THÈSE En vue de l'obtention du DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Immunologie Présentée et soutenue par Thibault SANTOLARIA Le 26 janvier 2009 Titre : INDUCTION DE TOLERANCE AUX ALLOGREFFES D'ORGANES SOLIDES PAR LES LYMPHOCYTES T REGULATEURS CD4+ CD25+ FOXP3+ JURY Président Pr Roland LIBLAU Dr Maria Cristina CUTURI Rapporteur Pr Jean DAVOUST Rapporteur Pr Joost van MEERWIJK Directeur de Thèse Ecole doctorale : Biologie - Santé - Biotechnologies Unité de recherche : U563 Inserm Directeur(s) de Thèse : Joost van Meerwijk 1 REMERCIEMENTS Aujourd’hui se tourne une page importante de ma vie, quatre années passées à l’Inserm U563 et pourtant, quand je regarde en arrière, j’ai l’impression d’être seulement arrivé hier. Cette page est émminamment importante puisque c’est elle qui m’a vu, pour rester dans l’immunologique, me différencier de cellule immature (étudiante) en cellule effectrice, apte à la dure loi de la sélection du travail… Même si une telle transformation demande une intégration personnelle du message (« La chimère hématopoïétique est à la réponse à toutes les questions » et autre « Les Tregs vont sauver le monde »), elle ne saurait s’opérer sans une éducation et un signal de survie de la part d’autres cellules spécialisées (la grande famille des Chefs, et la famille tout court). Dans mon cas, ma cellule présentatrice d’antigènes est certainement mon directeur de thèse : Joost van Meerwijk. Merci à vous de m’avoir accepté au sein du DEA d’immunologie, puisque c’est ainsi que cela s’appelait encore, et de m’avoir associé à l’un des plus passionnants sujets qui soit : la tolérance aux autres. Merci également de m’avoir tout au long de ces quatre années enseigné l’art délicat de la chimère hématopoïétique, la passion des Tregs et le goût de former la génération suivante. Je garderai en mémoire, de nos « interactions », les longues semaines, pleines de doutes et de craintes, à patienter pour savoir si oui ou non, nos greffes de coeur allaient survivre jusqu’à terme ; les mois à attendre que nos coupes histologiques soient enfin prêtes ; les jours précédents l’envoi du papier à faire et refaire, encore et encore, des photos avec Talal ; et votre détermination sans faille pour défendre le papier devant l’Editorial Board de Nature Medicine. Peu y aurait cru, vous oui ! Encore moins aurait réussit un tel pari, vous si ! Le jeu en valait la chandelle… Merci encore pour ses intences émotions. Si dans cette métaphore immunologique, Joost devait être la CPA, alors Paola serait certainement la mTEC. Parfait complément dans cette étape de sélection, vous avez su m’apporter la rigueur nécessaire à la réalisation d’un projet scientifique. Merci pour votre disponibilité, les nombreux rapports de congrès que vous nous avez fait (et les discussions qui s’ensuivaient) et votre enthousiasme au quotidien. Mon seul regret sera que vous ne m’ayez que partiellement communiqué votre passion pour la sélection thymique. Il faut dire que je partais avec un a priori assez fort vis-àvis de cette partie de l’immunologie. Merci à Geneviève pour sa gentillesse et son aide précieuse dans le phénotypage des nombreuses souris transgéniques utilisées au laboratoire. Bien sûr, le thymocyte n’est pas seul dans l’immensité du thymus. De très nombreux autres lymphocytes en devenir l’accompagnent dans cette longue transformation. Sans eux, le pauvre thymocyte ne serait plus le même. Parmi eux, il y a d’abord mes collègues de l’équipe Tolérance et Auto-immunité, à commencer par 2 REMERCIEMENTS les anciens, qui par leur sagesse ont contribué à ma formation. Un grand merci donc à toi, Olive, pour m’avoir appris les bases techniques du sujet et donné tous les conseils dont j’avais besoin : de l’étude comparative entre les pansements Carrefour et Hansaplast pour les greffes de peau, à la technique secrète de l’ACK ou les chemins détournés pour traverser Toulouse en pleine heure de pointe pour rentrer chez mes parents. Merci enfin, pour ta patience, devant mon style parfois si particulièrement particulier (« Lors du dysfonctionnement d’un organe, celui-ci n’assure plus sa fonction »). Ingrid, pendant les trois ans que je t’ai cottoyée, tu as été un tel soleil, de par ta fougue, ta gentillesse, et ton caractère si trempé, qu’il est difficile de t’oublier. Tantôt souriante, tantôt attendrissante quand tu parlais de Tristan et parfois si effrayante quand tu t’enflammais contre quelqu’un, tes rires resonneront encore longtemps contre les murs du labo. Mille mercis pour ce que tu es ! Surtout ne change pas… Julie, tu es la seule à m’avoir accompagné tout au long de ces quatre ans. D’abord intimidé par tes « Allo » si engageant, j’ai rapidement découvert derrière le masque, une fille extrêmement attachante et toujours prête à aider. Nos discussions, tant sur le Stade Toulousain que sur les derniers exploits d’un Ministre appelé à devenir Président à la place du Président, me manqueront. Merci également pour tes idées débordantes pour fêter le départ d’un des notres… idées qui m’ont tour à tour, mis dans la peau de Mitch, Travolta ou Charlie et ses drôles de dames. Enfin, comment oublier la petite Julie Ribot, mascotte de l’équipe et ambassadrice des pauses cafés-clopes. Même dans les moments difficiles, tu m’as toujours soutenu, écouté et je t’en remercie. Place maintenant aux jeunes, à la relève du labo. Honneur à la première arrivée : Céline ! C’est maintenant toi la doyenne du labo, le pillier sur lequel compteront les futurs étudiants. Merci pour ton écoute, tes discussions souvent enflammées et ton entrain quotidien. A Lise, je t’ai refilé le bébé et espère qu’il t’e donnera autant de bonheur et de réussite qu’il m’en a apporté. Bon courage pour la suite et profite bien de ces quelques années de thèse : elles ont une saveur toute particulière. Clémence, nos chemins ne se sont malheureusement pas croisés très longtemps mais cela m’a suffit pour comprendre qu’un peu à l’image d’Ingrid, tu allais rapidement devenir la coqueluche de l’U563, grâce à ta sympathie et à ta bonne humeur quotidienne. Mais, j’ai également découvert que, comme elle, tu n’étais pas genre à te faire marcher sur les pieds. Entre toi, Lise et Céline, Joost a donc du souci à se faire. Peut-être en fait, devrais-je lui souhaiter à lui « Bon Courage ». Enfin, il est temps de boucler la boucle, celle-là même qui avait commencé quand Olive m’avait cédé sa place comme seul coq de la basse-cour et qui se termine aujourd’hui puisque je laisse Svet au milieu de ces filles. Cela peut faire peur de prime abord, mais tu verras : on y prend goût très vite. En tout cas, courage pour la suite de ton M2R ! 3 REMERCIEMENTS Je remercie également tous les membres de l’unité, les anciens comme les nouveaux, pour avoir partagé avec moi tant de bons moments pendant ces 4 longues années : Florie, Camille, Sabina, Loïc, Nico, Yovan, Delphine, Lucile, Audrey et Patrick de l’animalerie, Fatima, Dominique, notre super secrétaire, et Aline, notre deuxième mère. Une mention spéciale à Nicolas, mon talentueux partenaire de dance, à Sophie, la gentillesse incarnée, à Aurelie, la « people » de l’U563, à Julie Tabiasco, la pile électrique toujours prête à aider, et Michaël, l’animateur de nos repas de midi, qui, chacun dans son style, m’a beaucoup apporté. Pour terminer, je remercie mes parents sans qui, je ne serais pas celui que je suis aujourd’hui et qui m’ont toujours soutenu ; mes amis qui depuis déjà 13 ans pour certains, me supportent et me permettent d’oublier les petits tracas de la vie. Enfin, si je devais une dernière fois utilisée la comparaison avec l’immunologie, je dirais qu’une cellule effectrice ne saurait exister sans sa contrepartie régulatrice, chacune étant le versant opposé de l’autre, unies en un tout... N’est-ce pas la définition de l’âme sœur ? Merci à toi Karine d’être ma cellule régulatrice, celle qui fait mon bonheur et mes peines et qui, comme moi, a subit la parfois difficile sélection thymique. 4 SOMMAIRE Résumé……………………………………………………………………………………… 8 Liste des illustrations…………………………………………………………………… 10 Liste des abréviations…………………………………………………………………... 11 Introduction………………………………………………………………………………...12 1ère Partie : Transplantation…………………………………………………… 13 A. Historique B. Limites non immunologiques 1) Le manque de donneur 2) La mort cérébrale 3) Ischémie et reperfusion C. Limites immunologiques 1) Les alloantigènes • Les antigènes majeurs d’histocompatibilité • Les antigènes mineurs d’histocompatibilité • Le système ABO 2) Les voies d’alloreconnaissance • Voie d’alloreconnaissance directe • Voie d’alloreconnaissance indirecte • Voie d’alloreconnaissance semi-directe 3) Les mécanismes de rejet • Le rejet hyperaigu • Le rejet aigu • Le rejet chronique D. Protocole d’inhibition du rejet 1) Drogues immunosuppressives • Inhibition de la prolifération • Glucocorticoïdes • Déplétion/modulation des lymphocytes • Inhibition de la synthèse des cytokines • Blocage de la migration des cellules activées 2) Nouvelles stratégies thérapeutiques • Induction de chimérisme hématopoïétique • Cellules dendritiques tolérogènes • Blocage des co-récepteurs 5 SOMMAIRE • Blocage des molécules de co-stimulation 2ème Partie : Tolérance……………………………………………………………53 A. Tolérance centrale 1) La sélection positive 2) La sélection négative B. Tolérance périphérique 1) La tolérance passive • L’ignorance • L’anergie • La délétion • La déviation phénotypique 2) La tolérance active • Les cellules dendritiques tolérogènes • Les lymphocytes NKT • Les lymphocytes T CD8 régulateurs • Les lymphocytes Tr1 3ème Partie : Les lymphocytes T régulateurs……………………………….67 A. Mise en évidence et caractérisation des Tregs 1) Mise en évidence des Tregs 2) Les premiers marqueurs 3) La découverte de Foxp3 4) Les nouveaux marqueurs B. Origine, développement et homeostasie des Tregs 1) Origine thymique 2) Développement des Tregs 3) Homéostasie des Tregs C. Mécanismes de suppression 1) Déprivation cytokines 2) CTLA-4 3) Cytotoxicité directe 4) Cytokines immunsuppressives D. Fonctions physiologiques et pathologiques 1) Prévention de l’auto-immunité 6 SOMMAIRE 2) Modulation des réponses anti-infectieuses 3) Inhibition de la réponse anti-tumorale 4) Tolérance foeto-maternelle E. Potentiel clinique des Tregs 1) Pathologies auto-immunes et immuno-inflammatoires 2) Maladie du greffon contre l’hôte 3) Aide à la thérapie génique Résultats……………………………………………………………………………………91 1) Article 2) Resultats préliminaires Discussions et perspectives…………………………………………………………..106 Annexes…………………………………………………………………………………...122 Références bibliographiques…………………………………………………………………………126 7 RESUME Thibault Santolaria INDUCTION DE TOLERANCE AUX ALLOGREFFES D’ORGANES SOLIDES PAR LES LYMPHOCYTES T REGULATEURS CD4+CD25+FOXP3+ Directeur de Thèse : Joost van Meerwijk Thèse soutenue à Toulouse, le 26 janvier 2009 La principale limite à la transplantation d’organe réside dans l’initiation d’une forte réponse immune dirigée contre le greffon. Si l’utilisation de drogues immunosuppressives a largement permis de contrôler l’apparition du rejet aigu, de nombreux patients souffrent d’un rejet chronique qui conduit inévitablement à la destruction de l’organe transplanté. L’induction d’une tolérance immunologique vis-àvis des antigènes du greffon pourrait permettre de s’affranchir du rejet ainsi que de la nécessité d’un traitement à vie avec des drogues immunosuppressives. Une tolérance similaire existe déjà à l’état physiologique vis-à-vis des antigènes du soi. Elle est médiée en périphérie par une sous population lymphocytaire douée de propriétés immunosuppressives : les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+. Lors de ce travail de thèse, j’ai pu montrer que, chez des souris irradiées à des doses cliniquement applicables, l’injection de cellules régulatrices CD4+CD25+Foxp3+ stimulées in vitro avec des alloantigens, induit une tolérance durable et spécifique vis-à-vis d’une greffe de moelle osseuse et, par la suite, de cœur ou de peau. Les Tregs spécifiques pour les antigènes présentés par la voie directe d’alloreconnaissance inhibent uniquement le développement du rejet aigu, en dépit de l’état de chimérisme induit. En revanche, des Tregs spécifiques pour les antigènes présentés par les voies directe et indirecte de reconnaissance préviennent l’apparition des phases de rejet aigu et chronique. Nos résultats démontrent ainsi le fort potentiel des Tregs, activés de manière appropriée, pour de futures approches de thérapie cellulaire, dans le but d’induire une tolérance durable aux greffes allogéniques. Mots clés : lymphocytes T régulateurs, transplantation, mécanismes d’action Discipline : Immunologie Equipe Tolerance et Autoimmunité INSERM U563, Hôpital Purpan 31024 Toulouse cedex 3 8 ABSTRACT Thibault Santolaria INDUCTION OF TOLERANCE TO SOLID ALLOGRAFTS BY REGULATORY T CELLS CD4+CD25+FOXP3+ Thesis supervisor : Joost van Meerwijk Toulouse, Purpan Hospital, January 26th 2009 A major challenge in transplantation medicine is controlling the very strong immune responses to foreign antigens that are responsible for graft rejection. Although immunosuppressive drugs efficiently inhibit acute graft rejection, a substantial proportion of patients suffer chronic rejection that ultimately leads to functional loss of the graft. Induction of immunological tolerance to transplants would avoid rejection and the need for lifelong treatment with immunosuppressive drugs. Tolerance to self-antigens is ensured naturally by several mechanisms ; one major mechanism depends on the activity of regulatory T lymphocytes. We showed that in mice treated with clinically acceptable levels of irradiation, regulatory CD4+CD25+Foxp3+ T cells stimulated in vitro with alloantigens induced long-term tolerance to bone marrow and subsequent skin and cardiac allografts. Regulatory T cells specific for directly presented donor antigens prevented only acute rejection, despite hematopoietic chimerism. By contrast, regulatory T cells specific for both directly and indirectly presented alloantigens prevented both acute and chronic rejection. Our findings demonstrate the potential of appropriately stimulated regulatory T cells for future cell-based therapeutic approaches to induce lifelong mmunological tolerance to allogeneic transplants. Keywords : regulatory T cells, transplantation, mechanisms Discipline : Immunology Tolerance and Autoimmunity team INSERM U563, Hôpital Purpan 31024 Toulouse cedex 3 9 LISTE DES ILLUSTRATIONS Figure 1 : Deux modèles permettent d’expliquer la forte fréquence de cellules alloréactives Figure 2 : Les trois voies d’alloreconnaissance dans la transplantation Figure 3 : La découverte des agents immunosuppresseurs en transplantation Figure 4 : Les cibles moléculaires des différentes drogues immunosuppressives Figure 5 : Démonstration par Billingham en 1953 de « l’acquisition active de tolérance » vis-à-vis d’alloantigènes Figure 6 : Génération de cellules dendritiques tolérogènes in vitro Figure 7 : Les mécanismes de tolérance centrale Figure 8 : Les mécanismes passifs de tolérance périphériques Figure 9 : Les différents marqueurs des Tregs et leur découverte Figure 10 : Les mécanismes effecteurs des Tregs Figure 11 : Les fonctions physiologiques et pathologiques des Tregs 10 LISTE DES ABREVIATIONS AIRE : autoimmune regulator APECED : autoimmune polyendocrinopathy-candidiasis-ectodermal dystrophy B6 : C57BL/6 CD : cellule dendritique CMH : complexe majeur d’Histocompatibilité CPA : cellule présentatrice d’antigène cTEC : cortical thymic epithelial cell CTLA-4 : cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 DN : double négatif DP : double positif EAE : encéphalite autoimmune expérimentale Foxp3 : forkhead box p3 GITR : glucocorticoid-induced TNF receptor family-related gene IDO : indoléamine 2,3-dioxygénése IFN : interferon Ig : immunoglobuline IL : interleukine iNKT : invariant natural killer T cell IPEX : immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy and X-linked syndrome LT : lymphocyte T mTEC : medullary thymic epithelial cell mTOR : mammalian target of rapamycin NFκ κB : nuclear factor-kappa B NK : natural killer NOD : non-obese diabetic PD-L1 : program death ligand 1 RAG : recombination activation gene Scid : severe combined immunodeficiency SP : simple positif STAT : signal transducer and activator of transcription TCR : T cell receptor TGF : transforming growth factor Th : T helper TNF : tumor necrosis factor Treg : lymphocyte T régulateur 11 INTRODUCTION 12 TRANSPLANTATION A. HISTORIQUE « Simple curiosité opératoire aujourd'hui, la transplantation d'un organe pourra peutêtre un jour avoir un certain intérêt pratique » Alexis Carrel, Prix Nobel de Médecine 1912. • Les premières expériences L’Histoire de la Transplantation est particulièrement riche en témoignages écrits, remontants pour certains aussi loin que l’Empire Romain et rapportant diverses tentatives de greffe de tissu. La Bible en est ainsi largement pourvoyeuse : le Christ remet en place l'oreille du soldat mutilé par Saint Pierre, Saint Antoine de Padoue procède à la réimplantation d'un pied, Saint Pierre fait de même avec les Seins de Sainte Agathe, tranchés par un romain. Quoique sans aucun fondement scientifique, ces récits illustrent parfaitement la fascination de l’Homme pour la transplantation. Au fil des âges, cette fascination va s’affirmer et, profitant des premières dissections aux XVème et XVIème siècles, connaît un nouvel essor. Gaspare Tagliacozzi, un des pères de la chirurgie plastique, utilise ainsi la peau du bras d’un homme pour réparer son nez arraché par un chien, réalisant ainsi la première autogreffe avérée. Un siècle plus tard, en 1668, Job van Meeneren décrit minutieusement comment il a consolidé le crâne d’un soldat blessé en utilisant les os d’un chien. Malheureusement, ces différentes tentatives n’ont pour fonction que de soigner un cas isolé et ne font en rien progresser la discipline. Ce n’est qu’en 1744 avec les débuts des expériences de greffes chez l’animal, réalisées par Abraham Trembley que la transplantation, jusqu’alors simple curiosité chirurgicale, passe par une démarche scientifique. Grâce à elles, de nouvelles techniques sont découvertes et permettent à Berger de les appliquer en retour chez l’Homme lors d’autogreffes de peau. Enfin, en 1869, Jacques-Louis Reverdin s’illustre à son tour en réalisant la première allogreffe de peau et donne ainsi son nom à une procédure chirurgicale. • Amélioration des techniques Néanmoins, si les tentatives de greffes d’organes, autres que la peau, sur des animaux se multiplient, leurs résultats ne permettent toujours pas d’envisager de les étendre à l’homme. Une des difficultés majeures concerne en effet l’incapacité des chirurgiens de l’époque à suturer de façon durable les vaisseaux sanguins des 13 organes transplantés à ceux des receveurs. Il faut attendre 1906 pour que Mathieu Jaloubay, un médecin lyonnais spécialisé en chirurgie vasculaire, mette au point une telle technique. Il l'applique dès lors à la transplantation, en greffant un rein de porc au pli du coude d’une femme atteinte d'insuffisance. Pourtant, cela ne suffit pas à empêcher le rejet rapide de l’organe. Ce n’est finalement qu’après la mise au point des techniques de suture vasculaire (1), qui vaudront le Prix Nobel de Médecine en 1912 à Alexis Carrel, que la transplantation d’organe entre enfin dans l’ère moderne. • Découvertes des antigènes HLA Pourtant, si de part le monde, de nombreux investigateurs parviennent à reproduire et à simplifier l’allotransplantation des deux reins réussie par le Docteur Carrel, aucune avancée majeure ne parvient à prolonger la survie des organes greffés. Il devient donc rapidement évident que d’autres phénomènes entrent en jeu et sont responsables des échecs systématiques des différentes tentatives de transplantation. En 1933, le Russe Serguey Voronoy est le premier à proposer une autre cause que l’imperfection des techniques chirurgicales : le rejet est un événement immunologique. Pour le prouver, il décide de réaliser la première homotransplantation, en greffant un rein provenant d’un homme de 60 ans décédé chez une jeune femme de 26 ans : il espère ainsi s’affranchir du rejet de greffe. Quatre jours après l’intervention, la patiente décède mais l’idée de Voronoy va révolutionner l’approche de la communauté scientifique. S'ensuit une longue période de latence ; le contexte mondial n'est guère propice aux recherches. Il faut attendre l'après-guerre pour que les travaux reprennent. En 1952, l’équipe de Jean Hamburger réalise une avancée sans précédent : un jeune patient, Marius Renard, reçoit dans l’urgence le rein de sa mère. Contre toute attente, le patient survit 21 jours (2). Deux ans plus tard, la totale réussite d’une transplantation rénale entre deux jumeaux identiques, sous la direction de Merrill et Murray à Boston (3), vient corroborer ces résultats. Le rôle de certains facteurs génétiques est alors supposé. En 1958, les travaux de Jean Dausset et de son équipe mettent à jour l’existence d’une « empreinte génétique » sous formes de marqueurs cellulaires, qui, à l’image des empreintes digitales, sont propres à chaque individu. Il s’agit des groupes d’antigènes HLA (« Human Leucocyte Antigen »). Quelques années plus tôt, leurs homologues murins (système H-2) avaient déjà été mis en évidence par Peter Gorer et George Snell. Toutefois, si ces découvertes majeures jettent les bases de l’histocompatibilité, elles confirment que l’application en clinique humaine de la transplantation ne sera possible que si la composante immunologique est contournée. 14 • L’immunosuppression Les recherches se concentrent donc sur l'immunosuppression. Plusieurs méthodes sont expérimentées, à commencer par l'irradiation totale. En 1959, des équipes à Boston et Paris réussissent les premières greffes rénales entre faux jumeaux. Des séances d'irradiation totale et un traitement par corticoïdes ont permis d'affaiblir suffisamment le système immunitaire du patient pour qu'il n'y ait pas de rejet. Parallèlement, à Richmond, l'Américain David Hume réalise la première greffe avec immunosuppression à partir d'un rein de donneur décédé. Les réussites s'enchaînent alors, principalement sur la greffe rénale. Après avoir mis au point les premières techniques d’immunosuppression, ils cherchent désormais à élargir la greffe à d’autres organes que le rein. Mais si ce dernier, organe pair, permet la greffe à partir d’un donneur vivant et a une durée de vie plus longue hors du corps, ce n’est pas le cas des autres organes. De plus, après quelques expérimentations, les équipes médicales constatent rapidement qu’un organe prélevé chez un donneur décédé après arrêt circulatoire, s’altère très rapidement, limitant grandement son intérêt en transplantation. • La mort cérébrale En 1959, l'école neurologique parisienne décrit l'état de mort cérébrale ouvrant ainsi de nouveaux horizons en termes de prélèvement à cœur battant. Les travaux de Mollaret et Goulon (4) sont publiés. C’est à eux que l’on doit l’expression de « coma dépassé » qui sera remplacé plus tard par la notion plus juste de mort cérébrale. Cependant la question se pose : « A quel moment, ces patients en mort encéphalique peuvent-ils être considérés comme décédés? » La lecture du tracé des encéphalogrammes apporte une réponse claire et ouvre désormais la voie au prélèvement d’organes sur un cadavre : le rein en 1963 par les équipes de Guy Alexandre en Belgique et Jean Hamburger en 1964 ; le foie en 1963 puis 1967 à Denver par Thomas Starzl ; les poumons en 1963 sous la direction de James Hardy ; le pancréas dès 1966. Si aucune de ces « premières » n’a été médiatisée à l’époque, il en va différemment de la première greffe cardiaque. Bénéficiant des travaux de Norman Shumway à San Francisco, le 3 décembre 1967, le professeur Christian Barnard, au Cap, en Afrique du Sud, étonne le monde par la première greffe de l'organe le plus symbolique : le cœur (5). Son second opéré, un blanc, survivra grâce au cœur d’un métis. Dans l’Afrique du Sud des années 60, le symbole est fort. 15 • La découverte de la Cyclosporine Pourtant, malgré toutes ses « premières », la transplantation humaine connait une période de transition durant les années 70 : les nombreuses contraintes techniques, la lourdeur des traitements immunosuppresseurs et les échecs fréquents ont eu raison de l’enthousiasme des précédentes décennies. Il faut attendre le 9 mars 1980 pour que l’utilisation d’une nouvelle molécule révolutionnaire, la Cyclosporine, utilisée comme immunosuppresseur lors d’une greffe de foie par le Dr Starzl, éveille de nouveaux espoirs (6). En quelques années, le taux de survie des greffons à cinq ans passe de 40 à 75%. L’avenir de la transplantation est dès lors assuré. Depuis, d’autres traitements immunosuppresseurs, plus efficaces encore, ont été découverts, permettant l’amélioration constante des chances de survie des patients. Cependant, la transplantation souffre encore de nombreuses limites. B. LIMITES NON IMMUNOLOGIQUES Pendant plusieurs siècles, la recherche s’est donc focalisée sur l’amélioration des techniques chirurgicales puis sur la compréhension de la physiopathologie des mécanismes de rejet et sur les moyens à mettre en œuvre afin de les contrôler. Les différentes avancées majeures ont ainsi occulté l’existence de nombreuses restrictions, non immunologiques, qui limitent encore aujourd’hui le recours et/ou le succès de cette solution thérapeutique. Elles sont notamment liées à l’appréhension du don d’organe dans nos sociétés, à l’origine des greffons et aux altérations subies par les organes avant même leur implantation chez le receveur. 1. LE MANQUE DE DONNEUR En 2007, 13081 patients nécessitaient une greffe en France. Parmi eux, seuls 4666 organes étaient greffés. 360 d’entre eux trouvèrent la mort cette année-là (Source EFG). Ainsi, le nombre de receveurs potentiels et de donneur n’ont cessé de progressivement diverger, provoquant un allongement constant des listes d’attentes (6348 patients en attente au 1er janvier 2002 ; 7307 en 2007). La raison en est le sentiment ambivalent qui nait du don d’organe : plaisir d’assurer la vie d’autrui et crainte pour le non-respect de sa propre mort. Au début des années 90, cette dernière perception a pris le pas sur la générosité. Entre 1991 et 1996, le nombre de greffes réalisées a chuté de 23% ! Ceci a conduit la communauté scientifique à développer des méthodes adéquates de prélèvement afin d’optimaliser et d’augmenter le nombre d’organes mis à disposition pour la transplantation. Depuis, de nombreuses campagnes de sensibilisation ainsi qu’un cadre légal favorable ont permis d’inverser cette tendance. 16 En effet, quand en 1952, Jean Hamburger réalise la première transplantation rénale française à partir d’un donneur vivant, aucune législation ne prévoyait les prélèvements in vivo. Les chirurgiens se trouvaient alors menacés par une autre loi qui les faisait tomber sous le coup de « l’atteinte au corps de la personne ». De même quand, en 1959, la mort cérébrale est décrite, elle n’a aucune valeur légale, obligeant les médecins et scientifiques de l’époque à opérer dans l’illégalité jusqu’à sa reconnaissance officielle en 1968 par une circulaire parue au journal officiel. Dès lors, la « tradition » veut que l’avis de la famille soit consulté avant tout prélèvement mais ceci entraine de très nombreux refus, en particulier quand il s’agit du cœur. Pour remédier à cela, la Loi Caillavet est promulguée le 2 décembre 1976. Elle y autorise le prélèvement d’organe à partir d’un donneur vivant ou en mort cérébrale « confirmée » et instaure pour la première fois, le concept de consentement présumé. Elle sera ensuite reprise par la loi n°94-654 du 29 juillet 1994 relative au don et à l’utilisation des éléments et produits du corps humain, ellemême complétée par les Lois de Bioéthique du 6 aout 2004. Quatre principes éthiques sont ainsi établis : le consentement, la gratuité du don, l’anonymat entre le donneur et le receveur et l’interdiction de publicité en faveur d’une personne ou d’un organisme déterminé. La notion de consentement présumé prévoit que « des prélèvements peuvent être effectués à des fins thérapeutiques ou scientifiques sur le cadavre d’une personne n’ayant pas fait connaître de son vivant son refus d’un tel prélèvement ». Pour recueillir les éventuels désaccords, un Registre National des Refus est créé en 1997 et est placé sous la responsabilité de l’Etablissement Français des Greffes. Toutefois, la consultation de la famille est fortement encouragée dans les cas où le défunt n’aurait pas clairement exprimé son opinion de son vivant. La loi de 1994 interdit toute rémunération du don d’organes ou de tissus qu’elle définit comme « un acte de générosité entièrement gratuit ». Elle affirme également le principe de l’anonymat : l’identité du donneur ne peut être révélée à la famille du défunt, et inversement afin d’éviter une relation délicate entre la famille du donneur et celle du receveur, de faciliter le deuil de la famille du donneur ainsi que la convalescence du malade vivant avec l’organe ou le tissus d’un autre. La famille du donneur peut toutefois être informée des résultats des greffes par les équipes médicales. Enfin, la publicité en faveur d’un don d’éléments ou de produits du corps humain est interdite tandis que l’information du public est encouragée. La sensibilisation de la population par des campagnes d’information a ainsi permis une augmentation du nombre de donneurs pendant les années 2000. Pourtant, si aujourd’hui 82% des français se disent favorables au don de leurs propres organes, seuls 40% ont fait part de leur position à leurs proches… 2. LA MORT CEREBRALE La mort fut traditionnellement définie par l'arrêt de toutes les fonctions organiques et plus particulièrement de la respiration et de l'automatisme cardiaque. 17 Depuis l'avènement des méthodes médicales de réanimation permettant de faire reprendre ces activités après leur suspension, ainsi que le maintien artificiel de la ventilation et de la circulation sanguine par l'appareillage médical, une définition, médicale et juridique, plus précise devint nécessaire. Décrit dès 1959, le concept de « mort cérébrale » implique une destruction totale du tronc cérébral et donc, à court terme, de l’organisme entier. Extrêmement rare (2.000 décès sur 500.000 chaque année en France), cet état ne doit pas être confondu avec certains comas profonds n’entrainant pas la mort et au cours duquel le cerveau n’est que partiellement endommagé. Selon la Loi, le diagnostic ne peut être réalisé que par deux médecins qualifiés, non impliqués dans une activité de transplantation et indépendant du donneur et/ou du receveur. Il requiert un examen clinique complet mettant en évidence trois critères indispensables à la déclaration de mort cérébrale : l’absence de conscience, de reflexes du tronc cérébral et de ventilation spontanée. En complément, la destruction totale et définitive du cerveau doit être confirmée par deux encéphalogrammes nuls et aréactifs effectués à un intervalle minimal de quatre heures ou par artériographie objectivant l'arrêt complet de la circulation encéphalique. Les activités cardiaque et respiratoire pouvant être maintenues artificiellement, la mort encéphalique a permis aux médecins et scientifiques d’obtenir des greffons d’excellente qualité. Cependant, malgré un cadre juridique favorable et de nombreuses campagnes d’informations, la moitié des cas en France n’est pas prélevée (dont 2/3 sont liés à un refus). De plus, il a été suggéré, dès les années 90, que l’état de mort cérébrale pouvait avoir un impact sur la qualité des organes périphériques. Ainsi, diverses données expérimentales et cliniques ont montré que la fonctionnalité et la survie des organes prélevés chez des individus vivants sont supérieures à celles observées avec des donneurs cadavériques (7, 8). Une des explications vient de l’origine même du décès. En effet, la mort cérébrale est généralement provoquée par un violent traumatisme, une hémorragie ou une tumeur, provoquant ainsi une hypoxie et/ou une augmentation sévère de la pression intracrânienne. En réponse, l’organisme diminue le débit et la fréquence cardiaque. Le cerveau, sous-alimenté et sous-oxygéné, active alors des mécanismes compensatoires. Cette réaction, appelée « reflexe de Cushing », se traduit par une libération massive et systématique de catécholamines par la médullosurrénale (9) et une sécrétion locale de noradrénaline et neuropeptide Y, par les terminaisons nerveuses sympathiques intramyocardiques (10). Sous l’effet de ces médiateurs, la fréquence et le débit cardiaque augmentent fortement. Cet emballement, conjugué aux propriétés vasoconstrictrices de la noradrénaline et du Neuropeptide Y, aboutit à une dérégulation de la balance entre apport et consommation en oxygène du cœur. Celui-ci entre alors en situation d’ischémie et modifie en conséquence son métabolisme en passant en anaérobie (11). La pression artérielle s’élève inexorablement avant d’atteindre un plateau et de se stabiliser. La déplétion des catécholamines et des substances vasoactives ainsi que la production d’espèces actives d’oxygène (ROS) par les cellules tuées ou stressées (12, 13), entraine alors la diminution de la résistance vasculaire systémique et l’hypotension. Le cœur diminue sa force et sa fréquence de contraction à des valeurs proches de la normale. 18 L’effet délétère de cet emballement sur la qualité du tissu cardiaque a été établi par différents groupes. Dans des cœurs de babouins, prélevés 12 heures après la mort, ils ont observé des lésions au niveau des tissus conducteurs, des cellules musculaires lisses des artères coronaires et des cardiomyocytes. Il a été suggéré que les catécholamines pourraient jouer un rôle majeur dans cette dégradation, notamment en induisant des spasmes microvasculaires (13, 14). Le tissu cardiaque n’est cependant pas le seul à être altéré lors d’une mort encéphalique. Les reins ou les poumons sont également affectés par la vasoconstriction, l’ischémie et par une dérégulation de la balance hormonale. De plus, l’équipe de Tilney a montré dans le cœur, les reins et le sang périphérique de donneurs cadavériques, des niveaux anormalement élevés de médiateurs proinflammatoires (8, 15). 3. L’ISCHEMIE ET LA REPERFUSION Une fois l’organe prélevé, il est maintenu stérile dans un environnement à basse température, en présence d’un milieu isotonique, puis est transporté jusqu’au receveur. Tout au long de cette étape pouvant durer jusqu’à plusieurs heures, les tissus sont privés d’oxygène et de nutriment tandis que les déchets cellulaires ne sont plus éliminés : c’est l’ischémie. Cette situation particulièrement stressante provoque au niveau de l’organe une accumulation de métabolites toxiques (16) ainsi que des altérations biochimiques au niveau cellulaire. L’absence d’oxygène limite le métabolisme oxydatif et accentue la glycolyse anaérobie. Ceci conduit à la production de ROS et d’acide urique, à l’accumulation rapide d’acide lactique, qui diminue le pH intracellulaire, et donc à l’activation d’enzymes lytiques. De plus, cette voie métabolique n’est que peu productrice d’énergie, entraînant à court terme une diminution des stocks d’ATP et l’arrêt de nombreuses fonctions cellulaires. Le dysfonctionnement de la pompe Na/K ATPase, notamment, perturbe l’homéostasie des électrolytes (K, Ca, Fe) et ainsi exacerbe l’activité des phospholipases et des protéases. Enfin, la fixation des métaux sur leur protéine de transport (transferrine, ferritine) est également inhibée. L’augmentation de la concentration intracellulaire en fer libre qui en résulte catalyse la génération de radicaux oxygénés (17) qui permettront à leur tour la production d’autres espèces actives d’oxygène telles que l’oxyde nitrique. L’équipe de Nori a ainsi mis en évidence l’implication de cette molécule dans l’altération des organes greffés, en montrant que l’inhibition in vivo de l’enzyme responsable de sa production (NO synthase) protège les reins des effets néfastes de l’ischémie (18). Une fois l’organe réimplanté, l’étape de reperfusion va permettre son réchauffement, sa réoxygénation, un retour à un métabolisme aérobie et donc à la production massive d’ATP. Cependant, des quantités importantes de ROS vont aussi être produites (17, 19). La réaction entre l’anion superoxyde et le peroxyde d’hydrogène va permettre la génération du radical hydroxyle. Cette molécule, hautement réactive et cytotoxique, va induire la peroxydation des membranes 19 lipidiques (17). L’intensité du stress oxydatif va largement dépasser les mécanismes de régulation et permettre une accumulation de ROS qui induiront la mort par apoptose des cellules présentes dans l’environnement (20). L’ischémie et la reperfusion de l’organe entrainent donc une destruction tissulaire plus ou moins importante. Celle-ci, même limitée, permet le relargage de nombreuses molécules toxiques et de facteurs de stress, à même d’entrainer un état inflammatoire important. Ainsi, des études réalisées sur le foie, le cerveau, le myocarde ou les reins ont montré que l’expression d’ICAM1 et VCAM est augmentée à la surface des cellules endothéliales. Ces deux molécules jouent un rôle crucial dans le recrutement des leucocytes dans les tissus. Au moment de la transplantation, l’entrée des cellules du système immunitaire du receveur au sein du greffon n’en sera que favorisée. De plus, l’altération tissulaire liée à la production de ROS conduit à la production de molécules chimioattractantes, telles l’IL-8 ou ELR-CXC, qui favorisent le recrutement rapide et massif des neutrophiles qui entretiendront à leur tour le processus inflammatoire. Enfin, les protéines de choc thermique, telles HSP60, libérées dans le tissu lésé, pourraient aussi avoir un rôle majeur sur les fibroblastes et les cellules musculaires lisses contenus dans la paroi des vaisseaux. En induisant leur prolifération et leur sécrétion de matrice extracellulaire, ces molécules pourraient notamment participer au développement de vasculopathies caractéristiques des épisodes de rejet chronique. Toutefois, grâce à la mise en lumière de ces mécanismes, de nombreuses cibles thérapeutiques ont ainsi pu être identifiées et la recherche a permis d’améliorer la qualité des liquides de conservation. Ainsi, de nombreux composés actifs sont ajoutés afin d’inhiber l’hypertrophie cellulaire, de contrôler l’homéostasie du calcium, de diminuer la génération des ROS et de fournir à l’organe des substrats hautement énergétiques. Il a également été montré que le conditionnement du receveur pouvait prévenir certaines complications. L’ajout de mannitol ou d’autres molécules anti-oxydantes, permet ainsi de prévenir au maximum la destruction cellulaire liée à la production des ROS. D’autres molécules visant à augmenter la vasodilatation ou à réduire la peroxydation lipidique (inhibiteurs des canaux calciques) sont aussi utilisées, notamment dans le cas d’allogreffes rénales. Enfin, l’utilisation de traitements anti-inflammatoires puissants a été associée à une augmentation de la survie et de la fonctionnalité des organes greffés. C. LIMITES IMMUNOLOGIQUES Les siècles précédents ont ainsi permis à la transplantation de progresser tant du point de vue des techniques chirurgicales que de la compréhension des mécanismes responsables de l’altération des organes avant la greffe. Pourtant, malgré des progrès évidents, il a fallut attendre la fin des années 50 et l’utilisation de 20 protocoles immunosuppresseurs expérimentaux pour que les premières greffes entre deux individus génétiquement différents fonctionnent. Par la suite, l’amélioration de ces traitements n’a toutefois pas réussi à vaincre la dernière limite à cette stratégie thérapeutique ambitieuse : l’activation du système immunitaire du receveur, conduisant à l’élimination plus ou moins rapide des tissus greffés. 1. LES ALLOANTIGENES De nombreuses molécules, exprimées par les cellules du greffon, sont susceptibles de conduire à l’activation du système immunitaire du receveur : les alloantigènes. Ceux-ci peuvent varier par leur distribution tissulaire, leur structure ou leurs fonctions physiologiques. Toutefois, trois types d’antigènes sont particulièrement impliqués : les antigènes majeurs d’histocompatibilité, les antigènes mineurs d’histocompatibilité et le système antigénique ABO • Les antigènes majeurs d’Histocompatibilité Les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) constituent la principale cible du système immunitaire lors du rejet de greffe. Mises en évidence dès 1936 à la suite de nombreuses études à partir de souris congéniques, elles sont codées par un ensemble de gênes situés sur le chromosome 6 chez l’homme et 17 chez la souris. Cette région comprend ainsi différents loci, classés en gènes de classe I (HLA- A, B et C chez l’Homme ; H-2K, D et L chez la souris) et de classe II (HLA-DP, DQ et DR chez l’Homme ; I-A et I-E chez la souris). Les molécules de CMH de classe I sont exprimées de manière constitutive à la surface de toutes les cellules nucléées. Ces glycoprotéines sont composées d’une chaîne α polymorphe à trois domaines, associée de façon non covalente à la β2microglobuline. Leur fonction consiste à présenter à la surface des cellules des fragments peptidiques dérivés de protéines endogènes. Ainsi en reflétant en permanence une image du contenu intracellulaire, elles permettent au système immunitaire de détecter des situations pathologiques, telles une infection virale ou les processus de cancérisation. Une exception à cette définition est apportée par les cellules dendritiques qui possèdent la capacité de présenter des peptides exogènes dans le contexte du CMH de classe I, ceci afin de permettre l’activation des lymphocytes T CD8+ vis-à-vis d’antigènes viraux non portés par la CPA : c’est la présentation croisée (21). 21 22 Ces molécules associées à leur peptide peuvent être reconnues et permettre l’activation des lymphocytes T CD8+ via leur TCR. Mais elles peuvent également réguler l’activation des cellules NK. Ainsi, une expression anormale des molécules de CMH de classe I, due par exemple à une infection virale ou à un stress important, conduira à l’activation des cellules NK et in fine à la destruction de la cible. Les molécules de CMH de classe II sont, elles, formées par l’assemblage de deux chaines polymorphes α et β. Elles sont impliquées dans la présentation des antigènes exogènes ou membranaires et permettent l’activation des lymphocytes T CD4+. Leur expression est, contrairement aux molécules de CMH de classe I, bien plus restreinte, limitée principalement aux cellules présentatrices d’antigènes (cellules dendritiques, macrophages, lymphocytes B) et aux cellules épithéliales thymiques. Toutefois, sous l’influence de certaines cytokines comme l’IFN-γ, elles peuvent également être retrouvées à la surface des cellules endothéliales vasculaires. Ainsi, si les molécules de CMH de classe I et II diffèrent par leur profil d’expression et leur structure, elles partagent une origine polygénique complexe, sont hautement polymorphes et répondent à une expression co-dominante de leurs gènes. Ceci leur permet ainsi d’augmenter les chances de survie de chaque individu face aux agressions extérieures mais posent à contrario un problème majeur en transplantation puisqu’elles réduisent fortement les probabilités d’histocompatibilité entre donneur et receveur. • Les antigènes mineurs d’Histocompatibilité Les antigènes mineurs d’histocompatibilité regroupent l’ensemble des molécules, différentes des antigènes du CMH de classe I et II, susceptibles d’induire l’activation de lymphocytes T allospécifiques et ainsi, d’amener au rejet d’une greffe. Le plus souvent de nature peptidique, il a été montré qu’ils pouvaient provenir non seulement de glycoprotéines membranaires, comme cela avait été initialement suggéré, mais également de protéines intracellulaires, telles que des facteurs de transcription ou la myosine. Ils trouvent leur origine dans les nombreuses variations géniques propres à chaque espèce et se traduisent par des peptides différents présentés aux cellules T par le biais des molécules de CMH (22, 23). Ils peuvent être codés par des chromosomes autosomaux comme c’est le cas pour la myosine ou la β2-microglobuline, par le chromosome Y ou l’ADN mitochondrial (24). Les antigènes mâles HY constituent ainsi l’un des exemples d’antigènes mineurs les mieux caractérisés. Ils n’ont une relevance que lorsqu’un tissu mâle est greffé chez une femelle histocompatible. Les femelles ne possédant pas le chromosome Y, leur système immunitaire voit les peptides, dérivés de gènes codés par l’Y (Hya, Sry, Uty, Smcy, Ube1y) et présentés naturellement par le CMH, comme étrangers (25). Néanmoins, cette immunogénicité des antigènes de mâles 23 n’est pas due à une simple présence/absence. En effet, tous les gènes, présents sur le chromosome Y et susceptibles de coder pour un antigène mineur, possèdent leur paralogue sur le chromosome X. Cependant, il a souvent des divergences importantes dans les séquences des paralogues et ce sont ces nombreuses différences qui sont vues par le système immunitaire femelle comme étranger (26). Ces antigènes sont donc capable d’induire l’activation des lymphocytes T CD4 et CD8 alloréactifs et ainsi d’entrainer le rejet d’un tissu greffé entre individu mâle et femelle histocompatible (27). En revanche, ils ne déclenchent pas de réponse humorale détectable. Ces différences mâle/femelle sont d’autant plus importantes chez la souris, où les lignées consanguines ont permis d’en étudier longuement les implications. Chez la souris, environ 720 loci codent ainsi pour des antigènes mineurs potentiels (28). Cependant, lorsque des greffes sont réalisées entre souris partageant les mêmes haplotypes du CMH mais génétiquement différentes, par exemple entre des souris de même haplotype, la réponse semble se limiter à un petit nombre de peptides dits immunodominants, en dépit d’une multitude de différence d’antigènes mineurs (29, 30). Des évidences suggèrent que ces peptides sont associés aux molécules de CMH avec une affinité supérieure et que ces complexes CMH/peptide sont exprimés à des niveaux élevés à la surface cellulaire. L’interaction CMH-peptide-TCR n’en est qu’optimisée et les réponses à leur encontre sont alors plus fortes. • Le système ABO Ce système d’antigènes, découvert en 1900 par Karl Landsteiner, n’entre pas dans la définition des antigènes mineurs, étant incapable d’activer les lymphocytes T. Son importance ne doit toutefois pas être sous-estimée. Les déterminants antigéniques du système ABO sont des oligosaccharides présents à la surface de différents types cellulaires et notamment par les érythrocytes et par l’endothélium vasculaire, interface importante entre le greffon et l’hôte. Le gène « ABO », situé sur le chromosome 9 chez l’Homme, code pour une glycotransférase de type A ou B, ces deux formes ne différant que par quatre substitutions d’acides aminés. Dans le cas de l’allèle O, une délétion d’un acide aminé dans l’exon 6 est à l’origine d’un codon stop et conduit à la synthèse d’une protéine tronquée inactive (31, 32). Ces glycosylations différentielles modifient la substance H et définissent ainsi les quatre groupes sanguins connus (A, B, AB, O). Durant les premières années de leur vie, les individus immunocompétents du groupe O produisent des anticorps contre les antigènes des groupes sanguins manquants : anti-A et anti-B (33). Il a été supposé que ces anticorps préformés, en majorité des IgM, sont produits par sensibilisation à des substances environnementales comme la nourriture, des bactéries ou des virus. Ces anticorps 24 constituent une barrière immunologique très efficace contre la transfusion et la transplantation d’organe entre individus de groupes sanguins différents. Ainsi, lors d’une greffe d’organe solide d’un donneur de type A et/ou B chez un receveur de type O, l’endothélium du greffon sera le premier, la cible des anticorps préformés (34) et nouvellement synthétisés, entrainant un rejet hyperaigu. Cependant, depuis de nombreuses années, afin de faire face à la raréfaction des organes disponibles, de nombreuses équipes ont, avec succès, réalisé des transplantations rénales de donneur ABO-incompatible en utilisant des protocoles visant à diminuer les anticorps anti-donneur A/B chez le receveur (plasmaphérèse, élimination des cellules B, ex vivo immunoadsorption) (35). Chez ces patients, la survie du greffon est alors comparable à celle obtenue lors d’une greffe entre personne de même groupe sanguin (36). 