirées du congélateur, les puits sont remplis avec 100 µl de paraformaldéhyde à 4 % en PBS et ré-incubées pendant 5 à 10 min à température ambiante. Le paraformaldéhyde est éliminé et les plaques rincées en NaCl 0,15 M ; soit • les plaques sont incubées à 70 ou 80 °C pendant 1 à 2 h, ou Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) • les plaques sont fixées dans de l’acétone à 80 % et incubées à 70 ou 80 °C pendant 1 h, ou • les plaques sont fixées à l’acétone à 20 % en PBS pendant 10 min suivi d’un séchage complet à 25 ou 30 °C pendant 4 h. (Ceci peut être obtenu plus rapidement à l’aide d’un sèche-cheveux ; après 3 à 5 min le séchage complet est obtenu comme en atteste la couleur blanchâtre de la mono-couche cellulaire). ix) Ajouter à chaque puits, 50 µl d’un sérum de porc hyperimmun anti-PPC ou un anticorps monoclonal, dilué en NaCl 0,5 M contenant 1 % de Tween 80 + 0,1 % d’azide de sodium, pH 7,6. Incuber 15 min à 37 °C. La dilution de l’anti-sérum à utiliser doit être déterminée par titrage préalable : c’est à dire qu’un sérum donnant un titre NPLA de 1/30 000, doit être utilisé au 1/100. x) Laver les plaques 5 fois en NaCl 0,15 M contenant 1 % de Tween 80, pH 7,6. xi) Ajouter à chaque puits, 50 µl d’une IgG anti-porc (ou anti-souris) conjugée à la peroxydase (IgG-HRPO) convenablement diluée en NaCl 0,5 M avec 1 % de Tween 80, pH 7,6, puis incuber à 37 °C pendant 10 min. xii) Laver les plaques 5 fois en NaCl 0,15 M contenant 1 % de Tween 80, pH 7,6. xiii) Ajouter 50 µl de solution du substrat chromogène à chacun des puits et laisser se développer la coloration pendant 15 à 30 min à température ambiante. Cette solution est décrite dans la Section B.1.a « Protocole d’immuno-peroxydase pour la différentiation des pestivirus par les anticorps monoclonaux ». xiv) L’épreuve est lue à l’œil nu. Les couches de cellules infectées sont totalement ou partiellement colorées en rouge-brun. La couche cellulaire doit être examinée au microscope à faible grossissement pour déterminer la dilution finale. Le cytoplasme des cellules infectées est coloré en rouge foncé. xv) Les témoins suivants sont inclus dans l’épreuve : témoin cellules, témoin sérum positif et titrage rétrospectif du virus utilisé. Le titrage rétrospectif doit confirmer que le virus a été utilisé à une concentration située entre 30 et 300 DICT50/50 µl. NOTE : Les durées d’incubation ci-dessus ne sont qu’indicatives. Des durées d’incubation plus longues avec des dilutions optimisées pour ces durées peuvent être envisagées pour économiser les réactifs. b) Épreuve de neutralisation virale en fluorescence (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) Méthode avec des tubes de Leighton : i) Ensemencer une suspension de cellules PK-15 à une concentration de 2 × 105 cellules/ml dans des tubes de Leighton munis de lamelles. ii) Incuber les cultures à 37 °C pendant 1 à 2 jours jusqu’à obtenir 70 à 80 % de confluence. iii) Inactiver les sérums à 56 °C pendant 30 min. Dans le cadre d’échanges internationaux, il est préférable d’utiliser une dilution initiale de 1/5 (dilution finale de 1/10). iv) Incuber un volume égal de sérum dilué et de suspension virale contenant 200 DICT50 (Dose de virus infectant 50 % de la culture tissulaire) par 0,1 ml, à 37 °C, pendant 1 à 2 h. Ainsi une quantité constante de 100 DICT50 de virus PPC est utilisée dans chaque puits réaction. v) Enlever les lamelles des tubes de Leighton, laver rapidement dans du milieu sans sérum, couvrir les couches de cellules avec le mélange sérum/virus (de l’étape iv) et incuber à 37 °C pendant 1 h en atmosphère humide. vi) Placer la lamelle dans un tube de Leighton propre et incuber les cultures en milieu de maintien pendant 2 jours supplémentaires. vii) Enlever les lamelles des tubes de Leighton, laver les couches cellulaires 2 fois, pendant 5 min, dans du PBS, pH 7,2, fixer dans l ‘acétone pur pendant 10 min, et colorer avec la dilution appropriée de conjugué pendant 30 min, à 37 °C, avant lavage. viii) Monter les lamelles sur des lames pour examen microscopique dégraissées, à l’aide d’un tampon carbonate/bicarbonate pH > 8 glycériné, et examiner en fluorescence. Lorsque l’épreuve FAVN est effectuée en plaques de micro-titrage, le protocole du NPLA (voir ci-dessous) peut être appliqué jusqu’à l’étape viii). Les plaques sont alors colorées avec la dilution du conjugué pendant 30 min, à 37 °C, et examinées en fluorescence. Note : pour la recherche de la fluorescence, il est recommandé d’examiner les plaques à l’aide d’un objectif de longue focale. Manuel terrestre de l’OIE 2008 1203 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) Parfois, les sérums de porcs infectés par les virus BVD ou BD réagissent en FAVN ou NPLA à faible dilution comme s’ils étaient infectés par le virus PPC. L’importance de la réactivité croisée dépend de la souche de pestivirus des ruminants responsable et du délai entre l’infection et le prélèvement (37). L’habituel titre élevé en anticorps atteint après exposition au virus PPC, y compris aux souches de basse virulence, permet de recourir à des dilutions initiales comparativement plus hautes dans les épreuves NPLA pour la recherche des anticorps PPC, de façon à éviter la plupart, des réactions croisées, mais pas toutes (29, 30). En cas de doutes persistants, la réalisation des épreuves comparatives utilisant une souche de virus PPC, une souche de virus BVD et une souche de virus BD, représentatives de la région ou du pays, se révèle utile. Les épreuves de neutralisation comparatives évaluent les titres obtenus avec la même série de dilution de raison 2 du sérum suspect, chacune des dilutions étant testée en double contre 100 DICT50 de chacun des virus choisis. Les épreuves comparatives sont effectuées selon les protocoles décrits pour l’épreuve FAVN ou NPLA ; les lignées cellulaires utilisées doivent être sensibles au virus BVD et BD. Les titres de neutralisation sont exprimés sous la forme de la réciproque de la plus haute dilution du sérum qui prévient la réplication virale dans la moitié des doubles puits. Une différence de 3 fois ou plus entre les valeurs de 2 titrages doit être considérée comme significative d’une infection par l’espèce virale donnant le titre le plus élevé. Il peut se révéler nécessaire d’utiliser des souches différentes du même génotype et/ou de tester plusieurs porc d’un troupeau infecté afin d’obtenir un résultat définitif. c) Méthode immuno-enzymatique (épreuve prescrite pour les échanges internationaux) Les techniques indirectes, de blocage ou de compétition peuvent être retenues et effectuées sur des supports appropriés ; plusieurs ont été décrites (par ex. 5, 13, 17, 21, 34). Les épreuves choisies doivent minimiser les réactions croisées avec le virus BVD et les autres pestivirus. Cependant l’épreuve doit assurer l’identification de toutes les infections PPC et à toutes les étapes de la réponse immunitaire à l’infection. Antigène : l’antigène doit dériver ou correspondre aux protéines virales de l’une des souches recommandées du virus PPC. Les cellules utilisées pour préparer l’antigène doivent être exemptes de toutes infections par l’un des autres pestivirus. Antisérums : les anti-sérums polyclonaux des épreuves de compétition ou de blocage doivent être produits sur porc ou lapin par infection à l’aide de l’une des souches de virus PPC recommandées ou avec la souche C lapinisée. Les anticorps monoclonaux doivent être dirigés contre ou correspondre à une protéine immunodominante du virus PPC. Les épreuves indirectes doivent utilisées une immunoglobuline anti-porcine qui détecte à la fois les IgG et les IgM. La sensibilité de l’ELISA doit être suffisamment élevée pour reconnaître positifs tous les sérums d’animaux convalescents, c’est-à-dire au moins 21 jours post-inoculation, qui réagissent à l’épreuve de séroneutralisation. L’ELISA peut seulement être utilisé sur des échantillons de sérum ou de plasma provenant de porcs individuels. Si la méthode utilisée n’est pas spécifique de la PPC, les échantillons positifs devront être examinés à l’aide d’épreuves discriminant le virus PPC des autres pestivirus. L’ELISA « complex-trapping blocking » (5) est basé sur une méthode en 1 étape valable pour l’utilisation de robots automatisant l’ELISA. Les sérums sont testés non dilués. L’épreuve est rapide, facile à réaliser et détecte les anticorps contre les souches de basse virulence du virus PPC de façon précoce après l’infection. Comme les AcMs sont spécifiques de la PPC, l’ELISA « complex-trapping blocking » ne détectera que rarement les anticorps contre le virus BVD, bien que le problème puisse persister avec les anticorps contre le virus BD. Les sérums positifs font l’objet d’une confirmation en NPLA. Un nouvel ELISA a été décrit récemment qui utilise une protéine dérivée de peptides viraux (19). Le test présente une plus grande sensibilité et permet une détection plus précoce des anticorps que les ELISA conventionnels, mais sa réactivité vis-à-vis des anticorps induits par les diverses souches du virus de la PPC n’est pas encore connue. Des informations complémentaires sur les kits de diagnostic commercialisés peuvent être obtenues auprès des Laboratoires de référence de l’OIE. C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE Il n’existe pas de vaccin à virus complet inactivé efficace contre la PPC. 1204 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) C1. Vaccins à virus vivant modifié Les vaccins VVM sont produits à partir de souches de virus PPC atténuées par passages soit sur cultures de cellules, soit sur une espèce animale réceptive n’appartenant pas à la famille des suidés. La production est conduite en culture de cellules ou chez des non-suidés selon le système lot-semence. Celui-ci doit être validé en ce qui concerne l’identité, la stérilité, la pureté, l’innocuité, la non transmissibilité, la stabilité et l’immunogénicité. Les lignes directrices pour la production des vaccins vétérinaires sont données au Chapitre 1.1.8, « Principes de fabrication des vaccins à usage vétérinaire ». Ces lignes directrices du Chapitre 1.1.8 sont d’ordre général et peuvent être complétées par des dispositions nationales ou régionales. Les locaux dédiés à la production vaccinale doivent répondre aux normes de biosécurité. Si le virus PPC est utilisé pour la production ou pour les épreuves de virulence, cette partie des locaux où ces activités sont menées doivent répondre aux normes de confinement des agents pathogènes du groupe 4 comme cela est souligné dans le Chapitre 1.1.2. Pour produire un lot semence et un vaccin fini de haute qualité, les conditions optimales de rendement en virus doivent être déterminées. Pour la production vaccinale en cultures de cellules, des courbes expérimentales de croissance doivent être effectuées afin d’étudier les effets de la composition du milieu, de la régulation du pH et de la concentration de l’atmosphère en CO2, initiant la concentration des cellules ensemencées, le rapport entre la surface de la couche cellulaire et le volume de milieu, la phase de croissance cellulaire au moment de l’infection virale, l’état stationnaire ou roulant des flacons durant la réplication virale, etc. Pour les vaccins produits chez l’animal, l’âge, la souche, le poids, l’importance de l’inoculum (nombre de DI50 animal [Dose infectant 50 % des animaux considérés]), la pathogénie de l’infection et les signes cliniques, sont les facteurs qui doivent être étudiés pour déterminer le pic de la production virale et les tissus à récolter. Indépendamment de la méthode de production, le substrat doit être récolté de façon aseptique et doit être soumis à un cycle de congélation-décongélation destiné à libérer les virus associés aux cellules. Les débris cellulaires et les fragments de tissus sont éliminés par filtration ou légère centrifugation. Un stabilisant est ajouté, tel que du lactose à une concentration finale de 5 %. Le vaccin est homogénéisé avant lyophilisation pour assurer l’uniformité du lot. Le virus vaccin du produit fini ne doit pas différer de plus de 5 passages du matériel utilisé pour valider le lot-semence. Le vaccin commercial doit être produit en lots lyophilisés comme un produit homogène. 