2. LES VOIES D’ALLORECONNAISSANCE L’activation du système immunitaire du receveur à lieu au niveau des nœuds lymphatiques drainants la greffe. Là, les lymphocytes T alloréactifs naïfs pourront être activés selon deux voies principales d’activation. • Voie de reconnaissance directe La voie de reconnaissance directe implique une interaction entre le TCR des lymphocytes T et les molécules de CMH allogéniques intactes à la surface des CPAs (Cellules dendritiques, cellules endothéliales, etc.) du donneur. La mise en évidence de cette voie s’appuie sur différentes observations. Ainsi, in vitro, une prolifération intense des lymphocytes T peut être observée lorsqu’ils sont mis en contact avec des cellules présentatrices d’antigènes (CPAs) irradiées. Cette réponse rapide et forte correspond à celle observée in vivo lors du rejet aigu d’un organe. Diverses stratégies de déplétion des CPAs de l’organe greffé sont venues conforter cette observation. Lafferty a ainsi montré que la survie d’une greffe allogénique de thyroïde, dont les CPAs ont été éliminées avant transplantation, est prolongée de façon significative par rapport à celle d’un greffon non manipulé (37). De même, lors d’une greffe de moelle osseuse, la maladie du greffon contre l’hôte (Graft versus Host Disease, GvHD) peut être prévenue par l’inactivation des CPAs de l’hôte (38). Lechler, pour sa part, a observé, dans un modèle de rat, qu’en prétransplantant un rein semi-allogénique dans un hôte intermédiaire, sous traitement immunosuppresseur, avant de le greffer à son hôte final quatre semaines plus tard, le greffon était durablement accepté (>100 jours). Dans ces conditions, l’injection de quelques milliers de cellules dendritiques du donneur chez le receveur final suffit à 25 restaurer l’immunogénicité de l’allogreffe, provoquant ainsi un rejet aigu (39). Cependant, si dans ces mêmes expériences, les combinaisons sont changées et que le greffon utilisé provient cette fois d’un hôte totalement allogénique, la greffe « retransplantée » est inévitablement rejetée, avec cependant une cinétique plus lente que si elle n’a pas été pré-transplantée chez un hôte intermédiaire. Ceci laissait à penser qu’une autre voie de présentation des alloantigènes pouvait prendre le relais. Enfin, dans de nombreux modèles expérimentaux, ainsi qu’en clinique humaine, il a été montré que plus l’histocompatibilité entre le receveur et le donneur était importante, meilleures étaient les chances de survie du greffon. Dans le cas d’une parfaite identité pour les molécules de CMH de classe II, une allogreffe de rein peut même être acceptée à long terme (40). La démonstration formelle que des cellules T, ne reconnaissant les alloantigènes que directement, pouvaient induire à elles seules le rejet de greffe, n’a été apportée que récemment par l’équipe de Gill. Ainsi, le transfert de lymphocytes T CD4+ syngéniques B6 chez un hôte Rag1-/- entraine le rejet d’un cœur allogénique BLAB/c exprimant les molécules de CMH de classe II mais pas le rejet d’un cœur provenant de souris déficientes pour ces mêmes molécules. En outre, dans ces mêmes combinaisons, l’expression des molécules de CMH II par l’hôte n’est pas nécessaire au rejet. La voie de reconnaissance directe médiée par les lymphocytes T CD4+ est ainsi nécessaire et suffisante pour induire le rejet de greffe (41). L’existence d’un tel mécanisme direct de stimulation des lymphocytes T par une molécule de CMH autre semble transgresser le dogme de la restriction du TCR au CMH du soi. L’analyse structurale d’un TCR allogénique a indiqué que ce mode de reconnaissance trouvait son origine dans la cross-réactivité de lymphocytes spécifiques de complexe peptide/CMH du soi pour les molécules de CMH allogéniques (42). Cette hypothèse est en accord avec des travaux plus anciens qui avaient montré qu’une large proportion des lymphocytes T participant à l’alloréactivité ont un phénotype mémoire (43). La réponse immunitaire dépendante d’une activation par la voie directe a été décrite comme particulièrement rapide et de grande amplitude. Ceci s’explique par la fréquence élevée (environ 7%) des cellules T susceptibles de reconnaître des molécules de CMH allogéniques, une fréquence 100 à 1000 fois plus grande que celle estimée des précurseurs T spécifiques d’un antigène exogène (44). Diverses hypothèses ont été proposées afin d’expliquer ce constat. 26 27 La première repose sur les travaux de Jerne dans les années 70. Il a ainsi été suggéré que le répertoire de gènes qui codent pour le TCR a évolué en fonction de sa capacité à conférer une réactivité avec les antigènes du CMH de l’espèce (45). Cette hypothèse a été par la suite confirmée et démontrée par Zerrahn et al. en 1997. Lors d’expérience de maturation de thymocytes en absence de molécule de CMH, ils ont en effet observé une alloréactivité similaire à des populations de thymocytes ayant subis les différentes étapes de sélection thymique (46). La deuxième propose que le ligand du TCR alloréactif est la molécule du CMH elle-même, indépendamment du peptide présenté. Ainsi, à la surface des CPAs du donneur, toutes les molécules de CMH allogéniques peuvent agir comme un ligand pour le TCR, augmentant ainsi fortement l’avidité de l’interaction. La forte fréquence de lymphocytes mobilisés lors d’une allogreffe serait donc liée au fait que même les cellules qui expriment un TCR de faible affinité sont susceptibles de s’activer. Enfin, la dernière hypothèse, à l’inverse de la précédente, propose que chaque TCR est spécifique d’un complexe CMH/peptide bien défini. Ainsi, en supposant qu’un peptide dérivé d’une protéine non polymorphe, mais présenté dans le contexte du CMH allogénique, soit reconnu comme du non-soi, le fort pourcentage de cellules T allospécifiques serait lié à l’existence d’un nombre immense de complexes immunogènes à la surface des CPAs. Ce modèle, proposée par Polly Matzinger, est appelée « modèle du complexe binaire simplifié » (47). En réalité, il est supposé que ces deux derniers modèles représentent deux cas extrêmes qui encadrent un large spectre de situations dans lesquelles le peptide contribue, à différents degrés, à l’interaction entre le TCR et le ligand. Obst et al. ont en effet pu montrer que le peptide a d’autan plus d’importance que les molécules de CMH du donneur et du receveur sont proches. A l’inverse, plus les molécules du CMH sont structurellement éloignées, plus l’interaction entre le TCR et son ligand est à dominance CMH (48). Enfin, la voie d’alloreconnaissance directe a essentiellement été associée aux épisodes de rejet aigus. En effet, les cellules dendritiques allogéniques sont présentes en nombre limité dans l’organe transplanté et sont incapables de se renouveler. Ainsi, leur capacité à soutenir une activation continue du compartiment T du receveur va décroitre avec le temps post-greffe. Ceci est en adéquation avec des études cliniques qui ont montré que le nombre de cellules T activées par cette voie diminue inexorablement, même en l’absence de rejet total du greffon (49, 50). • Voie de reconnaissance indirecte Suite à l’inflammation crée par l’acte chirurgical, les cellules dendritiques du receveur et leurs précurseurs hématopoïétiques sont attirés vers le greffon où ils vont pouvoir acquérir des alloantigènes par l’internalisation de molécules de CMH 28 solubles, par la phagocytose de corps apoptotiques/nécrotiques ou par échange de vésicules. Cette acquisition peut également avoir lieu directement au niveau des nœuds lymphatiques drainant grâce notamment à la présence de nombreuses CPAs du donneur à leur niveau. Ces alloantigènes sont alors présentés par les molécules du CMH de classe II endogènes présentés à la surface des CPAs du receveur. Les peptides présentés dérivent de l’action protéolytique de différentes enzymes lysosomales à l’égard des molécules du CMH allogéniques ou des antigènes mineurs d’histocompatibilité. La fréquence des lymphocytes T alloréactifs s’activant par la voie indirecte de présentation est extrêmement faible comparée à celle de la voie directe, puisqu’équivalente à la fréquence des cellules T reconnaissant des antigènes exogènes. L’existence de cette voie d’alloreconnaissance a été démontrée au cours de différentes études. Ainsi, Lechler, dans les mêmes expériences qui ont mises en évidence la voie directe, a observé que la déplétion des cellules dendritiques contenues dans le greffon permet de retarder, mais pas de totalement inhiber, le rejet (39). De même, dans un modèle murin, une greffe allogénique de peau provenant d’un donneur déficient pour les molécules de CMH de classe II peut être rejetée par le système immunitaire d’un animal receveur CMH I-/- (51). Dans ce système, la souris hôte n’a pas de cellules T CD8+ et ses cellules T CD4+ ne peuvent pas être directement activées par les CPAs contenues dans le greffon puisqu’elles n’expriment pas les antigènes de classe II. Enfin, Dalchau et al ont montré que des rats préalablement injectés avec des molécules solubles et allogéniques de CMH I ou II rejettent plus rapidement une allogreffe de peau que des animaux non manipulés (52). Si la portée de cette voie n’est que faible lors du rejet aigu, il semble qu’elle soit la voie prédominante lors du rejet chronique. En effet, l’influence de la voie directe diminue avec le temps, alors que la voie indirecte se maintient à des niveaux élevés chez des patients présentant un rejet cardiaque chronique en comparaison à des patients ayant acceptés le cœur transplanté (53). • Voie de reconnaissance semi-directe Pendant très longtemps, les voies directes et indirectes ont été considérées comme les seuls mécanismes de stimulation des cellules T allospécifiques du receveur. Pourtant, de nombreuses observations laissaient à penser que d’autres mécanismes étaient impliqués. Ainsi, il avait été décrit que des cellules T CD4+ activées par la voie indirecte étaient capables de délivrer une aide efficace aux lymphocytes T CD8+ stimulés directement par les molécules allognéiques de CMH de classe I (54). 29 Une nouvelle voie intermédiaire, qualifiée de « semi-directe » a récemment été décrite par l’équipe de Robert Lechler (55, 56). Elle a pu mettre en évidence in vitro que des cellules dendritiques pouvaient acquérir et présenter, par un mécanisme actif, des molécules intactes de CMH de classe I et de classe II présentes à la surface de cellules dendritiques ou endothéliales allogéniques. De plus, elle a montré que ce transfert d’antigène se déroule également in vivo et que les molécules de CMH ainsi captées sont capables d’activer par une voie directe, et spécifique de l’antigène, des cellules T syngéniques. Cette voie permettrait ainsi d’assurer, une fois les CPAs du donneur disparues, une activation continue des lymphocytes T CD8+, obligé de reconnaître le CMH de classe I du donneur pour présenter leurs fonctions cytotoxiques, et de recevoir une aide efficace des CD4+, activés eux par la voix d’alloreconnaissance indirecte. Toutefois, l’importance relative de ces mécanismes dans l’activation du répertoire alloréactif et son implication dans le rejet de greffe ne sont pas actuellement connues. 3. LES MECANISMES DE REJET Trois formes de rejet ont été initialement décrites. Elles se caractérisent par leur cinétique plus ou moins précoce après la greffe, par les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu et par les types de lésions constituées au niveau du greffon. • Le rejet hyperaigu Le rejet hyperaigu survient dans les heures qui suivent la reperfusion de l’organe. Il est l’exemple le plus classique et le plus spectaculaire d’un rejet dépendant des anticorps. Macroscopiquement, l’organe présente des signes évidents de thrombose vasculaire, d’hémorragies et une infiltration légère de cellules mononucléées. Il est la conséquence de la présence d’alloanticorps préformés dans le sang du patient suite à une transfusion, une greffe ou une grossesse. Ces anticorps sont majoritairement dirigés contre les antigènes ABO ou les molécules du CMH présents à la surface des cellules endothéliales du greffon. Leur fixation va entrainer l’activation intense de la cascade du complément qui aboutit à la destruction des cellules cibles par le complexe d’attaque membranaire ainsi qu’à la libération de médiateurs inflammatoires comme l’IL-8, MCP-1 ou le facteur de Von Willebrand (57). Les cellules de l’endothélium vont alors se rétracter, ce qui va augmenter la perméabilité des vaisseaux et provoquer des hémorragies, et perdre l’expression de molécules anticoagulantes ce qui conduira à une thrombose, à l’ischémie et à la mort rapide de l’organe (58). 30 De nos jours, la recherche systématique d’alloanticorps présents chez le receveur fait de ce type de rejet un évènement rare en transplantation clinique. Cependant, le rejet hyperaigu constitue encore à l’heure actuelle une barrière majeure en xénotransplantation (59). • Le Rejet Aigu Le rejet aigu se développe chez l’homme durant le premier trimestre suivant la transplantation. Jusqu’à la découverte des traitements immunosuppresseurs, il était la principale cause du rejet de greffe. L’analyse histologique révèle une infiltration interstitielle diffuse et massive composée de lymphocytes T, de macrophages et de granulocytes (60). L’organisation anatomique de l’organe est perdue. Les tissus nobles détruits sont progressivement remplacés par des tissus « de remplissage ». Les mécanismes impliqués dans la destruction rapide de l’organe sont nombreux et font intervenir un grand nombre de cellules immunitaires spécialisées. La réponse humorale semble ainsi jouer un rôle non négligeable dans la mise en place du rejet aigu (61, 62). Les lymphocytes T et les différents mécanismes effecteurs qu’ils activent restent toutefois les principaux acteurs de cette forme de rejet, aujourd’hui maitrisée. Véritables chef d’orchestre du système immunitaire, les lymphocytes T CD4+ vont coordonner toute la réponse immunitaire contre le greffon. Leur rôle majeur a été souligné par de nombreuses études. Lors d’une greffe allogénique de moelle osseuse, leur élimination de la population cellulaire injectée suffit en effet à inhiber le développement de la maladie du greffon contre l’hôte (63). De même, la déplétion de ces cellules par traitement anticorps, ou par l’utilisation de receveurs CMH II-/-, conduit à l’acceptation à long terme d’une allogreffe cardiaque (64). Cependant, il a également été montré dans un modèle murin d’allogreffe de peau, qu’en leur absence, une réponse efficace peut se développer et conduire à la destruction du greffon (65). Après leur activation, les lymphocytes T auxiliaires alloréactifs vont préférentiellement se différencier en cellule Th1. Ce biais dans la polarisation de l’alloréponse, lors du rejet aigu, a été rapporté à de nombreuses reprises (66, 67). Toutefois, une minorité de travaux a observé une différenciation plutôt en faveur de Th2. Il est à noter qu’à l’heure actuelle, le rôle des cellules Th17 reste obscur : seule l’IL-17 a été reliée à la transplantation (68). Le déséquilibre Th1/Th2 pourrait être lié au fait que l’avidité d’interaction entre les cellules T CD4+ et les cellules dendritiques allogéniques est élevée, puisque le ligand du TCR est exprimé à une forte densité à la surface des CPAs. Il a en effet été montré que des interactions de moyenne et de forte intensité favorisent la différenciation en Th1 (69). De plus, le type de CPA influence aussi fortement la balance Th1/Th2. Or les cellules dendritiques qui migrent 31 du greffon ont la capacité de produire de l’IL-12 qui est la cytokine clef de la différenciation des lymphocytes T naïfs en cellules effectrices de type 1. Une fois activé, les lymphocytes T CD4+ vont notamment fournir aux cellules B l’aide nécessaire pour leur division et pour leur production d’anticorps. Chez la souris, les Th1, via la sécrétion d’IFN-γ vont favoriser la production d’IgG2a, immunoglobulines fixatrices du complément. Après fixation à la surface de la cellule cible, notamment les cellules endothéliales du greffon, les anticorps peuvent entraîner directement la mort de la cible par l’activation de la cascade du complément. Parallèlement, après s’être associées à leurs récepteurs Fcγ présents, entre autres, à la surface des cellules NK, les immunoglobulines peuvent tuer indirectement leur cible via l’ADCC (Antibody Dependant Cellular Cytotoxicity) en activant les mécanismes cytolytiques de la cellule NK. • Les mécanismes cytotoxiques des cellules T Les lymphocytes T CD4+ vont également favoriser la différenciation des lymphocytes T CD8+ en cellules T cytotoxiques. Ces dernières vont s’accumuler, une fois activées, dans le greffon (66) où elles vont pouvoir exercer leur activité cytotoxique à l’encontre de leurs cellules cibles selon deux voies essentielles : la voie perforine/granzyme de façon prédominante et la voie Fas/FasL. L’utilisation de souris déficientes pour la perforine a permis de mieux définir l’importance de cette voie dans le rejet aigu. Une étude a pu montrer que des souris receveuses sauvages contrôles et des souris déficientes en perforine rejetaient un cœur allogénique avec des cinétiques identiques. Cependant, le rejet de greffe était retardé de façon significative quand la souris receveuse déficiente en perforine était greffée avec un cœur ayant une disparité isolée au niveau des antigènes de CMH de classe I (70). Cette observation peut être expliquée par le fait que les lymphocytes T CD8 jouent un rôle dominant dans le rejet d’organe possédant une disparité isolée au niveau des molécules de CMH de classe I, situation dans laquelle les lymphocytes T CD4 ne peuvent pas être activés par la voie directe, alors que d’autres mécanismes effecteurs sont mis en place dans des combinaisons d’histocompatibilité classe I et classe II (71). En effet, les lymphocytes T CD4 de type Th1 possèdent aussi une activité cytotoxique et utilisent préférentiellement pour ce faire la voie Fas/FasL. Le rôle de cette voie dans le rejet aigu a été observé dans des modèles où le rejet de greffe solide est uniquement dépendant de l’activation des lymphocytes T CD4. Ceci s’explique par le fait que, dans des combinaisons complètement allogéniques où les cellules T CD4 et CD8 seront activées, l’absence de la voie Fas/FasL attribuable en majorité aux cellules CD4, sera compensée par les mécanismes de lyse perforine/granzymes dépendant des lymphocytes T CD8. 32 Tout d’abord, il a été montré que dans des modèles de greffe de peau H-2bm12 sur des receveuses H-2b, situation dans laquelle le donneur possède une disparité isolée au niveau des molécules CMH II, le greffon de peau est rejeté par deux mécanismes distincts, le premier impliquant les éosinophiles et le second mettant en jeu des mécanismes dépendant d’interactions Fas/FasL. Chez la souris receveuse déficiente en IL-5, cytokine cruciale au développement et à l’activation des éosinophiles, il est en effet nécessaire et suffisant de neutraliser ces interactions Fas/FasL, en greffant par exemple une peau provenant d’un animal Fas-/- pour que le greffon soit durablement accepté (72). • Réaction d’hypersensibilité retardée La réaction d’hypersensibilité retardée (Delayed-type hypersensibility ou DTH) ont été associées, dans des modèles d’allogreffes de peau ou de cœur chez les rongeurs, aux épisodes de rejet aigu (73-75). Elle est généralement caractérisée par un œdème consécutif à l’augmentation de la perméabilité vasculaire ainsi qu’à l’infiltration massive du tissu par des cellules T, des macrophages et des neutrophiles (71). Elle est due au recrutement de lymphocytes Th1 et de CTLs au sein du greffon qui, après activation, sécrètent des cytokines telles que l’IFN-γ et le TNF-α qui vont participer à l’activation de macrophages. Ceux-ci vont dès lors libérer des molécules toxiques telles que le TNF-α, des radicaux libres et le monoxyde d’azote. Le monoxyde d’azote est toxique à haute concentration, il est aussi responsable de la vasodilatation et des œdèmes caractéristiques des DTH). Le TNFα en s’associant à son récepteur induit l’apoptose de la cellule cible par l’activation de la voie des caspases. De plus, la production par les lymphocytes T d’IFN-γ, de RANTES et de MCP1 (« Monocyte Chemotactic Protein-1 ») va avoir un effet sur les cellules endothéliales et favoriser la migration de nouvelles cellules infiltrantes qui entretiendront la DTH. Les neutrophiles, notamment, produiront une enzyme, la myéloperoxidase, qui va être à l’origine de la synthèse de métabolites toxiques comme des radicaux libres et du peroxyde d’hydrogène (71). • Rejet Chronique Dès lors qu’une immunosuppression est mise en œuvre, que ce soit au niveau des systèmes expérimentaux visant à étudier les mécanismes de rejet ou en clinique humaine, le rejet aigu est plus ou moins muselé avec succès. La découverte des drogues immunosuppressives a de ce point de vue, permit des progrès importants en transplantation. La survie à un an des greffons a ainsi considérablement augmenté. Toutefois, malgré ces avancées, 3 à 5% des patients perdent encore leur transplant chaque année. Ce constat est lié au développement inexorable d’un processus 33 indolent mais progressif : le rejet chronique. Contrairement au rejet aigu qui est la conséquence d’une réponse immunitaire exacerbée à l’encontre de l’organe étranger transplanté, celui-ci est une maladie dominée par le remodelage pathologique du tissu greffé (76). En effet, le rejet chronique ne conduit pas à la destruction de l’organe mais à l’obstruction progressive de la lumière des vaisseaux sanguins, consécutive à la prolifération des cellules musculaires lisses (77). Cette occlusion entraîne une mauvaise perfusion de l’organe, en altère ses fonctions et conduit à l’ischémie et, à terme, à la mort du greffon. Actuellement, cette artériosclérose de transplantation reste l’obstacle majeur à la survie à long terme d’organes vascularisés (78). Le développement du rejet chronique est un processus comportant plusieurs étapes clefs qui peuvent être distinguées en fonction des types de cellules infiltrantes, de cytokines et de facteurs de croissance impliqués dans les lésions tissulaires. Les étapes initiales du rejet chronique sont associées à une réponse inflammatoire, proche d’une DTH et dominée par une infiltration massive de monocytes/macrophages dans l’intima. Dans des modèles de greffe chez le rat, il a pu être montré que ces étapes précoces étaient aussi caractérisées par l’attachement de nombreuses cellules T et la production in situ d’IL-1, d’IFN-γ et de TNF-α. Il a de plus été rapporté que la production de la chimiokine MCP-1 par les macrophages résidents amplifiaient le recrutement de cellules inflammatoires (79). Dans les phases plus tardives, l’infiltration cellulaire est dominée par les macrophages, le nombre de cellules T diminuant peu à peu. Ces étapes sont caractérisées par la prolifération des cellules musculaires lisses, l’épaississement secondaire de l’intima et l’apparition des premières zones infarctiées. Avec le temps, ces phénomènes s’amplifient et des cytokines de type 2, telles que l’IL-4, l’IL-10 et le TGF-β, cytokine impliquée dans le remodelage et la fibrose tissulaire, apparaissent dans le greffon. Ces cytokines vont conduire au dérèglement de la balance synthèse/dégradation de la matrice extracellulaire et ainsi, à l’apparition d’une fibrose concentrique (80, 81). Parallèlement, les cellules musculaires lisses expriment à des niveaux élevés les récepteurs aux facteurs de croissance Platelet-Derived Growth Factor (PDGF-α, -β) et Epidermial Growth Factor (EGF), critiques pour leur prolifération et leur migration vers l’intima. Ces deux évènements aboutissent à la formation d’un épaississement diffus : la néointima. Dans les situations les plus extrêmes, la lumière vasculaire va complètement se boucher ce qui va conduire à l’ischémie de l’organe, à la fibrose de son parenchyme et à sa mort. L’étiologie du rejet chronique est multiple. L’hypercholestérolémie, l’hypertension, le tabagisme, l’âge, l’alcoolisme sont, comme pour l’athérosclérose, autant de facteurs aggravants. Les évènements consécutifs à la mort cérébrale, l’ischémie froide et à la reperfusion ont également des effets délétères. Cependant, même si des expériences de greffes secondaires ont permis de montrer qu’une fois 34 initiée, l’artériosclérose de transplantation peut s’autoentretenir en l’absence d’alloréponse, l’implication du système immunitaire dans cette forme de rejet reste indispensable, du moins pour son initiation. En effet, chez le rat, la greffe d’un cœur allogénique est associée au développement de rejet chronique contrairement à la greffe d’un cœur syngénique ayant subit les mêmes procédures chirurgicales (82). Les CPAs contenues dans le greffon ne s’autorenouvellant pas, l’activation des cellules T de l’hôte va essentiellement être réalisée par la voie indirecte et semidirecte (80). Une fréquence importante de lymphocytes T spécifique de complexes CMH du soi/peptide allogénique a été identifiée chez des patients développant un rejet chronique suite à une greffe de cœur, de rein (49) ou de poumon (83). Ces cellules vont essentiellement se différencier vers un phénotype Th2. Différentes hypothèses ont permis d’expliquer ce « shift » de la réponse immune constaté dans la plupart des modèles expérimentaux et en clinique humaine (77). Ainsi, l’action inhibitrice des traitements immunosuppresseurs sur l’état inflammatoire contribue à la diminution de l’intensité de la réponse Th1. De plus, l’activation des cellules T par la voie d’alloreconnaissance indirecte implique des interactions de plus faibles avidités, favorisant ainsi une différentiation Th2. De même, le changement dans la nature des CPAs impliquées dans l’activation du répertoire T et dans la composition cytokinique du milieu pourrait aussi y participer. Cette déviation de la réponse immune pourrait ainsi, en grande partie, être responsable du développement du rejet chronique vasculaire. Les cytokines de type 2, qui sont retrouvées en quantité importante dans les lésions d’artériosclérose, jouent en effet un rôle majeur dans la sécrétion d’alloanticorps, capables en l’absence de cellules T d’induire des lésions importantes, dans le contrôle de la balance synthèse/dégradation de matrice extracellulaire et dans la prolifération et la migration des cellules musculaires lisses dans l’intima. Elles participent également, via l’IL-4 et l’IL-5, au recrutement et à l’activation des éosinophiles qui, en sécrétant du TGF-β et des protéines cationiques telles la MBP (Major Basic Protein), favoriserait le développement de la fibrose (84). D. PROTOCOLES DE CONTROLE DU REJET Depuis les années 60, date à laquelle la transplantation d’organe a réellement été envisagé comme une solution thérapeutique, différentes stratégies ont été mises au point afin de contrôler la réponse immune du receveur, principal obstacle à sa réussite. Après la découverte en 1970 et l’utilisation dans les années 80 de la Cyclosporine, de nombreuses générations de molécules actives ont été développées avec le souci permanent d’un ciblage toujours plus précis des cellules responsables du rejet et d’une réduction des effets iatrogènes. Pourtant, si les efforts consentis en termes de recherche ont permis une augmentation de la survie des greffons, de nombreuses limites persistent encore. Elles ont conduit la communauté scientifique à mettre au point de nouvelles approches. 35 1. Les drogues immunosuppressives Les traitements anti-rejet utilisés couramment en clinique humaine ont pour objectif d’inhiber de façon plus ou moins directe l’activation et, plus récemment, la migration des lymphocytes T, principaux acteurs du rejet. Ainsi cinq grands types de drogues ou de traitements immunosuppresseurs ont été développés. Ils différent notamment par leurs cibles et leurs modes d’action (85). • Inhibition de la prolifération Les premières approches utilisées afin de contrôler l’alloréponse reposaient essentiellement sur un effet anti-prolifératif. En 1915, Murphy et Morton montraient ainsi que l’irradiation d’animaux conduisait à l’élimination du compartiment lymphoïde, et de façon concomitante, à la prise durable d’une tumeur allogénique. Cette destruction non sélective des cellules en cycle sera par la suite utilisée en clinique humaine par Jean Hamburger. En 1959, il décrira que le conditionnement de patients par irradiation totale du corps permet la survie à deux ans d’une allogreffe rénale. Malgré ce résultat encourageant, obtenu chez 9 patients transplantés sur 25, et le développement de techniques permettant de restreindre l’irradiation à certaines parties du corps, la toxicité sévère du traitement et le caractère transitoire des effets observés ont conduit à la recherche de nouvelles approches. C’est dans ce cadre qu’ont été mises en évidence les premières drogues antiprolifératives. Après différents travaux reposant sur l’utilisation du benzène, les traitements à l’azathioprine, toujours utilisés de nos jours, furent les premiers à donner des résultats probants, en permettant notamment de prolonger de façon significative la survie d’allogreffes rénales chez l’Homme (86). Une fois administrée, cette molécule est rapidement hydrolysée en 6-mercaptopurine, inhibiteur compétitif des bases puriques (adénine et guanine). Cependant, plus de 80% des patients traités par l’azathioprine développent des épisodes de rejet aigu. Cette limite majeure a permis le développement de produits analogues, mais plus efficaces. Le mycophenolate mofetil (MMF), qui inhibe de manière non compétitive et réversible la déshydrogénase inosine monophosphate, une enzyme indispensable à la synthèse des nucléosides guanosiques, a alors été mis au point. Néanmoins, des différences pharmacocinétiques interdividuelles importantes au niveau de son absorption intestinale lui confèrent une efficacité aléatoire. Ce frein, associé à la toxicité générale des traitements anti-prolifératifs vis-à-vis des tissus présentant un fort taux de renouvellement (tractus digestif, tissu hématopoïétique…) a aujourd’hui fortement restreint son utilisation. 36 37 • Les Glucocorticoïdes La seconde étape majeure dans le développement des drogues immunosuppressives a été la découverte des stéroïdes. Les glucocorticoïdes, stéroïdes dérivés de la synthèse chimique, forment un représentant majeur de cette famille de molécules. Ils possèdent des récepteurs de type nucléaire, qui, une fois associés à leur ligand, se libèrent des protéines chaperonnes de choc thermique hsp90 qui les retiennent dans le cytoplasme et transloquent aussitôt dans le noyau où ils s’associent à leurs éléments de réponse au niveau de l’ADN. Ces récepteurs vont dès lors réguler l’activité transcriptionnelle de nombreux gènes, notamment en inhibant la translocation de NF-κB. Ce facteur de transcription est à l’origine de l’activation et de la maturation de cellules du système immunitaire telles les cellules dendritiques (87). Les stéroïdes vont aussi inhiber, de façon directe ou non, la synthèse de nombreuses enzymes de l’inflammation telles que la cyclo-oxygénase 2, impliquée dans la synthèse de Prostaglandine E2, ou la phospholipase 2. Les corticostéroïdes sont donc de puissants anti-inflammatoires et immunosuppresseurs dont la première utilisation en tant que traitement anti-rejet date de la fin des années 60 (85). Ainsi de 1964 à 1978, de la prednisone a notamment été administrée, de façon chronique, en combinaison avec l’azathioprine. Ce traitement permettait la survie à un an de 50% des patients ayant reçu une allogreffe de rein. Cependant, leur administration provoqua de nombreuses altérations du compartiment hématopoïétique, des désordres métaboliques (hypertension et ostéoporose), des diabètes ainsi que l’aggravation d’états infectieux (réveil du virus de la varicelle ou du cytomégalovirus) et une sensibilité accrue aux infections. Du fait des nombreux effets indésirables liés à l’administration des stéroïdes, il est envisagé d’interrompre leur administration après les premiers mois suivant la greffe. Toutefois, les premiers résultats suggéraient que l’arrêt des corticostéroïdes trois mois après la greffe augmentait le risque de rejet. • Déplétion/modulation des lymphocytes Une autre stratégie consiste à détruire sélectivement les lymphocytes, étant donné leur rôle central dans l’alloréponse. La première approche, mise au point par Woodruff en 1963, consistait à placer un cathéter dans le canal thoracique des patients avant greffe, afin de drainer les lymphocytes qui retournent à la circulation sanguine (88). La lymphe récoltée, déplétée en cellules mononuclées par sédimentation ex vivo, était ensuite réinjectée au patient. En dépit de son originalité, cette approche n’a connu que très peu d’applications en clinique humaine, en raison notamment de la difficulté à la mettre en œuvre. 38 39 Une autre méthode, plus simple, fut envisagée : l’utilisation d’anticorps. Malheureusement, les premières expériences furent des échecs : les anticorps antilymphocytaires utilisés, polyclonaux, reconnaissaient une grande variété de cibles et s’accompagnaient donc d’une forte toxicité pour l’organisme. L’anti-thymocyte globulin a toutefois été utilisé durant de longues années, principalement aux EtatsUnis. Il est aujourd’hui de plus en plus délaissé en faveur des anticorps monoclonaux. Leur mise au point permit rapidement de résoudre ces problèmes. Ainsi, l’un des plus anciens, et cependant toujours utilisé, est l’anticorps OKT3 dont les premiers essais cliniques datent du début des années 1980 (89). Cette immunoglobuline de souris reconnait CD3ε, une molécule clef du complexe TCR qui joue un rôle prépondérant dans les évènements proximaux de la transduction du signal, inactivant ainsi les fonctions des cellules T naïves et activées. Un autre exemple d’anticorps, déplétant celui-ci, est le CAMPATH-1H ou Alemtuzumab. Il a été montré que l’injection de cet anticorps humanisé anti-CD52 à J0 et J1 post-greffe permet, en l’absence de stéroïdes, la survie à moyen terme d’une allogreffe rénale par un traitement léger à la cyclosporine (90). CD52 est une molécule de surface exprimée notamment par les cellules NK, les lymphocytes B et T, la plupart des populations de monocytes/macrophages et les cellules dendritiques. Il est actuellement en cours d’évaluation dans les greffes d’organes mais il est régulièrement utilisé dans les greffes de moelle osseuse pour prévenir le rejet et la GVHD ainsi que dans le traitement de leucémies (91). L’un des effets indésirables majeurs imputables à ces anticorps est l’importante immunosuppression qu’ils engendrent du fait de leur non-spécificité vis-à-vis des cellules T naïves ou activées. Leur utilisation est donc restreinte à de faibles doses et à des périodes de temps relativement courtes afin de réduire au maximum le risque d’infections opportunistes ou le développement de novo de tumeurs malignes. Afin de remédier à cela, deux autres anticorps monoclonaux, le Daclizumab (92) et le Basiliximab (93), visant spécifiquement les lymphocytes T activés, ont été développés. Ces anticorps sont dirigés contre la chaîne α du récepteur à l’IL-2 (CD25), exprimée à la surface des cellules T et NK activées. Cependant, même s’ils permettent de réduire la fréquence des épisodes de rejet aigu lors de greffes rénales, ces anticorps ont une efficacité limitée du fait de leur faible compétition avec l’IL-2 endogène et du fait qu’ils inhibent l’AICD (« Activation Induced Cell Death ») induite par cette cytokine. Ils entrainent de plus le syndrome du relargage de cytokines (Cytokine Storm). Toutefois, étant donnée leur spécificité vis-à-vis des cellules activées, leur administration ne semble pas associées à une susceptibilité accrue aux infections opportunistes. • Inhibition de la synthèse des cytokines Pour parachever leur activation et leur différenciation Th1/Th2, les lymphocytes T nécessitent un signal dépendant des cytokines. En court-circuitant ce signal, les médecins pensaient ainsi pouvoir réduire la réponse allogénique. La découverte de la cyclosporine en 1970 à l’occasion de recherche sur de nouveaux 40 antifongiques a ouvert la voie à l’immunosuppression chimique. Ce polypeptide, isolé à partir d’un champignon, fut testé dès 1978 et permis effectivement de fortement réduire la fréquence et l’intensité des épisodes de rejet aigu (94). Depuis le Tacrolimus (FK506), agent plus puissant, a été isolé à partir d’une bactérie. Ces deux molécules, en s’associant avec la calcineurine, inhibent son activité, laquelle sert de relais entre le TCR et différents facteurs de transcription, tels que JNK, NFAT ou NFκB. La transcription de certains gènes cibles comme l’IL-2 est alors fortement réduite. Cependant, même si l’effet de ces drogues est relativement restreint aux cellules lymphoïdes, elles ne peuvent pas être administrées seules à des doses suffisament élevées pour inhiber le rejet de greffe. En effet, la calcineurine étant largement distribuée, son inhibition va avoir de nombreux effets indésirables tels que des dommages neurologiques ou rénaux ainsi que l’apparition de diabète. Le Sirolimus ou Rapamycine, molécule apparentée structuralement au Tacrolimus, inhibe la kinase mTOR (mammalian Target of Rapamycin) impliquée dans la transduction des signaux en aval des molécules de co-stimulation ou en réponse à des cytokines telles que l’IL-2 ou l’IL-15 (95). L’activation de mTOR est à l’origine de la progression de la cellule T de la phase G1 à la phase S (96). L’administration de Sirolimus va avoir donc pour effets adverses principaux une hyperlipidémie et une thrombocytopénie. La stratégie actuelle consiste à combiner ces drogues qui possèdent différents mécanismes d’action pour minimiser les doses utilisées et par là même la toxicité intrinsèque à chacun de ces traitements. • Blocage de la migration des cellules effectrices En 1992, une nouvelle classe de drogues anti-rejet est découverte, suite à la modification chimique d’une molécule immunosuppressive naturelle retrouvée chez les champignons, la myriocine. Nommé FTY720, cette nouvelle drogue est un agoniste de haute affinité du récepteur 1 à la sphingosine-1 phosphate (S1P1). Contrairement aux drogues classiques, il n’inhibe pas l’activation ou la différenciation des cellules effectrices, mais en induisant l’internalisation de S1P1, il empêche l’émigration des cellules T des organes lymphoïdes vers la périphérie (97, 98). Ainsi, il a été montré, chez le rat, que son administration est associée à une importante diminution des infiltrations des cellules CD3 positives dans le greffon de peau allogénique. Et si son administration seule n’a que peu d’effet sur la survie du greffon, en combinaison avec la cyclosporine, il en permet une augmentation très significative (99). Un de ses avantages est qu’en ne faisant que séquestrer les lymphocytes T et B, il n’empêche ni leur activation dans les ganglions, ni les réponses humorales périphériques ou la génération de CTLs spécifiques d’un virus (97). Ainsi peut-on supposer que son administration, en comparaison aux drogues bloquant la 41 prolifération des cellules T ou leur activation, interfère moins avec le développement de réponses immunitaires à la suite d’une infection du patient (la réponse restera toutefois cantonnée aux organes lymphoïdes) Cette molécule est actuellement testée en essai clinique de phase III chez des patients ayant bénéficiés de greffe de rein. Récemment, les résultats d’une étude, qui comparait l’effet du remplacement du mycophénolate mofétil par le FTY720, tous deux en association avec la cyclosporine, ont été publiés. Ces données montrent que le FTY720 est aussi efficace que le mycophénolate mofétil dans la prévention du rejet de greffe, l’administration de FTY720 étant toutefois associée à une diminution du risque des infections par le CMV (100). 1. Nouvelles stratégies thérapeutiques Les drogues immunosuppressives ont beaucoup apporté à la transplantation. Grâce à elles, ce qui n’était encore qu’un rêve à la sortie de la seconde guerre mondiale est devenu une solution thérapeutique couramment utilisée en clinique humaine. Pourtant, elles restent soumises à de nombreux effets secondaires, liés notamment à une expression de leur molécule cible, non restreinte au compartiment lymphoïde. De plus, les traitements n’affectant pas uniquement la réponse alloréactive, l’état d’immunosuppression induit est global. Ainsi, en comparaison avec des individus sains, les patients ayant bénéficiés d’une greffe d’organe présentent une fréquence accrue de cancers et d’infections diverses. Ceci se caractérise également par une mortalité amplifiée. Enfin, l’effet des drogues immunosuppressives actuelles sur l’apparition des épisodes de rejet chronique reste particulièrement faible. Ces différentes limites ont poussé la communauté scientifique à élaborer de nouvelles stratégies thérapeutiques. En 1953, Billingham et fait une découverte sans précédent. En injectant in utero une suspension de cellules allogéniques à des souris gestantes, son équipe a montré qu’à leur naissance, les souriceaux acceptaient durablement une greffe de peau provenant d’un donneur génétiquement identique aux cellules administrées (101). Mais la prouesse tenait surtout au spectaculaire rejet par ces mêmes souriceaux d’une peau provenant d’un autre donneur allogénique. Ainsi, pour la première fois, il avait été montré que l’on pouvait manipuler le système immunitaire de manière spécifique afin de le forcer à accepter ce qui lui est étranger. La notion d’induction de tolérance au non-soi était née. Depuis, elle est devenue le Saint Graal que tout médecin en transplantation recherche. A l’inverse, ces expériences ont permis de mieux connaitre la tolérance au soi. Il est ainsi rapidement apparu que la tolérance observée était due à un microchimérisme qui se mettait en place chez les souriceaux à partir des cellules injectées. 