1. Gestion des semences virales a) Caractéristiques de la semence virale Pour valider un lot-semence pour un vaccin PPC à VVM, des échantillons de lot-semence doivent être soumis à des essais pilotes. Mis à part les tests d’identité, de stérilité, de pureté et de stabilité de l’atténuation, les essais pilotes peuvent aussi être réalisés avec des échantillons représentatifs du produit fini commercial. Ces échantillons doivent correspondre au même lot-semence ayant subi les tests précisés ci-dessus. En l’absence d’autres spécifications, tous les porcs utilisés en essais pilotes ont un âge compris entre 6 et 8 semaines, sont en bonne santé, exempts d’anticorps contre les virus PPC et BVD, de la même race et du même élevage, regroupés au hasard, si nécessaire, et placés dans les mêmes conditions. Les truies gestantes doivent être de caractéristiques identiques. Le virus semence doit être stérile et doit induire des anticorps spécifiques neutralisant une souche virulente de virus PPC, chez les porcs. b) Méthode de culture La production est effectuée en cultures de cellules ou chez un hôte réceptif n’appartenant pas à la famille des suidés. c) Validation de la semence candidate comme semence vaccinale i) Pureté Le vaccin doit être virologiquement pur. Trois porcs séronégatifs sont inoculés, chacun par voie intramusculaire, avec une quantité de virus lot-semence équivalent à 10 fois la quantité contenue dans une dose de vaccin. Ceci est répété Manuel terrestre de l’OIE 2008 1205 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) 3 semaines plus tard à la même dose et par la même voie. Des échantillons de sérum sont prélevés 2 semaines après la dernière inoculation et testés par la méthode la plus sensible pour l’absence d’anticorps vis-à-vis des virus de la peste porcine africaine, de la maladie d’Aujeszky, de la BVD, de la fièvre aphteuse (tous les types), de la gastro-entérite transmissible, de la maladie vésiculeuse des suidés, du syndrome respiratoire et reproductif porcin, de la grippe porcine (types H1N1 et H3N2), des adénovirus porcins, des teschovirus porcins (types 1 et 2), des parvovirus et circovirus porcins (type 1 et 2). ii) Innocuité Les vaccins doivent être testés quant à leurs effets pathogènes sur des porcs sains et aussi sur des porcs qui pourraient être immunodéprimés du fait de la présence d’infections concomitantes ou de l’administration de médicaments ; les tests doivent aussi vérifier que les vaccins ne traversent pas la barrière placentaire chez les truies en gestation. Pour les tests d’innocuité chez les porcs normaux, 10 porcs séro-négatifs sont chacun inoculés par voie intramusculaire avec 10 doses de vaccin. Dix autres porcs servent de témoins. Tous les porcs sont observés durant les 3 semaines suivantes. Les températures corporelles sont enregistrées et des échantillons de sang sont prélevés sur anti-coagulant, quotidiennement durant la première semaine. Les poids sont relevés à l’inoculation et 2 semaines plus tard. Aucun animal ne doit mourir ni montrer des signes de maladie dus au virus (lot-semence) vaccinal. La moyenne journalière des températures corporelles du groupe ne doit pas atteindre 40,5 °C ou plus durant toute la période de l’essai. Le gain de poids moyen ne doit pas tomber significativement (p < 0,05) en dessous de celui des témoins. La leucopénie (nombre de globules blancs < 7 × 106 cellules/ml) peut être écartée si elle intéresse un seul sujet, pendant 1 jour. Pour vérifier le degré d’atténuation, même chez des porcs immunodéprimés, 10 porcs sont soumis à une immuno-suppression par injections quotidiennes, à chacun, de 2 mg/kg de poids vif de prednisolone, pendant 5 jours consécutifs. Le troisième jour, chaque animal est inoculé avec l’équivalent d’une dose de vaccin et gardé en observation les 3 semaines suivantes. Aucun animal ne doit mourir ou devenir malade à cause du virus vaccinal. Pour vérifier l’innocuité chez les femelles en gestation, 10 truies à 25–35 jours de gestation, sont inoculées par voie intramusculaire avec l’équivalent d’une dose de vaccin. Un autre groupe de 10 sujets de même race et origine et au même stade de gestation, sert de témoin. La vaccination ne doit pas interférer avec une gestation conduite à son terme et le nombre de porcelets nés du groupe test ne doit pas être significativement plus faible (p < 0,05) que celui issu des truies témoins. Pour les essais terrain, un minimum de 200 porcs est utilisé, engendrés et élevés par au moins 20 mères, et séro-négatifs vis-à-vis de la PPC et de la BVD. Les portées sont également distribuées sur au moins 2 fermes. La moitié des porcelets de chaque portée est inoculée par voie intramusculaire, à l’âge de 7 à 14 jours, avec l’équivalent d’une dose de vaccin. Les congénères non inoculés servent de témoins. Tous les porcelets sont pesés au moment de l’inoculation et 2 semaines plus tard, et sont mis en observation durant 3 semaines. Un taux de mortalité excédant 5 % dû à des causes autres que la vaccination, invalide l’essai. Aucun animal ne doit mourir ou montrer des signes de maladie en rapport avec le virus vaccin. Le gain moyen de poids des porcs inoculés dans les portées, ne doit pas être inférieur à 20 % de celui des témoins, durant les 2 semaines post-inoculation. iii) Non transmissibilité Pour confirmer la non transmissibilité, 24 porcs séro-négatifs sont divisés en 4 groupes de taille égale. Cinq porcs de chaque groupe sont inoculés par voie intramusculaire avec l’équivalent d’une dose de vaccin. Les porcs restants représentent les témoins contact. Tous les porcs sont éprouvés 6 semaines plus tard avec au moins 105 DIP50 (Dose infectant 50 % des porcs) d’une souche virulente de virus PPC. Tous les porcs contact doivent être sérologiquement négatifs au moment de l’infection et doivent succomber dans les 3 semaines. Tous les porcs vaccinés doivent rester bien portants et survivre. iv) Stabilité de l’atténuation Pour confirmer la stabilité de l’atténuation du virus, 2 porcs sont inoculés par voie intramusculaire avec une quantité de virus lot-semence équivalent à 100 doses de vaccin, puis sacrifiés 6 à 7 jours plus tard. Les amygdales de chaque porc sont rassemblées et mises en suspension à 10 % en PBS, pH 7,2. Cette dernière est utilisée pour inoculer 2 autres porcs par voie intramusculaire avec 2 ml, et ceux-ci sont sacrifiés à leur tour 6 à 7 jours plus tard. Ce protocole est répété 5 fois. Durant ces passages, le tissu amygdalien peut être stocké à 4 °C, si le stockage est de moins de 24 h, ou à -70 °C pour des périodes plus longues. Simultanément, la présence de l’antigène PPC est vérifiée à chaque passage par l’IF direct sur des coupes au cryostat des amygdales ou par isolement du virus sur un substrat approprié. Si la présence du virus PPC ou de son antigène ne peut être démontrée après certains passages, une seconde série de passage est réalisée pour révéler l’infection, en commençant avec les derniers 2 porcs des séries précédentes. 1206 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) Cinq porcs sont inoculés par voie intramusculaire avec le sixième passage du virus lot-semence, équivalent à une dose de vaccin, ou, si ce passage n’a pas été atteint, le plus haut passage des 2 séries où le virus ou l’antigène viral a été détecté. Cinq porcs supplémentaires sont de façon similaire inoculés avec une dose de virus lot-semence, équivalent à une dose de vaccin. Tous les porcs sont pesés au moment de l’inoculation et de nouveau 2 semaines plus tard. Le sang est prélevé quotidiennement sur anti-coagulant durant la première semaine, et tous les porcs sont mis en observation pendant 3 semaines. Aucun animal ne doit mourir ou devenir malades en raison du virus vaccin. Le gain moyen de poids des deux groupes durant les deux premières semaines, ne doit pas 6 différer significativement (p < 0,05). Une leucopénie (nombre de globules blancs < 7 × 10 /ml) est tolérée, au plus chez un porc de l’un ou l’autre groupe, pendant 1 jour. v) Immunogénicité Pour démontrer l’efficacité immunogène, 10 porcs reçoivent chacun une quantité de virus équivalent à une dose de vaccin, et 2 autres porcs sont conservés séparément comme témoins non inoculés. Tous les porcs sont éprouvés 7 jours plus tard avec 105 DIP50 d’une souche virulente de virus PPC. Seuls les témoins doivent mourir. Pour tester la durée de l’immunité, 10 porcs reçoivent chacun une dose, et 2 autres sont maintenus séparément comme témoins. Six mois plus tard, les sérums des porcs vaccinés font l’objet d’une recherche d’anticorps anti-PPC ; au moins 8 porcs doivent être positifs. Tous les porcs sont alors éprouvés avec au moins105 DIP50 d’une souche virulente PPC et observés durant 3 semaines. Seuls les témoins doivent mourir. Pour tester la protection contre le développement du syndrome truie-porteuse, 20 truies gestantes à la même phase de gestation sont réparties au hasard en 2 groupes. Les truies d’un groupe sont vaccinées 1 ou 2 fois avec une quantité de virus équivalente à une dose de vaccin, et sont éprouvées par voie intranasale, 4 semaines après la dernière vaccination, avec une souche sauvage de basse virulence, en même temps que les truies non vaccinées témoins. Toutes les truies sont sacrifiées 4 semaines après l’épreuve et les fœtus sont examinés pour la présence du virus PPC ou de l’antigène viral. La vaccination doit réduire de façon significative la transmission transplacentaire du virus. Sous les conditions de conservation spécifiées par le fabricant pour le produit fini, un volume de virus équivalent à une dose de vaccin doit maintenir son immunogénicité au moins jusqu’au terme de la durée de conservation annoncée. 