42 43 Les études et les modèles pour reproduire les résultats de Billingham se sont donc multipliés mais seuls certains d’entre eux peuvent aujourd’hui prétendre à une application future chez l’homme. • L’induction de chimérisme hématopoiétique Dès 1945, Owen observa, chez des veaux ayant partagés la même circulation placentaire (102), l’existence d’un mélange d’erythrocytes de deux origines différentes. Chacun de ces veaux possédaient ainsi ses propres cellules et des cellules de son frère. De plus, ce chimérisme perdurait à très long terme. Peu après, Medawar montrait que chacun des faux-jumeaux étaient tolérants vis-à-vis d’une greffe de peau provenant de leur frère. Par la suite, les travaux de Billingham et Medawar mirent en évidence le fort potentiel thérapeutique d’un chimérisme dans le cadre de la transplantation (101). La pertinence d’une telle approche chez l’Homme, fut confortée quand des patients, ayant reçus au préalable une greffe de moelle osseuse pour raison thérapeutique, s’avérèrent tolérants à une greffe de rein provenant du même donneur, au point de pouvoir se passer de traitements immunosuppresseurs. Dès lors, la communauté scientifique s’intéressa de près à ces mécanismes et tenta de repoduire au travers de divers modèles, l’induction d’une telle tolérance. Les premières expériences chez la souris, réalisées par Ildstad et Sachs, montrèrent que l’élimination totale du système hématopoïétique par irradiation létale et sa reconstitution par un mélange de moelle osseuse syngénique et allogénique permet d’obtenir une tolérance durable et spécifique du donneur vis-à-vis d’une greffe de peau de même fond génétique que la moelle (103). L’approche fut plus tard rendu moins toxique par l’utilisation d’une irradiation non-létale combiné à un traitement d’anticorps déplétants anti-CD4 et anti-CD8 (104). Lors de la reconstitution du système immunitaire de l’hôte, la tolérance est induite et maintenue par des mécanismes de sélection des cellules T neogénérées au niveau du Thymus, médiés principalement par la présence au niveau de la medulla de cellules dendritiques du donneur. L’établissement de cette tolérance permet par la suite l’acceptation d’une greffe d’organe provenant de la même origine, sans l’utilisation de traitements immunosuppresseurs. Par la suite, des études chez le porc miniature et chez les primates nonhumains ont clairement établis le principe selon lequel l’induction d’un chimerisme mixe dans des conditions non-myéloablatives est un moyen particulièrement efficace de promouvoir la tolérance. L’approche a également été étendue à l’Homme, lors de tests cliniques dans lesquels la tolérance a été induite chez certains patients sans induire de maladie contre le greffon ou de toxicité (105, 106). Ce point s’est révélé particulièrement prometteur, l’établissement d’un chimérisme ayant longtemps été freiné par la forte morbidité de la GVHD. 44 Pourtant, de nombreuses interrogations subsistent sur le chimérisme et sa capacité à induire une tolérance. Ainsi, l’établissement d’un chimérisme mixte persistant, s’il est relativement aisé chez les rongeurs, s’avèrent particulièrement difficile chez les primates et l’Homme. Le conditionnement des receveurs reste encore aujourd’hui très contraignant pour permettre la prise de la moelle osseuse. De plus, il est rapidement apparu que l’induction d’un chimerisme n’était pas systématiquement synonyme d’une tolérance. Ce phénomène, appelé « Split Tolerance », a d’abord été observé dans des cas de chimérime total, où toutes les cellules hématopoïétiques proviennent du donneur. Depuis, il a été clairement décrit dans différents modèles de chimérisme mixte (104, 107-110). Enfin, il est à noter que, même dans le cas où une tolérance a été induite, celle-ci peut brusquement disparaître, parfois plusieurs mois après son induction, impliquant le rejet de l’organe solide greffé. Cette solution thérapeutique, quoique prometteuse, nécessite donc encore de nombreuses études afin de comprendre les mécanismes sous-jacents et pouvoir, à terme, induire une tolérance à chaque fois. • Les Cellules Dendritiques Tolérogènes Les cellules dendritiques jouent un rôle clef dans le contrôle de la réactivité du système immunitaire puisque ce sont elles qui vont présenter les alloantigènes aux cellules T effectrices. Cependant, si une fois matures, elles sont à l’initiation des mécanismes conduisant au rejet de greffe, elles participent à l’état immature aux mécanismes d’induction de tolérance. Cette dualité fonctionnelle a donc amené différents groupes à moduler l’état d’activation de ces cellules afin d’inhiber sélectivement le compartiment immun alloréactif et, ainsi, induire la survie à long terme de greffes allogéniques. De nombreux travaux reposent sur l’utilisation de cellules dendritiques allogéniques immatures. Ces cellules sont notamment caractérisées par une faible expression des molécules du CMH II et de co-stimulation. Aussi, en l’absence de signaux activateurs, leur capacité à stimuler les lymphocytes T est extrêmement faible. Dans différents systèmes, il a même été montré qu’elles ont un potentiel tolérogène important. La première démonstration d’un tel potentiel des cellules dendritiques fut apportée par Lu et al. en 1995. Ils ont dérivé, en présence de GMCSF et en l’absence d’IL-4, des cellules dendritiques à partir de précurseurs contenus dans la moelle osseuse. Après 8 à 10 jours de culture, ils ont montré que ces cellules induisent, de façon antigène spécifique, l’anergie réversible de lymphocytes T alloréactifs (111). Dans ce modèle, l’hyporéponse est associée à l’absence d’expression des molécules de co-stimulation par les CPAs puisque l’ajout d’un anticorps anti-CD28 in vitro permet de réverser le phénomène. 45 En 2000, la même équipe obtient des données analogues avec des cellules dendritiques dérivées en présence de faible quantité de GM-CSF et d’IL-4. Ces cellules sont résistantes à la maturation induite par différents stimuli tels que du LPS, du TNFα ou des anticorps anti-CD40. De phénotype immature, elles expriment que faiblement les molécules de co-stimulation CD80 et CD86 et sont incapables d’activer des lymphocytes T allogéniques in vitro. De façon spectaculaire, les auteurs ont pu démontrer l’efficacité de ces cellules dans un modèle de greffe cardiaque allogénique chez la souris. L’administration par voie systémique d’un faible nombre de cellules dendritiques immatures d’origine du donneur 7 jours avant la greffe, permet d’induire l’acceptation à long terme de façon spécifique (112). Différents traitements pharmacologiques peuvent être employés pour générer, in vitro, des cellules dendritiques immatures possédant des capacités tolérogènes. Ainsi, un grand nombre de traitements immunosuppresseurs classiquement utilisés en clinique, en plus de leur action sur les cellules T, ciblent également les cellules dendritiques. Les Corticostéroïdes, la Rapamycine et la Cyclosporine peuvent notamment inhiber la maturation des cellules dendritiques (113). Parallèlement, d’autres agents permettent l’induction de cellules dendritiques tolérogènes. La 1, 25 dihydroxy vitamine D3, par exemple, le métabolite actif de la vitamine D3, inhibe la différenciation et la maturation des cellules dendritiques humaines et murines in vitro. De plus, elle inhibe leur sécrétion d’IL-12 en réponse au LPS, alors que dans le même temps, leur sécrétion d’IL-10 est fortement augmentée. Tous ces effets ont pour conséquence d’inhiber la capacité des cellules dendritiques à activer les lymphocytes T alloréactifs, rendant les cellules T anergiques (114). L’utilisation in vivo de la 1, 25 dihydroxy vitamine D3 dans des modèles de greffe a permis de montrer son efficacité. Ainsi, l’inocculation de cellules dendritiques de mâles prétraitées à la vitamine D3 chez une femelle syngénique quelques jours avant qu’elle ne reçoive une peau de mâle, est associée à l’acceptation durable de la peau greffée. A l’opposé, l’administration de cellules dendritiques mâles non prétraitées n’est pas associée à une augmentation de survie du greffon en comparaison aux souris contrôles n’ayant pas reçu de cellules dendritiques (115). De plus, il a été montré que l’administration directe de vitamine D3 en association avec du mycophénolate mofétil induit l’acceptation durable de greffes cardiaques et d’îlots pancréatiques chez des souris. Les auteurs ont mis en évidence que chez les souris traitées, les cellules dendritiques autour de la greffe présentent un phénotype immature, attesté par une expression de CD40, CD80 et CD86 46 47 diminuée en comparaison avec des cellules dendritiques de souris non traitées. De même, lorsque ces cellules dendritiques purifiées sont mises en contact avec des lymphocytes T CD4 du donneur, elles sécrètent 10 fois moins d’IL-12 que leurs homologues provenant d’animaux non traités. Enfin la réponse T CD4 qui se développe est caractérisée par une faible production d’IFN-γ. Les auteurs on pu montrer que cette tolérance était transférable. En effet, des lymphocytes T CD4+ CD25+ purifiés à partir de la rate des souris tolérantes, cellules dont le pourcentage est augmenté par rapport aux souris contrôles, protègent des souris naïves du rejet de greffe d’îlots (116) : la tolérance induite serait donc dominante. Parallèlement à la génération de cellules dendritiques tolérogènes ex vivo, une étude récente indique que l’administration de dérivés apoptotiques provenant des splénocytes du donneur, 7 jours avant la greffe cardiaque, permet d’augmenter de façon significative la survie du greffon (117). En effet les cellules dendritiques du donneur qui ont capturé les cellules apoptotiques restent immatures, et la présentation des peptides allogéniques aux lymphocytes T CD4, activés ici de manière directe, entraine leur anergie. Ces cellules CD4, une fois « activées », s’avèrent incapable de sécréter de l’IL-2 et de l’IFN-γ. Cependant, ces différentes stratégies présentent de nombreuses limites. Ainsi, il a été montré que ces cellules peuvent maturer in vivo et conduire à l’accélération du rejet de l’organe. Ceci peut toutefois être contrôlé par l’injection d’anticorps bloquant l’interaction CD40/CD40L (118). Enfin, d’un point de vue logistique, il apparaît difficile d’injecter une semaine avant la greffe des cellules dendritiques dérivées de tissus prélevés chez un donneur cadavérique. Pour pallier cela, des stratégies reposant sur des cellules dendritiques syngéniques ont été proposées. La pertinence de cette approche est suggérée par le fait que l’induction de tolérance à des alloantigènes a été décrite, dans différents systèmes, comme nécessitant une voie d’alloreconnaissance indirecte fonctionnelle (119, 120). Ainsi, il a été montré dans des modèles de greffe cardiaque allogénique chez le rat par l’équipe du Dr Cuturi que l’injection de cellules dendritiques syngéniques immatures permet d’augmenter significativement la survie de l’organe transplanté (121). Mieux, lorsque l’injection des cellules dendritiques est suivie d’un traitement suboptimal de LF15-095, un état de tolérance durable et spécifique de l’antigène est induit (122). Cet analogue de la deoxyspergualine pourrait potentialiser l’action des cellules dendritiques en inhibant leur maturation in vivo. De façon intéressante, le même groupe a montré que l’administration d’exosomes provenant du donneur après la transplantation, en association avec du LF15-095, est capable d’induire une tolérance spécifique des alloantigènes du donneur, caractérisée par une profonde inhibition des réponses prolifératives « antidonneurs ». De plus, ce traitement permet de retarder significativement le rejet chronique. Ces données montrent que la présentation des molécules du CMH du donneur à la surface des exosomes peut induire le développement de réponses 48 « régulatrices » capables d’induire une tolérance vis-à-vis du donneur, même si ces exosomes sont administrés après la greffe (123). Enfin, une dernière approche concernant l’utilisation de cellules dendritiques tolérogènes, consiste à manipuler ces cellules in vivo afin d’optimiser leurs capacités tolérogènes (124). En ce sens, l’expression de différentes molécules aux propriétés immunosuppressives a été induite dans ces cellules par génie génétique. Afin de bloquer l’expansion clonale des lymphocytes T allospécifiques, et/ou d’induire leur apoptose, des stratégies ont consisté à transfecter les cellules dendritiques avec le gène codant pour l’indoléamine-2,3 dioxygénase (IDO). De même, afin de promouvoir l’anergie ou la délétion des cellules effectrices, l’expression de molécules telles que PDL-1 ou FasL a été forcée à la surface des CPAs. L’inhibition de l’expression des molécules de co-stimulation, indispensable à une bonne activation des lymphocytes T, a été envisagée via un effet autocrine, après transfection des cellules dendritiques avec les gènes codant pour l’IL-10 ou le TGF-β. • Blocage des co-récepteurs Dans les années 90, l’équipe de Herman Waldmann a développé des protocoles d’induction de tolérance basés sur l’administration, d’anticorps anti-CD4 non déplétants. Ces traitements permettent l’acceptation de greffes cardiaques allogéniques (125). L’addition d’anticorps anti-CD8 ou anti-CD40L, entraine une tolérance durable et spécifique du donneur, à savoir que l’animal ainsi « tolérisé » accepte une seconde greffe de même origine que la première alors qu’il rejette une greffe d’origine différente (126). Les auteurs ont mis en évidence que cette tolérance peut être transférée chez un hôte naïf : c’est la tolérance dominante (127). Celle-ci serait dépendante d’une population de lymphocytes T CD4+ possédant des propriétés immunorégulatrices. En effet, ces cellules, quand elles sont transférées, ont la capacité d’empêcher le rejet d’une greffe de même origine que celle de la greffe qu’a reçue l’animal tolérisé. Ces protocoles d’induction de tolérance utilisant des anticorps dirigés contre les co-récepteurs ont connu peu de succès, en dehors du groupe de H. Waldmann. Ceci est probablement dû à l’engouement général envers les anticorps bloquant les signaux de co-stimulation. De plus, l’état de tolérance qui se développe suite à l’administration de ces anticorps s’acquiert seulement après plusieurs semaines de traitement (128). • Blocage des molécules de co-stimulation Les succès rencontrés par les protocoles d’induction de tolérance à l’aide d’anticorps développés par Waldmann, ont conduit de nombreuses équipes à élargir 49 l’éventail de molécules cibles. Etant donnée leur importance pour une activation efficace du système immunitaire, les molécules de co-stimulation sont rapidement apparues comme d’excellents candidats. Il existe une grande variété de voies de co-stimulation ; cependant B7/CD28/CTLA-4 et CD40/CD40L est probablement la plus importante et certainement la mieux caractérisée à ce jour. De même, CD40/CD40L, malgré le fait qu’elle ne fasse pas intervenir à proprement parler des molécules de co-stimulation, a été bien décrite. Ces deux voies ont ainsi concentré toute l’attention de la communauté scientifique. Toutefois, si de nombreux modèles ont été mis au point chez les rongeurs, seul le blocage de la voie B7/CD28 a fait l’objet d’essais cliniques et d’études approfondies chez les primates non humains. L’interaction entre CD28 à la surface de la cellule T et les molécules B7 à la surface des APCs peut être bloquée par des anticorps anti-B7 et par CTL4-Ig, une protéine recombinante constituée du domaine extracellulaire de CTLA-4 fusionné à la chaîne lourde d’une immunoglobuline. L’utilisation de ces anticorps prévient le rejet aigu d’allogreffe et induit parallèlement une tolérance spécifique vis-à-vis des antigènes du donneur. Cependant, il est à noter que le blocage n’est pas efficace dans toutes les souches de souris, ni dans toutes les combinaisons. Une seule dose de CTLA4-Ig permet d’augmenter de façon significative la survie du rein greffé chez la majorité des rats traités (129). Néanmoins, il semble que l’administration d’antigènes du donneur sous la forme de transfusion de splénocytes du donneur (DST) soit nécessaire pour obtenir une acceptation durable et pour prévenir le rejet chronique des cœurs greffés (130). La DST potentialiserait l’action de l’administration de CTLA4-Ig en fournissant aux lymphocytes T alloréactifs un important stimulus pour leur TCR. Dans le même temps, le blocage des molécules de co-stimulation ne permettrait pas aux lymphocytes T d’obtenir une activation optimale. Il en résulterait une anergie ou l’apoptose des cellules T. CTLA4-Ig permettrait l’acceptation durable via plusieurs mécanismes. Tout d’abord, il réduirait la fréquence des cellules T alloréactives qui prolifèrent en augmentant parallèlement leur sensibilité à l’apoptose. En accord avec cela, des agents pharmacologiques comme la Rapamycine qui augmente l’AICD potentialise l’apoptose induite par l’administration de CTLA4-Ig, alors que la cyclosporine la diminue (131). Un deuxième mécanisme a récemment été découvert. Grohmann et al. ont pu montrer que la liaison de CTLA4-Ig aux molécules B7 induit l’expression de l’enzyme IDO par les cellules dendritiques in vitro. Celle-ci va métaboliser le tryptophane en kynurénine, métabolite entraînant l’apoptose des lymphocytes T. De façon intéressante, les auteurs ont mis en évidence que l’état de tolérance induit par l’administration de CTLA4-Ig était dépendant du catabolisme du tryptophane in vivo. Si des îlots pancréatiques allogéniques étaient durablement acceptés chez des souris recevant du CTLA4-Ig, ils étaient rapidement rejetés lorsque était coadministré 50 du 1-methyltryptophane, un inhibiteur d’IDO (132). Ces résultats sont en accord avec des études qui montraient l’importance d’une interaction B7/CTLA4-Ig intacte dans l’induction de tolérance. Ainsi, la tolérance induite par un traitement associant CTLA4-Ig et une DST était prévenue lorsque des anticorps Anti-CTLA4 étaient administrés de façon concomitante (133). Des résultats similaires à ceux obtenus avec blocage de la voie CD28/B7 ont été observés avec l’utilisation d’anticorps monoclonaux anti-CD40L (anti-CD154). In vivo, le blocage de cette voie va avoir, entre autres, pour conséquence d’altérer la maturation des cellules dendritiques, leur présentation d’antigène ainsi que leur capacité à activer les lymphocytes T (134). Chez des souris ayant reçu des anticorps anti-CD40L et une DST, on observe l’augmentation significative d’une population de lymphocytes T CD4+ CD25+, nécessaires pour induire un état de tolérance durable chez le receveur. Chez ces animaux, une forte expression des ARNm codant pour Foxp3, un marqueur des populations régulatrices, est observée dans les greffons cardiaques des souris tolérisées (135). Il semble que comme pour l’administration de CTLA4-Ig, le traitement des souris receveuses avec des anticorps anti-CD40L pendant les premiers jours suivant la greffe ne soit pas suffisant pour induire l’acceptation durable des greffes cardiaques (136) ou d’îlots pancréatiques allogéniques (137). En effet, il apparait que les lymphocytes T CD8 qui sont plus résistants au blocage de CD40, sont à l’origine, chez les souris ne possédant pas une voie de signalisation CD40/CD40L fonctionnelle, du développement du rejet chronique (138, 139). Comme pour le blocage de CD28, une DST est dans les deux cas nécessaire pour atteindre une tolérance à long terme sans survenue de rejet chronique (136, 137). Des stratégies visant à combiner le blocage des deux voies ont provué leur efficacité. Chez les souris, des anticorps anti-CD154 en association avec CTLA4-Ig permettent d’induire la survie à long terme d’allogreffes cardiaques BALB/c sans dommages vasculaires chroniques chez un hôte C3H (140). Ce protocole de tolérance autorise aussi l’acceptation de peau allogénique BALB/c par l’hôte C3H. Il faut toutefois préciser que l’efficacité de ces protocoles d’induction de tolérance est fortement dépendante des souches utilisées dans les combinaisons donneur/receveur, et ce particulièrement lorsque des greffes de peau, hautement immunogènes, sont réalisées. Ainsi, si dans la combinaison citée plus haut BALB/c dans C3H, la co-administration anti-CD40L et CTLA4-Ig permet l’acceptation de la peau greffée, dans une autre combinaison BALB/c dans B6, ce protocole n’est pas efficace et ne permet que de retarder de quelques jours le rejet de la peau greffée. Ces résultats pourraient s’expliquer par le fait que des lymphocytes T CD8 de certaines souches seraient plus résistants que d’autres aux blocages des voies de co-stimulation (141). Malheureusement, si l’administration d’anticorps anti-CD40L est efficace chez les primates non humains (142), certains groupes ont rapporté la survenue 51 d’épisodes thromboemboliques (143) suite à ce traitement chez l’Homme. Ces complications reflètent l’importance de l’expression des molécules de co-stimulation par les cellules non lymphoïdes. CD40L est en effet constitutivement exprimé à la surface de l’endothélium et son expression est induite à la surface des plaquettes activées. Ainsi, à ce jour, les stratégies de blocage de co-stimulation basées sur l’administration d’anticorps anti-CD40L ne font pas l’objet d’essais cliniques. A l’inverse, les protocoles basés sur l’utilisation de CTLA4-Ig font l’objet d’investigations cliniques. Belatacept est un dérivé de l’abacept, une protéine de fusion humaine constituée du domaine de CTLA4 fusionné à une IgG1 humaine. La différence entre les deux protéines est une substitution de deux acides aminés qui augmente l’affinité du belatacept. Un essai clinique de phase 2, incluant des adultes ayant subi une allogreffe de rein, a comparé son effet à celui de la cyclosporine, en addition d’une thérapie d’induction composée de basiliximab, de mycophénolate mofétil et de cortisone. Les résultats de l’étude publiée en 2005 concluent que le belatacept et la cyclosporine sont aussi efficaces dans la prévention des rejets aigus. Toutefois, il semble que la prise des belatacept soit associée à des effets indésirables moindres. Chez les patients ayant reçu la protéine CTLA4-Ig plutôt que la cyclosporine, on note un meilleur fonctionnement du rein greffé associé à une diminution d’un facteur 2 des néphropathies chroniques (144). De nouvelles études prospectives randomisées devraient à l’avenir permettre de tester l’efficacité de ce traitement pour d’autres greffes d’organes. Ces stratégies thérapeutiques parviennent donc, avec plus ou moins de succès, à induire une tolérance aux alloantigènes chez le receveur en manipulant son système immunitaire. Cette tolérance est, dans la plupart des modèles décrits ici, induite soit par l’anergie et la délétion des cellules alloréactives, soit par l’amplification ou la génération de sous-population de lymphocytes T doués de propriétés immunosuppressives. Ce faisant, ces différents protocoles ne font que détourner de leur but initial des mécanismes déjà existants à l’état naturel chez tout individu et lui permettant d’assurer l’intégrité de son organisme, en évitant que son propre système immunitaire ne se retourne contre lui : c’est la tolérance au soi. 52 TOLERANCE AU SOI Pour répondre à l’infini diversité des antigènes, les régions variables des récepteurs des lymphocytes B et T sont générées par recombinaisons géniques. Ce processus étant aléatoire, il permet la production d’un très vaste répertoire de spécificités, à même de couvrir en théorie l’intégralité des antigènes rencontrés. Le revers de la médaille toutefois, réside dans la génération de cellules présentant une forte affinité pour les antigènes du soi. Ces lymphocytes autospécifiques pourraient, une fois en périphérie, s’activer et représenter une menace pour l’organisme. Il est donc indispensable soit de neutraliser directement ces cellules lors de leur génération, c’est la « tolérance centrale » ; soit d’empêcher coute que coute leur activation au niveau des organes lymphoïdes secondaires, c’est la « tolérance périphérique ». A. TOLERANCE CENTRALE Le développement thymique des lymphocytes T passe par différentes étapes clefs, le passage à l’étape suivante étant tributaire de la réussite de la précédente. Tout au long de cette maturation, le thymocyte sera identifié par l’expression, temporellement et spatialement ordonnée, de différentes molécules de surface incluant les co-récepteurs CD4 et CD8. Ainsi, c’est au stade « double négatif » (DN), alors qu’il n’exprime aucun de ces deux marqueurs, que le thymocyte va exprimer la machinerie moléculaire nécessaire au réarrangement somatique des segments V, D et J codant pour la chaine β du TCR. Il s’agit notamment des enzymes de recombinaison RAG1 (145) et RAG2 (146, 147). Si un réarrangement fonctionnel a lieu, la chaine β va s’apparier à une pré-chaine α (pTα) pour former un complexe exprimé à la surface : le pré-TCR (148, 149). Pour passer à l’étape suivante, le thymocyte a dès lors besoin d’un signal de survie via son pré-TCR : c’est la sélection β. Cependant, les chaines β, dont la région intracellulaire est réduite, et pTα, en dépit d’une queue intracytoplasmique longue, ne peuvent initier la transduction du signal (150). Le pré-TCR va donc être exprimé à la membrane, associé à des molécules, telles CD3, impliquées dans les évènements de signalisation proximale (150, 151). Les voies de signalisation activées vont conduire à la répression de l’expression des enzymes RAG1 et RAG2 afin d’empêcher l’expression d’un second TCR : c’est l’exclusion allélique. Après une étape d’intense prolifération, les thymocytes acquièrent les co-récepteurs CD4 et CD8, devenant ainsi des cellules double positives (DP). La recombinaison somatiques des segments V, D et J codant pour la chaine α va alors débuter. Si un réarrangement fonctionnel a lieu et si les chaines α et β s’apparient correctement, le récepteur à l’antigène est exprimé. 53 54 Les prochaines étapes de maturation consisteront à s’assurer que ce nouveau TCR correspond bien à un cahier des charges très strict : il doit être capable de reconnaître les molécules de CMH du soi, puisque ce sont elles qui présenteront les antigènes exogènes, sans pour autant présenter une affinité trop forte pour les complexes CMH-peptide du soi. C’est le rôle des sélections positive et négative. 1. Sélection positive Pour permettre au lymphocyte T d’assurer sa fonction, le TCR ainsi généré doit être capable de reconnaître le CMH du soi. Malheureusement, en raison du caractère stochastique du réarrangement somatique, seuls 5% des TCR générés vont être réellement capables d’interagir avec les complexes peptide-CMH du soi. Une sélection des lymphocytes T dits « utiles » est donc indispensable. Cette étape de « sélection positive » s’effectue par défaut. Près de 90% des thymocytes meurent donc par négligence, car ils ne peuvent intégrer les signaux, dépendants de l’engagement du TCR, nécessaires à leur survie. Cette étape a été mise en évidence dès les années 70 : Bevan et al. montraient, à l’aide de chimères, que la spécificité des lymphocytes T d’un animal était restreinte aux molécules de CMH exprimées par ses cellules non hématopoïétiques (152). Peu après, l’équipe de Zinkernagel observait que la transplantation d’un thymus allogénique chez des chimères thymectomisées induit chez les cellules T du receveur une spécificité vis-à-vis des molécules de CMH allogénique (153). Elle montrait ainsi l’importance du thymus, et notamment de l’épithélium thymique, dans ce phénomène. Toutefois, il restait encore à déterminer qui du cortex et de la medulla était responsable de la sélection positive. La présence exclusive des DP (154) et l’expression des molécules de CMH de classe I et II au niveau du cortex apportèrent un début de réponse. La confirmation vint avec l’utilisation de souris transgéniques n’exprimant les molécules de CMH que sur les cellules épithéliales thymiques corticales (cTEC) ou, à l’inverse, uniquement sur les cellules épithéliales thymiques médullaires (mTEC) (155). En effet, chez ces souris, seule une expression dans le cortex permet la sélection positive des lymphocytes T. 2. Sélection négative L’interaction du TCR avec un complexe CMH/peptide du soi, exprimé à la surface des cTEC permet d’induire la survie du thymocyte DP. Cependant, le compartiment lymphocytaire T ainsi sélectionné est fortement enrichi en cellules ayant une forte affinité pour les antigènes du soi et donc dangereuses pour l’organisme. Dans des modèles expérimentaux dans lesquels l’expression des 55 molécules du CMH sont restreintes aux cellules épithéliales du cortex, il a en effet été montré que le répertoire de lymphocytes T qui se développe est en partie autospécifique (155, 156). Ces cellules sont fonctionnelles et potentiellement auto réactives puisque, ex vivo, elles sont capables de répondre à une stimulation délivrée par des CPAs syngéniques. Une étape de sélection, visant à éliminer ses cellules dangereuses, est donc nécessaire : c’est la sélection négative. En 1984, l’existence d’une tolérance restreinte par le CMH a été décelée par Polly Matzinger (157). Ainsi, si les lymphocytes T sont capables de s’activer au contact d’un antigène du non-soi présenté par le CMH du soi ou d’un antigène du soi complexé à un CMH allogénique, leur interaction avec un complexe CMH du soi/peptide du soi reste non immunogène. Depuis, deux mécanismes de sélection ont été décrits. Le premier aboutit à la délétion clonale des précurseurs autoréactifs (158, 159). Une étude quantitative et cinétique du développement des thymocytes a permis de montrer que la moitié à deux tiers des cellules sélectionnées positivement sont ainsi éliminées (160). Le second ne conduit pas à l’élimination physique des thymocytes dangereux, mais à leur inactivation fonctionnelle (161). Grâce à des expériences de chimères hématopoïétiques et à la différence de sensibilité aux radiations des différentes composantes cellulaires du stroma thymique, des auteurs ont suggéré que ces deux mécanismes de sélection soient induits par des populations cellulaires distinctes. La délétion serait essentiellement dirigée par les cellules dendritiques médullaires alors que l’induction d’anergie serait sous la dépendance d’une population radiorésistante : les cellules épithéliales de la medulla (162). Ce dogme a cependant été remis en cause par différentes publications. Il a notamment été montré que l’épithélium médullaire est susceptible d’induire la délétion partielle de thymocytes spécifiques de superantigènes (163) ou d’antigènes tissulaires (164). L’implication des cellules épithéliales thymiques de la medulla a été renforcé avec l’identification de AIRE (Autoimmune regulator) (165), une protéine présentant des similitudes importantes avec des facteurs de transcription, et dont l’expression, restreinte aux tissus lymphoïdes, est particulièrement élevée dans les mTEC. Le groupe de Christophe Benoist et Diane Mathis a ainsi montré que AIRE régule l’expression de 200 à 1200 gènes chez la souris (166). De plus, la greffe chez une souris nude, d’un thymus déplété de ses cellules hématopoïétiques et provenant d’une souris AIRE-/-, entraine, tout comme chez les souris AIRE-/-, le développement d’un syndrome auto-immun polyendocrinien. Chez l’Homme également, sa déficience provoque une pathologie semblable, autosomique récessive monogénique (167), baptisée APECED (« Autoimmune PolyEndocrinopathy Candidiasis Ectodermal Dystrophy »). L’activité de la protéine AIRE permettrait donc, via l’induction ectopique d’antigènes présentant une spécificité tissulaire, de prévenir l’auto-immunité. Un lien direct entre AIRE et la sélection négative a depuis été établi. Des auteurs ont généré des souris sauvages ou AIRE-/-, doubles transgéniques pour les 56 chaînes α et β d’un TCR spécifique d’un peptide dérivé du HEL (Hen Egg Lysozyme) et pour la protéine HEL sous le contrôle du promoteur à l’insuline (168). Dans les souris « sauvages », les thymocytes exprimant le TCR transgénique sont éliminés par des mécanismes de sélection négative nécessitant l’expression d’AIRE par le compartiment thymique non hématopoïétique. Dans les souris déficientes pour le facteur de transcription, des cellules T matures exprimant le TCR transgénique, sortent du thymus. Les mTEC, en présentant à leur surface les antigènes spécifiques d’organes, sous forme de peptides associés aux molécules du CMH, permettraient donc l’élimination des cellules autospécifiques. Il est à noter que AIRE semble ne pas être le seul mécanisme permettant l’expression d’antigènes ectopique (166, 169). En effet, il a été montré que l’expression par les mTEC de Chrna1 était régulé, en plus de l’action d’AIRE, par IRF8 (interferon regulatory factor 8) (170). B. TOLERANCE PERIPHERIQUE Les différentes étapes de sélection que connait un lymphocyte T permettent ainsi d’éliminer les cellules T « inutiles », car incapables de reconnaitre les molécules de CMH du soi, et les cellules dangereuses car présentant une trop forte affinité pour les antigènes du soi. Pourtant, malgré l’activité d’AIRE, tous les antigènes tissulaires ne sont pas exprimés dans le thymus (171), ou sont exprimés à des niveaux insuffisants pour induire la délétion de l’ensemble des cellules autospécifiques. Il en résulte la sortie du thymus de lymphocyte T matures autospécifiques et donc potentiellement autoréactifs (172-174). La présence des cellules chez un individu sain implique que d’autres mécanismes sont mis en place par l’organisme pour les neutraliser en périphérie. Ces mécanismes se subdivisent en deux ensembles : les mécanismes dits « passifs » qui font appel aux caractéristiques intrinsèques des cellules T et les mécanismes « actifs » qui sont assurés par des populations immunitaires régulatrices. 57 58 1. Tolérance passive • L’ignorance Durant la période périnatale, l’ignorance tient une grande importance. En effet, lors des deux semaines suivant la naissance, des lymphocytes T fonctionnels et spécifiques d’antigènes tissulaires peuvent s’accumuler dans la périphérie (175). Leur inaptitude à déclencher une réponse auto-immune est associée à l’incapacité des cellules dendritiques à présenter ces antigènes chez le jeune animal (175, 176). Ce constat permet notamment d’expliquer le délai de 4 à 6 semaines, observé dans le développement du diabète auto-immun chez les souris BDC2.5, en dépit d’un répertoire T enrichi en cellules spécifiques d’antigènes pancréatiques (176, 177). Chez l’adulte, l’ignorance réside principalement dans la séquestration des antigènes pour que les cellules immunitaires ne puissent atteindre certains tissus et dans la prévention de leur présentation. Ainsi, certains sites, présentent un statut immunoprivilégié, tels les yeux, le cerveau ou l’endomètre (178), grâce notamment à un accès limité (barrière hémato-encéphalique). Par ailleurs, les molécules de CMH de classe I sont absentes ou faiblement exprimées à la surface des neurones, des cellules oculaires (179, 180) ou trophoblastiques. Ceci permet une protection de ces cellules vis-à-vis des fonctions cytotoxiques des lymphocytes T CD8 (181), tout en les exposant à la lyse par les cellules NK. L’absence d’activation des lymphocytes T autospécifiques a aussi été associée à une trop faible expression de l’antigène, en dépit de cellules dendritiques pleinement fonctionnelles (182). Enfin, des cellules T autospécifiques demeurent ignorantes car elles expriment un TCR de trop faible affinité pour son ligand (183, 184). Ceci est lié au fait que le seuil d’affinité de l’interaction TCR/CMH/peptide conduisant à la délétion clonale des thymocytes est plus faible que le seuil requis pour l’activation des cellules T en périphérie (185). Toutefois, même si elle aboutit à l’absence de déclenchement des pathologies auto-immunes, l’ignorance ne peut être considérée comme un mécanisme d’induction de tolérance à part entière. En effet, les cellules T autospécifiques, ni éliminées, ni anergisées, demeurent physiquement et fonctionnellement présentes au sein du répertoire T périphérique. • L’anergie Les cellules dendritiques immatures présentes dans les organes lymphoïdes secondaires et les tissus périphériques induisent l’anergie des LT qu’elles rencontrent par l’absence des molécules de co-stimulation CD80 et 86 à leur surface (186, 187). En effet, l’interaction avec CD28 induit l’hétérodimère AP-1 (activator protein 1), qui se complexe avec le facteur de transcription NFAT (nuclear factor of activated T cell), activé par la signalisation calcique soutenue qui suit l’engagement du TCR. Un programme transcriptionnel alternatif est accompli par NFAT en absence 59 d’AP-1, conduisant à l’incapacité du LT d’engager une réponse proliférative, de produire de l’IL-2 ou de se différencier, et à la synthèse d’IL-10 (188). Les cellules dendritiques immatures expriment par ailleurs PD-L1 (program death ligand 1), une molécule de co-stimulation inhibitrice dont le récepteur est exprimé par les LT et LB activés (189). PD-L1 est également présent sur des cellules non lymphoïdes, comme les cellules β des îlots de Langherans, les cellules gliales ou placentaires. L’interaction PD-1/PD-L1 inhiberait la prolifération et la sécrétion de cytokines. Un autre rétrocontrôle négatif est l’induction de CTLA-4 à la surface des LT après stimulation (190). Son affinité supérieure à celle de CD28 pour CD80/86 permet de passer d’une signalisation activatrice à inhibitrice et de limiter l’expansion et l’activité des clones T engagés dans la réponse. • La délétion La manière la plus évidente pour neutraliser les clones autoréactifs, restent leur élimination physique. Un tel mécanisme, déjà utilisé lors de la tolérance centrale au niveau du thymus, a été démontré en périphérie par l’équipe de Heath (182). Ainsi, ils ont développé un modèle expérimental dans lequel des lymphocytes T OT1, exprimant un TCR transgénique spécifique de l’ovalbumine, se développent chez un hôte transgénique exprimant de façon constitutive dans le pancréas et le rein, une forme membranaire de la protéine. Afin d’éviter une délétion au niveau centrale, le thymus de ces souris est remplacé par celui d’une souris syngénique et non transgénique. Dans ce modèle, les cellules T arborant le TCR transgénique sont sélectionnées positivement dans le thymus et émigrent, de façon continue dans la périphérie. Dans les ganglions drainant les reins et le pancréas, elles vont alors interagir avec les cellules dendritiques qui cross-présentent l’autoantigène. Pourtant, malgré leur activation, ces souris ne développent aucune pathologie auto-immune. La raison en est qu’après quelques cycles de prolifération, ces cellules autoréactives entrent en apoptose. La cross-présentation d’antigène tissulaire par les cellules dendritiques peut donc permettre la tolérisation, par induction d’apoptose, des lymphocytes T autospécifiques. L’une des voies principales impliquée dans cette apoptose dépend de l’interaction du récepteur de mort Fas (CD95), exprimé à la surface du lymphocyte, avec son ligand (FasL). L’importance de cette voie est suggérée par l’analyse des animaux déficients pour l’une ou l’autre des molécules. En effet, les souris CD95-/(lpr/lpr) et CD95L-/- (gld) développent une pathologie auto-immune proche du lupus érythémateux (191, 192). De même, un défaut dans la voie Fas est associée chez l’Homme à un syndrome auto-immun lymphoprolifératif (193, 194). 60 • La déviation phénotypique En détournant la réponse immune vers une réponse peu agressive ou inadaptée, la déviation phénotypique permet à certains tissus de se préserver d’une inflammation dangereuse. Ainsi, dans le modèle de l’EAE (« Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale »), représentatif de la sclérose en plaque chez l’Homme, des cellules Th1, spécifiques d’autoantigènes constituant la gaine de myéline (dont MBP, pour « Myelin Basic Protein »), sont responsables de la pathologie. A l’inverse, des lymphocytes de la même spécificité, mais polarisés Th2, sont incapable d’initier la maladie et peuvent même inhiber l’action des cellules Th1. De plus, dans des modèles de souris transgéniques, la présence de cellules T spécifiques d’un peptide dérivé de MBP ne suffit pas à induire une EAE si l’enzyme RAG n’est pas inactivée, et donc si des cellules T endogènes non transgéniques sont générées. Ces résultats suggèrent fortement que le potentiel autodestructeur de lymphocytes T peut être contrôlé par des cellules de spécificité et/ou de polarisation différente. Ainsi, dans un modèle d’EAE, une réponse immune dirigée contre un antigène bactérien peut inhiber les conséquences morbides d’une réponse auto-immune, en induisant la déviation de la polarisation de Th1 vers Th2 (195). Sous l’influence de la réponse antibactérienne, l’environnement cytokinique dans lequel sont activées les cellules T autospécifiques est modifié. Aussi, malgré la pleine activation de ces cellules, leur mauvaise polarisation aboutit à une réponse abortive. Cette déviation de la réponse est couramment utilisée comme mécanisme d’échappement par les cellules tumorales et les agents infectieux qui favorisent une réponse inadaptée à leur élimination (196, 197). Les cytokines présentes dans le milieu, en influençant directement l’expression des molécules d’adhésion et des récepteurs aux chimiokines à la surface des lymphocytes T, peuvent également moduler le trafic des lymphocytes T et ainsi contrôler les cellules accessoires avec lesquelles ils vont interagir. En réponse à une stimulation tolérogène, les cellules T CD4 autospécifiques qui sont activées et prolifèrent, sont en revanche incapables de migrer dans les zones folliculaires des organes lymphoïdes secondaires pour y délivrer une aide efficace aux cellules B (195). L’entrée dans cette zone est en effet dépendante de CXCR5 dont l’expression optimale est associée à l’engagement de CD28 (198). D’autres travaux ont suggéré l’importance, dans la tolérance au soi, d’une distribution anatomique précise des lymphocytes. Ainsi, dans un modèle murin, il a été montré qu’une expression aberrante de CXCL13 (la chimiokine reconnue par CXCR5) par les cellules dendritiques peut aboutir au développement d’un lupus auto-immun (199). 61 2. Tolérance active La tolérance active implique de nombreuses sous-populations de cellules du système immunitaire qui vont, de par leurs propriétés immunosuppressives, inhiber l’activation et/ou les fonctions effectrices des lymphocytes autospécifiques. 1. Les cellules dendritiques tolérogènes S’il est possible de rendre tolérogènes des cellules dendritiques comme nous l’avons vu dans le chapitre sur les nouvelles thérapies en transplantation, certaines sont naturellement capables de concourir à la tolérisation des lymphocytes T. Ainsi, les cellules dendritiques immatures peuvent produire du TGB-β (200), une cytokine immunosuppressive qui inhibe la prolifération des cellules T et qui maintient les cellules dendritiques dans leur état immature. A l’état mature, elles peuvent également participer à la tolérance. Ainsi, le maintien de l’homéostasie des muqueuses passe par l’induction de cellules dendritiques tolérogènes, souvent productrices d’IL-10. La génération de ces cellules peut par exemple être obtenue par l’administration intra-nasale d’un antigène (201). Les cellules dendritiques peuvent également conduire à l’induction de lymphocytes régulateurs. Les cellules dendritiques, caractérisées par l’expression du marqueur CD103, y contribuent par le biais de l’acide rétinoïque (202, 203) tandis qu’il a été montré que les cellules dendritiques plasmacytoïdes matures, à la suite de la stimulation du TLR9 (Toll-Like Receptor) induisent en culture des lymphocytes T régulateurs CD4+ Foxp3+ fonctionnels (Tregs) (204). De façon intéressante, le groupe de Blomberg a observé que lors d’une allogreffe cardiaque, les cellules dendritiques plasmacytoïdes capturent les alloantigènes, migrent vers les nœuds lymphatiques drainants et y génèrent des Tregs (205). Dans les animaux rejetant la greffe, ces cellules sont retrouvées uniquement dans la rate, et l’inhibition de la migration des cellules dendritiques plasmacytoïdes vers les ganglions inhibent la tolérance mise en place par le conditionnement du donneur (DST et anti-CD40). Le fait que ces cellules dendritiques tolérogènes ne soient retrouvées que dans la rate reste inexpliqué : s’agit-il d’un sous-type cellulaire ou les nœuds lymphatiques constituent-ils un environnement conditionneur ? Une population proche des cellules dendritiques plasmacytoïdes, caractérisée par l’expression de CD19, présente la capacité de produire, suite à la stimulation avec TLR9 (206) ou à l’interaction avec CTLA-4 porté par les Tregs (207), l’IDO. Ceci conduit à l’arrêt de la prolifération des lymphocytes T, voire leur mort. 62 2. Les lymphocytes NKT Les cellules NKT constituent une population distincte des lymphocytes T et ont été définie sur l’expression de récepteurs habituellement exprimés par les cellules NK. Ces cellules se divisent en trois groupes, le plus représenté étant celui de iNKT (invariant NKT), qui arborent un répertoire très restreint, la majorité exprimant le TCR Vα14Jα18 pour la souris et Vα24/Jα18 pour l’Homme. Ce TCR est spécifique des glycolipides présentés par la molécule de CMH non classique, CD1d. Les deux autres groupes minoritaires comprennent les NKT de type II, qui sont restreintes à CD1d mais montrent un panel de TCR plus varié, et les NKT de type III qui ne sont pas restreintes à CD1d. Bien que leur contribution à l’auto-immunité et à l’inflammation soit fermement établie, plusieurs études ont montré qu’elles pouvaient participer à la régulation de la réponse. La souris NOD (Non Obese Diabetic) présente en effet un défaut en cellules iNKT. Le transfert adoptif de ces cellules (208), ou l’expression forcée de Vα14/Jα18 (209), ont un effet bénéfique sur le diabète. Chez l’Homme, une corrélation a été établie entre une diminution des iNKT dans le sang périphérique et l’auto-immunité (210). De plus, un biais Th2 a été observé dans les cytokines produites par des iNKT isolées du sang de patients en rémission de leur sclérose en plaques par comparaison aux patients en rechute ou aux sujets sains (211). L’effet protecteur des cellules NKT passe par la production d’IL-10 et d’IL-4 et pourrait en outre participer à l’homéostasie et à la génération périphérique des Tregs (212). 3. Les lymphocytes T CD8 L’existence de LT CD8+ suppresseurs (Ts) fut longtemps controversée. Malgré l’observation en 1978 par Cantor et al. de l’existence de cellules induites par contact avec des lymphocytes T CD4+, par le biais de la molécule de CMH de classe I non classique Qa-1 218 (213), il fallut attendre l’identification des Tregs pour que les investigations sur les Ts reprennent. La découverte que des souris invalidées pour le gène de CD8 présentaient une tendance significative à développer une pathologie chronique dans le modèle de l’EAE par le groupe de Mak fut la première à relancer l’intérêt pour ces cellules, jusque là oubliées (214). Par la suite, il a été montré dans un modèle murin d’EAE, que les LT CD8+ CD28-, contrairement à leur contrepartie CD28+, inhibent, sans préstimulation, l’activation et l’expansion clonale de lymphocytes T CD4 Th1 encephalitogènes. De plus, leur transfert protègent de l’induction de l’EAE (215). Ménager-Marcq et al. ont obtenu des résultats similaires dans le modèle de la colite avec des cellules CD8+CD28- naturelles (216). Les mécanismes d’action de ces cellules sont multiples puisqu’elles sont efficaces in vitro en absence de CPAs, ce qui implique un contact direct, et que leur fonction in vivo dépend de leur aptitude à sécréter des cytokines anti-inflammatoires, IL-10 et TGF-β. Chez l’Homme, un défaut spécifique d’activité régulatrice des LT CD8+ a été mis à jour chez les patients 63 souffrant de maladies inflammatoires chroniques des intestins (217), suggérant ainsi l’implication des Ts dans l’homéostasie intestinale. D’autres sous-populations de Ts ont depuis été caractérisées. Ainsi, les cellules T CD8αα+ représentent la moitié des lymphocytes T intraépithéliaux chez la souris (218). Ces cellules présentent un développement particulier qui, s’il commence bien au niveau du thymus comme les autres populations T, se termine en dehors, probablement au niveau intestinal. Leur fonction régulatrice a été rapportée dans le contrôle des infections et de l’inflammation de l’intestin par la reconnaissance, via le TCR ou les récepteurs NK co-exprimés à leur surface, de molécules du soi modifiées ou inductibles par le stress ou l’inflammation. De plus, une étude réalisée dans le modèle expérimental de la colite chez des souris immunodéficientes, montre que ces cellules protègent les souris contre le développement de la colite. Cependant, pour se faire, les auteurs utilisent des ratios de cellules transférées très nettement en faveur des cellules régulatrices ce qui laisse à penser que la véritable population régulatrice n’a toujours pas été identifiée parmi les lymphocytes T CD8αα+. À l’inverse des modèles murins, chez l’Homme, seuls des LT CD8αα+ γδ ont pu être mis en évidence au sein de l’épithélium intestinal (219). En revanche, des lymphocytes T CD8αβ+ exprimant des récepteurs NK ont été retrouvés et semblent jouer un rôle identique aux cellules CD8αα+. Dans certaines conditions, ils acquièrent des capacités lytiques pour éliminer des cellules épithéliales exprimant des stimuli de stress, ce qui participerait à la limitation du développement de cellules tumorales. Chez la souris, une nouvelle sous-population régulatrice, les lymphocytes T CD8+ CD122+, a été récemment identifiée. Ces cellules possèdent des propriétés suppressives en culture et leur absence in vivo entraîne un désordre hyperprolifératif (220). Enfin, une dernière population de Ts naturelles a été décrite chez le Rat et chez l’Homme, et est caractérisée par une faible expression de CD45RC et une fonction suppressive passant par le contact (221). Ces cellules ont démontré leurs capacités régulatrices dans le cadre de l’alloréactivité. 