2. Méthode de fabrication Chaque lot de vaccin PPC à VVM doit provenir du même lot-semence utilisé pour les essais pilotes. Aussi chaque lot doit-il être préparé selon le protocole de production et sous les conditions établies pour l’enregistrement du produit fini. Les propriétés de chaque lot et celles du lot-semence doivent être vérifiées comme étant uniformes. 3. Contrôles en cours de fabrication Le protocole de production dépendra de la souche vaccinale, des modalités de production (animaux ou cultures de cellules), et des infrastructures disponibles. Les normes pour les vaccins en cultures de cellules peuvent varier selon le système de production adopté, à savoir, des cultures de cellules de première explantation, des lignées cellulaires, des cultures en couches monocellulaires ou en suspension. 4. Contrôle des lots Tous les porcs utilisés dans les contrôles de lots doivent être âgés de 6 à 8 semaines et exempts d’anticorps vis-à-vis des virus PPC et BVD. Ils doivent être de même origine, race, élevage, et répartis au hasard en autant de groupes que nécessaire. a) Identité Le vaccin doit induire des anticorps neutralisants vis à vis d’une souche virulente de virus PPC. b) Stérilité Les tests de stérilité et d’absence de contamination du matériel biologique peuvent être trouvés dans le Chapitre 1.1.9., « Contrôle de la stérilité ou de l’absence de contamination des matériels biologiques ». Manuel terrestre de l’OIE 2008 1207 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) c) Innocuité Trois porcs reçoivent chacun, par voie intramusculaire, 10 doses de vaccin reconstitué, en une seule injection. Les porcs sont observés pendant les 3 semaines suivantes et les températures corporelles sont relevées quotidiennement pendant la première semaine. Aucun porc ne doit succomber ou présenter des signes de maladie attribuable au vaccin ; la moyenne quotidienne des températures ne doit jamais dépasser 40,5 °C, et les porcs doivent croître normalement. d) Pureté Le lot doit être virologiquement pur. Pour apprécier cela, 3 porcs reçoivent chacun par voie intramusculaire 10 doses de vaccin. Des échantillons de sérums sont prélevés au moment de l’inoculation et, de nouveau, 5 semaines plus tard. Ces sérums sont testés pour la recherche d’anticorps anti-BVD (neutralisation pendant 1 h à 37 °C) et anti-parvovirus porcins (inhibition de l’hémagglutination utilisant 4 unités hémagglutinantes). L’ensemble des 3 porcs doit rester en bonne santé. Les tests de pureté virologique ne sont pas nécessaires lorsque les vaccins sont produits sur lapins. e) Activité L’activité est exprimée en nombre de doses protégeant à 50 % (DP50) contenues dans une dose de vaccin. Une dose de vaccin correspond à au moins 100 DP50. Deux groupes de 5 porcelets, âgés de 6 à 8 semaines, reçoivent par voie intramusculaire, respectivement, une dilution en solution saline tamponnée pH 7,2, de 1/40 et de 1/160 du vaccin reconstitué. Les porcs vaccinés ainsi que 2 témoins, sont éprouvés par voie intramusculaire avec 105 DIP50 d’une souche virulente de virus PPC, 2 semaines plus tard. Les porcs sont observés durant les 2 semaines suivantes, période durant laquelle les 2 témoins doivent mourir. À partir des porcs qui survivent sans montrer de signes cliniques de PPC, le nombre de DP50 contenues dans le vaccin est calculé par les méthodes statistiques. Ce test d’activité peut être remplacé par un essai d’infectivité, à condition que le fabricant puisse démontrer qu’il existe une relation distincte et reproductible entre le contenu en virus du vaccin et la protection qu’il confèrera aux porcs vis-à-vis de l’épreuve virulente. f) Stabilité La