4. Les lymphocytes Tr1 Les lymphocytes Tr1 sont caractérisés par leur capacité à sécréter de grandes quantités d’IL-10. Générés en présence de cette même cytokine, ils ne possèdent aucun marqueur de surface propre. Leur identification se fait donc grâce à leur profil cytokinique particulier, à savoir la production d’IL-10 et de TGF-β mais pas d’IL-4, à l’absence d’expression constitutive de Foxp3, bien qu’elle puisse être induite après stimulation comme chez les lymphocytes T CD4+CD25- humains (222), et à la présence sélective de ROG (repressor of GATA-3), par ailleurs retrouvé chez les LT 64 CD4+ activés (223). Il a également été mis en évidence des LT CD8+ Tr1 aux propriétés similaires à la population CD4+. Les Tr1 peuvent être induits in vitro et in vivo à partir de LT naïfs ; mais parce qu’ils peuvent parfois produire de l’IFN-γ ou de l’IL-5, il a été proposé que les Tr1 puissent également dériver de LT Th1 ou Th2 par stimulation chronique (224). La génération en culture des Tr1 nécessite une stimulation antigénique et de l’IL-10, toutefois ces deux signaux ne semblent pas suffisants pour obtenir une différenciation complète (225). L’apport d’IFN-α (225) ou l’engagement de CD2 (222), CD46 (226) ou CD45RO/RB (227) amplifieraient considérablement la conversion. In vivo, ces cellules peuvent être générées chez des sujets sains par le biais d’une injection de cellules dendritiques immatures chargées d’un peptide du virus influenza (228). Les cellules dendritiques plasmacytoïdes ont aussi l’aptitude de polariser des cellules T CD4+ et CD8+ en Tr1 (229, 230). Cependant, les CPAs les plus efficaces dans la génération de Tr1 restent les cellules dendritiques myeloïdes tolérogènes, elles-mêmes induites en présence d’IL-10 (231), de TGF-β (232), de TNFα (233), du peptide immunosupresseur VIP (234), de vitamine D3 et/ou dexaméthasone (114). Les lymphocytes Tr1 présentent ainsi des capacités suppressives dont le rôle dans le contrôle de l’inflammation et de l’auto-immunité a été décrit in vivo. Ainsi, des Tr1 ont été isolés du liquide synovial de patients atteints d’arthrite rhumatoïde, leur fréquence basse étant inversement corrélée à celle des cellules Th1 (235). Les Tr1 sont par ailleurs capables d’inhiber le développement de la colite induite par le transfert de LT CD4+CD45RBhi (236). En outre, des clones de Tr1 spécifiques de la gliadine, l’élément immunogénique du gluten, ont été isolés de la muqueuse intestinale de patients cœliaques en rémission (237). Les Tr1 semblent de surcroît revêtir une importance particulière dans l’allergie : il a été mis en évidence qu’ils représentent la sous-population dominante parmi les cellules spécifiques pour les allergènes environnementaux les plus communs chez les individus sains (238). Le groupe de Hawrylowicz a de plus montré que l’effet bénéfique des glucocorticoïdes dans l’asthme était partiellement dû à la conversion de Tr1, et que l’administration de vitamine D3 restaurait cette génération chez des patients résistants aux stéroïdes (239). Enfin, les capacités régulatrices de Tr1, ainsi que leur facilité de génération, a conduit au développement de thérapies. Dans le domaine de la transplantation, leur utilisation a paru tout indiqué en raison de nombreuses données corrélant la tolérance du greffon avec la présence de cellules productrices d’IL-10 (223). Un premier essai clinique de transfert de Tr1 est mené en Italie par Maria Grazia Roncarolo dans le cadre de la prévention de la maladie du greffon contre l’hôte (240). Une génération in vivo par une combinaison de rapamycine et d’IL-10 serait également possible chez la souris et permettrait d’établir une tolérance à long terme à une allogreffe d’îlots pancréatiques (241). 65 Les cellules immunitaires, présentant des propriétés régulatrices et chargées d’assurer en périphérie la tolérance, sont nombreuses et diverses. Régulièrement, de nouvelles populations sont découvertes. Pour autant, la plus décrite à l’heure actuelle reste sans conteste les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ Foxp3+. 66 LES LYMPHOCYTES T REGULATEURS CD4+CD25+Foxp3+ (TREGS) A. MISE EN EVIDENCE ET CARACTERISATION DES TREGS 1. Mise en évidence des Tregs En 1969, alors qu’ils tentent de statuer sur le rôle du thymus dans le système immunitaire, Nishizuka et Sakahura réalisent des thymectomies néonatales de souriceaux (242, 243). Ils se rendent alors compte que chez des femelles dont l’ablation a été réalisée 3 jours après la naissance, les ovaires s’atrophient puis dégénèrent dans les mois qui suivent l’opération. Dans ce modèle, l’analyse histologique montre clairement que les signes cliniques observés ne sont pas imputables à un simple défaut hormonal, comme cela avait été suggéré dans des travaux antérieurs. Contrairement à ce qui est observé chez des animaux ayant subi une ablation de l'hypophyse, les ovaires ne présentent pas simplement un blocage ou un retard dans leur développement. Ils subissent une attaque, une agression qui aboutit à la destruction des follicules. Un phénotype analogue est observé quatre ans plus tard chez des rats Wistars thymectomisés à l’âge adulte et irradiés souslétalement à plusieurs reprises (244). Dans les semaines suivant le conditionnement, une destruction de la thyroïde consécutive à une infiltration de cellules mononuclées est observée. Dans les deux cas, la greffe d’un thymus syngénique ou le transfert de lymphocytes T, en particulier de cellules CD4+, permet de protéger les animaux de ces pathologies (245, 246). Ces résultats suggèrent pour la première fois, l’existence d’une sous-population de cellules T suppressives qui aurait pour rôle de contrôler en périphérie le compartiment lymphocytaire T autospécifique. Pendant de longues années, de nombreuses équipes ont essayé dans différents modèles de mieux caractériser, phénotyper et isoler cette sous-population lymphocytaire suppressive. Elles ont rencontré de nombreuses difficultés ainsi qu’un scepticisme d’une partie de la communauté scientifique allant jusqu’à remettre en cause l’existence même d’une telle sous-population de cellules ayant des propriétés régulatrices, du fait du manque de marqueurs réellement spécifiques et du flou autour de leurs mécanismes d’action. 67 68 2. Les premiers marqueurs Depuis les expériences de 1969, aucune avancée majeure n’est faite au sujet des Tregs. A tel point que certains commencent à douter de l’existence d’une population régulatrice. Ce n’est qu’en 1981 que Sakaguchi et al. ont amené de nouvelles évidences dans la caractérisation de cette population lymphocytaire suppressive. Toujours en utilisant le modèle murin de thymectomie néonatale, ils ont montré que le transfert de splénocytes pouvait prévenir le développement d’une ovarite auto-immune chez la souris en montrant que la population cellulaire responsable de la protection pouvait être restreinte par le phénotype suivant : T CD4+ CD5high (ou Lyt-1high) (246). CD5 est une glycoprotéine transmembranaire, exprimée fortement par les lymphocytes T activés, qui antagonise la signalisation en aval du récepteur à l’antigène chez les cellules T et B. De façon intéressante, cette molécule permet aussi de définir une sous-population de lymphocytes B, appelée cellules B1, jouant un rôle « immunomodulateur » (247). Pour tester l’hypothétique fonction suppressive des différentes souspopulations de cellules T CD4+, la stratégie gagnante fut dès lors d’essayer de créer une brèche dans la tolérance en déplétant les sous-populations soupçonnées d’être régulatrices puis de vérifier que la reconstitution du compartiment éliminé permettait d’inhiber l’apparition et le développement d’un syndrome auto-immun. En utilisant cette démarche, l’équipe de Shimon Sakaguchi a confirmé en 1985 les résultats obtenus 3 ans plus tôt (248). Ces auteurs ont montré que l’élimination ex vivo des cellules T CD4+CD5+ permet l’induction, par la population CD4+CD5- résiduelle, d’une pathologie auto-immune multi-organes après transfert dans des souris nude congéniques. L’injection de cellules T CD4+CD5high suffit à prévenir le développement de la pathologie. Suivant cette logique, l’effort de recherche s’est concentré sur la capacité à pouvoir mieux disséquer cette population régulatrice du compartiment effecteur autologue, de nombreux marqueurs ont donc été proposés afin de mieux l’identifier. CD45RB (protéine tyrosine phosphatase exprimée par la quasi-totalité des cellules d’origines hématopoïétiques) a été proposé par Powrie et al. en 1990. Ils ont montré que l’injection de la sous-population T CD4+CD45RBhigh à des rats congéniques athymiques induit une pathologie sévère s’accompagnant d’une perte de poids et d’une infiltration massive de cellules dans de nombreux organes. A l’inverse, le transfert adoptif de la fraction cellulaire T CD4+ CD45RBlow n’est pas pathogéne, les animaux continuant à gagner du poids normalement. De façon encore plus surprenante, le transfert de lymphocytes T CD4+ totaux n’est associé qu’à une morbidité mineure (249, 250). Même quantitativement minoritaire, la population T CD4+ CD45RBlow est donc capable de contrôler la population effectrice T CD4+ CD45RBhigh. En 1993, Powrie et al. et Morrissey et al. ont montré simultanément que le transfert de lymphocytes T CD4+ CD45RBhigh à des souris SCID (severe combined immunodeficiency) induit le développement d’une pathologie inflammatoire et autoimmune au niveau des muqueuses intestinales, l’IBD (Inflammatory Bowel Disease). L’injection de la fraction autologue T CD4+ CD45RBlow ou bien la co-injection des fractions T CD4+ CD45RBhigh et T CD4+ CD45RBlow n’induit pas l’IBD (251, 252). 69 L’inconvénient principal de ces marqueurs est qu’ils englobent encore des populations cellulaires trop importantes pour permettre vraiment de distinguer précisément les populations T régulatrice et effectrices. Les lymphocytes T CD4+ CD45RBlow représentent en effet entre 25 et 30% des lymphocytes T CD4+ totaux chez une souris naïve (253). C’est en 1995 que Sakaguchi et son équipe identifient une population douée de propriétés immunoregulatrices, caractérisée par l’expression constitutive de CD25. Un grand pas est alors franchi puisque ce marqueur permet réellement de différencier, au moins fonctionnellement, la population de lymphocytes T CD4+ régulateurs des autres populations T. En effet, le compartiment T CD4+ CD25+ régulateur (Tregs) qui constitue entre 5 et 10% des lymphocytes T CD4+ totaux chez une souris naïve ainsi que chez l’homme constitue une population cellulaire prévenant le développement de pathologies auto-immunes dans des modèles de transferts adoptifs comme ceux décrits précédemment (254). De plus, l’élimination des cellules CD4+ CD25+ permet d’exacerber des réponses allogéniques ou xenogéniques. Ce travail a conforté des résultats publiés en 1990 qui suggéraient l’existence d’une population « suppressive » au sein du compartiment CD4+ CD25+ dans un modèle d’allogreffe cardiaque chez le rat (255). Ces auteurs avaient en effet mis en évidence, qu’après traitement des animaux receveurs avec de la cyclosporine, le système immunitaire des rats qui toléraient à long terme l’organe allogénique contenait une population CD4+ CD25+ incapable de rejeter le greffon après transfert dans un hôte lymphopénique. Mieux, ces cellules avaient la capacité d’inhiber le rejet induit par des lymphocytes T effecteurs naïfs, ou présensibilisés par des alloantigènes. La caractérisation de ces cellules régulatrices a aussi permis d’expliquer les mécanismes sous-jacents dans le modèle de thymectomie néonatale. Une étude cinétique a en effet mis en évidence que la population CD4+ CD25+ n’apparaît dans les organes lymphoïdes périphériques que 4 à 5 jours après la naissance (256). Dans ce travail, les auteurs ont également montré que la reconstitution de ce compartiment suppresseur permet de prévenir la pathologie. Ainsi, la thymectomie à J+3 a pu être étroitement associée à l’absence de génération des lymphocytes T CD4+CD25+ et l’absence de développement de ces cellules régulatrices à l’apparition d’auto-immunité. Toutefois, le marqueur CD25, étant exprimé par les lymphocytes T activés, n’est, tout comme les précédents, pas spécifique du compartiment régulateur. La quête pour un marqueur unique a donc continué et a permis de mettre en évidence l’expression d’autres marqueurs, tels CTLA-4 (257, 258) et GITR (GlucocorticoidInduced Tumor necrosis factor Receptor family-related gene) (259). Cependant, ces derniers sont eux-aussi exprimés par les lymphocytes T conventionnels après activation. 70 3. La découverte de Foxp3 En 1982, une étude de cas clinique portant sur un patient dont dix-sept enfants de sexe masculin dans la famille sont morts durant la première année de vie, permet de mettre en évidence un syndrome jusque là inconnu. Les analyses et les informations recueillies auprès de huit patients ont permis de décrire un nouveau syndrome, l’IPEX (Immune dysregulation polyendocrinopathy enteropathy-X-linked syndrom), dépendant d’une mutation récessive située sur le chromosome X. Un tableau clinique complet a été dressé. Il associe des diarrhées, un diabète de type 1, une anémie hémolytique, des poussées d’eczéma, une réponse antivirale exagérées, le tout combiné avec des évidences de manifestations auto-immunes conduisant à la destruction des glandes endocrines, comme la thyroïde. L’évaluation fonctionnelle du système immunitaire chez ces patients a révélé des anomalies dans le fonctionnement du compartiment T (260). De plus, chez ces patients, le niveau des IgE circulantes peut-être très élevé et associé à une augmentation des éosinophiles, évidences indiquant une déviation du répertoire T CD4+ vers un lignage Th2 (261). Il faudra attendre 2001 pour qu’une mutation dans le gène codant pour le facteur de transcription Foxp3 soit identifiée comme cause du développement de l’IPEX (262, 263). En parallèle de ces données obtenues chez l’homme, un modèle de souris Scurfy présentant des mutations perte de fonctions situées sur le chromosome X dans le gène codant pour le facteur de transcription Foxp3 et développant un syndrome auto-immun lymphoprolifératif apparenté à l’IPEX sur le plan clinique a permis de mieux comprendre l’importance de Foxp3 pour le système immunitaire. Les souris scurfy mâles meurent aux environs de trois à quatre semaines de vie suite à l’apparition de pathologies auto-immunes multi-organes avec présence de forts infiltrats lymphocytaires (263-266). Cependant, ce n’est qu’en 2003 que le lien entre le défaut génétique et le comportement anormal du répertoire T a été établi. Trois groupes ont alors montré simultanément que Foxp3 était spécifiquement exprimé par les Tregs (267-269). De plus, en utilisant un modèle de KO conditionnel, l’équipe de Rudensky a établi que l’expression de ce facteur de transcription par les cellules régulatrices est indispensable à leur développement intrathymique (269, 270). En accord avec ce travail, un nombre accru de cellules T CD4+ CD25+ a été mis en évidence chez des souris surexprimant Foxp3 (267). Ces résultats suggèrent donc que chez les patients atteints d’IPEX, comme chez les souris Scurfy, le phénotype observé n’est pas associé à une défaillance intrinsèque aux cellules effectrices mais plutôt à un défaut de génération du compartiment régulateur. Confirmant cette hypothèse, le transfert néonatal de cellules T CD4+ CD25+ dans les souris Scurfy prévient l’apparition et le développement du syndrome auto-immun. Des travaux récents du groupe de Roncarolo ont permis de préciser un peu l’impact de cette mutation pour la population de Tregs chez des patients IPEX (271, 272). Ainsi l’analyse du sang périphérique chez les patients IPEX a mis en évidence que le nombre de cellules T CD4+ CD25high en périphérie est identique à celui obtenu à partir de prélèvements de donneurs sains. Des tests fonctionnels in vitro montrent que les lymphocytes T CD4+ CD25high de ces patients IPEX (Foxp3- ou Foxp3+) ont 71 une altération importante de leur potentiel suppresseur sur des effecteurs T autologues. Il en est de même chez les souris Scurfy où les rares cellules CD4+ CD25+ retrouvées en périphérie sont incapables, in vitro, d’inhiber la prolifération de cellules CD4+ suite à une stimulation polyclonale (267). De plus, des cellules CD4+ naïves, chez lesquelles l’expression constitutive de Foxp3 a été induite par infection rétrovirale, sont susceptibles, in vitro d’inhiber la prolifération de cellules effectrices et, in vivo, d’inhiber la colite ou la gastrite auto-immune induite chez des souris SCID par injection de cellules T CD45RBhigh (269, 273). Récemment, le groupe de Rudensky a généré, par Knock-In, une souris transgénique exprimant une protéine de fusion GFP-Foxp3 (270). Outre la possibilité d’identifier et de suivre facilement le développement des cellules Foxp3+, cette approche a également permis de montrer qu’il n’y a pas de corrélation stricte entre son expression et celle de CD25. En réalité, seuls 80% des cellules Foxp3+ sont CD25+. Ainsi l’induction d’un syndrome auto-immun mineur suite à la déplétion des cellules T CD25+ chez des animaux non manipulés peut sans doute s’expliquer par la capacité des lymphocytes T Foxp3+ CD25- et/ou Foxp3+ CD8- à compenser le déficit. A l’inverse, Lahl et al. ont montré de manière élégante en 2007, que la déplétion des Tregs in vivo dans une souris nouveau-née est suffisante pour conduire au développement de symptômes équivalents à ceux observés chez une souris Scurfy (splénomégalie, lymphoadénopathie, diabète de type 1 et une sévère inflammation cutanée) (274). Pour cela, ils ont généré une souche de souris DEREG (Depletion of regulatory T cell) exprimant un récepteur à la toxine diphtérique (DTR) couplé à la GFP (Green Fluorescent Protein), le tout sous le contrôle du locus génique de Foxp3. Cela permet de visualiser de manière précise à la fois la présence de Tregs par un double marquage en cytométrie en flux (Foxp3/GFP) ainsi que leur déplétion après injection aux animaux, de toxine diphtérique (absence de cellules Foxp3+ GFP+). Le facteur de transcription Foxp3 est donc le marqueur qui a permis d’identifier de manière précise les Tregs et reste aujourd’hui, un des marqueurs les plus fiables, même si chez l’Homme, son expression peut être induite chez des lymphocytes T activés. Cependant, au vu du très large potentiel que ces cellules pourraient avoir en clinique humaine, il est important de pouvoir trouver d’autres marqueurs de surface afin de pouvoir les isoler sans avoir une population effectrice contaminante trop importante au sein de la fraction cellulaire triée. La recherche « du » marqueur se poursuit donc. 4. Les nouveaux marqueurs En 2006, deux groupes ont parallèlement mis en évidence que les Tregs CD4+ CD25+ Foxp3+ n’exprimaient que faiblement CD127, la chaîne α du récepteur à l’IL7, alors que les lymphocytes T effecteurs activés (CD25+) ou non activés (CD25-) étaient CD127high (275, 276). Des analyses moléculaires par CHiP (puces à ADN) suggèrent que le promoteur du gène codant pour CD127 est une cible pour le facteur de transcription Foxp3. De plus la surexpression de Foxp3 dans une souris 72 transgénique conduit à une population de cellules exprimant de manière homogène CD127low et possédant des propriétés suppressives (275). Les cellules T effectrices/mémoires et naïves CD4+ CD25+ CD127low présentent toutes deux des propriétés suppressives lors de tests fonctionnels in vitro au contraire des cellules T CD4+ CD25+ CD127high qui ne possèdent aucune activité suppressive. CD127 semble donc au final un très bon marqueur de surface permettant d’identifier et d’isoler en combinaison avec CD25 des populations pures de Tregs chez des individus sains ou bien chez des patients atteints de diabète de type 1 (275) pour des études in vitro ou pour d’éventuelles stratégies de thérapies cellulaires. Enfin, en 2007, le groupe de Sakaguchi a identifié chez la souris un nouveau marqueur de surface FR4 (Folate Receptor 4), un sous-type de récepteur à l’acide folique, exprimé fortement et constitutivement sur les Tregs CD4+ CD25+ CD127low Foxp3+. Ce marqueur permet aussi de distinguer entre Tregs (CD4+ CD25+ FR4high) et T conventionnels activés (CD4+ CD25+ FR4low). L’élimination in vivo chez la souris des lymphocytes T CD4+ FR4high avec des anticorps déplétants conduit, suivant la dose administrée soit, à forte dose, au développement de pathologies auto-immunes soit, à faible dose et si la souris porte une tumeur, à une régression de la masse tumorale. De plus, la surexpression rétrovirale de Foxp3 dans des lymphocytes T CD4+ conduit à un phénotype FR4high suggérant ainsi que Foxp3 contrôle le niveau d’expression de FR4 (277). B. ORIGINE, DEVELOPPEMENT ET HOMEOSTASIE DES TREGS 1. Origine thymique L’origine thymique des lymphocytes T CD4+ CD25+ fut soupçonnée dès les expériences de thymectomie néonatale (243). La découverte de cellules CD4+ CD8CD25+ dans le thymus, présentant les mêmes caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles que leur contrepartie périphérique (278), confirma les premières hypothèses, suggérant même que la population CD4- CD8- formait un précurseur commun aux cellules conventionnelles et régulatrices. Il fut démontré par la suite que les thymocytes régulateurs exprimaient en outre Foxp3 (268). 2. Développement des Tregs Le thymus contribue donc à l’induction de tolérance du soi en inactivant ou en éliminant les cellules autospécifiques du compartiment T effecteur et en générant, naturellement, les cellules T régulatrices. Pourtant, cette origine thymique des Tregs soulève la question de leur développement. Comment un même organe parvient-il à assurer la génération et la sélection de deux populations de lymphocytes T aux 73 fonctions totalement opposées ? Existe-t-il des signaux spécifiques, non conventionnels, qui dirigent le comportement de la cellule en cours de maturation ? 5. Les Tregs subissent la sélection thymique La nécessité d’une interaction entre le TCR exprimé à la surface des Tregs et les complexes CMH/peptide a été mise en évidence à de multiples reprises. En 2001, Bensinger a montré que l’expression des molécules du CMH de classe II uniquement par les cTEC est nécessaire et suffisante au développement de cellules T régulatrices pleinement fonctionnelles (279). Par ailleurs, la mesure en absence de délétion clonale de la proportion de cellules spécifiques pour les superantigènes endogènes exprimés par l’épithélium thymique, fait apparaitre que la sélection positive des Tregs est augmentée (280). En outre, quand un seul couple CHM II/peptide est exprimé uniquement dans le cortex, les Tregs spécifics pour le ligand sont préférentiellement sélectionnés parmi le large répertoire des précurseurs immatures (281). Comme sa contrepartie CD25-, le compartiment CD25+ est donc sélectionné positivement et cette sélection vis-à-vis d’autoantigènes serait accrue par rapport aux cellules conventionnelles. Après leur sélection positive au niveau du cortex, les Tregs semblent subir également une sélection négative efficace. Ainsi, Paola Romagnoli a analysé et comparé le répertoire Vβ chez des thymocytes CD25+ et CD25- isolés à partir d’animaux exprimant ou non Mtv 1, 6, 7, 8, 11, 13, 14 et 17. Elle a ainsi pu montrer que le compartiment régulateur présente la même sensibilité à la délétion médiée par des superantigènes endogènes à surface des cellules dendritiques (279, 282, 283). L’implication des mTEC dans le développement des Tregs reste plus incertaine. Anderson et al. ont démenti l’hypothèse que l’expression d’AIRE fût la source d’une sélection positive des Tregs, son absence ne modifiant pas leur développement ni leur fonctionnalité (284). Toutefois, l’équipe de Aschenbrenner a montré qu’une absence de molécules du CMH II à la surface des mTECs induit une réduction de Tregs polyclonaux. De plus, l’expression de l’antigène HA uniquement à la surface des mTECs AIRE+, mimant ainsi l’expression ectopique d’antigènes par AIRE, conduit à la génération importante de Tregs spécifiques (285). 6. Le choix de lignage Au cours des différentes études cherchant à découvrir l’origine des cellules régulatrices, deux modèles se sont peu à peu imposés et s’opposent aujourd’hui : les modèles « instructif » et « sélectif ». Le point de départ des deux repose sur l’interprétation de différents travaux portant sur les interactions de forte affinité du TCR des cellules régulatrices avec un complexe CMH/ligand agoniste. 74 Ainsi, en 1999, l’équipe de Sakaguchi a montré, dans des souris DO11.10 dont le TCR transgénique est spécifique de l’ovalbumine, qu’en l’absence d’expression du ligand du TCR par le stroma thymique, environ 3% des cellules T CD4+ qui se développent sont CD25+ (278). Contrairement aux cellules CD25-, ces cellules expriment en majorité une chaine TCRα endogène. De plus, lorsque des souris DO11.10 sont générées sur fond génétique RAG2-/-, un développement normal du compartiment effecteur est observé alors qu’aucune cellule CD4 simple positive (SP) CD25+ mature n’est produite. En l’absence d’expression du ligand agoniste dans le thymus, des lymphocytes T régulateurs exprimant le TCR transgénique ne peuvent donc pas se différencier. En 2001, cette hypothèse était confirmée par Jordan et al. Ces auteurs montraient que, contrairement à la sélection thymique des autres types de cellules T αβ, le développement des lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+, requiert des interactions agonistes de haute avidité avec des complexes CMH/peptide du soi exprimés par les cellules épithéliales (286). Des approches complémentaires sont venues enrichir l’argumentation en faveur de la nécessité d’un signal antigènique fort (287-289). Le renforcement de la signalisation en aval du TCR par l’inhibition de la phosphatase SHP-1 (Src homology region 2 domain-containing phosphatase 1) permet de doubler la taille du compartiment régulateur (290), tandis que l’interruption de la voie aboutissant à l’activation de NF-κB limite dramatiquement le développement des Tregs (291). Il a donc été proposé que l’engagement des précurseurs T vers le lignage régulateurs se fasse lorsque l’intensité d’interaction TCR/ligand dépasse un certain seuil d’avidité. Les travaux de l’équipe de Diane Mathis ont amené à reconsidérer l’interprétation de ces résultats. Ils ont analysé le développement intrathymique des compartiments effecteurs et régulateurs dans une souris exprimant un TCR transgénique (292). Dans ce modèle, l’expression du ligand du récepteur à l’antigène peut être modulée, de façon dépendante de la dose, par ajout de tétracycline dans l’eau de boisson des animaux. Ils ont ainsi pu mettre en évidence que l’augmentation de l’expression du ligand permet un enrichissement du compartiment CD4 en cellules CD25+ exprimant le TCR transgénique dans le thymus et les organes lymphoïdes secondaires. Surtout, ils ont observé que cet enrichissement, s’il est lié à une baisse significative du nombre de thymocytes CD25-, n’est pas associé à une augmentation du nombre absolu de thymocytes CD25+. Lorsque l’avidité d’interaction augmente, les cellules CD25- ne sont donc pas converties en cellules CD25+ mais elles sont éliminées. Ainsi, dans ce modèle, comme dans celui de Jordan, l’augmentation de la proportion de Tregs parmi les thymocytes dans le cadre d’interactions de haute avidité est le fait d’une résistance à la délétion. Toutefois, les résultats obtenus par notre équipe dans un modèle de superantigènes, permettant de s’affranchir des limites des TCR transgéniques, s’avèrent incompatibles avec un modèle d’instruction. 75 7. Le rôle des molécules de co-stimulation En plus d’une interaction TCR/ligand forte, il semble que le développement des Tregs soit dépendant des molécules de co-stimulation exprimée à la surface des cellules de l’environnement thymique. En effet, les souris invalidées pour CD28 ne présentent qu’une population très réduite de Tregs dans le thymus et la périphérie (293, 294). Le groupe de Singer a identifié le domaine de liaison de Lck comme la clef de la fonction de CD28 dans la différenciation qui permet aux thymocytes DP de devenir des lymphocytes T CD4+ Foxp3+ (295). De plus, il a été très récemment montré que l’expression de CD40 par les cellules épithéliales thymiques et les cellules dendritiques influencerait quantitativement la génération des Tregs (296). 3. Homéostasie des Tregs Une fois en périphérie, les Tregs migrent, via la circulation sanguine, dans les organes lymphoïdes secondaires. A l’équilibre, il a été montré que la taille du compartiment régulateur est stable. Un tel constat pourrait s’expliquer par l’état d’anergie qui caractérise les Tregs. Pourtant, il en est rien. En effet, l’équipe de Salomon a montré que ce même compartiment se divise en deux sous-populations (297). La première, qui exprime de hauts niveaux de CD62L, est dans un état quiescent. La deuxième correspond à des cellules en cycle qui ont diminué l’expression de CD62L et augmenté celle de marqueur de surface, tels CD69 ou CD44, caractéristiques de lymphocytes activés. Une étude plus approfondie a permis à cette équipe de suggérer que ces cellules correspondent à la fraction autospécifique du compartiment T régulateur. Cette prolifération des Tregs n’est possible qu’en présence d’IL-2 exocrine sécrétée par les populations T effectrices. L’IL-2 est une cytokine produite rapidement après activation des cellules T au niveau des ganglions lymphatiques drainant le site de l’infection ou de l’inflammation. En induisant la prolifération des Tregs dès l’initiation de la réponse immunitaire, l’IL-2 favorise la mise en place d’une réponse suppressive effective dans les plus brefs délais, ayant pour but de contrôler la réponse effectrice et d’éviter l’apparition de lésions immunopathologiques. Il a récemment été montré in vivo que lors de l’immunisation d’une souris par un antigène donné il y a expansion des Tregs (FR4high Foxp3+) de façon antigène spécifique (277). L’expression importante de CD25 donne un avantage prolifératif aux Tregs par rapport aux lymphocytes T effecteurs. Une approche utilisant des souris Foxp3-GFP possédant une déficience soit en IL-2, soit en CD25 (IL-2Rα-/-) a permis de montrer que l’IL-2 n’est pas impliquée à proprement dit dans le développement intra-thymique des Tregs (298). mais que cette cytokine est cruciale in vivo pour le maintien et l’homéostasie périphérique des Tregs. Une étude complémentaire réalisée chez l’homme a montré que l’IL-2 régule positivement et spécifiquement dans les Tregs l’expression de Foxp3 et que cette régulation implique la liaison des protéines STAT3 et STAT5 sur le premier intron du gène codant pour Foxp3 (299). 76 L’homéostasie des Tregs n’est pas uniquement dépendante de l’IL-2. D’autres cytokines participent à la modulation du compartiment régulateur. C’est le cas de l’ l’IFN-γ dont l’action sur la réponse immunitaire semble dépendre du contexte. L’IFN-γ a en effet des fonctions paradoxales, en favorisant d’une part le développement d’une réponse pro-inflammatoire de type Th1 et d’autres part en permettant aux Tregs de contrôler le déroulement des réponses immunes (300). L’équipe de Kathryn Wood a proposé en 2005 un modèle où les Tregs produisaient rapidement et seulement de manière transitoire de l’IFN-γ, crucial pour leur fonction in vivo (301). Cette production d’IFN-γ par les Tregs peut de plus créer un microenvironnement suppressif induisant une inhibition de l’activation et de la prolifération des cellules T effectrices et ce, en influençant la fonction des APCs en induisant l’enzyme iNOS (inducible nitric oxide synthase), l’enzyme HO-1 (heme oxygenase-1) ou bien l’enzyme IDO induisant le catabolisme du tryptophane (302). La cytokine clef impliquée dans le maintien en périphérie et la mise en place des fonctions effectrices des Tregs est le TGF-β. Il existe plusieurs isoformes du TGF-β : le TGF-β1, le TGF-β2 et le TGF-β3. Le TGF-β1 est l’isoforme ayant une activité immunologique, les autres jouant plutôt un rôle au cours de l’embryogenèse ou bien lors des processus de myogenèse. Le TGF-β est une cytokine pléïotropique (la plupart des cellules possèdent un récepteur au TGF-β) très conservée au cours de l’évolution possédant un effet immunosuppresseur prononcé. En effet, une souris exprimant un dominant négatif du récepteur de type II au TGF-β (dnTGF-β RII) exprimé sous le contrôle d’un promoteur T spécifique et donc possédant des cellules T incapables de répondre à cette cytokine va développer des pathologies autoimmunes. Cela démontre, l’importance cruciale du TGF-β dans l’homéostasie du compartiment T (303). En 2005, Marie et al. ont montré que le TGF-β1 était critique pour l’homéostasie et l’activité régulatrice du pool de Tregs périphérique mais non requis pour le développement intrathymique de ces cellules. En effet, des souris TGF-β1-/âgées de 8 à 10 jours (phénotype létal à 3 semaines de vie) présentent une réduction significative du nombre de Tregs en périphérie mais un nombre inchangé de thymocytes Foxp3+ au sein du thymus. Ils ont de plus montré en utilisant un modèle murin dnTGF-β RII que l’abrogation de la signalisation TGF-β dépendante dans les Tregs induit une diminution à la fois du niveau d’expression de Foxp3 mais également de l’activité suppressive (304). Ces résultats sont toutefois à modérer. En effet, Liu et al ont récemment montré qu’un retard dans le développement des Tregs était observable chez des souris déficientes pour le recepteur au TGF-b1 au niveau des cellules T, 3 à 5 jours après la naissance (305). Ce retard est ensuite compensé par une expansion accélérée des Tregs thymiques, attribuable à une surproduction d’IL-2. Durant ces dernières années il a été largement documenté que le TGF-β1 associé à une stimulation du TCR permettait in vitro chez l’homme et la souris la conversion de lymphocytes naïfs T CD4+ CD25- Foxp3- en lymphocytes T CD4+ CD25+ Foxp3+ régulateurs (306). Cette conversion de T effecteurs en Tregs ou TiTregs (TGF- β induced Tregs) permet d’obtenir des cellules présentant une activité 77 suppressive in vitro mais également in vivo après transferts adoptifs dans des modèles murins (307-310). Ces Ti-Tregs transférés in vivo chez la souris persistent dans l’organisme assurant ainsi une fonction régulatrice à long terme chez l’animal (311). Le groupe de Schevach a récemment montré que la présence d’IL-2 semble être un paramètre important pour réaliser cette conversion en Ti-Tregs induite par le TGF-β (312). Cependant, ces Ti-Tregs, une fois générés, s’avèrent instables (313). L’absence d’expression de CD127 est une des caractéristiques phénotypiques permettant d’identifier les Tregs. La répression de CD127 serait d’ailleurs subordonnée à l’expression de Foxp3. Le groupe de Bandeira a montré que la génération et l’homéostasie des Tregs sont maintenues en absence de l’IL-7, contrairement à leur contrepartie effectrice (314). Le développement thymique, bloqué à la transition DN2-DN3, est sévèrement réduit pour les deux populations. Cependant, des cellules régulatrices sont toujours présentes et fonctionnelles, même après l’involution du thymus. Les souris déficientes pour l’IL-7, qui développent la colite après déplétion des lymphocytes T CD25+, entrent en rémission spontanément alors que le compartiment régulateur se reforme. La génération périphérique des Tregs expliquerait donc que la lymphopénie des souris invalidées pour cette cytokine ne soit pas corrélée au développement d’une pathologie auto-immune. Enfin, il a été mis en évidence dès 1999 que les Tregs ont besoin de la présence de leur antigène en périphérie pour se maintenir (315). Dans un modèle de rats thymectomisés et irradiés, une thyroïdite et un diabète auto-immun curables par le transfert de Tregs apparaissent. Lorsque ces cellules proviennent d’animaux dont la thyroïde a été détruite in utero par administration d’iode 131, elles ne parviennent à contrôler que le diabète de type I. Par contre, les thymocytes sont capables de prévenir la survenue des deux pathologies. Garza et al. ont utilisé une approche similaire pour étudier la tolérance à un antigène ovarien, ZP3 (316). Une oophorite auto-immune peut être induite expérimentalement, chez des souris mâles ou femelles simultanément ovariectomisées, par la greffe d’un ovaire accompagnée d’une immunisation contre ZP3. La sévérité de la pathologie était nettement plus marquée chez le mâle que chez la femelle. En revanche, si l’ovariectomie a eu lieu plus d’une semaine avant l’induction de l’oophorite, la protection chez la femelle est perdue, ce qui montre que cette tolérance nécessite la persistance des antigènes ovariens. C. MECANISMES DE SUPPRESSION Une fois le marqueur CD25 associé aux lymphocytes T régulateurs, l’objectif de nombreuses équipes a été de découvrir par quel mécanisme passe leurs propriétés immunosuppressives. Cependant, ce n’est pas un mais plusieurs mécanismes qui ont rapidement été mis à jour. Aujourd’hui encore, de nouveaux mécanismes sont découverts. De nombreuses études montrent que les Tregs CD4+ CD25+ Foxp3+ naturels inhibent l’activation et/ou l’expansion de différentes cellules immunitaires, à 78 commencer par les lymphocytes T CD4+ effecteurs. En effet, l’équipe de Sakaguchi a montré que la déplétion en Tregs conduit au développement de pathologies autoimmunes T CD4+ dépendantes pouvant être corrigées par transfert adoptif de Tregs (254). Depuis cette approche expérimentale a été étendue à de nombreux modèles de pathologies auto-immunes chez la souris (253). Des études in vitro ont montré que les Tregs suppriment efficacement l’activation, la prolifération et/ou la production de cytokines de lymphocytes T CD4+ ou T CD8+ aussi bien dans des systèmes avec des CPAs que dans des systèmes sans CPAs avec des stimulations polyclonales de type anti-CD3/CD28 (317-320). In vivo, il a été récemment observé par des approches de microscopie biphotonique intravitale que les Tregs peuvent bloquer l’exocytose des granules lytiques des CTLs (321). Les lymphocytes T ne sont pas les seuls à subir la loi des Tregs : les cellules B également. Leur prolifération, leur production d’immunoglobuline ainsi que leur commutation isotypique peuvent ainsi être inhibées (322, 323). L’aptitude des Tregs à inhiber les cellules NK (Natural Killer) et les cellules NKT (Natural Killer T) a été également documentée (324, 325). Enfin, les Tregs peuvent également moduler la maturation des cellules dendritiques (326). Il est important de noter que la suppression induite par les Tregs peut se faire sur des cellules T naïves, effectrices ou bien mémoires. Cependant leur potentiel régulateur sur l’activation ou bien la réponse proliférative est plus efficace sur des populations lymphocytaires T naïves (327, 328). Les Tregs ne sont cependant efficaces qu’après avoir été stimulées par leur antigène spécifique (329) et en absence de fortes doses de cytokines signalant par la chaîne commune γ (330, 331), en particulier l’IL-2 (329), et de costimulation par CD28 (329). En effet, ces deux signaux réversent l’état d’anergie des Tregs et leur ôtent leurs propriétés régulatrices. 1. Déprivation des cytokines de survie On a longtemps cru que l’inhibition de la prolifération s’expliquait par une inhibition de la transcription d’IL-2 par les lymphocytes effecteurs (320). Les travaux de Pandiyan et al ont élégamment proposé une autre hypothèse, déjà proposée en 2004 (330) : le concept de déprivation du micro-environnement. Ils ont réussit à montrer que la présence de Tregs dans les co-cultures induit une diminution de la concentration en IL-2, mais contrairement à ce qui était auparavant avancé, ils n’ont pas observé de diminution de la transcription (331). Ils ont donc proposé que la déprivation en IL-2, mais aussi en IL-7, induirait l’apoptose des cellules effectrices par une voie dépendante du facteur pro-apoptotique Bim. En effet, les Tregs sont impuissants à contrôler une colite induite par des lymphocytes T colitogènes déficients pour Bim. 79 80 2. CTLA-4 Différentes expériences utilisant des « transwel »l ont clairement établi que le contact cellulaire était indispensable entre les Tregs et les cellules effectrices pour que l’inhibition de la prolifération puisse avoir lieu (320, 332). L’expression constitutive par les Tregs d’une molécule inhibitrice de l’activation T comme CTLA-4 ne pouvait dès lors qu’attirer l’attention des chercheurs, d’autant que ses ligands, CD80 et CD86, sont exprimés par les CPAs et les lymphocytes T CD4+ activés. En étudiant séparément la fonction biologique de CTLA-4, il apparaît alors évident de l’importance de cette molécule dans la fonction suppressive in vitro et in vivo des Tregs. En effet le blocage de CTLA-4 chez la souris conduit au développement de pathologies auto-immunes multi-organes (253). De plus, des études génomiques chez l’homme ont montré que l’altération quantitative de la forme transmembranaire ou bien soluble de CTLA-4 conduisait à une destruction autoimmune des tissus (333). Le blocage de CTLA-4 lors de tests de suppression in vitro par des anticorps monoclonaux anti-CTLA-4 ou bien en utilisant des CTLA-4 Fab (Fragment antigen binding) inhibe l’activité suppressive des Tregs quand les Tregs sont isolés à partir de souris WT et les T effecteurs à partir de souris CTLA-4-/- (332). Il a également été montré que l’expression forcée de Foxp3 dans des cellules T naïves augmentait l’expression de CTLA-4, suggérant ainsi que l’expression de CTLA-4 est régulée positivement par ce facteur de transcription (268). CTLA-4 présent sur les Tregs va pouvoir agir de plusieurs manières dans l’induction de mécanismes régulateurs. Tout d’abord, CTLA-4 peut interagir avec les molécules accessoires CD80 et CD86 à la surface des lymphocytes T effecteurs. Il en résulte un signal « outside-in » suppresseur pour les lymphocytes T. Enfin, l’engagement de CTLA-4 avec ses ligands à la surface des cellules dendritiques induit l’expression d’IDO (207). 3. Cytotoxicité directe L’expression par les lymphocytes T régulateurs humains après activation de la granzyme A avait soulevé l’hypothèse d’une cytotoxicité directe des Tregs vis-à-vis des cellules effectrices (334). Une lyse dépendante de la perforine a pu être démontrée vis-à-vis de lymphocytes T CD4 et CD8 humains (334). Chez la Souris, l’équipe de Ley a pu éclaircir l’apparent paradoxe d’une immunité tumorale plus efficace chez les animaux déficients en granzyme B, en montrant que les Tregs du micro-environnement tumoral sont capables de lyser des cellules CD8+ et NK (335). En outre, plusieurs études ont établi une cytoxicité des Tregs envers les lymphocytes B, avec lesquels ils interagissent en tant que CPAs, soit par la voie perforine/granzyme (336), soit par l’interaction Fas/FasL (337). 