période de validité d’un lot de vaccin PPC lyophilisé ne doit pas être inférieure à 1 an. C2. Vaccins avec marqueur sérologique En dépit de l’existence de vaccins VVM contre la PPC, inoffensifs et efficaces, leur utilisation a été déconseillée dans l’UE et dans quelques autres pays indemnes de PPC ou pays voisins, en raison du fait que les anticorps induits par de tels vaccins ne peuvent être distingués des anticorps induits par le virus sauvage. Un « vaccin avec marqueur sérologique » qui permet la distinction entre les animaux infectés et les animaux vaccinés (DIVA) ne présente pas cet inconvénient : il peut entraîner une réponse immunitaire protectrice qui peut être distinguée de la réponse immunitaire induite par une souche sauvage. Un pré-requis supplémentaire pour toute stratégie DIVA est la disponibilité d’une épreuve sérologique d’accompagnement qui soit hautement discriminante afin de mettre en évidence l’absence d’infection et de déceler les infections résiduelles. Les exigences minimales pour les vaccins marqués et les épreuves discriminantes d’accompagnement ont été formulées comme suit (6) : a) Vaccin Le vaccin doit fournir une protection contre toutes les contaminations naturelles (par exemple : il doit prévenir l’apparition des signes cliniques et empêcher la ré-excrétion du virus). L’efficacité de la vaccination doit être expérimentalement démontrée par des essais dans lesquels la transmission de virus sauvage au sein de groupes de porcs vaccinés est étudiée. La protection due à la vaccination doit être obtenue le plus rapidement possible et de préférence en moins de 2 semaines. Une protection rapide et fiable doit être, si possible, obtenue après une seule administration. Bien plus, il doit être vérifié que la contamination de truies gestantes vaccinées ne conduit pas à une infection transplacentaire et à la naissance de portées congénitalement infectées par le virus PPC. La durée de l’immunité doit être d’au moins 6 mois. De nombreux vaccins marqués sont en développement et deux ont été enregistrés dans l’UE. Ceux-ci sont des vaccins sous-unités qui utilisent la glycoprotéine E2 du virus PPC comme immunogène et ont subi des 1208 Manuel terrestre de l’OIE 2008 Chapitre 2.8.3. — Peste porcine classique (hog cholera) évaluations indépendantes (9, 32). La sous-unité E2 est produite sur cellules d’insecte infectées par un baculovirus génétiquement modifié, contenant le gène E2 du virus PPC. Ainsi les vaccins ne renferment aucun virus PPC et le baculovirus vecteur est chimiquement inactivé. Les préparations finies sont adjuvées avec des huiles minérales pour former une émulsion double (eau/huile/eau) ou simple (eau dans l’huile). Plusieurs études sur la capacité de ces vaccins à prévenir la transmission horizontale ou verticale ont donné des résultats contradictoires (3). b) Épreuve discriminante d’accompagnement L’épreuve sérologique d’accompagnement doit être très sensible car la vaccination va réduire la prévalence de la maladie. Idéalement, elle doit permettre la discrimination dans le délai nécessaire à l’apparition des anticorps dirigés contre la protéine immunisante et doit être utilisée surtout comme une épreuve au niveau des élevages. Si une forte sensibilité réduit la spécificité de l’épreuve, déjà compromise par la présence d’anticorps vis-à-vis d’autres pestivirus, de bons et rapides tests de confirmation doivent être disponibles pour différencier les résultats positifs des fausses réactions. Les épreuves d’accompagnement DIVA pour les vaccins sous-unités E2 sont des épreuves ELISA dans lesquelles la détection des anticorps dépend de la protéine Erns (12, 16). De telles épreuves ont été récemment adoptées par la Commission européenne (2) dans le but de déterminer si des élevages, vaccinés avec le vaccin sous-unité E2, pouvaient avoir été exposés à un virus sauvage. Une évaluation de leur performance (12) a révélé qu’aucun ELISA discriminant n’a permis de détecté les porcs sevrés vaccinés avec un vaccin avec marqueur et éprouvés avec un virus de la PPC ; la recommandation est donc de n’utiliser cette stratégie que sur la base des élevages. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 1. ANON (2002). 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