81 4. Les cytokines immunosuppressives La nécessité d’un contact cellulaire pourrait faire penser que la sécrétion de cytokines par les lymphocytes T régulateurs n’intervient pas dans leurs propriétés immunosuppressives. Il est vrai qu’in vitro, l’utilisation d’anticorps bloquant anti-IL-10 et/ou anti-TFG-β n’altère nullement leurs fonctions (253, 332, 338). Pourtant, in vivo, de nombreuses données ont clairement démontré le contraire. Ainsi l’IL-10 est requise dans le contrôle de la colite par les Tregs CD4+ CD25+ CD45RBlow. En effet, des Tregs isolés à partir de souris IL10-/- ne peuvent pas prévenir cette pathologie (339). De plus, Kingsley et al. ont montré que l’IL-10 était impliquée dans l’inhibition par les Tregs du rejet de greffes de peau, l’administration d’anticorps anti-IL-10 bloquants accélérant le rejet (340). Il a récemment été observé que les Tregs infiltrant la lamina propria intestinale ou le système nerveux central peuvent respectivement inhiber le développement de la colite et de l’EAE par une sécrétion locale d’IL-10. De plus, après analyse des différents pools de Tregs, il apparaît que les Tregs infiltrant l’intestin produisent de l’IL-10 au contraire des Tregs spléniques, ces données suggérant peut-être que l’environnement influence le profil de sécrétion des Tregs et les fonctions effectrices suppressives mises en place (341, 342). Les premières cibles de l’IL-10 sont les cellules myéloïdes dont elle restreint l’expression des cytokines pro-inflammatoires, des chimiokines, des molécules de CMH de classe II et de co-stimulation (343). Une partie de l’effet de l’IL-10 pourrait également découler de l’induction de lymphocytes Tr1 ou de cellules dendritiques tolérogènes, cellules qui amplifieraient la suppression en produisant elles-mêmes cette cytokine (223, 344). Il faut toutefois remarquer que par opposition à ses propriétés immunosuppressives, l’IL-10 a un effet stimulateur sur la prolifération et la cytotoxicité des LT CD8+ (345). L’autre cytokine immunosuppressive majeure est le TGF-β, et une part importante de l’action des Tregs lui est attribuée. Le TGF-β intervient entre autres sur la maturation des cellules dendritiques (346), la prolifération et la différenciation des lymphocytes T CD4+ (347, 348) et des lymphocytes B (349, 350), ou les fonctions cytotoxiques des lymphocytes T CD8+ (351) et des NK (325). Une propriété non négligeable est de participer à la génération de novo de Tregs à partir de LT CD4+ Foxp3- (307, 352). A la sécrétion de TGF-β par les Tregs pourrait venir s’ajouter celle induite par ces dernières chez les cellules dendritiques de manière à créer un microenvironnement tolérogène. Ainsi, dans le modèle de la colite, l’expression d’un dominant négatif du récepteur TGF-βRII par les lymphocytes T CD4+ colitogènes a montré que ceux-ci doivent être sensibles au TGF-β pour être inhibé. L’origine du TGF-β est encore aujourd’hui controversée. Ainsi, dans le même modèle de colite, l’équipe de Powrie à montré que cette cytokine n’était pas produite par les cellules régulatrices (353) alors qu’à l’inverse, le groupe de Flavell a montré qu’elles étaient à l’origine de cette production (354). En s’appuyant sur des marquages en cytométrie, Nakamura et al. ont émis l’hypothèse que le TGF-β produit se retrouverait adsorbé à la surface et serait délivré à la cellule cible par contact (355). Ce concept est étayé par le fait que le TGF-β soit sécrété sous une forme inactive qui doit être clivée pour acquérir son activité biologique. Il a été récemment découvert que l’intégrine αvβ8 82 joue ce rôle chez les cellules dendritiques (356). Chez les Tregs, la molécule équivalente a été identifiée comme la furine. Une nouvelle cytokine immuno-suppressive est venue, il y a peu, rejoindre l’IL10 et le TGF-β : l’IL-35 (357). Composée de deux chaînes, IL-12α et IL-27β, son expression semble spécifique aux Tregs, car IL-27β est régulée par Foxp3. En son absence, les Tregs sont inefficaces à endiguer la prolifération homéostatique de lymphocytes T transférés dans un animal immunodéficient, comme ils échouent à protéger du développement de la colite. Par ailleurs, elle est la seule cytokine dont le défaut a une influence sur leur capacité à inhiber la prolifération des cellules CD4+ in vitro. D. FONCTIONS PHYSIOLOGIQUES ET PATHOLOGIQUES Le potentiel immunosuppresseur des Tregs joue un rôle majeur dans la régulation des réponses immunes. Toutefois, selon le processus pathologique impliqué, leur rôle pourra être bénéfique, comme lors de la prévention de l’autoimmunité ou la tolérance fœto-maternelle, ou au contraire fortement délétère lors d’une réponse anti-tumorale . 1. Prévention de l’auto-immunité Depuis les premiers travaux visant à identifier un marqueur fiable, l’implication des Tregs dans la prévention de l’auto-immunité ne fait aucun doute. De façon systématique, il a été montré que l’altération, au profit des mécanismes effecteurs, de l’équilibre établi entre l’activité des cellules autoréactives et celle des régulatrices, aboutit au développement d’une réponse immune dirigée contre les antigènes du soi : la thymectomie néonatale mène à une oophorite (243), la thymectomie et l’irradiation de rats adultes entraînent une thyroïdite et un diabète (245), et le transfert à un animal immunodéficient de lymphocytes T CD4+ CD25- aboutit à une auto-immunité systémique mortelle (254). Moins artificiellement, les conséquences graves d’une absence des Tregs sont illustrées par le syndrome de l’IPEX (260, 262, 263) ou par l’infection néonatale par le MTLV (mouse T lymphotropic virus) qui, en détruisant le compartiment CD4, cause entre autres une gastrite (358). D’une façon moins drastique, la diminution des fonctions effectrices des Tregs peut être à l’origine de désordres dans la tolérance au soi. Ainsi des cellules régulatrices avec des capacités amoindries ont été isolées du sang de patients souffrant d’une forme relativement peu sévère de l’IPEX (271), de diabète de type I (359), de sclérose en plaque (360), de polyarthrite rhumatoïde (361) ou du syndrome de Wiskott-Aldrich (362). La perturbation de l’homéostasie des Tregs pourrait également conduire à la survenue de pathologies : la déficience en IL-2 ou l’incapacité à y répondre handicapent lourdement les Tregs, ce qui provoque chez les animaux invalidés des atteintes auto-immunes (298). De nouveau, des défauts moins marqués peuvent suffire à déséquilibrer le système immunitaire. Une 83 insuffisance dans la production d’IL-2 a été ainsi suggérée comme un des facteurs de susceptibilité au diabète de la souris NOD et à l’encéphalite auto-immune expérimentale (363, 364). Par ailleurs, l’accumulation de Tregs dans le système nerveux central a été associée à la rémission observée chez la souris C57BL/6 dans le modèle de l’EAE (341). Chez cette souche, l’induction de la maladie se traduit par l’apparition d’une inflammation aïgue du tissu nerveux qui se résorbe spontanément. Une fois guéris, les animaux deviennent réfractaires à la ré-induction de la pathologie. La déplétion des Tregs avant la première immunisation retarde la rémission spontanée, tandis qu’une élimination postérieure au rétablissement empêche l’acquisition de la résistance. Les Tregs s’avèrent donc capables de contrôler la réponse auto-immune, mais leur enrichissement suite à une première réponse pourrait établir une tolérance durable. 2. Modulation des réponses anti-infectieuses Lors d’une réponse immunitaire anti-infectieuse, le système immunitaire met en place différents mécanismes effecteurs : la production de cytokines proinflammatoires, la production de chimiokines permettant le recrutement de cellules immunitaires sur le lieu de l’infection et finalement l’activation de cellules cytotoxiques comme les CTLs et les NK qui vont pouvoir lyser les cellules infectées. Bien que ces mécanismes soient cruciaux pour limiter la propagation de l’agent pathogène dans l’organisme ainsi que pour éliminer le pathogène de l’organisme, ils doivent être drastiquement contrôlés afin d’éviter tout risque d’hyper-inflammation et de dommages tissulaires collatéraux. En effet, il est possible que lors de la réponse immunitaire adaptative contre les antigènes du pathogène il y ait génération d’une réaction immunitaire dite croisée ou « cross-réactive » contre des antigènes du soi aboutissant alors au développement de pathologies auto-immunes. C’est pour palier à cela que le système immunitaire a développé des mécanismes suppresseurs afin de préserver l’homéostasie de l’organisme. Il a tout d’abord été décrit des mécanismes de régulation consistant en la production de cytokines anti-inflammatoires par les cellules de l’immunité innée. Plus récemment, l’implication de l’immunité adaptative a été largement documentée dans différents modèles infectieux avec le rôle capital que jouent les Tregs Foxp3+ (365). La plupart des infections où les Tregs ont un rôle protecteur important sont des cas d’infections chroniques (366). L’isolement de Tregs à partir de patients atteints d’une infection chronique par Helicobacter pylori, montre que ces cellules régulatrices sont capables d’inhiber des réponses cellulaires T spécifiques des antigènes bactériens mais pas des réponses cellulaires T spécifiques d’autres antigènes (367). Un exemple bien documenté à ce jour est le cas de l’infection gastro-intestinale bactérienne par Helicobacter hepaticus qui va causer une inflammation intestinale. Le transfert de cellules T CD4+ isolées à partir d’une souris IL-10-/- infectée par Helicobacter hepaticus dans une souris RAG-/- infectée par cette même bactérie va permettre un excellent contrôle de l’infection, mais cela va également augmenter l’inflammation intestinale et induire l’apparition d’une colite inflammatoire. Le transfert de lymphocytes T CD4+ totaux isolés à partir d’une souris sauvage infectée par 84 Helicobacter hepaticus dans une souris RAG-/- également infectée par la même bactérie va permettre d’induire une réponse immunitaire contre le pathogène moins importante, mais en évitant le développement de la colite. Les auteurs de ce travail ont donc montré l’importance de la génération d’un pool de Tregs antigène spécifique qui va moduler la réponse immunitaire anti-bactérienne via un mécanisme dépendant de l’IL-10 (368). Toutefois, le revers de la médaille à cette intervention des Tregs est que certains pathogènes utilisent en leur faveur cette immunorégulation afin de restreindre la réponse immune. C’est le cas des infections par Pneumocystis carinii, par Candida albicans, par Leishmania major, par le virus de l’hépatite C, par le virus de l’herpès (366). Cette persistance à long terme va créer un nouvel état d’homéostasie pour l’organisme, ce qui est illustré par le modèle murin d’infection par Leishmania major. En 2002, Yasmina Belkaid et al. ont montré que la persistance de Leishmania major au niveau de la peau de souris C57BL/6 après résolution de la phase « aigüe » de l’infection était due à l’action endogène des lymphocytes T CD4+ CD25+ régulateurs (369). Au cours du processus infectieux, les Tregs s’accumulent au niveau du derme des souris infectées et inhibent via des mécanismes à la fois dépendants et indépendants de l’IL-10 les réponses effectrices des lymphocytes T CD4+ CD25- conventionnels visant à éliminer le parasite. Cependant, l’activité suppressive des Tregs ne se fait pas que pour assurer la survie du pathogène, cela permet également au système immunitaire (du fait de la persistance des antigènes parasitaires en périphérie) de mettre en place une mémoire immunitaire efficace en cas de réinfection par le même pathogène. En effet, des souris IL-10-/- infectées par Leishmania major développent une réponse immunitaire permettant l’élimination de la totalité de la charge parasitaire mais ne permettant pas la mise en place d’une mémoire immunitaire capable de protéger l’animal en cas de réinfection (369). Le groupe de Yasmina Belkaid a depuis montré en 2006, dans ce modèle d’infection parasitaire que la chimiokine CCR5 était responsable du recrutement des Tregs au niveau du derme infectieux (370). Ils ont de plus montré, après avoir réalisé des tests fonctionnels ex vivo, que la majorité des Tregs recrutés au niveau du derme de souris infectées par Leishmania major étaient spécifiques des antigènes du parasite (371). 3. Inhibition des réponses anti-tumorales Les pathologies infectieuses et inflammatoires sont induites par des organismes exogènes (virus, bactéries, parasites…). Les cancers au contraire sont des pathologies inflammatoires qui vont être induites suite à des divisions anarchiques et non contrôlées de cellules du soi. Du fait de l’origine endogène des tumeurs, générer une immunité anti-tumorale efficace est un processus délicat car 85 86 cela pourrait conduire à la mise en place d’une réponse auto-immune. Heureusement, les antigènes tumoraux ne sont pas tous des antigènes du soi mais possèdent des caractéristiques propres (antigènes EBV dans certains lymphomes, des formes mutées de p53 dans certains carcinomes épithéliaux, etc), le terme de « soi modifié » est alors employé afin de les désigner. Malgré les efforts du système immunitaire à mettre en place une réponse immunitaire anti-tumorale, la régression spontanée d’une tumeur établie est un évènement très rare. En effet, les tumeurs ont développé de nombreux mécanismes d’évasion au système immunitaire notamment en générant un microenvironnement suppresseur grâce à la production de cytokines aux propriétés immunosuppressives : l’IL-10 (372, 373) et le TGF-β (200, 374). Les tumeurs sont également capables de sécréter des facteurs de croissance endothéliaux comme le VEGF (Vascular endothelial growth factor) qui permet d’induire des processus de néoangiogenèse favorisant ainsi la croissance tumorale. D’autre part, le VEGF sécrété localement par les cellules tumorales inhibe la maturation des cellules dendritiques affectant ainsi l’activation des lymphocytes T (375). Toutefois, des travaux récents semblent montrer qu’un obstacle majeur à l’immunosurveillance anti-tumorale et à la mise en place de stratégies d’immunothérapies anti-tumorale efficaces est du à l’immunosuppression réalisée par les Tregs (376). De nombreux travaux ont à ce jour démontré in vivo dans des modèles murins le rôle délétère des Tregs dans l’immunité anti-tumorale (376). L’élimination sélective des Tregs par l’injection d’anticorps déplétants anti-CD25, anti-FR4 favorise une diminution de la croissance tumorale et le rejet de la tumeur (277, 376). Les Tregs infiltrent massivement les tumeurs solides et leur nombre est considérablement augmenté au niveau des ganglions lymphatiques drainant ces sites tumoraux. L’expansion périphérique du pool de Tregs se fait indépendamment du thymus au niveau des organes lymphoïdes secondaires et ne requiert pas de prolifération cellulaire. Il s’agirait majoritairement d’une conversion de lymphocytes T CD4+ CD25Foxp3- en Tregs CD4+ CD25- Foxp3+ induite de manière active par la tumeur (377). Toujours chez la souris, en 2007, Liu et al. ont montré que c’était le TGF-β produit par les cellules tumorales qui induisait cette conversion de lymphocytes T CD4+ CD25- Foxp3- effecteurs en Tregs CD4+ CD25+ Foxp3+. Ils ont de plus montré que le traitement des souris avec un anticorps bloquant anti-TGF-β permettait d’inhiber ce processus de conversion et d’induire une immunité anti-tumorale efficace (374). En plus de la fonction jouée par le TGF-β dans l’induction de Tregs, le groupe de Zitvogel a montré que lors d’une réponse immunitaire anti-tumorale (après transferts adoptifs des différents types cellulaires dans une souris nude), le TGF-β produit par les Tregs et fixé à leur surface permettait d’inhiber les fonctions effectrices et cytotoxiques des NK sur la lyse des cellules tumorales (325). Parallèlement, le groupe de Von Boehmer a montré dans un modèle tumoral murin que les Tregs inhibent in vivo la cytotoxicité des CTLs via la production de TGF-β. En effet, le transfert de CTLs exprimant un dnTGF-βRII et donc étant insensibles à la signalisation induite par le TGF-β résiste à la suppression réalisée par les Tregs. Le rétablissement de la cytotoxicité est associé dans ce modèle à un rejet de la tumeur (351). 87 Supportant ces travaux réalisés avec des modèles tumoraux murins, l’impact des Tregs sur l’immunité anti-tumorale chez des patients atteints de cancer est maintenant bien documenté (373, 376). En 2001, Woo et al. ont observé pour la première fois que des patients atteints de cancers des poumons et de cancers ovariens présentaient un nombre supérieur de Tregs par rapport à celui observé chez des individus sains (378). Depuis, de nombreux types de cancers où la fréquence des Tregs dans le sang périphérique est supérieure à celle observée chez un donneur sain ont été référencés : cancer du sein, cancer pancréatique, leucémies. Cette liste continue de s’agrandir au fil des différentes investigations cliniques qui semblent toutes indiquer que ces Tregs possédant des propriétés suppressives in vitro sont un obstacle majeur à une réponse immunitaire antitumorale efficace chez ces patients (376). Arriver à mieux comprendre les mécanismes d’actions employés par les Tregs dans l’inhibition des réponses immunitaires anti-tumorales apparaît donc comme un enjeu crucial dans la mise en place de stratégies thérapeutiques anticancéreuses (373). L’IL-2 est une cytokine assurant la prolifération des lymphocytes T, elle est utilisée en thérapeutique humaine notamment chez des patients atteints de tumeurs rénales ou de mélanomes afin de favoriser les réponses immunitaires anti-tumorales. La dose d’IL-2 administrée est un paramètre très important à prendre en compte. A hautes doses, l’IL-2 va favoriser l’expansion des Tregs chez ces patients et de ce fait la progression de la tumeur (379). L’expression constitutive et forte de CD25 à la surface des Tregs par rapport aux lymphocytes T conventionnels va leur donner un avantage prolifératif. L’établissement de stratégies thérapeutiques visant à inhiber de manière sélective les Tregs spécifiques d’antigènes tumoraux permettrait donc d’induire une réponse immunitaire contre les tumeurs efficace sans pour autant risquer le développement de pathologies auto-immunes dues à une rupture de tolérance (373). 4. Tolérance fœto-maternelle La grossesse pourrait sur un plan immunologique se décrire comme une greffe semi-allogénique naturelle. En effet, durant la phase de gestation du fœtus, le système immunitaire maternel doit s’adapter et relever un challenge important pour pouvoir tolérer la présence de non-soi dans l’organisme, ce non-soi correspondant aux alloantigènes paternels (380). Les agressions du système immunitaire maternel dirigées contre le fœtus sont inhibées par différents mécanismes visant à neutraliser localement les cellules immunitaires réactives contre les alloantigènes du fœtus. Tout d’abord, il y a établissement d’une barrière physique : la barrière placentaire constituant une interface sélective entre la mère et le fœtus. Au niveau de cette interface, il y a expression de la molécule de CMH de classe I non classique HLA-G qui inhibe l’activation des cellules NK et induit l’apoptose des CTLs (381). De plus, les cellules trophoblastiques expriment la molécule FasL ce qui leur confère le potentiel d’induire l’apoptose des lymphocytes T allospécifiques maternels (382). Malgré leur efficacité, tous ces mécanismes ont toutefois une action restreinte à un 88 niveau local. Leur seule présence n’explique donc pas la capacité à assurer de manière prolongée une tolérance systémique aux alloantigènes paternels. En 2004, Aluvihare et al. ont montré, dans un modèle murin, que durant la période de gestation, il y avait de manière alloantigène indépendante une expansion systémique du pool périphérique de Tregs maternels. Leur fonction, en plus de supprimer les réponses auto-immunes, consiste à inhiber les réponses allogéniques dirigées contre le fœtus. Leur absence conduit à un avortement chez la souris, avortement correspondant à un rejet immunologique du fœtus (383). Une autre équipe a montré parallèlement chez la souris que lors de l’administration d’un traitement à base d’E2 (17-beta œstradiol) ou bien durant la période physiologique de gestation (période au cours de laquelle le niveau systémique des œstrogènes est élevé), il y a augmentation du niveau d’expression de Foxp3 et expansion du pool périphérique de Tregs. Ces données expliquent donc l’augmentation du nombre de Tregs circulants durant la grossesse et de plus, permettent de mieux comprendre le rôle protecteur de l’E2 sur le développement de pathologies auto-immunes (384). Enfin, des travaux plus anciens ont montré que le traitement de souris gestantes avec un inhibiteur pharmacologique d’IDO conduit à un avortement dû à un rejet immunologique du fœtus (385). A l’époque, l’action d’IDO n’a pas été reliée à l’activité régulatrice des Tregs, mais il est envisageable que la fonction protectrice des Tregs durant la grossesse soit due au moins en partie à l’induction d’IDO par les Tregs au niveau des cellules trophoblastiques et des CPAs. E. POTENTIEL CLINIQUE DES TREGS Les différentes fonctions imputées aux Tregs ont conduit de nombreuses équipes à développer des modèles expérimentaux de thérapie cellulaire reposant sur l’utilisation de leurs capacités immunosupressives. 1. Pathologie auto-immune et immuno-inflammatoire De nombreuses études précliniques réalisées dans des modèles animaux ont montré que le transfert adoptif de Tregs est capable de prévenir le développement de pathologies auto-immunes ou immuno-inflammatoires telles que : le diabète de type 1, l’EAE, l’arthrite rhumatoïde, etc. (240). Les travaux montrant que le transfert adoptif de Tregs peut corriger une pathologie auto-immune active et déjà établie sont plus rares (386-388). Le groupe de Powrie a montré en 2003 que l’injection de Tregs polyclonaux dans le traitement d’une pathologie inflammatoire intestinale déjà établie (modèle murin de l’IBD) permettait d’éliminer les infiltrats lymphocytaires pathogéniques au niveau de la lamina propria intestinale et de rétablir une architecture intestinale physiologique (386). Après expansion ex vivo de 89 Tregs transgéniques stimulés par des cellules dendritiques autologues présentant des antigènes des îlots pancréatiques, Tarbell et al. ont montré que l’injection de ces Tregs antigène-spécifiques permettait de corriger un diabète auto-immun déjà établi dans une souris NOD de treize semaines. Les souris traitées avec succès possèdent toujours des cellules T diabétogéniques mais elles présentent parallèlement un nombre accru de cellules Foxp3+ au niveau des ganglions lymphatiques drainant le pancréas (387). Un travail très récent du groupe de Kuchroo a montré que le traitement de pathologies auto-immunes à l’aide de Tregs générés ex vivo devait être associé à un contrôle de l’inflammation tissulaire locale. En effet, en utilisant un modèle murin d’EAE, ils ont montré qu’au pic de la pathologie, les Tregs spécifiques du peptide MOG35-55 étaient capables d’inhiber des lymphocytes T effecteurs de même spécificité isolés à partir de la rate mais incapables d’inhiber ces mêmes effecteurs lymphocytaires isolés à partir du système nerveux central. L’importante production de cytokines pro-inflammatoires (IL-6 et TNF) par ces lymphocytes T effecteurs recrutés au niveau du système nerveux central des animaux malades inhibe l’activité suppressive des Tregs (389). L’ensemble de ces éléments semble indiquer que le traitement de pathologies auto-immunes chez l’homme par la mise en place de thérapies cellulaires utilisant des Tregs pourrait être possible. L’utilisation de Tregs polyclonaux semble fonctionner dans des animaux lymphopéniques où l’expansion de ces cellules est possible et où un pool suffisant de Tregs ayant une spécificité pour les auto-antigènes d’intérêt sera constitué. Cependant dans un hôte immunocompétent, les travaux actuels semblent indiquer la nécessité d’injecter des Tregs ayant une spécificité antigénique pour les auto-antigènes d’intérêt. Cela rend donc plus complexe la mise en place de protocoles cliniques de thérapie cellulaire chez des patients atteints de pathologies auto-immunes ou immuno-inflammatoires. 2. La maladie du greffon contre l’hôte Que ce soit pour contrer une maladie génétique touchant le compartiment hématopoïétique ou pour soigner une leucémie, la greffe de moelle osseuse s’est aujourd’hui imposée comme une des meilleures (voire parfois la seule) solution thérapeutique. Elle implique cependant un protocole lourd et éprouvant, imposant l’isolement du malade en unité aseptique. La préparation à la greffe associant une chimiothérapie à haute dose et éventuellement l’irradiation corporelle totale, vise surtout à traiter la maladie mais, dans le cas de greffes allogéniques, démantelent également les défenses immunitaires du patient. Le patient, une fois la greffe acceptée, s’expose à de nombreuses complications, telles qu’une pneumonie interstitielle, des lésions plus ou moins graves, des infections liées à l’immunosuppression voire, à plus long terme, une altération importante du cristallin, de la rétine ou de la thyroïde. Dans le cas des greffes allogéniques, la complication la plus crainte par les médecins reste la maladie du greffon contre l’hôte, où les lymphocytes T contenus 90 dans la moelle osseuse allogénique vont pouvoir s’activer vis-à-vis des cellules du receveur et ainsi provoquer des lésions graves pouvant entrainer la mort du patient. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement capable de l’inhiber sans compromettre la capacité du patient à combattre les infections. Afin de prévenir le développement de cette pathologie, il a été proposé d’éliminer, avant injection, les cellules T contenus dans le greffon. Cependant, cette démarche n’est pas réellement envisageable car, si elles ont un effet délétère vis-à-vis de l’hôte, ces cellules favorisent la prise des cellules souches hématopoïétiques (390), accélèrent la reconstitution du système immunitaire et réduisent le risque de syndromes lymphoprolifératifs associés à une infection par EBV (391). Enfin, elles sont les principales responsables de l’effet thérapeutique des greffes de moelles osseuse chez les patients atteints de leucémie, l’effet GVL ou GVT (Graft versus Leukemia ou Tumor) (392). Ainsi, plutôt que de les éliminer, il apparait plus opportun d’essayer de finement contrôler les précurseurs alloréactifs responsables de la pathologie. Jusqu’en 2002, très peu de travaux s’étaient intéressés à la capacité des Tregs à contrôler une alloréponse. Sakaguchi avait montré, dans des souris nude, que le rejet d’une allogreffe de peau est accéléré lorsque les lymphocytes T transférés sont déplétés en cellules CD25+ (254). In vivo, Taylor et al. avaient mis en évidence que ces cellules sont impliquées dans la tolérance induite à des alloantigènes par blocage des « voies de co-stimulation » CD40/CD40L ou CD28/B7 (393). Enfin, deux autres groupes avaient réussit à induire la survie d’îlots pancréatiques ou de greffe de peau allogénique par transfert de cellules régulatrices CD4+ CD25+ isolées à partir d’un animal préalablement rendu tolérant (116, 394). Ces données, suggérant que les Tregs sont capables de moduler des réponses dirigées contre des alloantigènes, ont incité plusieurs équipes à tester leur capacité à inhiber le développement d’une GvHD (393, 395, 396). Le modèle qu’ils ont développé est assez similaire. Il consiste à irradier létalement des souris puis de les reconstituer avec une greffe de moelle osseuse allogénique. En l’absence de toute autre manipulation, les animaux survivent à long terme. Par contre, lorsque des cellules T allogéniques ou des splénocytes totaux sont administrés, une GvHD sévère se développe. De façon intéressante, la coinjection de cellules T CD4+ CD25+, isolées à partr d’un donneur non manipulé, permet de retarder significativement l’apparition de la pathologie. Chez l’Homme comme chez l’animal, la fraction CD25+ ne représente que 5 à 10% du repertoire TT CD4+ périphérique. L’utilisation de ces cellules en clinique, dans des protocoles de thérapies cellulaires, nécessite donc une étape préalable d’expansion. Aussi ses auteurs ont-ils développé des méthodes de culture ex vivo en présence d’antigènes du receveur, pour induire spécifiquement la prolifération des cellules allospécifiques, et d’IL-2, afin de réverser l’état d’anergie des Tregs. Lorsque les cellules ainsi cultivées sont injectées avec la moelle osseuse et les cellules effectrices, le développement de la pathologie est retardé (393, 395). Mieux, elle est totalement inhibée lorsque les Tregs ont été préactivés ex vivo en présence de TGF91 β. Les Tregs pourraient donc être utilisés en thérapie pour inhiber l’apparition de la GvHD. D’autant plus que (392)les Tregs parviennent dans le même modèle, chez des souris ayant reçu des cellules leucémiques, à inhiber le développement de la GvHD tout en permettant l’élimination des cellules cancéreuses (397, 398). Cependant, ces résultats semblent dépendre du type de cellules cancéreurses utilisé. La différence de comportement des cellules régulatrices vis-à-vis des deux types de réponses immunes pourrait s’expliquer par une différence, en termes d’intensité et/ou de mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu, entre la GvHD et la réponse anti-tumorale (GvT pour Graft versus Tumor). En effet, la maladie du greffon est principalement médiée par les cellules T CD4+ tandis que la GvT est, elle, caractérisée par une cytotoxicité dépendante des cellules T CD8+. Aussi, on peut émettre l’hypothèse que le fait que la réponse du greffon contre la tumeur puisse se dérouler est lié, dans ces modèles, à une inhibition plus efficace du compartiment CD4 que CD8 par les lymphocytes T régulateurs. 3. L’aide à la thérapie génique Comme la transplantation, les protocoles de thérapie génique peuvent être limités par des mécanismes de rejet. L’expression du transgène va ainsi déclencher une réponse visant à détruire les cellules qui expriment le « néo-auto-antigène ». L’utilisation de Tregs en clinique humaine, pour empêcher cette réponse, s’est donc rapidement imposée. L’équipe de Jean Davoust a ainsi montré que l’injection de Tregs isolés à partir de souris exprimant un TCR transgénique spécifique de HA permet de contrôler totalement la réponse immune. Ces cellules, contrairement à des Tregs non relevants, sont capables d’inhiber la production de cytokines pro-inflammatoire, l’activité cytotoxique des cellules T CD8+ spécifiques de l’antigène et la production d’anticorps par les cellules B. L’analyse histologique montre clairement une réduction de l’infiltration de cellules mononuclées et une prise à long terme du transgène (399). Plus récemment, ces auteurs ont réussit à faire accepter, sans aucun préconditionnement des receveurs, une greffe de moelle osseuse de mâle chez des femelles syngéniques, en utilisant des Tregs spécifiques des antigènes de mâles (DBY). De façon spectaculaire, les souris ainsi greffées conservent une immunocompétence intacte et peuvent ainsi développer une réponse immune contre un antigène exogène, tel l’ovalbumine (400). 92 RESULTATS 93 OBJECTIFS Depuis leur découverte, les lymphocytes T régulateurs présentent un formidable potentiel thérapeutique. Ce potentiel a depuis été confirmé à de nombreuses reprises dans divers modèles animaux et permettraient de soigner un vaste éventail de maladies. Dans le cas de la transplantation, la capacité de ces cellules à inhiber le développement de la GvHD a conduit de nombreuses équipes à s’intéresser à leur utilisation afin d’induire une tolérance aux alloantigènes. Toutefois, à l’état naturel, la balance entre les cellules regulatrices et leur contrepartie effectrice est très nettement en faveur de cette dernière. L’objectif communément admis par la communauté consiste donc à inverser cette balance afin de permettre aux Tregs de prendre le pas. Dans ce but, certaines équipes ont dévelopé des approches reposant sur l’injection d’anticorps non déplétants aux animaux receveurs. Ces traitements permettent en effet l’émergence d’une population de cellules T régulatrices. Pour notre part, nous avons choisi une approche alternative consistant à isoler sur la base des marqueurs de surface CD4 et CD25, expandre puis ré-injecter ces cellules. Nos premiers travaux ont permis de montrer que ces cellules, une fois expandues, pouvaient inhiber le rejet d’une moelle osseuse semi-allogénique dans un modèle d’irradiation létale. La tolérance induite était alors durable et spécifique des alloantigènes. Cependant, le modèle utilisé était particulièrement éloigné de la clinique humaine, de part la forte intensité du conditionnement des receveurs et la nature semi-allogénique de la moelle utilisée. L’objectif de mon travail de thèse a donc été multiple. Il s’agissait dans un premier temps d’induire une tolérance aux alloantigènes dans un modèle plus relevant en terme clinique. Pour ce faire, nous avons choisi d’irradier sous létalement les receveurs et de réaliser chez ces animaux une greffe de moelle osseuse, cette fois, totalement allogénique (major and minor antigen mismatches). Dans un second temps, nous voulions étendre notre modèle à l’induction de tolérance vis-à-vis de greffes d’organes solides. Nous avons donc choisi les modèles bien décrits de la greffe de peau, intéressante pour la forte immunogénicité qui y est associée, et de la greffe de cœur, organe fortement irrigué et dont le rejet est facilement monitorable par simple palpation abdominale. Enfin, nous avons voulu étudier si la tolérance induite était spécifique des antigènes utilisés lors de l’activation in vitro des cellules régulatrices, ainsi que les mécanismes impliqués dans cette protection. Dans ce but, nous nous sommes notamment intéressés à l’implication des cytokines anti-inflammatoires IL-10 et TGF-β, dont le rôle potentiel comme mécanisme d’action des Tregs a été démontré dans divers modèles. 94 © 2008 Nature Publishing Group http://www.nature.com/naturemedicine LETTERS Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes Olivier Joffre1,2,6,7, Thibault Santolaria1,2,6, Denis Calise3, Talal Al Saati4, Denis Hudrisier1,2,7, Paola Romagnoli1,2 & Joost P M van Meerwijk1,2,5 A major challenge in transplantation medicine is controlling the very strong immune responses to foreign antigens that are responsible for graft rejection. Although immunosuppressive drugs efficiently inhibit acute graft rejection, a substantial proportion of patients suffer chronic rejection that ultimately leads to functional loss of the graft1. Induction of immunological tolerance to transplants would avoid rejection and the need for lifelong treatment with immunosuppressive drugs1,2. Tolerance to self-antigens is ensured naturally by several mechanisms3; one major mechanism depends on the activity of regulatory T lymphocytes4,5. Here we show that in mice treated with clinically acceptable levels of irradiation, regulatory CD4+CD25+Foxp3+ T cells stimulated in vitro with alloantigens induced long-term tolerance to bone marrow and subsequent skin and cardiac allografts. Regulatory T cells specific for directly presented donor antigens prevented only acute rejection, despite hematopoietic chimerism. By contrast, regulatory T cells specific for both directly and indirectly presented alloantigens prevented both acute and chronic rejection. Our findings demonstrate the potential of appropriately stimulated regulatory T cells for future cell-based therapeutic approaches to induce lifelong immunological tolerance to allogeneic transplants. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) have a crucial role in the prevention of autoimmune4,5 and immunoinflammatory6 diseases, in the regulation of immunity to viral and parasite infections7,8, in the maintenance of maternal tolerance to the fetus9 and in the inhibition of antitumor immunity10. Given their proven physiological role in immune regulation, it is appealing to try to use Tregs to induce immunological tolerance to allografts. We and others have opted to use a strategy in which Tregs are isolated from unmanipulated hosts, cultured in vitro to expand cells with appropriate specificity, and then used to protect allografts in mice. In this fashion, tolerance to bone marrow11 but not skin allografts12,13 has been successfully induced. Here we evaluated whether immunological tolerance to solid tissue allografts could be induced with a protocol in which mice preconditioned with clinically acceptable levels of irradiation were grafted with allogeneic bone marrow, injected with Tregs and then transplanted with donor skin or heart. We grafted sublethally irradiated BALB/c (H-2d) mice with allogeneic T cell–depleted C57BL/6 (B6, H-2b) bone marrow. Three weeks later, the grafted cells had been rejected (Fig. 1a), demonstrating the non-lymphoablative nature of the preconditioning. To prevent rejection of bone marrow allografts, we next injected the preconditioned BALB/c mice with B6 bone marrow and host-type Tregs stimulated in vitro with donor strain–derived antigen-presenting cells (APCs; Supplementary Note 1 online). The in vitro culture protocol we used allowed for the expansion of CD4+CD25+Foxp3+ Tregs (Fig. 1b). When co-injected with donor bone marrow, these Tregs efficiently protected the allograft from rejection (Fig. 1a). Thus, we also induced tolerance to fully allogeneic bone marrow grafts in other donor-host combinations, independently of interleukin-10 (IL-10) production by Tregs (Fig. 1c and Supplementary Fig. 1a,b online). Using a modified experimental setup, we showed that allograft protection required that effector T cells responded to TGF-b (Supplementary Fig. 1b). Finally, we observed no rejection up to 120 d after transplantation (Fig. 1d), and after engraftment, allogeneic precursors reconstituted all hematopoietic lineages (data not shown). To be activated, Tregs require antigen-specific stimulation with major histocompatibility complex (MHC) molecule–peptide complexes. However, once activated, these cells exert their suppressor effector function in a non–antigen specific manner in vitro14. It was therefore important to evaluate whether Tregs induced generalized immunosuppression in our system. We stimulated B6 Tregs with BALB/c APCs and then injected them into sublethally irradiated B6 recipient with BALB/c and SJL (H-2s) bone marrow. Three weeks later, the target bone marrow had reconstituted the hosts’ hematopoietic systems, but the third-party SJL bone marrow had been fully rejected (Fig. 1e). Similarly, Tregs specific for SJL antigens protected SJL but 1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, U563, Tolerance and Autoimmunity section, Toulouse, F-31300 France. 2Université Toulouse III Paul Sabatier, Toulouse, F-31400 France. 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut Louis Bugnard, Institut Fédératif de Recherche 31, Plateau technique de Microchirurgie Expérimentale, Toulouse, F-31403 France. 4Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Institut Claude de Preval, Institut Fédératif de Recherche 30, Plateau technique d’Histopathologie Expérimentale (Toulouse Midi-Pyrénées Genopole), Toulouse, F-31300 France. 5Institut Universitaire de France, Paris, F-75000 France. 6These authors contributed equally to this study. 7Present addresses: Cancer Research UK London Research Institute, Immunobiology Laboratory, London WC2A 3PX, UK (O.J.); Centre National de la Recherche Scientifique, UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, F-31400 France (D.H.). Correspondence should be addressed to J.P.M.v.M. ([email protected]). Received 30 May; accepted 25 October; published online 9 December 2007; doi:10.1038/nm1688 88 VOLUME 14 [ NUMBER 1 [ JANUARY 2008 NATURE MEDICINE LETTERS Figure 1 In vitro–preactivated Foxp3+ Tregs Number of Tregs induce long-lasting tolerance to fully allogeneic injected (× 106) 250 bone marrow grafts. (a) Hematopoietic 200 0 0.5 1 2 100 150 95% chimerism, assessed by FACS analysis of PBMCs, 100 ** ** in BALB/c mice grafted with B6 bone marrow 50 log H-2Kb 0 and injected with BALB/c Tregs preactivated 50 in vitro with B6 APCs. FACS analysis was carried 100 out 3 weeks after bone marrow transplantation. *** 2,000 0 b d Above, typical FACS plots of H-2K versus H-2K 1,500 – + Treg: – + 93% 50 1,000 staining; below, the percentage of donor (H-2Kb+) CBA BALB/c 500 cells among PBMCs from individual mice. 0 Bone marrow graft 0 (b) Phenotype of Tregs before (above) and after log CD4 0 0.5 1 2 in vitro culture with donor-type APCs (below). Number of Tregs log Foxp3 injected (× 106) Right, black lines indicate staining with antibody to Foxp3, and gray curves staining with isotypematched control antibodies. (c,d) Hematopoietic 100 log Foxp3 reconstitution assessed at 3 weeks (c) or at the 100 10 indicated time points (d) after B6 mice were grafted with allogeneic donor bone marrow from 50 + Treg DBA/2 BM 50 indicated or BALB/c donors with or without Tregs. BALB/c 5 B6 BM SJL w/o Treg Values for individual mice are shown; bars indicate means. (e) Hematopoietic reconstitution 0 0 0 – + – + 0 40 80 120 by cells of BALB/c (’) and SJL (&) origin in B6 0 3 6 9 αBALB/c αSJL Time (d) after graft mice grafted with a mixture of BALB/c and SJL Time (weeks) after graft Treg specificity bone marrow cells with or without Tregs of indicated specificity, as assessed 3 weeks after grafting. (f) Percentage of Thy1.1 Tregs, as analyzed by FACS at the indicated time points, among CD4+ splenocytes from B6 mice grafted with B6 (&) or (’) DBA/2 bone marrow and injected with B6.Thy1.1 Tregs cultured in vitro in presence of DBA/2 APCs. The FACS plots above indicate Foxp3-staining on Thy1.1+CD4+ splenocytes. Horizontal bars indicate mean values. ***P o 0.001, **P o 0.01 (Student’s t-test). b c Donor cells in PBMC (%) 1 10 10 1, 0 00 0 NATURE MEDICINE VOLUME 14 [ NUMBER 1 [ JANUARY 2008 Thy1.1+ Treg among CD4+ (%) Donor cells in PBMCs (%) f Cell counts 1 10 1 1, 00 00 0 Cell counts log CD25 Donor cells in PBMCs (%) not BALB/c bone marrow from rejection (Fig. 1e). These results showed that the APCs used in the in vitro cultures determined the specificity of the Tregs in vivo. Moreover, despite the fact that in these mice Tregs had clearly been activated (as they prevented rejection of target bone marrow), they did not protect third-party grafts. Their suppressor effector function was therefore donor specific; they had not induced generalized immunosuppression. Our data showed that Tregs allow for the establishment of hematopoietic chimerism. We next analyzed whether this chimeric state, in its turn, created a favorable environment for the persistence of injected Tregs. We sublethally irradiated B6 mice, grafted them with allogeneic DBA/2 (H-2d) or syngeneic bone marrow, injected them with Tregs previously stimulated with DBA/2 APCs in vitro, and monitored the persistence of the injected Tregs in the mice (Fig. 1f). We found that substantially more injected Tregs persisted in spleens (but not in blood or lymph nodes; data not shown) of mice that had been injected with donor-type bone marrow. Moreover, these cells had maintained their expression of Foxp3 (Fig. 1f). These results show that donor hematopoietic cells and donor-specific Tregs mutually favor each other’s persistence in vivo. We wanted to know whether Tregs could also induce tolerance to solid allografts (Fig. 2). Three weeks after irradiation—the time it took the mice to recover from the preconditioning regimen—B6 animals received allogeneic DBA/2 skin transplants. We injected Tregs, cultured in vitro with donor-type APCs, immediately after irradiation (D0) or just before grafting the skin (D21). In contrast to the results for bone-marrow transplantation, in this setting skin grafts were rapidly rejected (Fig. 2a). Combined with previously published data12,13, these data suggested that alloantigen-specific Tregs alone do not induce immunological tolerance to allogeneic skin grafts, at least not at the cell doses tested. We therefore next tried to induce tolerance to skin allografts by combining Treg transfer with bone marrow transplantation to prolong Treg persistence. In addition, we expected that the induced chimeric state would contribute to induction of e *** Donor cells in PBMCs (%) d *** © 2008 Nature Publishing Group http://www.nature.com/naturemedicine log H-2Kd a allograft-tolerance. We reconstituted B6 hosts with DBA/2 bone marrow, injected them with in vitro cultured Tregs, and 3 weeks later grafted them with DBA/2 skin. Allogeneic skins did not show any macroscopic signs of rejection during the 100-d observation period, but third-party SJL skins were rapidly rejected (Fig. 2a). We obtained similar results with five other host-donor combinations and when using mice with substantially lower levels of hematopoietic chimerism (Supplementary Figs. 2 and 3a,b online). We also assessed whether mice in which Tregs protected a skin allograft from rejection were generally immunosuppressed. SJL mice received B6 bone marrow grafts, B6-specific Tregs and B6 and third-party DBA/2 skins on opposing flanks. Whereas in these mice B6 skins survived, DBA/2 skins were rapidly rejected (Fig. 2b). Treg-mediated allograft protection was therefore specific, and these cells did not induce generalized immunosuppression. At 100 d after transplantation, we submitted the skin grafts to histological analysis. The allografts showed only minor signs of rejection (that is, tissue damage), but we observed substantial infiltration by eosinophils and macrophages (Fig. 2d,g), which were previously observed in chronically rejected skin allografts15. Although this observation indicated that the combined Treg–bone marrow chimerism approach had not induced full immunological tolerance to allogeneic skins, 250 d after transplantation, allogeneic grafts still survived (Supplementary Fig. 3c). These results demonstrated that the combined Treg–hematopoietic chimerism approach protected allogeneic skin grafts from rejection but did not induce full immunological tolerance to the graft, despite persistent hematopoietic chimerism (Supplementary Fig. 3d). It therefore seems unlikely that this protocol will induce long-term protection of tissue allografts in clinical settings. Graft rejection is initiated when APCs present donor antigens from the transplanted tissue to host lymphocytes, which are then activated to attack the grafted organ via direct cytotoxicity, B cell help and induction of an inflammatory response16. Donor antigens from a 89 LETTERS 100 75 + BM + Treg αDBA/2 75 50 + Treg D0 + Treg D21 25 + BM + BM + Treg αDBA/2 (SJL skin) 50 25 0 0 0 10 20 30 40 50 100 Time (d) after skin graft c 100 Treg SJL αB6 B6 skin DBA/2 skin 75 50 0 0 10 20 30 40 50 100 d 100 + BM + Treg αF1 75 50 + BM + BM + Treg αF1 (SJL skin) 25 25 10 20 30 40 50 100 0 g 25 Infiltrates: None Weak Moderate Severe DBA/2 F1 Treg specificity DBA/2 → B6 (ctrl) f F4/80 HE Luna DBA/2 skin → B6, Treg αDBA/2 50 10 20 30 40 50 100 F4/80 HE 75 0 0 0 B6 → B6 (ctrl) e © 2008 Nature Publishing Group http://www.nature.com/naturemedicine b 100 100 (ctrl B6 skin) Mice (%) Graft survival (%) a Luna h DBA/2 skin → B6, Treg αF1 F4/80 F4/80 Luna HE Luna HE Figure 2 Tregs prevent acute and chronic skin allograft rejection. (a) Skin allograft survival, as monitored daily by assessment of macroscopic signs of rejection, in mice grafted under different conditions. Left, data for B6 recipient mice preconditioned with sublethal irradiation only (J, n ¼ 4) or combined with injection of Tregs preactivated in vitro with donor-type (DBA/2) APCs immediately after irradiation (‘‘D 0’’, , n ¼ 8) or 3 weeks later, just before DBA/2 (or control B6) skin transplantation (‘‘D 21’’, m, n ¼ 10). Control mice were irradiated and received a syngeneic skin graft (&, n ¼ 4). Right, data for B6 mice irradiated and injected with donor DBA/2 bone marrow with (, n ¼ 12, ’, n ¼ 8) or without (n, n ¼ 6) Tregs. Three weeks later, DBA/2 (or control SJL) skins were transplanted and their survival monitored. (b) Survival of ‘target’ B6 () and third-party DBA/2 (J) skins in SJL mice that were irradiated, injected with B6 bone marrow and Tregs cultured with B6 APCs, and grafted 3 weeks later with B6 and SJL skins on opposing flanks (n ¼ 4). (c) As in a (right), except that Tregs were precultured with (B6 DBA/2)F1 APCs (n, n ¼ 3; , n ¼ 8, ’, n ¼ 8). (d) Scoring of infiltrates of DBA/2 skins transplanted on mice that had received DBA/2 bone marrow and Tregs cultured with DBA/2 (n ¼ 12) or (B6 DBA/2)F1 (n ¼ 8) APCs. (e–h) Representative features of skin histopathology 100 d after transplantation (HE, H&E; F4/80, immunohistochemistry with an antibody to F4/80; Luna, Luna’s eosinophil stain). Scale bars represent 200 mm (HE), 400 mm (F4/80) or 40 mm (Luna). transplant are presented to T cells in two distinct ways, depending on the origin of the APCs1. First, donor APCs migrate from the graft to secondary lymphoid organs where they activate host T cells, which therefore recognize donor antigens presented by donor MHC molecules. In contrast to this ‘direct’ pathway, donor antigens can also be picked up in the transplanted tissue by host APCs, processed and then presented to T cells on self-MHC molecules (‘indirect allorecognition’). Whereas acute organ graft rejection has been attributed mainly to direct antigen presentation, chronic rejection is thought to be mediated mostly by T cells specific for indirectly presented donor antigens1. In our in vitro culture protocol, we activated host Tregs with donor-type APCs. The injected Treg population was therefore enriched in cells specific for directly presented alloantigens17. This may explain why acute skin allograft rejection was efficiently inhibited while chronic rejection still occurred. Tregs specific for indirectly presented alloantigens might, therefore, be able to prevent the chronic immune response to the graft (Supplementary Note 2 online). To test this hypothesis, we expanded Tregs with (host donor)F1 APCs. B6 hosts were transplanted with DBA/2 bone marrow and 90 simultaneously injected with Tregs that had previously been expanded in vitro with (B6 DBA/2)F1 APCs. Three weeks later, mice were grafted with DBA/2 (or third-party SJL) skin and allograft survival was monitored. Whereas third-party skins were rejected, ‘target’ skin grafts survived the whole 100-d monitoring period (Fig. 2c). We obtained similar results with the reciprocal host-donor combination (Supplementary Fig. 3e). When, at 100 d after grafting, we subjected the DBA/2 skins to histological analysis, we observed healthy skin without eosinophil or macrophage infiltration (Fig. 2d,h). The fundamental difference between our results with Tregs specific for directly versus both directly and indirectly presented alloantigens occurred despite similar hematopoietic chimerism in the two experimental conditions (Supplementary Fig. 3d). These results show that, in combination with hematopoietic chimerism, Tregs specific for directly and indirectly presented alloantigens protected skin allografts from acute and chronic rejection. We next wanted to know whether Tregs cultured appropriately in vitro would also induce tolerance to cardiac allografts (Fig. 3). Irradiated host mice received allogeneic bone marrow grafts, VOLUME 14 [ NUMBER 1 [ JANUARY 2008 NATURE MEDICINE LETTERS + Treg D0 + Treg D21 25 10 20 30 40 50 100 Time (d) after transplantation 50 + BM 25 0 0 10 20 30 40 50 100 Time (d) after transplantation e B6 heart → B6 (ctrl) 4 *** 3 f 2 1 DBA/2 heart → B6 (Treg αF1) 0 DBA/2 F1 Treg specificity DBA/2 heart → B6 (Treg αDBA/2) Masson HE 0 75 Masson 0 + BM + Treg αDBA/2 + BM + Treg αF1 HE 50 c 100 Rejection score at day 100 75 Graft survival (%) (ctrl B6 heart) HE d b 100 Masson © 2008 Nature Publishing Group http://www.nature.com/naturemedicine Graft survival (%) a Figure 3 Tregs prevent acute and chronic cardiac allograft rejection. (a) Cardiac allograft survival, monitored daily (for 100 d) by abdominal palpation, in B6 mice that were preconditioned with sublethal irradiation only (J, n ¼ 2) or with irradiation and injection of Tregs preactivated in vitro with donor-type (DBA/ 2) APCs immediately after irradiation (‘‘D 0’’, m, n ¼ 5) or 3 weeks later (‘‘D 21’’, ’, n ¼ 5) and then transplated 3–8 weeks later with donor DBA/2 hearts. Control mice were irradiated and received a syngeneic B6 heart graft (&, n ¼ 4). (b) Data as in a for B6 mice that were irradiated and injected with donor DBA/2 bone marrow with (, n ¼ 12, &, n ¼ 9) or without (n, n ¼ 2) Tregs cultured in vitro with DBA/2 () or (B6 DBA/2)F1 (&) APCs and then transplanted 3–8 weeks later with donor DBA/2 hearts. (c) Clinical score of DBA/2 cardiac allograft rejection 100 d after transplantation into sublethally irradiated hosts grafted with DBA/2 bone marrow and injected with Tregs preactivated in vitro with DBA/2 (n ¼ 12) or (B6 DBA/2)F1 (n ¼ 9) APCs, as indicated. *** P o 0.001 (Student’s t-test). (d–f) Representative features of cardiac histopathology 100 d after transplantation of B6 (d) or DBA/2 (e,f) hearts in B6 hosts. Specificity of injected Tregs is indicated in the figure. Scale bar represents 200 mm in left panels and 50 mm in right panels. in vitro–cultured Tregs and, 3–8 weeks later, allogeneic heart transplants. Whereas in the control groups the hearts were rejected, in treated mice the grafted hearts continued beating for more than 100 d after transplantation (Fig. 3a,b and Supplementary Fig. 4a online). Prevention of rejection was partially dependent on IL-10 (Supplementary Fig. 1c). At 100 d after transplantation, the beating hearts were removed for histological analysis. In hearts grafted into mice that had received Tregs specific for directly presented alloantigens only, we observed large, diffuse infiltrates of mononuclear cells and eosinophils, destruction of cardiac muscle fibers, thickening of the intima, arteriosclerosis and extended areas of fibrosis replacing contractile tissue (Fig. 3e and Supplementary Fig. 4b), all typical signs of chronic cardiac allograft rejection. All the hearts thus analyzed showed moderate to severe chronic rejection (Fig. 3c and Supplementary Fig. 4c). In contrast, hearts grafted into mice that had received Tregs specific both for directly and indirectly presented alloantigens showed little or no signs of rejection (Fig. 3b,c,f). This difference occurred despite similar hematopoietic chimerism in both cases (Supplementary Fig. 4d). These data show that Tregs specific for both directly and indirectly presented donor antigens, in combination with mixed hematopoietic chimerism, prevented both acute and chronic rejection of heart allografts. Our findings show that host CD4+CD25+Foxp3+ Tregs, when appropriately stimulated in vitro, can be used to induce immunological tolerance to bone marrow and subsequent skin or cardiac allografts in hosts submitted to non-lymphoablative g-irradiation, preventing both acute and chronic rejection (Supplementary Note 3 online). Suppression of rejection is most likely due to two interdependent mechanisms. First, Tregs suppress host lymphocytes and thus directly contribute to acceptance of the allograft. Second, NATURE MEDICINE VOLUME 14 [ NUMBER 1 [ JANUARY 2008 immunosuppression by Tregs also helps in establishing a chimeric hematopoietic state, allowing the persistence of injected Tregs and contributing to the induction of central and peripheral immunological tolerance of the allografts18. We showed here that mixed hematopoietic chimerism did not induce immunological tolerance to skin and cardiac allografts. This important conclusion is consistent with data on transplantation in mixed hematopoietic chimeras19–22. Transplantation protocols based exclusively on the induction of hematopoietic chimerism will therefore most probably not yield permanent tolerance to, and survival of, allografts. In conclusion, we have demonstrated that adequately prestimulated Tregs can be used to protect skin and cardiac allografts from acute and chronic rejection. The preconditioning regimen used in our study has a level of toxicity that may be acceptable in clinical settings23. However, other protocols aimed at the induction of hematopoietic chimerism are currently being tested in clinical trials24–26 and could be used, in combination with injection of in vitro activated Tregs, to replace the one we used. Moreover, human Tregs with indirect specificity can be expanded in vitro27. Induction of tolerance to organs or tissues to be taken from live donors should therefore be feasible using our protocol or a modified version thereof. We can also predict that it could, after adaptation, be used to induce tolerance to transplants taken from cadaveric donors. METHODS Mice. Sex-matched mice between 6 and 10 weeks of age were used. Mice were purchased from the Centre de Recherche et d’Elevage Janvier. Thy1.1 B6 mice and IL-10–deficient B6 mice were purchased from Charles River. dnTbRIItransgenic B6 mice28 were bred in our specific pathogen–free animal facility. All 91 LETTERS © 2008 Nature Publishing Group http://www.nature.com/naturemedicine experiments involving animals were performed in compliance with relevant laws (authorization no. 31-13) and institutional guidelines (Institut National de Santé et de la Recherche Médicale, Inserm) and were approved by the local ethics committee (Midi-Pyrénées, France; ref. MP/01/31/10/03). Antibodies. Antibodies with the following specificities were used for analyses and purification of Tregs: H-2Kb (AF6-88.5), H-2Kd (SF1-1.1), H-2Ks (5KH49), H-2Kk (36-7-5) (BD PharMingen); CD4 (GK1.5), CD8 (53.6.7), Thy1.1, CD25 (PC61), Foxp3 (FJK-16s, eBioscience); F4/80 (CI:A3-1, Serotec). Hybridoma supernatants of antibodies recognizing FcgRII/III (2.4G2), CD8 (53.6.7), MHC class II (M5/114.15.2) and Thy1.2 (AT83) were produced in our laboratory. Purification and in vitro culture of CD4+CD25+ T cells. CD4+CD25+ splenic T cells were purified and cocultured with g-irradiated splenocytes as previously described17. Bone marrow allografts. Bone marrow cells from femurs and tibias were prepared as previously described17. 107 cells were injected intravenously into g-irradiated mice (5 Gy, 137Cs source). Flow cytometry. Hematopoietic reconstitution and Treg persistence were determined by analyzing peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or splenocytes at indicated time points. Erythrocyte-depleted cells were resuspended in 2.4G2 hybridoma supernatant and saturating concentrations of indicated antibodies (Fig. 1) were added. Acquisition was performed on a FACSCalibur or an LSR II cytometer and data were analyzed using CellQuest (BD Biosciences) or FlowJo (Tree Star) software. Foxp3 analysis was performed according to the manufacturer’s instructions (eBioscience). Skin and cardiac transplantation. Skin graft was performed as previously described29. Skins were considered rejected if Z70% of the surface was necrotic. Heterotopic heart transplantation was performed in the surgery section of the Institut Fédératif de Recherche 31 animal facility according to a published method30 with some modifications. Functionality of the transplanted heart was monitored daily by abdominal palpation. Clinical rejection was defined by cessation of palpable heartbeats and confirmed by autopsy. Loss of graft function within 48 h of transplantation was considered as a technical failure (o5%), and animals in which this occurred were omitted from the analysis. Histological analysis. Skin biopsies and hearts were fixed in 10% buffered formalin and embedded in paraffin. Sections were stained with H&E, Masson’s trichrome or Luna’s eosinophil stain or using antibodies specific for F4/80. Heart rejection was graded from 0 (none) to 4 (severe): 0, no rejection; 1, slight perivascular mononuclear cell infiltration; 2, intense and/or interstitial mononuclear cell infiltration; 3, intense interstitial mononuclear cell infiltration associated with myocyte loss and slight fibrosis; 4, interstitial mononuclear cell infiltration associated with myocardial necrosis and massive fibrosis. Statistics. Statistical significance was determined using Student’s t-test. Note: Supplementary information is available on the Nature Medicine website. ACKNOWLEDGMENTS The authors would like to thank M.-C. Cuturi, J. Cohen and C. Reis e Sousa for valuable advice and critical comments on the manuscript, J.-C. Guéry for stimulating discussions, F. Powrie (University of Oxford, UK) and R. Flavell (Yale University) for transgenic mice, the personnel of the Institut Fédératif de Recherche 30, Institut Fédératif de Recherche 31 and Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale animal facilities for expert animal husbandry, F. Capilla for preparation of histological specimens, the personnel of the Institut Fédératif de Recherche 30 flow cytometry facility for technical assistance, and C. Joffre for her permanent support. This work was supported in part by grants from the Région Midi Pyrénées (nos. 01008776 and 03011999), the Etablissement Français des Greffes (2003), the Roche Organ Transplantation Research Foundation (ROTRF no. 133456773) and the Ligue Nationale contre le Cancer (no. GL/VP-4825 to O.J.). AUTHOR CONTRIBUTIONS O.J. and T.S. performed, and contributed to the design of, the in vitro and in vivo experiments and interpreted results; D.C. designed and performed cardiac transplantations; T.A.S. helped in the design and interpretation of histological 92 analysis; D.H. and P.R. contributed to the design of experiments and interpretation of results; J.P.M.v.M. directed the study and wrote the paper; and all authors contributed to writing and critically reviewing the manuscript. Published online at http://www.nature.com/naturemedicine Reprints and permissions information is available online at http://npg.nature.com/ reprintsandpermissions 1. Lechler, R.I., Sykes, M., Thomson, A.W. & Turka, L.A. Organ transplantation—how much of the promise has been realized? Nat. Med. 11, 605–613 (2005). 2. Waldmann, H. & Cobbold, S. Exploiting tolerance processes in transplantation. Science 305, 209–212 (2004). 3. Stockinger, B. T lymphocyte tolerance: from thymic deletion to peripheral control mechanisms. Adv. Immunol. 71, 229–265 (1999). 4. Shevach, E.M. et al. The lifestyle of naturally occurring CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells. Immunol. Rev. 212, 60–73 (2006). 5. Sakaguchi, S. et al. Foxp3+ CD25+ CD4+ natural regulatory T cells in dominant selftolerance and autoimmune disease. Immunol. Rev. 212, 8–27 (2006). 6. Izcue, A., Coombes, J.L. & Powrie, F. Regulatory T cells suppress systemic and mucosal immune activation to control intestinal inflammation. Immunol. Rev. 212, 256–271 (2006). 7. Belkaid, Y., Blank, R.B. & Suffia, I. Natural regulatory T cells and parasites: a common quest for host homeostasis. Immunol. Rev. 212, 287–300 (2006). 8. Rouse, B.T., Sarangi, P.P. & Suvas, S. Regulatory T cells in virus infections. Immunol. Rev. 212, 272–286 (2006). 9. Aluvihare, V.R., Kallikourdis, M. & Betz, A.G. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nat. Immunol. 5, 266–271 (2004). 10. Beyer, M. & Schultze, J.L. Regulatory T cells in cancer. Blood 108, 804–811 (2006). 11. Joffre, O. & van Meerwijk, J.P.M. CD4+CD25+ regulatory T lymphocytes in bone marrow transplantation. Semin. Immunol. 18, 128–135 (2006). 12. Nishimura, E., Sakihama, T., Setoguchi, R., Tanaka, K. & Sakaguchi, S. Induction of antigen-specific immunologic tolerance by in vivo and in vitro antigen-specific expansion of naturally arising Foxp3+CD25+CD4+ regulatory T cells. Int. Immunol. 16, 1189–1201 (2004). 13. Golshayan, D. et al. In vitro-expanded donor alloantigen-specific CD4+CD25+ regulatory T cells promote experimental transplantation tolerance. Blood 109, 827–835 (2007). 14. Thornton, A.M. & Shevach, E.M. Suppressor effector function of CD4+CD25+ immunoregulatory T cells is antigen nonspecific. J. Immunol. 164, 183–190 (2000). 15. Le Moine, A. et al. Critical roles for IL-4, IL-5, and eosinophils in chronic skin allograft rejection. J. Clin. Invest. 103, 1659–1667 (1999). 16. Rocha, P.N., Plumb, T.J., Crowley, S.D. & Coffman, T.M. Effector mechanisms in transplant rejection. Immunol. Rev. 196, 51–64 (2003). 17. Joffre, O., Gorsse, N., Romagnoli, P., Hudrisier, D. & van Meerwijk, J.P.M. Induction of antigen-specific tolerance to bone marrow allografts with CD4+CD25+ T lymphocytes. Blood 103, 4216–4221 (2004). 18. Sykes, M. Mixed chimerism and transplant tolerance. Immunity 14, 417–424 (2001). 19. Boyse, E.A., Lance, E.M., Carswell, E.A., Cooper, S. & Old, L.J. Rejection of skin allografts by radiation chimaeras: selective gene action in the specification of cell surface structure. Nature 227, 901–903 (1970). 20. Ildstad, S.T., Wren, S.M., Bluestone, J.A., Barbieri, S.A. & Sachs, D.H. Characterization of mixed allogeneic chimeras. Immunocompetence, in vitro reactivity, and genetic specificity of tolerance. J. Exp. Med. 162, 231–244 (1985). 21. Sharabi, Y. & Sachs, D.H. Mixed chimerism and permanent specific transplantation tolerance induced by a nonlethal preparative regimen. J. Exp. Med. 169, 493–502 (1989). 22. Luo, B., Chan, W.F., Shapiro, A.M. & Anderson, C.C. Non-myeloablative mixed chimerism approaches and tolerance, a split decision. Eur. J. Immunol. 37, 1233–1242 (2007). 23. Vriesendorp, H.M. Aims of conditioning. Exp. Hematol. 31, 844–854 (2003). 24. Cosimi, A.B. & Sachs, D.H. Mixed chimerism and transplantation tolerance. Transplantation 77, 943–946 (2004). 25. Fudaba, Y. et al. Myeloma responses and tolerance following combined kidney and nonmyeloablative marrow transplantation: in vivo and in vitro analyses. Am. J. Transplant. 6, 2121–2133 (2006). 26. Salama, A.D., Womer, K.L. & Sayegh, M.H. Clinical transplantation tolerance: many rivers to cross. J. Immunol. 178, 5419–5423 (2007). 27. Jiang, S., Camara, N., Lombardi, G. & Lechler, R.I. Induction of allopeptidespecific human CD4+CD25+ regulatory T cells ex vivo. Blood 102, 2180–2186 (2003). 28. Gorelik, L. & Flavell, R.A. Abrogation of TGFb signaling in T cells leads to spontaneous T cell differentiation and autoimmune disease. Immunity 12, 171–181 (2000). 29. Coudert, J.D., Coureau, C. & Guery, J.C. Preventing NK cell activation by donor dendritic cells enhances allospecific CD4 T cell priming and promotes Th type 2 responses to transplantation antigens. J. Immunol. 169, 2979–2987 (2002). 30. Corry, R.J., Winn, H.J. & Russell, P.S. Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection. Transplantation 16, 343–350 (1973). VOLUME 14 [ NUMBER 1 [ JANUARY 2008 NATURE MEDICINE SUPPLEMENTARY DATA : DISCUSSION En supplementay Data de cette publication, nous présentons diverses expériences complémentaires, venant renforcer le message principal du papier mais également apporter de précieuses informations sur le rôle des Tregs en transplantation. Ainsi, nous avons étudié l’implication des cytokines anti-inflammatoires TGF-β et IL-10 et avons pu montrer, dans notre modèle d’irradiation létale, que la sensibilité au TGF-β des lymphocytes T effecteurs était une condition sine qua none pour que l’induction de tolérance à une allogreffe de moelle osseuse, par les Tregs, puisse se dérouler. Cette cytokine est donc un mécanisme important mis en jeu par les Tregs. Toutefois, il reste à déterminer l’origine de sa production : les Tregs en sont-ils la source ? Ou induisent-ils d’autres populations (Lymphocytes T, Cellules dendritiques, etc.) capables de la produire ? Concernant l’IL-10, nous avons observé que si cette cytokine n’était pas impliquée dans la mise en place d’une tolérance lors de la greffe de moelle osseuse, sa production par les Tregs est, elle, indispensable à la survie à long terme d’un cœur. Cette différence dans l’implication de l’IL-10, selon la nature de l’organe à protéger, sera discutée dans le Chapître « Discussion et Perspectives ». Dans la figure supplémentaire n°2, nous avons reproduit l’état de tolérance, induit par les Tregs, dans différentes combinaisons. Il est donc important de noter que, contrairement à l’induction de tolérance par traitement à base d’anticorps ou par chimérisme, la protection n’est pas dépendante du fond génétique utilisé. D’autant plus que, dans nos expériences, les receveurs et les donneurs différent totalement, tant au niveau des antigènes majeures (CMH) que des mineurs. Ceci laisse à penser qu’un tel protocole, en plus de palier efficacement aux drogues immunosuppressives, pourrait considérablement élargir le nombre de donneurs potentiels en clinique humaine, en éliminant la nécessité d’une compatibilité, même partielle, entre le donneur et le receveur. Une perspective intéressante, toujours dans le cadre d’une application chez l’Homme, sera de tester notre protocole dans des modèles de xénotransplantation, particulièrement difficile à inhiber, notamment en raison du rejet hyperaigu auxquels ils sont associés. Par la suite, nous avons mis à jour des résultats particulièrement intéressants. En effet, nous avons montré que la tolérance induite, dans le cas de la peau, pouvait être maintenue, malgré un faible chimérisme (inférieur ou égale à 10%). Cela est d’autant plus important qu’il a été montré qu’un chimérisme pouvait altérer la réponse immune vis-à-vis de certaines infections chroniques, le virus profitant alors d’une faille dans la sélection des lymphocytes T pour se cacher à l’intérieur des cellules de la moelle. Plus le chimérisme est faible, moins cette altération est importante. Enfin, cela confirme de nombreux résultats, montrant que l’induction d’un micro-chimérisme peut suffire à induire une tolérance. 95 De façon importante, nous avons également pu montrer que, dans le cas de la greffe de peau, l’induction de tolérance en présence de Tregs spécifiques uniquement pour la voie directe, si elle montre bien des évidences histologiques d’une activation immunitaire dès 100 jours post-greffe, ne s’accompagne pas d’un rejet efficient de la peau, celle-ci survivant jusqu’à plus de 250 jours après la greffe. Ces données vont à l’encontre de celles observées pour le cœur où les dégats observés à 100 jours sont parfois très importants et altèrent la fonction même de l’organe. On pourrait en conclure que l’impact du rejet chronique varie selon l’organe observé, notamment selon l’intensité de son irriguation et de l’inflammation de la greffe provoque. Une autre explication de cette différence pourrait provenir d’anciennes études montrant que, selon l’endroit où elle est prélevée chez le donneur, la peau n’est susceptible de la même façon d’activer une réponse immunitaire contre les antigènes mineurs, en partie responsables du rejet chronique. Enfin, toujours dans la figure supplémentaire 3, nous montrons que malgré l’apparition d’un rejet chronique, le chimérisme n’est pas affecté chez les receveuses. Ce contrôle nous permet d’affirmer que le rejet n’est pas du à un défaut du niveau de chimérisme mais bien à son incapacité à induire une tolérance totale du greffon. Enfin, dans la dernière figure, nous avons voulu vérifier si la tolérance partielle induite par notre protocole n’était pas simplement du à un « artefact », du à la combinaison choisie. Pour cela, nous avons utilisé une moelle osseuse puis un cœur Balb/c, présentant les mêmes molécules de CMH que les souris DBA/2 (H-2d) mais un génome totalement différent. Là encore, le rejet chronique est évident et il n’est pas associé à une altération du niveau de chimerisme chez les receveuses. 96 Supplementary Figure 1 The roles of TGF-β and IL-10 in protection of bone marrow and heart allografts by Treg. (a) Sublethally irradiated B6 mice were grafted with BALB/c bone marrow cells and injected or not with Treg from wt or IL-10 deficient B6 mice, pre-activated in vitro with BALB/c APC. Hematopoietic chimerism was assessed by FACS analysis three weeks after bone marrow transplantation. Squares indicate percentage of donor (H-2Kd+) cells among PBMC from individual mice. Horizontal bars indicate mean values. (b) B6 mice were lethally irradiated and grafted with a 1:1 mixture of B6 and (B6 x DBA/2)F1 (H-2bd) bone marrow. The host’s immune system was reconstituted by injection of wt or dnTβRIItransgenic B6 splenocytes and injected or not with wt Treg, pre-activated in vitro with (B6 x DBA/2)F1 (donor-type) APC. PBMC were analyzed as in (a). ***P<0.001, n.s., not significant (Student’s t test). (c) B6 mice were sublethally irradiated and injected with BALB/c bone marrow cells and Treg from wt (, n=5) or IL-10 deficient (, n=11) B6 mice, in vitro cultured in presence of BALB/c APC. Three to eight weeks later, mice were transplanted with a BALB/c cardiac allograft. Graft survival was monitored daily by abdominal palpation. Kaplan-Meyer curves indicate allograft survival during the 100-day observation period. Supplementary Figure 2 Treg, in combination with hematopoietic chimerism, prevent rejection of fully allogeneic skin grafts. B6 (a), SJL (b,c), and DBA/2 (d,e) hosts were sublethally irradiated, injected with donor SJL (a, d), DBA/2 (b), or B6 (c, e) bone-marrow with or without Treg cultured in vitro with APC of indicated mouse-strain. Three weeks later, donor skins were transplanted and their survival monitored. (a) , n=6, , n=10, , n=8, (b) , n=3, , n=8, , n=8; (c) , n=4, , n=8, , n=8; (d) , n=4, , n=8, , n=8; (e) , n=3, , n=8, , n=8. Supplementary Figure 3 Treg and hematopoietic chimerism prevent skin-allograft rejection. (a,b) B6 hosts were sublethally irradiated, grafted with a mixture of B6 and DBA/2 bonemarrow cells (1:1 ratio), and injected or not (as indicated) with B6 Treg beforehand cultured in presence of DBA/2 APC. (a) Induced hematopoietic chimerism, as assessed at three weeks post-transplantation, by FACS analysis of PBMC. Indicated are the percentages of donor cells (H-2Kd+) among PBMC. (b) Three weeks post grafting, DBA/2 skins were transplanted on the chimeras and their survival monitored macroscopically. , n=3, , n=9. (c) B6 hosts were irradiated, injected with DBA/2 bone-marrow with (, n=6) or without (, n=3) Treg cultured in vitro with DBA/2 APC. Three weeks later, indicated skins were transplanted and their survival monitored for 250 days. (d) PBMC from mice treated as described in the legend of Fig. 2 were analyzed by FACS at 100 days post skin transplantation, the day mice were euthanized and biopsies taken for histological analysis. Indicated are the percentages of donor cells (H-2Kd+) among PBMC. (e) DBA/2 mice were irradiated, grafted with B6 bone marrow, injected or not (as indicated) with Treg in vitro cultured with (B6 x DBA/2)F1 APC, and grafted, three weeks later, with indicated skins. Skin graft survival was monitored macroscopically. Supplementary Figure 4 Treg specific for directly presented alloantigens prevent acute but not chronic cardiac allograft rejection. (a) B6 recipient mice were preconditioned i) with sublethal irradiation only (, n=6), ii) with irradiation and injection of BALB/c (H-2d) bone marrow (▲, n=5), or iii) with irradiation and injection of donor bone marrow and Treg preactivated in vitro (, n=5). Three to eight weeks later, mice were transplanted with BALB/c hearts. Allograft survival was monitored. (b) Representative features of cardiac histopathology 100 days after transplantation (HE, hematoxylin and eosin; Masson, Masson’s trichrome stains). Scale bar represents 200 µm in left panels, 100 µm in upper right panels, and 40 µm in lower right panels. (c) Clinical score of BALB/c heart graft rejection 100 days post-transplantation. Clinical scores of B6 hearts transplanted into sublethally irradiated B6 hosts are shown as comparison (n=5). **P<0.01 (Student’s t test). (d) PBMC from mice treated as described in the legend of Fig. 3 were analyzed by FACS at 100 days post cardiac transplantation, the day mice were euthanized and hearts taken for histological analysis. Indicated are the percentages of donor cells (H-2Kd+) among PBMC. Supplementary Note 1 Rational for the use of in vitro cultured Treg In this report we used Treg prestimulated in vitro with donor-type APC. Freshly isolated Treg did not induce tolerance to bone marrow allografts in our previous study, probably for quantitative reasons1. Moreover, very large numbers of non-specifically expanded Treg were required to inhibit bone-marrow allograft rejection in another report2. Also in reports on Tregmediated prevention of GvHD it was shown that Treg in vitro cultured with specific APC are more potent than cells expanded in vitro with third-party APC3,4. In vitro culture therefore has two advantages: it increases the available numbers of Treg and improves their in vivo reactivity. Moreover, the use of in vitro cultured cells allows for evaluation of their in vivo antigen-specificity during the suppressor-effector phase (Fig. 1e). 1. Joffre, O., Gorsse, N., Romagnoli, P., Hudrisier, D. & van Meerwijk, J.P.M. Induction of antigen-specific tolerance to bone marrow allografts with CD4+CD25+ T lymphocytes. Blood 103, 4216-4221 (2004). 2. Taylor, P.A. et al. L-Selectin(hi) but not the L-selectin(lo) CD4+25+ T-regulatory cells are potent inhibitors of GVHD and BM graft rejection. Blood 104, 3804-3812 (2004). 3. Cohen, J.L., Trenado, A., Vasey, D., Klatzmann, D. & Salomon, B.L. CD4(+)CD25(+) Immunoregulatory T Cells: New Therapeutics for Graft-Versus-Host Disease. J. Exp. Med. 196, 401-406. (2002). 4. Trenado, A. et al. Recipient-type specific CD4+CD25+ regulatory T cells favor immune reconstitution and control graft-versus-host disease while maintaining graftversus-leukemia. J. Clin. Invest. 112, 1688-1696 (2003). Supplementary Note 2 Evidence that Treg with indirect specificity may prevent allograft rejection The hypothesis we postulated in this report stating that Treg specific for indirectly presented alloantigens could prevent chronic allograft-rejection is consistent with previously published data showing that tolerance to allografts induced by blockade of costimulatory molecules, which is known to be mediated by Treg1, requires host MHC class II2. Also other evidence supports the notion that Treg specific for indirectly presented alloantigens may be involved in prevention of allograft-rejection3-6, e.g. by inhibiting production of alloantibodies7. 1. Taylor, P.A., Noelle, R.J. & Blazar, B.R. CD4+CD25+ Immune Regulatory Cells Are Required for Induction of Tolerance to Alloantigen via Costimulatory Blockade. J. Exp. Med. 193, 1311-1318 (2001). 2. Yamada, A. et al. Cutting Edge: Recipient MHC Class II Expression Is Required to Achieve Long-Term Survival of Murine Cardiac Allografts After Costimulatory Blockade. J. Immunol. 167, 5522-5526 (2001). 3. Hara, M. et al. IL-10 Is Required for Regulatory T Cells to Mediate Tolerance to Alloantigens In Vivo. J. Immunol. 166, 3789-3796 (2001). 4. Wood, K.J. & Sakaguchi, S. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nat. Rev. Immunol. 3, 199-210 (2003). 5. Lechler, R.I., Sykes, M., Thomson, A.W. & Turka, L.A. Organ transplantation--how much of the promise has been realized? Nat. Med. 11, 605-613 (2005). 6. Golshayan, D. et al. In vitro-expanded donor alloantigen-specific CD4+CD25+ regulatory T cells promote experimental transplantation tolerance. Blood 109, 827-835 (2007). 7. Callaghan, C.J. et al. Abrogation of antibody-mediated allograft rejection by regulatory CD4 T cells with indirect allospecificity. J. Immunol. 178, 2221-2228 (2007). Supplementary Note 3 Different transplanted tissues are differentially affected by Treg-specificity Interestingly, whereas Treg specific for directly and indirectly presented alloantigens fully protected all three tested tissues (bone marrow, skin, and heart), cells specific for directly presented alloantigens differentially affected their rejection. When the latter cells were administered, bone-marrow allografts showed indefinite survival; skin grafts showed signs of chronic rejection (eosinophil and macrophage infiltration), but without widespread tissue destruction; and cardiac allografts were heavily infiltrated and extensive tissue-destruction associated with fibrosis was observed. This observation suggests that rejection of the three tested tissues is mediated by distinct mechanisms, differentially affected by Treg specific for directly presented alloantigens but all inhibited by cells activated by the direct and indirect pathways. More work will need to be done to assess the rejection mechanisms involved and to understand the differential Treg-specificity requirements to control them. CONCLUSION En réalisant ce travail, notre objectif premier était de réussir à induire une tolérance aux alloantigènes, grâce aux lymphocytes T régulateurs, dans un modèle proche des conditions de clinique humaine. Sur ce point, les résultats obtenus sont particulièrement encourageants mais ne sauraient cacher la longue route semée d’obstacles qu’il reste encore à parcourir avant qu’un tel protocole soit applicable chez l’Homme. Les conditions de sélection des Tregs, leur amplification in vitro, les problèmes logistiques et de pré-conditionnement des receveurs, sont autant de freins qu’il nous faudra résoudre, en passant notamment chez le primate. Notre deuxième objectif était, toujours dans le cadre d’une application chez l’Homme, d’étendre la tolérance acquise à la greffe d’organes solides comme le cœur ou la peau. Malheureusement, nos premiers résultats indiquaient des traces évidentes de rejet lors des coupes histologiques : infiltrats massifs, destructuration du tissu musculaire et fibrose dans le cas du cœur. Mais des analyses plus poussées ont rapidement révélées que ces altérations relevaient en réalité du développement progressif d’un rejet chronique. Ces résultats étaient donc la preuve que l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique ne suffit pas à engendrer une tolérance totale vis-à-vis d’une allogreffe. Plus important, nous avons par la suite montré que des Tregs, pré-activés par les deux voies d’alloreconnaissance, inhibaient le développement des rejets aigu et chronique. Enfin, ces travaux nous ont permis d’étudier les mécanismes impliqués dans l’établissement d’une tolérance aux alloantigènes par les lymphocytes T régulateurs. Nous avons ainsi pu montrer l’implication du TGF-β et de l’IL-10, respectivement lors de la greffe de moelle osseuse et de cœur. Toutefois, cet obectif est loin d’être accomplit puisque ces deux cytokines peuvent difficilement à elles seules expliquer l’incroyable potentiel suppresseur des Tregs. De nombreux autres mécanismes ont été associés aux Tregs et il nous reste à déterminer lesquels sont impliqués dans notre modèle d’induction de tolérance. 97 RESULTATS PRELIMINAIRES 98 OBJECTIFS Nos travaux ont ainsi pu montrer que les lymphocytes T régulateurs peuvent induire une tolérance durable et spécifique vis-à-vis d’alloantigènes, non seulement dans le cadre d’une greffe de moelle osseuse mais également lors de la transplantation d’organes solides, tels le cœur et la peau. Dans ce dernier cas, nous avons également pu montrer que les Tregs protégeaient non seulement du rejet aigu mais, de façon plus importante, du rejet chronique. Une des perspectives évidentes de ce travail consiste à étudier les mécanismes mis en place par les cellules régulatrices afin d’établir cette tolérance. Nous nous sommes donc tout naturellement intéressés aux cytokines antiinflammatoires, IL-10 et TGF-b, connues pour être dans certains modèles, produites par les Tregs et indispensables à leurs fonctions immunosuppressives. Nous avons ainsi pu montrer dans le précédent article que les lymphocytes T effecteurs, responsables du rejet, doivent absolument être sensibles au TGF-β, sans quoi l’induction de tolérance ne peut plus avoir lieu. A l’inverse, l’IL-10, produite par les Tregs, ne semble jouer aucun rôle dans notre modèle de greffe de moelle osseuse. En revanche, son rôle s’avère majeur pour la survie à long terme du cœur. Toutefois, hormis ces cytokines, il existe de nombreux autres mécanismes utilisés par les lymphocytes T régulateurs pour inhiber l’activation, la prolifération, la différenciation et/ou l’action des cellules effectrices. L’objectif de ce nouveau travail a donc été de faire un état de lieux des différents mécanismes impliqués. Etant donné son rôle majeur dans l’induction de la tolérance aux alloantigènes dans le cadre foeto-maternel, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à l’indoléamine 2,3 dioxygénase (IDO) et aux diverses molécules susceptibles d’induire sa production in vivo (IFN-γ, CD80/86). 99 RESULTATS PRELIMINAIRES Introduction Les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ Foxp3+ (Tregs) jouent un rôle crucial dans de nombreuses physiopathologies. Ainsi, il a été montré qu’ils participaient à la prévention de l’autoimmunité (401, 402) et des maladies immunoinflammatoires (403), dans la régulation de l’immunité anti-virale et antiparasitaire (404, 405) et dans l’inhibition des réponses anti-tumorales (406). Plus récemment, il a également été montré que les Tregs étaient indispensables à la maintenance de la tolérance foeto-maternelle (383), c'est-à-dire à l’induction d’une tolérance vis-à-vis d’alloantigènes. Cette découverte, couplée à la capacité de ces cellules à inhiber l’apparition de la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) (398), a conduit de nombreuses équipes à envisager leur utilisation en transplantation, lors de protocole de thérapie cellulaire. Notre équipe a ainsi pu montrer que des Tregs purifiés à partir d’animaux non manipulés et expandus in vitro de manière adéquate, induisent une tolérance vis-àvis d’une greffe de moelle osseuse totalement allogénique chez des animaux faiblement irradiés. Plus important, consécutivement à ce conditionnement, les receveurs acceptent une greffe de cœur ou de peau sans présenter d’épisodes de rejet aigu ou chronique. Lors de ces travaux, nous avons également démontré que le TGF-β était indispensable à la prise de la greffe de moelle osseuse tandis que l’IL-10 participait à la survie à long terme du cœur. D’autres mécanismes, dont l’implication varie d’un modèle à un autre, ont été associés aux lymphocytes T régulateurs. Ainsi, il a été montré par l’équipe de Kathrine Woods que la production transitoire d’IFN-γ par les Tregs est indispensable à l’induction de tolérance vis-à-vis d’alloantigène, suite à un traitement à base d’anticorps bloquant (301). Un autre mécanisme impliqué est l’intéraction entre la molécule CTLA-4 à la surface des cellules regulatrices et les molécules de costimulation CD80/86 à la surface des cellules effectrices (355). Enfin, de façon intéressante, il a été montré que les Tregs peuvent induire la synthèse de l’indoléamine 2,3 dioxygénase (IDO) par les cellules dendritiques (307, 401). Cette induction peut se faire soit par l’intéraction entre la molécule CTLA-4, à la surface de la cellule régulatrice, et les molécules de co-stimulation CD80/86 à la surface de la cellule dendritique soit par la production d’IFN-γ par la Treg. Une fois produite, cette enzyme permet le catabolisme du tryptophane. Ce faisant, l’IDO appauvrit le milieu en cet acide aminé essentiel et induit l’apparition de la kinurenine, un catabolite proapoptotique. A la vue de ces données, et sachant que l’IDO a également été impliquée dans l’établissement de la tolérance foeto-maternelle, nous nous sommes intéressés au rôle de cette enzyme dans notre modèle d’induction de tolérance à une allogreffe 100 de moelle osseuse. Nous avons ainsi pu montrer que les productions d’IFN-g par les Tregs et d’IDO par les CPA ne sont pas nécessaires à la protection de la moelle osseuse. De même, les molécules CD80/86 à la surface des cellules effectrices n’est pas, dans notre modèle, nécessaire à l’établissement de la tolérance. Matériel et Méthodes Souris : toutes les souris utilisées sont des femelles agées de 6 à 8 semaines au début des expériences. Les lignées de souris IFN-γ-/-, CD80/86-/- et IDO-/- ont été entretenues au sein de notre animalerie, en respect des lois d’éthique en vigueur. Anticorps : les anticorps avec les spécificités suivantes ont été utilisés pour analyser le chimérisme des animaux receveurs et la purification des Tregs : H-2Kb (AF6-88.5), H-2Kd (SF1-1.1), H-2Ks (5KH49) (BD PharMingen) ; CD4 (GK1.5), CD25 (PC61). Les surnageants d’hybridomes, reconnaissant le FcgRII/III (2.4G2), CD8 (53.6.7) le CMH de classe II (M5/114.15.2) et Thy1.2 (AT83) ont été produits dans notre laboratoire. Tri des Tregs : les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ ont été purifiés comme décrit précédement (407). Brièvement, le tri consiste dans un premier temps à éliminer les erythrocytes et les cellules mortes grâce à un gradient de Lympholyte M. Les cellules sont ensuite enrichies en CD4 par élimination des autres populations grâce à des anticorps dirigés contre CD8, CMH II et FcgRII/III et des billes de tri (DYNALBEADS). La population enrichie est ensuite sélectionnée positivement pour le marqueur CD25 à l’aide d’un anticorps dirigé contre CD25 et de billes de tri (MYLTENYI). La pureté obtenue en routine est supérieure ou égale à 95%. Greffe de Moelle Osseuse : les greffes de moelle osseuse sont réalisées comme précédemment décrit (407). Brièvement, les souris receveuses sont irradiées à 500 Rad , 24 heures avant la greffe. Les cellules hématopoïétiques du donneur sont obtenues à partir des os longs des pattes postérieures (Fémurs et Tibias). Afin d’éviter tout risque de GvHD, les lymphocytes T contenus dans la moelle osseuse sont éliminés par déplétion au complément, à l’aide d’un anticorps dirigé contre Thy1.1 (AT83). Analyse du chimerisme : 3 semaines après la greffe, le sang des receveurs est prélevé au niveau du sinus retro-orbital. Après élimination des erythrocytes, le sang est incubé avec des anticorps dirigés contre l’haplotype du CMH du donneur et du receveur. 101 Résultats Lors de ses travaux, nous avons ainsi pu montrer l’implication des cytokines immunosuppressives TGF-β et IL-10 à diverses étapes du protocole d’induction de tolérance à une greffe de moelle osseuse puis d’organe solide. Nous nous sommes par la suite intéréssés aux autres mécanismes des Tregs intervenant dans l’induction de tolérance à une allogreffe de moelle osseuse. Rôle de l’IFN-γγ dans l’induction de tolérance Les récents travaux de Kathrine Woods et de son équipe ont mis en évidence une production transitoire d’IFN-γ par les lymphocytes T régulateurs. Dans leur modèle, reposant sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre les molécules de costimulation, ils ont put montrer que cette production était indispensable à l’établissement d’une tolérance vis-à-vis des alloantigènes (301) . Dans ce cas, l’IFNγ pourrait agir sur les cellules dendritiques et induire la synthèse de l’IDO, enzyme responsable du catabolisme du tryptophane et donc de la mise en place d’un milieu appauvrie. Nous avons donc voulu étudier si la production d’IFN-γ par les cellules régulatrices jouait un rôle similaire dans notre propre modèle d’allogreffe. Pour cela, des souris B6 ont été irradiées létalement puis reconstituées avec un mélange 1 :1 de moelles osseuses allogénique DBA/2 et syngénique. L’analyse à trois semaines du chimérisme au niveau du sang a montré que le greffon médulaire était accepté. A l’inverse, la « reconstitution » du système immunitaire des souris receveuses par l’injection de splénocytes B6 entraine un rejet rapide et total de la moelle osseuse allogénique. Dans ce modèle, déjà utilisé lors de nos premiers travaux (408) et des expériences sur le TGF-β, nous avons ensuite tenté d’inhiber le rejet médié par les splénocytes grâce à la co-injection de lymphocytes T régulateurs purifiés à partir de souris sauvage ou déficientes pour l’IFN-γ. Nous avons ainsi observé que les deux populations de Tregs étaient capables d’induire une tolérance comparable vis-à-vis des alloantigènes. La production de cette cytokine par les Tregs ne semble donc pas impliquée dans notre modèle. Rôle de l’interaction CTLA-4 / CD80-86 dans l’induction de tolérance Un autre mécanisme impliquant les Tregs et pouvant conduire à la synthèse d’IDO nécessite l’intéraction de la molécule CTLA-4, exprimée par les cellules régulatrices, avec les molécules de co-stimulation CD80/86 exprimées par les CPAs. Afin de tester ce mécanisme d’action dans notre modèle, nous avons eu recours, chez des souris irradiées létalement, à une greffe de moelle osseuse allogénique provenant de souris B6 déficientes pour CD80/86 : ainsi les CPAs qui permettront l’activation du système immunitaire ne pourront pas intéragir avec le CTLA-4 des 102 Tregs. Toutefois, ce système présente une faille : sans molécules de co-stimulation, les CPAs allogéniques se sont révélées, sans surprise, incapables d’activer efficacement les splénocytes injectés. La moelle osseuse n’a donc pas été rejetée, même en l’absence des cellules régulatrices. Au contraire, sa prise en est même facilitée. Ces résultats ne permettent donc pas de statuer sur l’implication de cette intéraction entre CPAs et Tregs. CD80/86 n’est cependant pas exprimé exclusivement à la surface des CPAs. Ainsi, les lymphocytes T effecteurs, une fois activé, expriment ces molécules et peuvent devenir par là-même des cibles pour les Tregs. Afin de tester cette hypothèse, nous avons cette fois utilisé, toujours dans le même modèle d’irradiation létale, des splénocytes provenant de souris CD80/86-/-. Des souris B6 ont donc été irradiées létalement puis reconstituées avec un mélange équivalent de moelles osseuses syngénique et allogéniques DBA/2. L’injection des splénocytes KO permet un rejet du greffon équivalent à celui entrainé par des splénocytes sauvages. A l’inverse, la co-injection de Tregs, cultivé in vitro en présence d’APC DBA/2, permet dans les deux cas, une protection du greffon médulaire. Nos résultats montrent donc que l’interaction entre le CTLA-4 des Tregs et les molécules CD80/86 des cellules effectrices n’est pas impliquée dans l’induction de tolérance vis-à-vis des alloantigènes. Rôle d’IDO dans l’induction de tolérance Enfin, nous nous sommes directement intéressés au rôle de l’indoléamine 2,3 dioxygénase dans la mise en place d’une tolérance durable. Pour cela, nous avons utilisé une moelle osseuse allogénique provenant de souris B6 défientes pour cette enzyme et avons comparé sa « prise » avec celle provenant de souris B6 sauvages, en présence de lymphocytes T régulateurs. Nos résultats montrent que les deux moelles ont été acceptées de manière identique, rejetant ainsi une implication de cette enzyme dans l’induction de tolérance à une allogreffe de moelle osseuse. Ces expériences ont par la suite été reproduites dans le modèle d’irradiation sous-létale, utilisé dans le Nature Medicine. Discussion Notre équipe a montré que les lymphocytes T régulateurs sont capables d’induire la protection d’une greffe de moelle osseuse. Plus important, cette protection passe par une tolérance durable et spécifique qui, si les Tregs sont convenablement activés, permet d’inhiber les phases de rejet aigu et chronique. Si de nombreux mécanismes d’action ont été décrits pour les Tregs, ceux impliqués dans cette tolérance aux alloantigènes n’avaient pas encore été identifiés. Dans un premier temps, nous avons ainsi pu montrer que le TGF-β et l’IL-10 jouait 103 un rôle important dans l’établissement de cette tolérance, respectivement, vis-à-vis d’une greffe de moelle osseuse et de cœur. Lors de ce travail, nous avons donc tenté de mettre à jour d’autres mécanismes. De par son implication dans la tolérance foeto-maternelle, l’IDO nous a semblé un candidat de choix. Toutefois, nos résultats n’ont pu mettre en évidence son implication dans la mise en place de la protection de la moelle osseuse. De même, nous avons testé, sans succès, les molécules communément décrites comme pouvant induire in vivo sa synthèse, à savoir la cytokine IFN-γ et les molécules de costimulation CD80/86, via l’intéraction avec CTLA-4. Ces résultats préliminaires tendent à nous faire penser que la voix de l’IDO n’est pas impliquée dans la tolérance établie par les Tregs et rejoignent ainsi ceux observés notamment par l’équipe de Sykes dans un modèle d’induction de tolérance par CTLA-4Ig (409). Toutefois, ces résultats sont à modérer. En effet, dans le cas d’IDO, s’il semble que l’enzyme n’intervient pas dans les mécanismes conduisant à l’acceptation d’une moelle osseuse, nous devons encore réaliser les mêmes expériences lors de la greffe de peau ou de cœur, afin d’exclure qu’elle puisse jouer un rôle lors de la greffe d’organe solide, comme cela a été le cas de l’IL-10. Un tel comportement pourrait s’expliquer, là encore, par l’état d’inflammation, provoqué par l’acte chirurgical lui-même ou l’état d’ischémie de l’organe et associé à une production d’IFN-γ, plus important lors de greffe d’organes solides que lors d’une greffe de moelle osseuse, moins invasive. Ainsi, chez l’Homme, et contrairement à certains modèles animaux, si de nombreux rapports font état d’une expression d’IDO au sein de transplants indemnes de rejet, preuve d’un proccessus de tolérisation médié par l’enzyme (410, 411), tous font, pour le moment, référence à des transplantations d’organes solides. Concernant l’IFN-γ, les résultats que nous avons obtenus montrent que sa production par les Tregs n’est pas nécessaire à l’établissement d’une tolérance à une allogreffe de moelle osseuse. Ces données sont en contradiction avec celles obtenues par Kathrine Woods où, dans son modèle, une production éphémère de cette cytokine est indispensable à l’inhibition des réponses allogéniques. La différence entre ces résultats peut s’expliquer par la différence des modèles utilisés. En effet, dans le cas de Woods, les lymphocytes T régulateurs sont induits in vivo par le traitement des receveurs à l’aide d’anticorps neutralisants tandis que dans notre cas, les Tregs sont naturellement présents chez le receveur. Nous pouvons donc imaginer que malgré des marqueurs phénotypiques similaires, nos deux populations régulatrices diffèrent. Parallèlement à cela, il est tout à fait possible qu’une production d’IFN soit bien, dans notre modèle, impliquée dans les processus de tolérisation mais que cette production ne soit pas le fruit des Tregs injectés. Cette production pourrait être assurée par différentes populations cellulaire : les lymphocytes T activés, les CPAs suite à l’intéraction avec les Tregs, mais, également des populations régulatrices induites par les Tregs injectés. Il s’agira donc en perspective de ce travail de reproduire nos expériences en utilisant des splénocytes 104 (T effecteurs ou T régulatrices induites) et/ou des moelles osseuses (CPAs) IFN-γ-/chez des souris irradiées létalement. Enfin, dans le cas des molécules de co-stimulation CD80/86, elles aussi capables d’induire la production d’IDO par les CPAs lorsqu’elles intéragissent avec le CTLA-4 des cellules régulatrices, nos résultats ne nous ont pas permis de conclure quant au rôle de cette voie. En effet, nous avons observé, comme attendu, qu’une greffe de moelle osseuse déficiente pour ces molécules ne s’accompagne pas d’un rejet, les cellules effectrices n’étant pas totalement activées. Il nous est donc impossible dans ces conditions de déterminer si les Tregs sont capables ou non d’induire une tolérance et par conséquent, si ces molécules sont impliquées. Pour ce faire, vu que, dans cette voie, les molécules CD80/86 intéragissent avec CTLA-4, il nous faudra tester la capacité de Tregs CTLA-4 déficientes à induire une tolérance vis-à-vis d’une allogreffe de moelle osseuse, dans notre modèle d’irradiation létale. Parallèlement à cela, nous avons pu écarter l’implication de l’intéraction entre le CTLA-4 des Tregs et les molécules de co-stimulation CD80/86 à la surface des cellules T activées. Néanmoins, si ces résultats venaient à être confirmés, ils poseraient la question de savoir pourquoi une enzyme comme l’IDO, déjà montrée comme facilitant la mise en place d’une tolérance vis-à-vis d’alloantigènes, dans le cas de l’intéraction foeto-maternelle, et impliquées dans de nombreux modèles expérimentaux de transplantation, n’est pas induite ici. Là encore, l’origine des cellules régulatrices versus des cellules régulatrices induites in vivo (dans le cas des traitements aux anticorps neutralisants), ainsi que l’étape de pré-activation in vitro, susceptible de modifier le comportement de nos Tregs ou d’amplifier une souspopulation particulière, pourrait en partie l’expliquer. 105 Cellules du donneur dans le sang (%) 100 80 N.S 60 40 20 0 MO : + + + + Splénocytes : - + + + Tregs : - - WT IFN- -/- Figure 1 : La production d’IFN- par les Tregs n’est pas impliquée dans l’induction de tolérance vis-à-vis d’une allogreffe de moelle osseuse. Des souris B6 sont irradiées létalement puis reconstituées avec un mélange de moelle osseuse syngénique et allogénique (MO), en présence ou non de splénocytes syngéniques (Splénocytes) et de lymphocytes T régulateurs purifiés à partir de souris WT ou IFN- -/- (Tregs). Le chimérisme est ensuite analysé 3 semaines après greffes par FACS à partir du sang. A *** Cellules du donneur dans le sang (%) 100 80 60 40 20 0 MO : WT WT CD80/86-/- WT CD80/86-/- Splénocytes : - + + + + Tregs : - - - + + B Cellules du donneur dans le sang (%) 100 80 N.S 60 40 20 0 MO : + + + + + Splénocytes : - WT CD80/86-/- WT CD80/86-/- Tregs : - - - + + Figure 2 : les molécules CD80/86 à la surface des lymphocytes T effecteurs ne sont pas impliquées dans l’induction de tolérance vis-à-vis d’une allogreffe de moelle osseuse par les Tregs. (a) Des souris DBA/2 sont irradiées létalement puis reconstituées avec une moelle osseuse DBA/2 et une moelle allogénique B6 soit WT, soit issue de donneurs CD80/86 -/(MO). Les souris sont co-injectées ou non avec des splénocytes syngéniques WT (Splénocytes) et des lymphocytes T régulateurs. (b) Des souris B6 sont irradiées létalement puis reconstituées avec un mélange de moelle osseuse syngénique (B6) et allogénique (DBA/2), en présence ou non de splénocytes B6 WT ou CD80/86-/- et de Tregs. Le chimérisme est ensuite analysé 3 semaines après greffes par FACS à partir du sang. Cellules du donneur dans le sang (%) 100 N.S 80 60 40 20 0 WT IDO-/- WT IDO-/- WT IDO-/- Splénocytes : - - + + + + Tregs : - - - - + + MO : Figure 3 : l’IDO n’est pas impliqué dans l’induction de tolérance vis-àvis d’une allogreffe de moelle osseuse par les Tregs. Des souris DBA/2 sont irradiées létalement puis reconstituées avec une moelle osseuse DBA/2 et une moelle allogénique B6 soit WT, soit issue de donneurs IDO-/- (MO). Les souris sont co-injectées ou non avec des splénocytes syngéniques WT (Splénocytes) et des lymphocytes T régulateurs. Le chimérisme est ensuite analysé 3 semaines après greffes par FACS à partir du sang. DISCUSSION ET PERSPECTIVES 109 Depuis l’antiquité, la transplantation est apparue aux yeux des médecins et des scientifiques comme une stratégie thérapeutique prometteuse. Cependant, il a fallut attendre le dernier siècle pour qu’enfin le rêve commence à prendre forme. La découverte de techniques chirurgicales, l’établissement d’un cadre juridique favorable et les progrès exponentiels réalisés en Immunologie fondamentale ont permis de sans cesse améliorer les techniques et les traitements utilisés en clinique humaine. La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacent au rejet de greffe ont notamment permis le developpement d’outils prédictifs ou diagnostiques qui ont considérablement amélioré les chances de succès. Cela a également mis à jour des cibles potentielles pour les drogues immunosuppressives développées par l’industrie pharmaceutique. Les chances de survie des malades ainsi que leur confort s’en sont trouvés grandement améliorées. Mais ces nombreux progrès ont également mis en lumière les limites des traitements actuels : les effets iatrogènes, l’immunosuppression globale et le faible effet sur le rejet chronique. En parallèle, la découverte des mécanismes de tolérance au soi, centraux et périphériques, et surtout la démonstration par Billingham de la capacité de les manipuler dans le cadre de la transplantation, ont ouvert la voie à de nouvelles approches thérapeutiques. De nombreuses stratégies ont alors été proposées telle l’utilisation de cellules dendritiques tolérogènes ou d’anticorps bloquant les molécules de co-stimulation. Rapidement, ces protocoles prometteurs ont mis en evidence que la tolérance induite était dépendante d’une sous-population de cellules douées de propriétés régulatrices : les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+. Caractérisés par Sakaguchi en 1995, les Tregs ont rapidement montré un potentiel immunosuppresseur sans précédent. De nombreux modèles ont été développés afin de découvrir toute l’étendue de ce potentiel, son implication dans les processus physiologoqiques et pathologiques ainsi que leur possible utilisation lors de thérapies cellulaires. Les données obtenues par différents groupes ont notamment établi que la déplétion avant greffe de la fraction CD25 permet d’exacerber les réponses immunes allogéniques de l’hôte, mais aussi du greffon dans des modèles de GvHD. Ces résultats nous ont amené à penser que l’utilisation de la fraction allospécifique contenue dans le compartiment régulateur pourrait permettre d’induire un état de tolérance aux allogreffes. 1) L’expansion des Tregs A l’état physiologique, la balance cellules effectrices/cellules régulatrices est très nettement en défaveur de ces dernières. Une des solutions pour induire une tolérance vis-à-vis des antigènes du greffon est d’inverser cette tendance en isolant le compartiment régulateur à partir des animaux receveurs, en l’expandant in vitro puis en le réinjectant. C’est la solution pour laquelle nous avons opté. 110 La première difficulté a consisté à mettre au point les conditions de culture des cellules régulatrices. Leur nombre au sein d’un organisme étant relativement faible (les CD25+ ne représentent que 5 à 10% du compartiment CD4), l’objectif premier de la mise en culture était de les expandre afin d’obtenir des quantités suffisantes de cellules. Pour cela, les lymphocytes T régulateurs, fraichement isolés à partir d’animaux syngéniques au receveur, ont été stimulés pendant 15 jours avec des splénocytes totaux irradiés du donneur, et de l’IL-2 afin de réverser leur état d’anergie. Le second avantage de cette méthode est qu’elle induit l’enrichissement des Tregs en cellules allospécifiques. Ceci peut expliquer pourquoi, lors de nos premiers essais, l’injection des cellules régulatrices fraichement isolées ne suffisait pas, à quantité égale, à induire une tolérance (408). De la même manière, des études similaires pour inhiber le rejet de moelle osseuse (412) ou l’apparition de la GvHD (395, 398), ont montré qu’un grand nombre de cellules non-spécifiques devait être utilisé pour égaler les résultats observés avec des Tregs spcifiques. Ces données, combinées aux nôtres, montrent que cette méthode de culture permet effectivement de fortement enrichir la population isolée en cellules allospécifiques. La culture in vitro, avant la ré-injection, présenterait donc le double avantage d’augmenter quantitativement et qualitativement le nombre de cellules transférables. Cependant, des études récentes suggèrent qu’un tel protocole peut encore être amélioré. Il a en effet été montré que la présence d’IL-2 induit une prolifération en partie non-spécifique (413). Pour palier à ce probleme, l’utilisation de cellules dendritiques purifiées ou derivées à partir de précurseurs pluripotents comme source d’alloantigène pourraient être envisagée. De tels systèmes permettent en effet, en l’absence d’IL-2, d’induire uniquement une expension antigène-spécifique des lymphocytes T régulateurs. Toutefois, si la spécificité des cellules obtenues sera meilleure, il risque d’en être autrement concernant leur nombre, la capacité d’expansion d’un tel système étant plus faible. Une autre stratégie consisterait à améliorer l’efficacité d’action de la population CD4+ CD25+. L’ajout d’adjuvant dans la culture, tels que le TGF-β, la forme active de la vitamine D3 ou le mycophenolate mofétil a en effet été décrit comme permettant d’augmenter leurs capacités immunosuppressives (414). Enfin, l’équipe de Roncarolo a montré que l’addition in vitro de rapamycine favorise la prolifération des Tregs CD4+ CD25+ (415). Il semble toutefois que cet effet soit du à une différence de sensibilité à la rapamycine, les Tregs possédant des voies d’activation alternes à mTOR (416). Ainsi, au sein de la culture, les cellules effectrices seraient inhibées par la drogue tandis que les cellules régulatrices n’en seraient pas affectées. Cet effet a également été observé in vivo (417). 111 2) La spécificité des Tregs Nous avons ensuite utilisé ces cellules dans un modèle expérimental d’allogreffe de moelle osseuse. Pour cela, les souris sont irradiées à une dose souslétale comparable aux niveaux de conditionnement utilisés par les praticiens. Dans ce modèle, le système immunitaire du receveur reste fonctionnel malgré l’irradiation. Ainsi, en l’absence de lymphocytes T régulateurs, la moelle allogénique est rapidement rejetée. A l’inverse, l’utilisation de nos cellules permet une protection durable du greffon. De manière intéressante, nous avons pu reproduire ces résultats dans différentes combinaisons de donneur/receveur avec à chaque fois le même succès, là où les traitements à base d’anticorps, par exemple, ont clairement montré que leur tolérance ne fonctionne que chez certaines souches de souris (141). Forts de ces résultats, nous avons ensuite cherché à savoir si la tolérance induite par les lymphocytes T régulateurs n’affecte pas l’immunocompétence des animaux receveurs. En d’autres termes, si les lymphocytes T régulateurs, à l’instar des drogues immunosuppressives, inhibent de façon globale le système immunitaire et donc la réponse allogénique ou si, au contraire, ils permettent la mise en place de réponses immunitaires tierces. La question était d’autant plus pertinente que la spécificité d’action des Tregs in vivo n’avait été que peu documentée. En effet, s’il était connu que pour s’activer et exercer leurs propriétés immunosuppressives, les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ nécessitent en périphérie une interaction avec l’antigène pour lequel ils sont spécifiques, l’éventuelle interférence de leurs fonctions inhibitrices avec d’autres réponses immunitaires, dirigées contre des antigènes différents du leur, restait inconnue. De précédentes expériences in vitro avaient montré qu’une fois activées, les Tregs inhibent sans restriction (418). Pendant longtemps, ceci est restée un dogme aussi bien in vitro qu’in vivo. Plusieurs équipes, dont la nôtre, ont finalement démontré en juin 2004 que l’activité immunosuppressive des cellules régulatrices peut être spécifique d’un antigène, tant lors de la phase d’activation des cellules que pendant sa phase effectrice (408, 419, 420). Notre première demonstration de la spécificité d’action des Tregs était dans un modèle de greffe de moelle osseuse semi-allogénique chez des animaux dont le système immunitaire était totalement détruit suite à une irradiation létale. Il nous est donc apparu pertinent de confirmer nos premiers résulats dans notre nouveau modèle, plus proche de la clinique humaine. Nous avons ainsi montré qu’une souris recevant une greffe de moelle en présence de Tregs n’accepte le greffon que si les cellules régulatrices sont spécifiques des alloantigènes de la moelle injectée. De façon plus spectaculaire, l’injection de deux moelles, l’une pour laquelle les Tregs sont spécifiques et l’autre non, est systématiquement suivie d’un rejet rapide de la moelle tierce. Des résultats identiques ont été obtenus lors des greffes de peau. Toutefois, le développement d’une réponse allogénique tierce malgré la présence de nos Tregs est certes encourageant quant à la spécificité d’action de ces cellules, mais reste insuffisant dans l’optique d’une application chez l’Homme. En 112 effet, la réponse allogénique tierce qui se développe dans notre modèle, malgré la présence des Tregs, est une réponse forte. Elle pourrait donc s’affranchir d’une nonspécificité résiduelle des cellules injectées. Surtout, notre modèle a seulement mis en évidence que les Tregs étaient capables d’une spécificité dépendante de la CPA, ayant servie à sa pré-activation in vitro et non d’une réelle spécificité antigènique. Ainsi, dans nos expériences, les antigènes « à protéger » se trouvent sur une CPA différente de celle présentant les antigènes « à éliminer ». La question encore en suspens est donc de déterminer si, dans le cas où les deux types d’antigènes, « à protéger » et « à éliminer », sont présentés par la même CPA, la réponse immune tierce peut se développer, sans pour autant nuire à l’état de tolérance vis-à-vis des antigènes « à protéger ». Pour répondre à ces différentes questions, il s’agira de montrer si l’organisme des souris receveuses est toujours capable soit de développer une réponse immunitaire efficace contre un antigène exogène, tel l’ovalbumine ou HY, soit d’éliminer un agent pathogène tel le virus de l’influenza ou du LCMV murin. Ces analyses se feront quand se sont les CPA du receveur (alloantigène et antigène exogène sont sur deux CPAs différentes) ou du donneur (l’alloantigène et l’antigène exogène se retrouvent alors sur la même CPA), qui présentent l’antigène exogène. 3) Le rôle du TGF-β Nous nous sommes par la suite interessés aux mécanismes qui pouvaient rendre compte de cette spécificité d’action. Les études que nous avons réalisées semblent indiquer qu’une sécrétion d’IL-10 par les cellules T régulatrices n’est pas nécessaire, dans notre système, à leur activité immunosuppressive. En revanche, le TGF-β semble être indispensable. Une publication récente de l’équipe de Fiona Powrie a montré dans le système de la colite, que si cette cytokine est nécessaire à l’immunosuppression induite par les lymphocytes T CD4+ CD25+, les Tregs ne sont pas à l’origine de cette production (353). Ces resultats ont cependant été remis en question par l’équipe de Flavell qui a montré l’importance de la production du TGF-β par les Tregs dans le même modèle de colite (354). Une des sources potentielles de cette cytokine est représentée par les cellules dendritiques allogéniques, puisque ces cellules sont susceptibles d’être rendues tolérogènes par les Tregs (421). Ainsi, on peut suspecter un système dans lequel les lymphocytes T régulateurs induiraient la production de TGF-β par les cellules dendritiques exprimant les alloantigènes dont ils sont spécifiques et que cette cytokine créerait un microenvironnement local peu propice pour l’activation des cellules effectrices, voire leur conversion en cellules régulatrices. Seules les cellules effectrices reconnaissant les alloantigènes présentés par ces cellules dendritiques devenues tolérogènes seraient affectés par cette inhibition indirecte de la part des Tregs. De plus, le fait que la production de médiateurs solubles par les cellules dendritiques puisse être « adressée » vers des partenaires lymphocytaires précis a été suggéré par différents modèles (422). Une autre explication voudrait que l’inhibition puisse dépendre de l’engagement de la forme membranaire du TGF-β, exprimée à la surface des cellules régulatrices, avec 113 le récepteur à cette cytokine immunosuppressive exprimé à la surface des T effecteurs. 4) Autres mécanismes d’action Enfin, pour expliquer cette spécificité d’action, nous pouvons imaginer que les différents mécanismes de suppression à disposition des Tregs et nécéssitant un contact cellulaire étroit, soit avec les cellules dendritiques allogénique susceptibles d’activer la réponse immunitaire soit avec les cellules effectrices, participent à l’induction de cette tolérance. Les Tregs peuvent ainsi via CTLA-4 (207) ou par le biais d’une production momentanée d’IFN-γ (301), induire chez les CPAs la production d’IDO. Cette enzyme, en catabolisant le tryptophane, va limiter la prolifération des lymphocytes environnants, voire même, par le biais de la kinurenine, induire leur apoptose. Ils peuvent également, comme cela a été montré in vitro, diminuer l’expression des molécules de co-stimulation à leur surface. Cependant, nos résutats préliminaires tendent à montrer que la production d’IFN-γ par les Tregs, ainsi que celle d’IDO par les CPAs ne seraient pas nécessaires à l’induction de tolérance lors de la greffe de la moelle osseuse. Leur rôle lors de la greffe d’organes solides reste toutefois à déterminer. Une autre cytokine immuno-suppressive pourrait elle-aussi être impliquée : l’IL-35 (357). Composée de deux chaînes, IL-12α et IL-27β, son expression a été montrée spécifique aux Treg, IL-27β étant régulée par Foxp3. En son absence, les Treg sont inefficaces à endiguer la prolifération homéostatique de LT transférés dans un animal immunodéficient, comme elles échouent à protéger du développement de la colite. Par ailleurs, elle est la seule cytokine dont le défaut a une influence sur leur capacité à inhiber la prolifération des LT CD4+ in vitro. Il a été également rapporté un pouvoir cytotoxique des Tregs vis-à-vis des lymphocytes T CD4+, CD8+ (334) et B (336). L’ensemble de ces mécanismes reste encore à étudier dans notre modèle. 5) La survie des Tregs Un des objectifs de ce travail était de réussir à induire une tolérance vis-à-vis d’organes autres que la moelle osseuse. Malheureusement, l’adaptation stricte du protocole précédent, à savoir une greffe chez un animal affaibli soutenue par l’injection de Tregs pré-activés ex vivo, s’est avérée un echec. Les greffons cardiaques étaient rapidement rejettés. Néanmoins, nos résultats montraient un léger retard dans le rejet, certes non significatif mais un retard tout de même. Nous avons dès lors émis l’hypothèse, s’appuyant sur les travaux de Seddan et Mason (315), que le rejet était dû, non pas à une impuissance de la part des cellules régulatrices injectées, mais plutôt à leur incapacité à survivre au-delà de quelques jours en 114 l’absence, en périphérie, des alloantigènes pour lesquelles elles sont spécifiques. Nos résultats sur la survie des cellules régulatrices en présence des alloantigènes corrèlent cette hypothèse. Ainsi, chez des souris ayant reçues une moelle de même fond génétique que les CPAs ayant servi à l’activation in vitro des Tregs, le pourcentage de cellules injectées retrouvé au niveau de la rate des souris est bien supérieur à ce même pourcentage chez des souris ayant reçues une moelle syngénique. Il est à supposer que cette différence de pourcentage serait due à une prolifération en périphérie plus importante des Tregs en présence de leurs alloantigènes, comme le suggère les travaux de Salomon sur l’homéostasie des cellules régulatrices CD62L- (297). Toutefois, dans cette expérience, l’irradiation et la greffe ont eu lieu avec vingt quatre heures de décalage, contrairement aux expériences sur les greffes de peau, en absence de moelle osseuse, où l’irradiation a eu lieu trois semaines avant la greffe de la peau. Pour confirmer notre hypothèse, il conviendra donc de reproduire les expériences de greffe de peau, en absence de moelle osseuse, en utilisant des Tregs Thy1.1, afin de pouvoir les suivre. Une diminution drastique de leur pourcentage en périphérie, correlée à l’apparition des signes cliniques du rejet des greffons, appuierait notre hypothèse. Enfin, afin de déterminer si les forts pourcentages observés sont bien le fruit d’une intense division des cellules régulatrices, l’injection dans le même modèle de Tregs marqués au CFSE nous permettra d’établir avec précision la capacité d’expansion in vivo de ces cellules, chez un receveur lymphopénique. 6) Implication des Tregs spécifiques de la voie indirecte dans le contrôle du rejet chronique Dès lors, des souris ayant reçues au préalable une greffe de moelle osseuse sous couvert de Tregs pré-activés ex vivo par les deux voies d’alloreconnaissance, acceptent à long terme une greffe de cœur ou de peau. Dans un tel système, l’induction de tolérance à l’allogreffe est dépendante de deux mécanismes distincts et complémentaires. Ainsi les cellules dérivées de la moelle osseuse qui reconstituent le système hématopoïétique, vont participer, dans les organes lymphoïdes secondaires, à la sélection négative des populations lymphocytaires néosynthétisées. Par contre, le compartiment immun périphérique présent avant traitement, et persistant après irradiation sous-létale, va être controlé par les cellules régulatrices injectées. La nécessité de ce mécanisme périphérique d’induction de tolérance aux alloantigènes dans la survie du greffon cardiaque est soulignée par différentes observations. La première est qu’il semble nécessaire, afin de contrôler totalement le rejet de l’organe solide, de modifier les conditions de culture des cellules T régulatrices. Leur préactivation ex vivo via les deux voies d’alloreconnaissance, contrairement à une stimulation par des CPAs allogéniques, est en effet associée à un contrôle total de l’alloréponse. Ceci avait déjà été suggéré par des données montrant que la tolérance induite aux allogreffes par les anticorps bloquants les voies de co-stimulation, connue pour être médiée par les Tregs, 115 nécessite l’expression des molécules du CMH de classe II de l’hôte (120). A défaut un rejet chronique se développe. De plus, l’utilisation de lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ isolés à partir de souris IL-10-/- nous a permis de montrer que la sécrétion de cette cytokine par les cellules régulatrices est impliquée, voire indispensable, à la protection de l’allogreffe cardiaque sur le long terme. Pris ensemble, ces résultats suggèrent fortement que, contrairement au dogme établit communément, un contrôle périphérique actif est nécessaire pour que l’allogreffe de cœur ou de peau soit acceptée. 7) Chimérisme et tolérance L’induction d’un chimérisme n’est donc pas synonyme de tolérance (104, 108110). Ceci peut notamment s’expliquer par le fait que si une sélection négative a bien lieu au niveau du thymus des chimères vis-à-vis des alloantigènes (423), elle s’avère imparfaite et laisse s’échapper des cellules alloréactives en périphérie. Chez un individu normal, un tel phénomène est observé pour les cellules autoréactives. Toutefois, celles-ci, une fois en périphérie, doivent être contrôlées par les Tregs, sélectionnées eux aussi au niveau du thymus. Hors, aujourd’hui encore, il n’a pas été clairement défini si la génération de Tregs capables d’inhiber en périphérie l’alloréponse était efficiente chez des chimères. En effet, il a été montré que les antigènes présentés par les cellules dendritiques de la medulla thymique, seules cellules d’origines hématopoïétiques impliquées dans la sélection, ne semblaient pas intervenir dans la sélection des Tregs, ceux-ci se développant normalement lors d’une greffe de moelle n’exprimant pas le CMH chez une souris sauvage (282, 285). Ceci pourrait expliquer pourquoi la tolérance induite par le chimérisme n’est pas toujours durable. Ainsi, même dans le cas historique des agneaux jumaux décrit par l’équipe de Medawar, 70% des greffes de peau réalisées étaient rejettés à long terme (424, 425). Ces résultats montrent que l’établissement d’un chimérisme parvient à contrôler le rejet aigu mais pas le rejet chronique. Chez l’adulte, une étude approfondie des différents résultats d’induction de tolérance à l’aide d’un chimérisme révèle que lorsque les donneurs ne différent des receveurs que par leurs molécules du CMH, les greffes de peau sont acceptées. A l’inverse, lorsque cette différence génétique s’étend également aux antigènes mineurs, les peaux sont à long terme rejettées. Il semble donc que le chimérisme hématopoïétique est capable d’inhiber l’activation des cellules T effectrices contre les molécules de CMH allogéniques (reconnaissance directe) mais qu’il échoue à contrôler les cellules reconnaissants les antigènes mineurs (reconnaissance indirecte), rôle qui revient aux Tregs dans notre modèle. Ces données posent dès lors la question de pourquoi, alors que leur génération thymique est en théorie possible, l’injection de Tregs spécifiques de la voie indirecte est indispensable au contrôle du rejet chronique. La première réponse qui vient à l’esprit est que ces cellules ne sont tout simplement pas générées au niveau du thymus et ne sont donc pas présentes en périphérie. Une autre explication 116 veut que leur nombre, à la suite de cette génération, soit trop faible en périphérie pour assurer une parfaite protection. Ceci est corroboré par le fait que nous injectons de grandes quantités de cellules régulatrices : 2.106, soit le double des cellules régulatrices retrouvées au niveau de la rate d’une souris saine. 8) Différence de l’impact du rejet chronique sur la moelle, la peau et le cœur Nos résultats montrent clairement une disparité dans la façon dont les trois organes que nous avons testés sont affectés par la présence ou non de Tregs spécifiques de la voie indirecte. Ainsi, en leur absence, la moelle osseuse montre une survie à très long terme sans la moindre altération du chimérisme ; la peau présente des infiltrats massifs mais qui n’altèrent pas sa survie ; tandis que le cœur est lentement dégradé avec une altération importante de sa structure et de sa fonction. Ces observations suggèrent que les mécanismes impliqués sont différents selon les organes impliqués. De plus, dans le cas de la peau, sa relative sensibilité au rejet chronique pourrait s’expliquer par le fait que la peau de queue, que nous avons utilisée dans notre modèle, est connue pour être moins sensible aux différences d’antigènes mineurs (426, 427), cela même qui sont impliqués dans le rejet chronique chez des chimères. 9) Le rôle de l’IL-10 Une observation surprenante dans notre modèle est liée au fait que la production d’IL-10 par les cellules régulatrices n’est pas impliquée dans l’induction de tolérance aux allogreffes de moelle osseuse. De plus, et même si une production de cette cytokine par les cellules allogéniques greffées ne peut être exclue, l’utilisation de receveur IL-10-/- montre que cette cytokine n’est pas produite par une autre source cellulaire. Ce résultat parait être en opposition avec de nombreuses données de la littérature qui suggéraient, notamment dans les systèmes reposant sur l’injection d’anticorps non déplétants, que cette cytokine joue un rôle important dans le contrôle de l’alloréponse (339, 340, 428). Cette apparente contradiction de nos données avec celles de l’équipe de Wood pourrait être liée aux différences entre nos deux systèmes. Les populations de lymphocytes T régulateurs que nous utilisons pourraient notamment être fonctionnellement différentes, au moins partiellement, en dépit d’un phénotype apparemment identique (CD4+ CD25+ Foxp3+). En effet, l’utilisation d’anticorps bloquant pourrait induire l’émergence de sous-populations régulatrices, productrices d’IL-10. De même, dans notre système, les cellules sont expandues pendant deux semaines avant d’être injectées, ce qui pourrait induire préférentiellement l’expansion de certaines sous-populations régulatrices. Une autre hypothèse, repose sur les travaux de O’Gara (428). Elle soutient que dans les systèmes dans lesquels l’état inflammatoire est faible, cette cytokine, même produite 117 par les cellules suppressives, n’aurait pas un rôle central ou du moins, ne serait pas indispensable à l’immunosuppression dépendante des cellules régulatrices. Ceci est le cas dans le modèle de la gastrite et pourrait aussi expliquer nos résultats dans les greffes de moelle osseuse. A l’inverse, dans le cas de processus inflammatoires chroniques, comme dans le modèle de la colite, l’IL-10 jouerait un rôle clef pour éviter un emballement des mécanismes effecteurs qui les rendraient incontrôlables par les cellules régulatrices. Cette hypothèse semble confirmer par nos propres résultats. En effet, dans le cas de la greffe de cœur, l’IL-10 semble tenir une place importante dans la stratégie mise en œuvre par les Tregs pour maintenir la tolérance. Là aussi, l’état inflammatoire résultant de l’activation du système immunitaire est plus important. 10) Vers un protocole clinique Notre protocole permet donc d’établir une tolérance durable et spécifique visà-vis d’une greffe de moelle osseuse, de cœur ou de peau. Pour autant, aussi prometteur qu’il soit, de nombreux obstacles doivent encore être franchi pour envisager une application à l’Homme. La première limite consiste dans la purification et l’expansion des lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+. En effet, si chez la souris cette population renferme en très grande majorité des cellules régulatrices, en raison de l’absence de cellules activées chez ces animaux naïfs, il n’en est pas de même chez l’Homme. L’expression de CD25 ne permet pas de différencier les effectrices des régulatrices. Ainsi, purifier sur ce seul marqueur pourrait conduire à isoler puis amplifier des lymphocytes T effecteurs qui pourraient altérer l’efficacité du protocole voire pire. La découverte récente du marqueur de surface CD127 permettant de bien séparer les populations effectrices (CD127high) et régulatrices (CD127low) devrait permettre d’améliorer la spécificité des procédures de tri cellulaire. De plus, la culture des fractions triées avec de la rapamycine pourra assurer l’obtention post-culture d’une population cellulaire encore plus pure. L’expansion in vitro des Treg humains pourrait elle-aussi constituer un obstacle car si des progrès ont été réalisé sur ce point (318), la maitrise de leur expansion reste encore délicate. D’autant que, dans notre protocole, afin de permettre l’activation des Tregs durant la phase d’expansion via les deux voies d’alloreconnaissance, nous utilisons des CPAs semi-allogéniques ce qui s’avèrent extrêmement restrictif, et donc inapplicable, chez l’Homme. Une alternative à ceci pourrait être d’utiliser, comme suggéré par les travaux de Lechler, des lysats cellulaires de cellules allogéniques et d’en « charger » des CPAs du receveur afin de permettre une protection efficace contre les phases de rejet aigu et chronique. De tels travaux sont actuellement en cours, au sein du laboratoire. Autre limite de taille : l’irradiation totale des receveurs. Celle-ci présente l’avantage de libérer de la place pour la moelle injectée au niveau des niches hématopoïétiques mais affaiblit en contrepartie le système immunitaire. De plus, quoiqu’utilisée en clinique, celle-ci est de plus en plus délaissée au profit des traitements myéloablatifs et/ou d’irradiation d’une petite partie du corps. Afin de 118 remplacer cette étape, il serait intéressant de tester différentes drogues myéloablatives, telles le BuSulfan. Ceci nous permettrait également d’établir la capacité des Tregs à inhiber le rejet chez un individu dont le système immunitaire n’a pas été affecté. De même, pour des raisons « cinétiques », il conviendra de tester des stratégies à base de drogues immunosuppressives qui permettront de contenir les mécanismes de rejet du temps de la culture in vitro des Tregs. En effet, dans le cas de greffons prélevés sur un donneur cadavérique, les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ ne pourront être précultivés avant l’implantation de l’organe ou de la moelle osseuse. Aussi, notre stratégie thérapeutique n’est envisageable que si des drogues immunosuppressives sont capables de suppléer les lymphocytes régulateurs pendant l’étape d’expansion in vitro et que ces cellules par la suite, parviennent à prendre le relais des traitements médicamenteux sans que ceux-ci n’aient d’effets indésirables sur elles. Ainsi, si la Cyclosporine ne pourrait être utilisée en raison de ces effets similaires sur les Tregs comme sur les effectrices, la Rapamycine ou le FTY720 pourraient parfaitement correspondre. La rapamycine, en effet, favorise le développement in vivo des cellules régulatrices, celles-ci ne répondant pas à l’inhibition de mTOR, et pourrait donc être utilisée. Toutefois, elle ne semble pas à même d’inhiber seule le rejet. Le FTY720, pour sa part, est une nouvelle molécule pleines de promesse qui, en séquestrant au niveau des organes lymphoïdes secondaires les lymphocytes T, pourrait être fortemente intéressante. En effet, si elle était utilisée pendant l’étape d’expansion des Tregs, elle permettrait de contenir la pathogénicité des cellules alloréactives tut en les regroupant dans des sites anatomiques précis, hors de l’organe transplanté. Ceci pourrait permettre d’une part de potentialiser l’action des Tregs injectés qui n’aurait plus alors qu’à inhiber les cellules effectrices dans les organes lymphoïdes secondaires et d’autre part, de réduire les dommages subis par le greffon. Notre travail a ainsi permis de mettre en lumière l’immense potentiel thérapeutique des lymphocytes T régulateurs dans la transplantation de moelle osseuse, mais également d’organes solides. La tolérance induite est alors durable et surtout spécifique des antigènes ayant servis à l’activation des cellules régulatrices. Nous avons montré que l’établissement d’un chimérisme hématopoïétique ne suffit pas à induire une tolérance vis-à-vis des alloantigènes. Plus important encore, les Tregs nécessitent une activation par la voie d’alloreconnaissance indirecte afin d’être capable d’inhiber l’apparition du rejet chronique. Nous nous sommes enfin intéressés aux mécanismes impliqués dans l’induction de cette tolérance. Nous avons pu montrer que le TGF-b est impliqué dans l’induction de tolérance tandis que l’IL-10 ne semble intervenir que lors de la greffe d’organes solides. La production d’IFN-γ par les Tregs de même que l’intéraction entre CTLA-4 à leur surface et CD80/86 sur les effectrices ne sont pas impliqués dans la protection de la moelle osseuse. 119 ANNEXES 120 Supprimer l’immunosuppression Olivier Joffre, Thibault Santolaria, Joost P.M. van Meerwijk M/S n° 8-9, vol. 24, août-septembre 2008 Nouvelles.indd 689 surveillance, augmentant ainsi la fréquence de néoplasmes et d’infections et la morbidité qui leur est associée. Enfin, si elles sont efficaces pour lutter contre les à-vis des antigènes du donneur. Dès épisodes de rejet aigu, ces drogues n’ont 1953, les travaux de Billingham, Brent et que peu d’effet sur le rejet chronique Medawar ont confirmé cette hypothèse (Figure 1). Face à ces limitations majeu- [1]. Si leur approche basée sur l’inducres, la communauté scientifique tente tion d’un chimérisme hématopoïétique de développer des stratégies visant à durant la vie fœtale apparaît inexploiinduire une tolérance au greffon, c’est- table en clinique humaine, des études à-dire un état d’hyporéponse immuno- récentes suggèrent que des protocoles logique spécifique des alloantigènes. similaires sont envisageables chez des La majorité des approches envisagées individus adultes [2]. repose sur un concept commun : détourner les 100 mécanismes de tolérance 80 au soi de leur fonction première. 60 La tolérance « au soi » est un processus nécessaire 40 afin d’éviter que le sys20 tème immunitaire ne s’attaque aux tissus de l’or0 ganisme. Elle est assurée 0 1 5 10 par différents mécanismes Années post-transplantation complémentaires. Dans 2000-2005 1985-1989 les organes lymphoïdes primaires, les précurseurs Figures 1. Survie des patients après transplantation cardiaque lymphocytaires autospéci- selon la période de greffe. L’augmentation significative de la fiques sont éliminés après médiane de survie des receveurs entre les périodes 1985-1989 interaction avec des cellu- et 1995-1999 (72,3 mois contre 131,9) est essentiellement les d’origine hématopoïé- associée au développement de stratégies thérapeutiques qui tique. Cette observation ont permis de contrôler efficacement les épisodes de rejet aigu a conduit de nombreuses et ainsi, d’augmenter la survie du greffon à court terme. Après équipes à postuler qu’une la première année, entre 2 et 3% des patients perdent encore greffe de moelle osseuse chaque année le greffon en raison du développement d’une allogénique puisse induire forme de rejet qualifiée de chronique (source : Agence de la un état de tolérance vis- biomédecine, www.agence-biomedecine.fr). Survie (%) L’obstacle du rejet immunitaire en transplantation La transplantation est une stratégie thérapeutique attractive confrontée à de nombreux obstacles. Le don d’organe est notamment limité par le sentiment ambivalent qu’il provoque, mêlé du désir de voir repoussées les limites de la vie et d’une profonde aversion à l’égard de la manipulation de la mort. D’un point de vue médical, la principale barrière est représentée par le système immunitaire du receveur qui met en place et coordonne un ensemble de mécanismes visant à détruire le greffon allogénique, considéré à juste titre comme du nonsoi. Pour contrôler les différentes formes de rejet, un large panel d’immunosuppresseurs a été développé depuis 40 ans. Conjugués à l’optimisation des techniques chirurgicales et des méthodes de conservation, ils ont permis de considérablement augmenter la survie des greffons (Figure 1). Ces molécules présentent cependant de nombreux inconvénients. Comme tout traitement médicamenteux, leur efficacité est influencée par des différences pharmacocinétiques interindividuelles. La large distribution tissulaire et la nature moléculaire de leurs cibles sont à l’origine d’effets iatrogènes majeurs, notamment au niveau des tissus chargés de l’épuration de l’organisme et/ou présentant un fort taux de renouvellement cellulaire. De plus, ces molécules inhibent globalement le système immunitaire et non spécifiquement le compartiment responsable du rejet. Cette immunosuppression générale altère les mécanismes d’immuno- O. Joffre : Inserm U563, Section Tolérance et Auto-immunité, 31300 Toulouse, France. Adresse actuelle : CRUK, LRI, Immunobiology Lab, London WC2A 3PX, Royaume-Uni. T. Santolaria : Inserm U563, Section Tolérance et Auto-immunité, 31300 Toulouse, France. J.P.M. van Meerwijk : Inserm U563, Section Tolérance et Auto-immunité, 31300 Toulouse, France. Université Paul Sabatier Toulouse III, 31400 Toulouse, France. Institut Universitaire de France, Toulouse, France. [email protected] [email protected] NOUVELLES Utilisation des lymphocytes T régulateurs en transplantation MAGAZINE NOUVELLE 689 29/08/2008 10:33:18 Un autre mécanisme impliqué dans l’induction et la maintenance de la tolérance « au soi » est dépendant de l’action de lymphocytes T régulateurs dont l’existence, suspectée depuis les travaux de Le Douarin [3], a été définitivement établie par l’équipe de Sakaguchi [4]. L’observation que leur déplétion entraîne le développement d’une pathologie auto-immune létale [5] démontre que ces cellules, de phénotype CD4+CD25+Foxp3+ et naturellement produites dans le thymus, ont un rôle non-redondant dans le contrôle des lymphocytes autospécifiques [11]. Différents groupes ont développé des approches visant à évaluer leur utilisation potentielle dans le cadre de la transplantation. A Voie d’alloreconnaissance directe Une nouvelle stratégie de contrôle du rejet de greffe de moelle osseuse par des T régulateurs amplifiés La capacité des lymphocytes T régulateurs à contrôler les mécanismes de rejet dépend du rapport de force entre les compartiments suppresseurs et effecteurs allospécifiques. Les cellules T régulatrices n’étant présentes dans l’organisme qu’en quantités limitées, les protocoles d’immunothérapie ont longtemps été bloqués par le faible nombre de cellules obtenues après purification. De plus, contrairement au compartiment des lymphocytes effecteurs, le répertoire des lymphocytes T régulateurs est pauvre en précurseurs allospécifiques [6]. Dans le laboratoire, nous avons levé ces deux barrières en développant une approche B Voie d’alloreconnaissance indirecte CD8+ CD8+ CD4+ CMH I CD4+ TCR CMH I TCR TCR CMH II TCR CMH II 3 Matériel allogénique (molécules du CMH solubles, cellules mortes, débris cellulaires…) DC allogénique 2 1 DC syngénique Figures 2. Deux voies d’alloreconnaissance conduisent à l’activation des lymphocytes T allospécifiques. A. Dans les semaines suivant l’opération, les cellules dendritiques (DC) allogéniques présentes dans le tissu greffé migrent dans les ganglions lymphatiques drainant. Elles vont alors stimuler les cellules T allospécifiques par une voie d’alloreconnaissance qualifiée de « directe » qui implique l’interaction du récepteur à l’antigène des lymphocytes T (TCR) avec les molécules de CMH allogéniques exprimées par les DC du donneur. Sauf dans le cas particulier de la greffe de moelle osseuse, le nombre de DC allogéniques est fini puisque ces cellules ne sont pas renouvelées. La voie d’alloreconnaissance directe est donc principalement associée au rejet aigu. B. Les DC du receveur activent les cellules T allospécifiques par une voie « indirecte », essentiellement impliquée dans l’initiation et le développement du rejet chronique. Elle est dépendante de la présentation de peptides allogéniques par les molécules de CMH endogènes. Les antigènes du donneur, sous forme de cellules mortes ou de molécules solubles, sont captés par phagocytose ou pinocytose par les DC du receveur (1). Ils sont alors dirigés vers la voie de biosynthèse des molécules du CMH II sur lesquelles ils sont chargés sous forme de peptides après protéolyse (2). Ce processus aboutit à l’activation des lymphocytes T CD4+ allospécifiques. Certaines populations de DC sont aussi capables de présenter, par un mécanisme de cross-présentation, les antigènes exogènes allogéniques aux cellules T CD8+ via les molécules du CMH I (3). 690 Nouvelles.indd 690 qui nous a permis de prévenir le rejet d’une allogreffe de moelle osseuse [7]. Après purification, nous avons augmenté le nombre de lymphocytes T régulateurs issus du receveur via une étape de culture in vitro. Afin d’enrichir la population obtenue en précurseurs allospécifiques, nous avons utilisé des cellules présentatrices d’antigènes du donneur comme source de signal mitogène. Nous avons alors testé la capacité des cellules T régulatrices du receveur ainsi obtenues à contrôler les mécanismes de rejet après allogreffe de moelle osseuse chez des animaux conditionnés par une irradiation non-lymphoablative. Le but avoué du prétraitement était de libérer des niches pour les cellules souches hématopoïétiques allogéniques et de déprimer transitoirement et partiellement la réactivité du système immunitaire afin de faciliter l’action de la population suppressive injectée. Dans ce système, nous avons montré que les cellules régulatrices issues du receveur et amplifiées selon notre protocole contrôlent de façon durable le rejet dirigé contre la moelle osseuse allogénique. Contrairement aux drogues immunosuppressives, nous avons observé que ce traitement inhibe uniquement le compartiment alloréactif, et non le système immunitaire dans sa globalité. Notre procédure permet donc un contrôle total du rejet tout en évitant les effets secondaires des drogues. L’intérêt de ce type d’approche repose aussi sur le fait qu’à leur tour, les cellules hématopoïétiques allogéniques transférées participent à l’induction de tolérance des lymphocytes T et B néosynthétisés dans les organes lymphoïdes primaires ainsi qu’à la survie de la population régulatrice injectée. Encouragés par ces résultats, nous avons utilisé le même protocole pour tenter de prévenir le rejet de tissus ou d’organes solides [8]. Contrairement aux résultats obtenus après allogreffe de moelle osseuse, les cellules T régulatrices n’ont que légèrement retardé la destruction de greffes allogéniques de cœur ou de peau. Étant donné que les lymphocytes T régulateurs ne survivent qu’en présence M/S n° 8-9, vol. 24, août-septembre 2008 29/08/2008 10:33:19 Une préactivation des cellules T régulatrices par les voies d’alloreconnaissance directes et indirectes est nécessaire pour inhiber totalement les mécanismes de rejet aigu et chronique Le rejet d’allogreffe est orchestré par des lymphocytes T susceptibles de reconnaître les alloantigènes de deux façons fondamentalement distinctes (Figure 2). À court terme, les cellules T allospécifiques sont stimulées « directement » par les cellules présentatrices d’antigène du donneur migrant du greffon aux organes lymphoïdes draînants. Dans ce cas, les cellules T de l’hôte reconnaissent donc les peptides allogéniques présentés par les molécules du CMH du donneur. Cette voie d’activation est essentiellement associée aux épisodes de rejet aigu. À plus long terme, les cellules présentatrices d’antigène de l’hôte colonisent le tissu greffé, captent des antigènes, avant d’activer « indirectement » d’autres lymphocytes T allospécifiques. Ces derniers, qui reconnaissent donc des complexes formés par des molécules du CMH du soi et des peptides allogéniques, vont alors initier les mécanismes de rejet chronique. Le protocole de culture que nous avions établi ne permettait d’enrichir la population régulatrice qu’en cellules reconnaissant les antigènes du donneur par la voie directe. Nous avons M/S n° 8-9, vol. 24, août-septembre 2008 Nouvelles.indd 691 Sur le chemin d’une utilisation clinique ? Si ces données sont encourageantes, de nombreux obstacles restent cependant à résoudre avant de transposer notre approche à la clinique humaine. Le premier est logistique puisqu’il conviendra de contrôler le rejet de la moelle et de l’organe le temps nécessaire à la culture des cellules T régulatrices. Le deuxième concerne le fait que les lymphocytes T mémoires jouent un rôle important dans le rejet de greffe chez l’homme. Les souris de laboratoire étant élevées et maintenues dans des structures exemptes de pathogènes, leur système immunitaire en est quasiment dépourvu. Des travaux complémentaires sont donc nécessaires afin d’évaluer la capacité des cellules T régulatrices à contrôler l’alloréactivité des lymphocytes mémoires. Le troisième obstacle est lié à la purification des cellules régulatrices. Chez des animaux de laboratoire, un enrichissement basé sur l’expression du marqueur CD25 permet d’obtenir une population virtuellement pure de cellules suppressives. Chez l’homme, la situation est plus complexe puisque le marqueur CD25 est exprimé par les cellules T activés et que Foxp3, de par sa localisation nucléaire, n’est pas exploitable. Des études récentes semblent suggérer que d’autres marqueurs, tels que CD127 ou FR4, pourraient être utilisés [9, 10]. Même si la route est encore longue, notre travail suggère que les cellules T régulatrices pourront être utilisées en clinique afin d’induire un état de tolérance à un greffon allogénique. Le bénéfice attendu pour les patients est immense puisque ce type d’approche permettra de contrôler totalement et durablement les mécanismes de rejet sans induire de toxicité et sans favoriser le développement de néoplasmes ou d’infections opportunistes. ‡ Tregs-based immunotherapy: an efficient way to fully inhibit acute and chronic rejection MAGAZINE émis l’hypothèse selon laquelle l’absence de contrôle des mécanismes de rejet chronique était due à l’absence, dans la population injectée, de cellules suppressives reconnaissant les alloantigènes par voie indirecte. Nous avons donc modifié notre protocole de culture in vitro afin de générer une population de cellules T régulatrices enrichie en précurseurs capables de reconnaître les alloantigènes à la fois par les voies directe et indirecte. En utilisant cette population, nous avons pu inhiber totalement les mécanismes de rejet chronique et ainsi protéger à long terme des doubles greffes de moelle osseuse et de peau ou de cœur. En développant une stratégie permettant de dévier les deux mécanismes d’induction de tolérance au soi de leur fonction première, nous avons donc induit un état de tolérance durable et spécifique à des allogreffes de tissus et d’organes. NOUVELLES des antigènes pour lesquels ils sont spécifiques, et que contrairement à la moelle osseuse, les tissus solides n’ont que peu de cellules présentatrices d’antigènes capables de délivrer les signaux nécessaires, nous avons testé si la co-injection de moelle osseuse allogénique avec les cellules T régulatrices pourrait favoriser la protection de la greffe solide. Dans ce contexte, les lymphocytes T régulateurs préviennent donc le rejet de la moelle qui en retour favorise leur survie. Cette approche nous a permis d’inhiber efficacement les épisodes de rejet aigu mais pas le développement du rejet chronique. Ce résultat démontre qu’un chimérisme hématopoïétique ne garantit pas la survie des greffes à long terme. RÉFÉRENCES 1. Billingham RE, Brent L, Medawar PB. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature 1953 ; 172 : 603-6. 2. Kawai T, Cosimi AB, Spitzer TR, et al. HLA-mismatched renal transplantation without maintenance immunosuppression. N Engl J Med 2008 ; 358 : 353-61. 3. Coutinho A, Salaun J, Corbel C, et al. The role of thymic epithelium in the establishment of transplantation tolerance. Immunol Rev 1993 ; 133 : 225-40. 4. Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, et al. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol 1995 ; 155 : 1151-64. 5. Sakaguchi S. Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol 2004 ; 22 : 531-62. 6. Romagnoli P, Hudrisier D, van Meerwijk JPM. Preferential recognition of self antigens despite normal thymic deletion of CD4+CD25+ regulatory T cells. J Immunol 2002 ; 168 : 1644-8. 7. Joffre O, Gorsse N, Romagnoli P, et al. Induction of antigen-specific tolerance to bone marrow allografts with CD4+CD25+ T lymphocytes. Blood 2004 ; 103 : 4216-21. 8. Joffre O, Santolaria T, Calise D, et al. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nat Med 2008 ; 14 : 88-92. 9. Liu W, Putnam AL, Xu-Yu Z, et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med 2006 ; 203 : 1701-11. 10. Yamaguchi T, Hirota K, Nagahama K, et al. Control of immune responses by antigen-specific regulatory T cells expressing the folate receptor. Immunity 2007 ; 27 : 145-59. 11. Vocanson M, Hennino A, Chavagnac C, et al. Eczéma allergique de contact : comment ré-induire une tolérance ? Med Sci (Paris) 2006 ; 22 : 158-63. 691 29/08/2008 10:33:19 REFERENCES 121 1. Carrel, A. 1910. VIII. On the Experimental Surgery of the Thoracic Aorta and Heart. Ann Surg 52:83-95. 2. Oeconomos, N., J. Hamburger, P. Delinotte, J. Vaysse, G. Richet, B. Antoine, E. Elmelik, and C. Perrin. 1953. [Attempt at renal homograft (maternal kidney) after nephrectomy for traumatism of a lone kidney.]. Mem Acad Chir (Paris) 79:642-652. 3. Guild, W. R., J. H. Harrison, J. P. Merrill, and J. Murray. 1955. Successful homotransplantation of the kidney in an identical twin. Trans Am Clin Climatol Assoc 67:167-173. 4. Mollaret, P., and M. Goulon. 1959. [The depassed coma (preliminary memoir).]. Rev Neurol (Paris) 101:315. catecholamines. 62:330-335. Transplantation 10. Mertes, P. M., J. P. Carteaux, Y. Jaboin, G. Pinelli, K. el Abassi, C. Dopff, J. Atkinson, J. P. Villemot, C. Burlet, and M. Boulange. 1994. Estimation of myocardial interstitial norepinephrine release after brain death using cardiac microdialysis. Transplantation 57:371-377. 11. Seguin, C., Y. Devaux, S. Grosjean, E. M. Siaghy, P. Mairose, F. Zannad, N. de Talance, D. Ungureanu-Longrois, and P. M. Mertes. 2001. Evidence of functional myocardial ischemia associated with myocardial dysfunction in brain-dead pigs. Circulation 104:I197-201. 12. Kosieradzki, M., J. Kuczynska, J. Piwowarska, I. Wegrowicz-Rebandel, A. Kwiatkowski, W. Lisik, G. Michalak, R. Danielewicz, L. Paczek, and W. A. Rowinski. 2003. Prognostic significance of free radicals: mediated injury occurring in the kidney donor. Transplantation 75:1221-1227. 5. Barnard, C. N. 1967. The operation. A human cardiac transplant: an interim report of a successful operation performed at Groote Schuur Hospital, Cape Town. South African medical journal = Suid-Afrikaanse tydskrif vir geneeskunde 41:1271-1274. 13. 6. Starzl, T. E., R. Weil, 3rd, S. Iwatsuki, G. Klintmalm, G. P. Schroter, L. J. Koep, Y. Iwaki, P. I. Terasaki, and K. A. Porter. 1980. The use of cyclosporin A and prednisone in cadaver kidney transplantation. Surg Gynecol Obstet 151:17-26. Novitzky, D., A. G. Rose, and D. K. Cooper. 1988. Injury of myocardial conduction tissue and coronary artery smooth muscle following brain death in the baboon. Transplantation 45:964966. 14. Terasaki, P. I., J. M. Cecka, D. W. Gjertson, and S. Takemoto. 1995. High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors. N Engl J Med 333:333-336. Novitzky, D., W. N. Wicomb, D. K. Cooper, A. G. Rose, and B. Reichart. 1986. Prevention of myocardial injury during brain death by total cardiac sympathectomy in the Chacma baboon. Ann Thorac Surg 41:520-524. 15. Takada, M., K. C. Nadeau, W. W. Hancock, H. S. Mackenzie, G. D. Shaw, A. M. Waaga, A. Chandraker, M. H. Sayegh, and N. L. Tilney. 1998. Effects of explosive brain death on cytokine activation of peripheral organs in the rat. Transplantation 65:1533-1542. 16. Perico, N., D. Cattaneo, M. H. Sayegh, and G. Remuzzi. 2004. Delayed graft function in kidney transplantation. Lancet 364:1814-1827. 7. 8. Wilhelm, M. J., J. Pratschke, F. Beato, M. Taal, M. Kusaka, W. W. Hancock, and N. L. Tilney. 2000. Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation. Circulation 102:24262433. 9. Herijgers, P., V. Leunens, T. B. Tjandra-Maga, K. Mubagwa, and W. Flameng. 1996. Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating 122 17. Haugen, E., and K. A. Nath. 1999. The involvement of oxidative stress in the progression of renal injury. Blood Purif 17:58-65. 26. Roopenian, D., E. Y. Choi, and A. Brown. 2002. The immunogenomics of minor histocompatibility antigens. Immunological reviews 190:86-94. 18. Noiri, E., T. Peresleni, F. Miller, and M. S. Goligorsky. 1996. In vivo targeting of inducible NO synthase with oligodeoxynucleotides protects rat kidney against ischemia. J Clin Invest 97:2377-2383. 27. Gordon, R. D., E. Simpson, and L. E. Samelson. 1975. In vitro cell-mediated immune responses to the male specific(H-Y) antigen in mice. J Exp Med 142:1108-1120. 28. 19. Li, C., and R. M. Jackson. 2002. Reactive species mechanisms of cellular hypoxia-reoxygenation injury. Am J Physiol Cell Physiol 282:C227241. Perreault, C., D. C. Roy, and C. Fortin. 1998. Immunodominant minor histocompatibility antigens: the major ones. Immunol Today 19:69-74. 29. Wettstein, P. J. 1986. Immunodominance in the T-cell response to multiple non-H-2 histocompatibility antigens. II. Observation of a hierarchy among dominant antigens. Immunogenetics 24:24-31. 30. Wolpert, E., L. Franksson, and K. Karre. 1995. Dominant and cryptic antigens in the MHC class I restricted T cell response across a complex minor histocompatibility barrier: analysis and mapping by elution of cellular peptides. Int Immunol 7:919928. 31. Daniels, G. 2005. The molecular genetics of blood group polymorphism. Transpl Immunol 14:143-153. 32. Seltsam, A., M. Hallensleben, A. Kollmann, and R. Blasczyk. 2003. The nature of diversity and diversification at the ABO locus. Blood 102:3035-3042. 33. Stussi, G., J. Halter, U. Schanz, and J. D. Seebach. 2006. ABO-histo blood group incompatibility in hematopoietic stem cell and solid organ transplantation. Transfus Apher Sci 35:59-69. 34. Chopek, M. W., R. L. Simmons, and J. L. Platt. 1987. ABO-incompatible kidney transplantation: initial immunopathologic evaluation. Transplant Proc 19:4553-4557. 35. Tyden, G., G. Kumlien, H. Genberg, J. Sandberg, T. Lundgren, and I. Fehrman. 2005. ABO-incompatible 20. Castaneda, M. P., A. SwiateckaUrban, M. M. Mitsnefes, D. Feuerstein, F. J. Kaskel, V. Tellis, and P. Devarajan. 2003. Activation of mitochondrial apoptotic pathways in human renal allografts after ischemiareperfusion injury. Transplantation 76:50-54. 21. Ackerman, A. L., and P. Cresswell. 2004. Cellular mechanisms governing cross-presentation of exogenous antigens. Nature immunology 5:678684. 22. Rotzschke, O., K. Falk, H. J. Wallny, S. Faath, and H. G. Rammensee. 1990. Characterization of naturally occurring minor histocompatibility peptides including H-4 and H-Y. Science (New York, N.Y 249:283-287. 23. 24. 25. Wallny, H. J., and H. G. Rammensee. 1990. Identification of classical minor histocompatibility antigen as cellderived peptide. Nature 343:275-278. Simpson, E. 1998. Minor transplantation antigens: animal models for human host-versus-graft, graft-versus-host, and graft-versusleukemia reactions. Transplantation 65:611-616. Simpson, E., D. Scott, and P. Chandler. 1997. The male-specific histocompatibility antigen, H-Y: a history of transplantation, immune response genes, sex determination and expression cloning. Annu Rev Immunol 15:39-61. 123 kidney transplantation and rituximab. Transplant Proc 37:3286-3287. 36. Takahashi, K., K. Saito, S. Takahara, A. Okuyama, K. Tanabe, H. Toma, K. Uchida, A. Hasegawa, N. Yoshimura, and Y. Kamiryo. 2004. Excellent longterm outcome of ABO-incompatible living donor kidney transplantation in Japan. Am J Transplant 4:1089-1096. 37. Lafferty, K. J., A. Bootes, G. Dart, and D. W. Talmage. 1976. Effect of organ culture on the survival of thyroid allografts in mice. Transplantation 22:138-149. 38. Shlomchik, W. D., M. S. Couzens, C. B. Tang, J. McNiff, M. E. Robert, J. Liu, M. J. Shlomchik, and S. G. Emerson. 1999. Prevention of graft versus host disease by inactivation of host antigen-presenting cells. Science (New York, N.Y 285:412-415. 39. 40. 41. Lechler, R. I., and J. R. Batchelor. 1982. Restoration of immunogenicity to passenger cell-depleted kidney allografts by the addition of donor strain dendritic cells. J Exp Med 155:31-41. Pescovitz, M. D., J. R. Thistlethwaite, Jr., H. Auchincloss, Jr., S. T. Ildstad, T. G. Sharp, R. Terrill, and D. H. Sachs. 1984. Effect of class II antigen matching on renal allograft survival in miniature swine. J Exp Med 160:14951508. Pietra, B. A., A. Wiseman, A. Bolwerk, M. Rizeq, and R. G. Gill. 2000. CD4 T cell-mediated cardiac allograft rejection requires donor but not host MHC class II. J Clin Invest 106:10031010. 42. Daniel, C., S. Horvath, and P. M. Allen. 1998. A basis for alloreactivity: MHC helical residues broaden peptide recognition by the TCR. Immunity 8:543-552. 43. Lombardi, G., S. Sidhu, M. Daly, J. R. Batchelor, W. Makgoba, and R. I. Lechler. 1990. Are primary alloresponses truly primary? Int Immunol 2:9-13. 124 44. Suchin, E. J., P. B. Langmuir, E. Palmer, M. H. Sayegh, A. D. Wells, and L. A. Turka. 2001. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol 166:973-981. 45. Jerne, N. K. 1971. The somatic generation of immune recognition. European journal of immunology 1:1-9. 46. Zerrahn, J., W. Held, and D. H. Raulet. 1997. The MHC reactivity of the T cell repertoire prior to positive and negative selection. Cell 88:627-636. 47. Matzinger, P., and M. J. Bevan. 1977. Hypothesis: why do so many lymphocytes respond to major histocompatibility antigens? Cell Immunol 29:1-5. 48. Obst, R., N. Netuschil, K. Klopfer, S. Stevanovic, and H. G. Rammensee. 2000. The role of peptides in T cell alloreactivity is determined by selfmajor histocompatibility complex molecules. J Exp Med 191:805-812. 49. Baker, R. J., M. P. HernandezFuentes, P. A. Brookes, A. N. Chaudhry, and R. I. Lechler. 2001. The role of the allograft in the induction of donor-specific T cell hyporesponsiveness. Transplantation 72:480-485. 50. Hornick, P. I., P. D. Mason, M. H. Yacoub, M. L. Rose, R. Batchelor, and R. I. Lechler. 1998. Assessment of the contribution that direct allorecognition makes to the progression of chronic cardiac transplant rejection in humans. Circulation 97:1257-1263. 51. Auchincloss, H., Jr., R. Lee, S. Shea, J. S. Markowitz, M. J. Grusby, and L. H. Glimcher. 1993. The role of "indirect" recognition in initiating rejection of skin grafts from major histocompatibility complex class IIdeficient mice. Proc Natl Acad Sci U S A 90:3373-3377. 52. Dalchau, R., J. Fangmann, and J. W. Fabre. 1992. Allorecognition of isolated, denatured chains of class I and class II major histocompatibility complex molecules. Evidence for an galactosyltransferase-deficient pigs. Science (New York, N.Y 299:411-414. important role for indirect allorecognition in transplantation. European journal of immunology 22:669-677. 53. 54. Baker, R. J., M. P. HernandezFuentes, P. A. Brookes, A. N. Chaudhry, H. T. Cook, and R. I. Lechler. 2001. Loss of direct and maintenance of indirect alloresponses in renal allograft recipients: implications for the pathogenesis of chronic allograft nephropathy. J Immunol 167:7199-7206. Lee, R. S., M. J. Grusby, L. H. Glimcher, H. J. Winn, and H. Auchincloss, Jr. 1994. Indirect recognition by helper cells can induce donor-specific cytotoxic T lymphocytes in vivo. J Exp Med 179:865-872. 55. Herrera, O. B., D. Golshayan, R. Tibbott, F. Salcido Ochoa, M. J. James, F. M. Marelli-Berg, and R. I. Lechler. 2004. A novel pathway of alloantigen presentation by dendritic cells. J Immunol 173:4828-4837. 56. Jiang, S., O. Herrera, and R. I. Lechler. 2004. New spectrum of allorecognition pathways: implications for graft rejection and transplantation tolerance. Curr Opin Immunol 16:550557. 57. Nakashima, S., Z. Qian, S. Rahimi, B. A. Wasowska, and W. M. Baldwin, 3rd. 2002. Membrane attack complex contributes to destruction of vascular integrity in acute lung allograft rejection. J Immunol 169:4620-4627. 58. Rocha, P. N., T. J. Plumb, S. D. Crowley, and T. M. Coffman. 2003. Effector mechanisms in transplant rejection. Immunological reviews 196:51-64. 59. Phelps, C. J., C. Koike, T. D. Vaught, J. Boone, K. D. Wells, S. H. Chen, S. Ball, S. M. Specht, I. A. Polejaeva, J. A. Monahan, P. M. Jobst, S. B. Sharma, A. E. Lamborn, A. S. Garst, M. Moore, A. J. Demetris, W. A. Rudert, R. Bottino, S. Bertera, M. Trucco, T. E. Starzl, Y. Dai, and D. L. Ayares. 2003. Production of alpha 1,3- 125 60. Vanrenterghem, Y. 1998. Role of acute rejection in chronic rejection. Transplantation proceedings 30:12101211. 61. Brandle, D., J. Joergensen, G. Zenke, K. Burki, and R. P. Hof. 1998. Contribution of donor-specific antibodies to acute allograft rejection: evidence from B cell-deficient mice. Transplantation 65:1489-1493. 62. Moll, S., and M. Pascual. 2005. Humoral rejection of organ allografts. Am J Transplant 5:2611-2618. 63. Sprent, J., M. Schaefer, E. K. Gao, and R. Korngold. 1988. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. I. L3T4+ cells can either augment or retard GVHD elicited by Lyt-2+ cells in class I different hosts. The Journal of experimental medicine 167:556-569. 64. Krieger, N. R., D. P. Yin, and C. G. Fathman. 1996. CD4+ but not CD8+ cells are essential for allorejection. The Journal of experimental medicine 184:2013-2018. 65. Haskova, Z., N. Usiu, J. S. Pepose, T. A. Ferguson, and P. M. Stuart. 2000. CD4+ T cells are critical for corneal, but not skin, allograft rejection. Transplantation 69:483-487. 66. Chan, S. Y., L. A. DeBruyne, R. E. Goodman, E. J. Eichwald, and D. K. Bishop. 1995. In vivo depletion of CD8+ T cells results in Th2 cytokine production and alternate mechanisms of allograft rejection. Transplantation 59:1155-1161. 67. Chen, N., Q. Gao, and E. H. Field. 1996. Prevention of Th1 response is critical for tolerance. Transplantation 61:1076-1083. 68. Loong, C. C., H. G. Hsieh, W. Y. Lui, A. Chen, and C. Y. Lin. 2002. Evidence for the early involvement of interleukin 17 in human and experimental renal allograft rejection. The Journal of pathology 197:322-332. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. Constant, S. L., and K. Bottomly. 1997. Induction of Th1 and Th2 CD4+ T cell responses: the alternative approaches. Annual review of immunology 15:297322. Schulz, M., H. J. Schuurman, J. Joergensen, C. Steiner, T. Meerloo, D. Kagi, H. Hengartner, R. M. Zinkernagel, M. H. Schreier, K. Burki, and et al. 1995. Acute rejection of vascular heart allografts by perforindeficient mice. European journal of immunology 25:474-480. Le Moine, A., M. Goldman, and D. Abramowicz. 2002. Multiple pathways to allograft rejection. Transplantation 73:1373-1381. Le Moine, A., M. Surquin, F. X. Demoor, J. C. Noel, M. A. Nahori, M. Pretolani, V. Flamand, M. Y. Braun, M. Goldman, and D. Abramowicz. 1999. IL-5 mediates eosinophilic rejection of MHC class II-disparate skin allografts in mice. J Immunol 163:3778-3784. Nadeau, K. C., H. Azuma, and N. L. Tilney. 1995. Sequential cytokine dynamics in chronic rejection of rat renal allografts: roles for cytokines RANTES and MCP-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92:87298733. Sirak, J., C. G. Orosz, E. Wakely, and A. M. VanBuskirk. 1997. Alloreactive delayed-type hypersensitivity in graft recipients: complexity of responses and divergence from acute rejection. Transplantation 63:1300-1307. Valujskikh, A., D. Matesic, A. Gilliam, D. Anthony, T. M. Haqqi, and P. S. Heeger. 1998. T cells reactive to a single immunodominant self-restricted allopeptide induce skin graft rejection in mice. The Journal of clinical investigation 101:1398-1407. Orosz, C. G., and R. P. Pelletier. 1997. Chronic remodeling pathology in grafts. Current opinion in immunology 9:676-680. 126 77. Shirwan, H. 1999. Chronic allograft rejection. Do the Th2 cells preferentially induced by indirect alloantigen recognition play a dominant role? Transplantation 68:715-726. 78. VanBuskirk, A. M., D. J. Pidwell, P. W. Adams, and C. G. Orosz. 1997. Transplantation immunology. Jama 278:1993-1999. 79. Adams, D. H., M. E. Russell, W. W. Hancock, M. H. Sayegh, L. R. Wyner, and M. J. Karnovsky. 1993. Chronic rejection in experimental cardiac transplantation: studies in the LewisF344 model. Immunological reviews 134:5-19. 80. Waaga, A. M., M. Gasser, I. Laskowski, and N. L. Tilney. 2000. Mechanisms of chronic rejection. Current opinion in immunology 12:517521. 81. Bojakowski, K., P. Religa, M. Bojakowska, U. Hedin, Z. Gaciong, and J. Thyberg. 2000. Arteriosclerosis in rat aortic allografts: early changes in endothelial integrity and smooth muscle phenotype. Transplantation 70:65-72. 82. Russell, M. E., A. F. Wallace, L. R. Wyner, J. B. Newell, and M. J. Karnovsky. 1995. Upregulation and modulation of inducible nitric oxide synthase in rat cardiac allografts with chronic rejection and transplant arteriosclerosis. Circulation 92:457464. 83. Reznik, S. I., A. Jaramillo, K. S. SivaSai, K. L. Womer, M. H. Sayegh, E. P. Trulock, G. A. Patterson, and T. Mohanakumar. 2001. Indirect allorecognition of mismatched donor HLA class II peptides in lung transplant recipients with bronchiolitis obliterans syndrome. Am J Transplant 1:228-235. 84. Goldman, M., A. Le Moine, M. Braun, V. Flamand, and D. Abramowicz. 2001. A role for eosinophils in transplant rejection. Trends in immunology 22:247-251. 85. Kahan, B. D. 2003. Individuality: the barrier to optimal immunosuppression. Nat Rev Immunol 3:831-838. 86. Calne, R. Y., G. P. Alexandre, and J. E. Murray. 1962. A study of the effects of drugs in prolonging survival of homologous renal transplants in dogs. Ann N Y Acad Sci 99:743-761. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. among renal allograft recipients treated with basiliximab, a chimeric anti-interleukin-2-receptor monoclonal antibody. United States Simulect Renal Study Group. Transplantation 67:276-284. Matasic, R., A. B. Dietz, and S. VukPavlovic. 1999. Dexamethasone inhibits dendritic cell maturation by redirecting differentiation of a subset of cells. J Leukoc Biol 66:909-914. Woodruff, M. F., and N. A. Anderson. 1963. Effect of Lymphocyte Depletion by Thoracic Duct Fistula and Administration of Antilymphocytic Serum on the Survival of Skin Homografts in Rats. Nature 200:702. Cosimi, A. B., R. B. Colvin, R. C. Burton, R. H. Rubin, G. Goldstein, P. C. Kung, W. P. Hansen, F. L. Delmonico, and P. S. Russell. 1981. Use of monoclonal antibodies to T-cell subsets for immunologic monitoring and treatment in recipients of renal allografts. N Engl J Med 305:308-314. Calne, R., S. D. Moffatt, P. J. Friend, N. V. Jamieson, J. A. Bradley, G. Hale, J. Firth, J. Bradley, K. G. Smith, and H. Waldmann. 1999. Campath IH allows low-dose cyclosporine monotherapy in 31 cadaveric renal allograft recipients. Transplantation 68:1613-1616. Lechler, R. I., M. Sykes, A. W. Thomson, and L. A. Turka. 2005. Organ transplantation--how much of the promise has been realized? Nat Med 11:605-613. Vincenti, F., R. Kirkman, S. Light, G. Bumgardner, M. Pescovitz, P. Halloran, J. Neylan, A. Wilkinson, H. Ekberg, R. Gaston, L. Backman, and J. Burdick. 1998. Interleukin-2-receptor blockade with daclizumab to prevent acute rejection in renal transplantation. Daclizumab Triple Therapy Study Group. N Engl J Med 338:161-165. Kahan, B. D., P. R. Rajagopalan, and M. Hall. 1999. Reduction of the occurrence of acute cellular rejection 127 94. Calne, R. Y., D. J. White, S. Thiru, D. B. Evans, P. McMaster, D. C. Dunn, G. N. Craddock, B. D. Pentlow, and K. Rolles. 1978. Cyclosporin A in patients receiving renal allografts from cadaver donors. Lancet 2:1323-1327. 95. Abraham, R. T., and G. J. Wiederrecht. 1996. Immunopharmacology of rapamycin. Annu Rev Immunol 14:483-510. 96. Kuo, C. J., J. Chung, D. F. Fiorentino, W. M. Flanagan, J. Blenis, and G. R. Crabtree. 1992. Rapamycin selectively inhibits interleukin-2 activation of p70 S6 kinase. Nature 358:70-73. 97. Pinschewer, D. D., A. F. Ochsenbein, B. Odermatt, V. Brinkmann, H. Hengartner, and R. M. Zinkernagel. 2000. FTY720 immunosuppression impairs effector T cell peripheral homing without affecting induction, expansion, and memory. J Immunol 164:5761-5770. 98. Matloubian, M., C. G. Lo, G. Cinamon, M. J. Lesneski, Y. Xu, V. Brinkmann, M. L. Allende, R. L. Proia, and J. G. Cyster. 2004. Lymphocyte egress from thymus and peripheral lymphoid organs is dependent on S1P receptor 1. Nature 427:355-360. 99. Yanagawa, Y., K. Sugahara, H. Kataoka, T. Kawaguchi, Y. Masubuchi, and K. Chiba. 1998. FTY720, a novel immunosuppressant, induces sequestration of circulating mature lymphocytes by acceleration of lymphocyte homing in rats. II. FTY720 prolongs skin allograft survival by decreasing T cell infiltration into grafts but not cytokine production in vivo. J Immunol 160:5493-5499. 100. Salvadori, M., K. Budde, B. Charpentier, J. Klempnauer, B. Nashan, L. M. Pallardo, J. Eris, F. P. Schena, U. Eisenberger, L. Rostaing, A. Hmissi, and S. Aradhye. 2006. tolerance through hemopoietic chimerism, including protection from chronic heart allograft rejection. J Immunol 173:7025-7036. FTY720 versus MMF with cyclosporine in de novo renal transplantation: a 1year, randomized controlled trial in Europe and Australasia. Am J Transplant 6:2912-2921. 101. Billingham, R. E., L. Brent, and P. B. Medawar. 1953. Actively acquired tolerance of foreign cells. Nature 172:603-606. 102. Owen, R. D. 1945. Immunogenetic Consequences of Vascular Anastomoses between Bovine Twins. Science (New York, N.Y 102:400-401. 103. 104. 105. 106. 107. Ildstad, S. T., and D. H. Sachs. 1984. Reconstitution with syngeneic plus allogeneic or xenogeneic bone marrow leads to specific acceptance of allografts or xenografts. Nature 307:168-170. Sharabi, Y., and D. H. Sachs. 1989. Mixed chimerism and permanent specific transplantation tolerance induced by a nonlethal preparative regimen. J Exp Med 169:493-502. Spitzer, T. R., F. Delmonico, N. Tolkoff-Rubin, S. McAfee, R. Sackstein, S. Saidman, C. Colby, M. Sykes, D. H. Sachs, and A. B. Cosimi. 1999. Combined histocompatibility leukocyte antigen-matched donor bone marrow and renal transplantation for multiple myeloma with end stage renal disease: the induction of allograft tolerance through mixed lymphohematopoietic chimerism. Transplantation 68:480-484. Buhler, L. H., T. R. Spitzer, M. Sykes, D. H. Sachs, F. L. Delmonico, N. Tolkoff-Rubin, S. L. Saidman, R. Sackstein, S. McAfee, B. Dey, C. Colby, and A. B. Cosimi. 2002. Induction of kidney allograft tolerance after transient lymphohematopoietic chimerism in patients with multiple myeloma and end-stage renal disease. Transplantation 74:1405-1409. Metzler, B., P. Gfeller, M. Bigaud, J. Li, G. Wieczorek, C. Heusser, P. Lake, and A. Katopodis. 2004. Combinations of anti-LFA-1, everolimus, anti-CD40 ligand, and allogeneic bone marrow induce central transplantation 128 108. Ildstad, S. T., S. M. Wren, J. A. Bluestone, S. A. Barbieri, and D. H. Sachs. 1985. Characterization of mixed allogeneic chimeras. Immunocompetence, in vitro reactivity, and genetic specificity of tolerance. J Exp Med 162:231-244. 109. Luo, B., W. F. Chan, A. M. Shapiro, and C. C. Anderson. 2007. Nonmyeloablative mixed chimerism approaches and tolerance, a split decision. European journal of immunology 37:1233-1242. 110. Boyse, E. A., E. M. Lance, E. A. Carswell, S. Cooper, and L. J. Old. 1970. Rejection of skin allografts by radiation chimaeras: selective gene action in the specification of cell surface structure. Nature 227:901-903. 111. Lu, L., D. McCaslin, T. E. Starzl, and A. W. Thomson. 1995. Bone marrowderived dendritic cell progenitors (NLDC 145+, MHC class II+, B7-1dim, B7-2-) induce alloantigen-specific hyporesponsiveness in murine T lymphocytes. Transplantation 60:15391545. 112. Lutz, M. B., R. M. Suri, M. Niimi, A. L. Ogilvie, N. A. Kukutsch, S. Rossner, G. Schuler, and J. M. Austyn. 2000. Immature dendritic cells generated with low doses of GM-CSF in the absence of IL-4 are maturation resistant and prolong allograft survival in vivo. European journal of immunology 30:1813-1822. 113. Hackstein, H., and A. W. Thomson. 2004. Dendritic cells: emerging pharmacological targets of immunosuppressive drugs. Nat Rev Immunol 4:24-34. 114. Penna, G., and L. Adorini. 2000. 1 Alpha,25-dihydroxyvitamin D3 inhibits differentiation, maturation, activation, and survival of dendritic cells leading to impaired alloreactive T cell activation. J Immunol 164:2405-2411. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121. Griffin, M. D., W. Lutz, V. A. Phan, L. A. Bachman, D. J. McKean, and R. Kumar. 2001. Dendritic cell modulation by 1alpha,25 dihydroxyvitamin D3 and its analogs: a vitamin D receptordependent pathway that promotes a persistent state of immaturity in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 98:6800-6805. Gregori, S., M. Casorati, S. Amuchastegui, S. Smiroldo, A. M. Davalli, and L. Adorini. 2001. Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance. J Immunol 167:1945-1953. Wang, Z., A. T. Larregina, W. J. Shufesky, M. J. Perone, A. Montecalvo, A. F. Zahorchak, A. W. Thomson, and A. E. Morelli. 2006. Use of the inhibitory effect of apoptotic cells on dendritic cells for graft survival via T-cell deletion and regulatory T cells. Am J Transplant 6:1297-1311. Lu, L., W. Li, F. Fu, F. G. Chambers, S. Qian, J. J. Fung, and A. W. Thomson. 1997. Blockade of the CD40-CD40 ligand pathway potentiates the capacity of donorderived dendritic cell progenitors to induce long-term cardiac allograft survival. Transplantation 64:18081815. Wise, M. P., F. Bemelman, S. P. Cobbold, and H. Waldmann. 1998. Linked suppression of skin graft rejection can operate through indirect recognition. J Immunol 161:58135816. Yamada, A., A. Chandraker, T. M. Laufer, A. J. Gerth, M. H. Sayegh, and H. Auchincloss, Jr. 2001. Recipient MHC class II expression is required to achieve long-term survival of murine cardiac allografts after costimulatory blockade. J Immunol 167:5522-5526. Peche, H., B. Trinite, B. Martinet, and M. C. Cuturi. 2005. Prolongation of heart allograft survival by immature dendritic cells generated from recipient type bone marrow progenitors. Am J Transplant 5:255-267. 129 122. Beriou, G., H. Peche, C. Guillonneau, E. Merieau, and M. C. Cuturi. 2005. Donor-specific allograft tolerance by administration of recipient-derived immature dendritic cells and suboptimal immunosuppression. Transplantation 79:969-972. 123. Peche, H., K. Renaudin, G. Beriou, E. Merieau, S. Amigorena, and M. C. Cuturi. 2006. Induction of tolerance by exosomes and short-term immunosuppression in a fully MHCmismatched rat cardiac allograft model. Am J Transplant 6:1541-1550. 124. Morelli, A. E., and A. W. Thomson. 2003. Dendritic cells: regulators of alloimmunity and opportunities for tolerance induction. Immunological reviews 196:125-146. 125. Qin, S., S. P. Cobbold, H. Pope, J. Elliott, D. Kioussis, J. Davies, and H. Waldmann. 1993. "Infectious" transplantation tolerance. Science (New York, N.Y 259:974-977. 126. Lin, C. Y., L. Graca, S. P. Cobbold, and H. Waldmann. 2002. Dominant transplantation tolerance impairs CD8+ T cell function but not expansion. Nature immunology 3:1208-1213. 127. Davies, J. D., L. Y. Leong, A. Mellor, S. P. Cobbold, and H. Waldmann. 1996. T cell suppression in transplantation tolerance through linked recognition. J Immunol 156:3602-3607. 128. Scully, R., S. Qin, S. Cobbold, and H. Waldmann. 1994. Mechanisms in CD4 antibody-mediated transplantation tolerance: kinetics of induction, antigen dependency and role of regulatory T cells. European journal of immunology 24:2383-2392. 129. Sayegh, M. H., E. Akalin, W. W. Hancock, M. E. Russell, C. B. Carpenter, P. S. Linsley, and L. A. Turka. 1995. CD28-B7 blockade after alloantigenic challenge in vivo inhibits Th1 cytokines but spares Th2. J Exp Med 181:1869-1874. 130. 131. 132. ligand. Proc Natl Acad Sci U S A 92:9560-9564. Sayegh, M. H., X. G. Zheng, C. Magee, W. W. Hancock, and L. A. Turka. 1997. Donor antigen is necessary for the prevention of chronic rejection in CTLA4Ig-treated murine cardiac allograft recipients. Transplantation 64:1646-1650. Li, Y., X. C. Li, X. X. Zheng, A. D. Wells, L. A. Turka, and T. B. Strom. 1999. Blocking both signal 1 and signal 2 of T-cell activation prevents apoptosis of alloreactive T cells and induction of peripheral allograft tolerance. Nat Med 5:1298-1302. Grohmann, U., C. Orabona, F. Fallarino, C. Vacca, F. Calcinaro, A. Falorni, P. Candeloro, M. L. Belladonna, R. Bianchi, M. C. Fioretti, and P. Puccetti. 2002. CTLA-4-Ig regulates tryptophan catabolism in vivo. Nature immunology 3:1097-1101. 133. Judge, T. A., Z. Wu, X. G. Zheng, A. H. Sharpe, M. H. Sayegh, and L. A. Turka. 1999. The role of CD80, CD86, and CTLA4 in alloimmune responses and the induction of long-term allograft survival. J Immunol 162:1947-1951. 134. Rothstein, D. M., and M. H. Sayegh. 2003. T-cell costimulatory pathways in allograft rejection and tolerance. Immunological reviews 196:85-108. 135. Lee, I., L. Wang, A. D. Wells, M. E. Dorf, E. Ozkaynak, and W. W. Hancock. 2005. Recruitment of Foxp3+ T regulatory cells mediating allograft tolerance depends on the CCR4 chemokine receptor. J Exp Med 201:1037-1044. 136. Hancock, W. W., M. H. Sayegh, X. G. Zheng, R. Peach, P. S. Linsley, and L. A. Turka. 1996. Costimulatory function and expression of CD40 ligand, CD80, and CD86 in vascularized murine cardiac allograft rejection. Proc Natl Acad Sci U S A 93:13967-13972. 137. Parker, D. C., D. L. Greiner, N. E. Phillips, M. C. Appel, A. W. Steele, F. H. Durie, R. J. Noelle, J. P. Mordes, and A. A. Rossini. 1995. Survival of mouse pancreatic islet allografts in recipients treated with allogeneic small lymphocytes and antibody to CD40 130 138. Ensminger, S. M., O. Witzke, B. M. Spriewald, K. Morrison, P. J. Morris, M. L. Rose, and K. J. Wood. 2000. CD8+ T cells contribute to the development of transplant arteriosclerosis despite CD154 blockade. Transplantation 69:26092612. 139. Shimizu, K., U. Schonbeck, F. Mach, P. Libby, and R. N. Mitchell. 2000. Host CD40 ligand deficiency induces long-term allograft survival and donorspecific tolerance in mouse cardiac transplantation but does not prevent graft arteriosclerosis. J Immunol 165:3506-3518. 140. Larsen, C. P., E. T. Elwood, D. Z. Alexander, S. C. Ritchie, R. Hendrix, C. Tucker-Burden, H. R. Cho, A. Aruffo, D. Hollenbaugh, P. S. Linsley, K. J. Winn, and T. C. Pearson. 1996. Long-term acceptance of skin and cardiac allografts after blocking CD40 and CD28 pathways. Nature 381:434438. 141. Trambley, J., A. W. Bingaman, A. Lin, E. T. Elwood, S. Y. Waitze, J. Ha, M. M. Durham, M. Corbascio, S. R. Cowan, T. C. Pearson, and C. P. Larsen. 1999. Asialo GM1(+) CD8(+) T cells play a critical role in costimulation blockade-resistant allograft rejection. J Clin Invest 104:1715-1722. 142. Kirk, A. D., L. C. Burkly, D. S. Batty, R. E. Baumgartner, J. D. Berning, K. Buchanan, J. H. Fechner, Jr., R. L. Germond, R. L. Kampen, N. B. Patterson, S. J. Swanson, D. K. Tadaki, C. N. TenHoor, L. White, S. J. Knechtle, and D. M. Harlan. 1999. Treatment with humanized monoclonal antibody against CD154 prevents acute renal allograft rejection in nonhuman primates. Nat Med 5:686693. 143. Kawai, T., D. Andrews, R. B. Colvin, D. H. Sachs, and A. B. Cosimi. 2000. Thromboembolic complications after treatment with monoclonal antibody against CD40 ligand. Nat Med 6:114. 144. 145. 146. 147. Mombaerts, P., J. Iacomini, R. S. Johnson, K. Herrup, S. Tonegawa, and V. E. Papaioannou. 1992. RAG-1deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell 68:869-877. Shinkai, Y., S. Koyasu, K. Nakayama, K. M. Murphy, D. Y. Loh, E. L. Reinherz, and F. W. Alt. 1993. Restoration of T cell development in RAG-2-deficient mice by functional TCR transgenes. Science (New York, N.Y 259:822-825. Shinkai, Y., G. Rathbun, K. P. Lam, E. M. Oltz, V. Stewart, M. Mendelsohn, J. Charron, M. Datta, F. Young, A. M. Stall, and et al. 1992. RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell 68:855-867. 148. Saint-Ruf, C., K. Ungewiss, M. Groettrup, L. Bruno, H. J. Fehling, and H. von Boehmer. 1994. Analysis and expression of a cloned pre-T cell receptor gene. Science (New York, N.Y 266:1208-1212. 149. Groettrup, M., K. Ungewiss, O. Azogui, R. Palacios, M. J. Owen, A. C. Hayday, and H. von Boehmer. 1993. A novel disulfide-linked heterodimer on pre-T cells consists of the T cell receptor beta chain and a 33 kd glycoprotein. Cell 75:283-294. 150. von Boehmer, H., and H. J. Fehling. 1997. Structure and function of the pre-T cell receptor. Annu Rev Immunol 15:433-452. 151. van Oers, N. S., H. von Boehmer, and A. Weiss. 1995. The pre-T cell receptor (TCR) complex is functionally coupled to the TCR-zeta subunit. J Exp Med 182:1585-1590. 152. immune responsiveness of donor cytotoxic cells. Nature 269:417-418. Vincenti, F., C. Larsen, A. Durrbach, T. Wekerle, B. Nashan, G. Blancho, P. Lang, J. Grinyo, P. F. Halloran, K. Solez, D. Hagerty, E. Levy, W. Zhou, K. Natarajan, and B. Charpentier. 2005. Costimulation blockade with belatacept in renal transplantation. N Engl J Med 353:770-781. Bevan, M. J. 1977. In a radiation chimaera, host H-2 antigens determine 131 153. Zinkernagel, R. M., G. N. Callahan, A. Althage, S. Cooper, P. A. Klein, and J. Klein. 1978. On the thymus in the differentiation of "H-2 self-recognition" by T cells: evidence for dual recognition? J Exp Med 147:882-896. 154. Ceredig, R., D. P. Dialynas, F. W. Fitch, and H. R. MacDonald. 1983. Precursors of T cell growth factor producing cells in the thymus: ontogeny, frequency, and quantitative recovery in a subpopulation of phenotypically mature thymocytes defined by monoclonal antibody GK1.5. J Exp Med 158:1654-1671. 155. Laufer, T. M., J. DeKoning, J. S. Markowitz, D. Lo, and L. H. Glimcher. 1996. Unopposed positive selection and autoreactivity in mice expressing class II MHC only on thymic cortex. Nature 383:81-85. 156. Capone, M., P. Romagnoli, F. Beermann, H. R. MacDonald, and J. P. van Meerwijk. 2001. Dissociation of thymic positive and negative selection in transgenic mice expressing major histocompatibility complex class I molecules exclusively on thymic cortical epithelial cells. Blood 97:13361342. 157. Matzinger, P., R. Zamoyska, and H. Waldmann. 1984. Self tolerance is H2-restricted. Nature 308:738-741. 158. Kappler, J. W., N. Roehm, and P. Marrack. 1987. T cell tolerance by clonal elimination in the thymus. Cell 49:273-280. 159. Kisielow, P., H. Bluthmann, U. D. Staerz, M. Steinmetz, and H. von Boehmer. 1988. Tolerance in T-cellreceptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature 333:742-746. 160. van Meerwijk, J. P., S. Marguerat, R. K. Lees, R. N. Germain, B. J. Fowlkes, and H. R. MacDonald. 1997. Quantitative impact of thymic clonal deletion on the T cell repertoire. J Exp Med 185:377-383. 161. 162. Roberts, J. L., S. O. Sharrow, and A. Singer. 1990. Clonal deletion and clonal anergy in the thymus induced by cellular elements with different radiation sensitivities. The Journal of experimental medicine 171:935-940. 163. Degermann, S., C. D. Surh, L. H. Glimcher, J. Sprent, and D. Lo. 1994. B7 expression on thymic medullary epithelium correlates with epitheliummediated deletion of V beta 5+ thymocytes. J Immunol 152:32543263. 164. Gallegos, A. M., and M. J. Bevan. 2004. Central tolerance to tissuespecific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation. J Exp Med 200:1039-1049. 165. Su, M. A., and M. S. Anderson. 2004. Aire: an update. Current opinion in immunology 16:746-752. 166. Anderson, M. S., E. S. Venanzi, L. Klein, Z. Chen, S. P. Berzins, S. J. Turley, H. von Boehmer, R. Bronson, A. Dierich, C. Benoist, and D. Mathis. 2002. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science (New York, N.Y 298:1395-1401. 167. 168. 169. cells is regulated at multiple levels. J Exp Med 202:33-45. Ramsdell, F., T. Lantz, and B. J. Fowlkes. 1989. A nondeletional mechanism of thymic self tolerance. Science (New York, N.Y 246:10381041. Aaltonen, J., P. Bjorses, L. Sandkuijl, J. Perheentupa, and L. Peltonen. 1994. An autosomal locus causing autoimmune disease: autoimmune polyglandular disease type I assigned to chromosome 21. Nature genetics 8:83-87. Liston, A., S. Lesage, J. Wilson, L. Peltonen, and C. C. Goodnow. 2003. Aire regulates negative selection of organ-specific T cells. Nature immunology 4:350-354. Derbinski, J., J. Gabler, B. Brors, S. Tierling, S. Jonnakuty, M. Hergenhahn, L. Peltonen, J. Walter, and B. Kyewski. 2005. Promiscuous gene expression in thymic epithelial 132 170. Giraud, M., R. Taubert, C. Vandiedonck, X. Ke, M. Levi-Strauss, F. Pagani, F. E. Baralle, B. Eymard, C. Tranchant, P. Gajdos, A. Vincent, N. Willcox, D. Beeson, B. Kyewski, and H. J. Garchon. 2007. An IRF8-binding promoter variant and AIRE control CHRNA1 promiscuous expression in thymus. Nature 448:934-937. 171. Klein, L., M. Klugmann, K. A. Nave, V. K. Tuohy, and B. Kyewski. 2000. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat Med 6:56-61. 172. Bouneaud, C., P. Kourilsky, and P. Bousso. 2000. Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion. Immunity 13:829-840. 173. Liblau, R., E. Tournier-Lasserve, J. Maciazek, G. Dumas, O. Siffert, G. Hashim, and M. A. Bach. 1991. T cell response to myelin basic protein epitopes in multiple sclerosis patients and healthy subjects. European journal of immunology 21:1391-1395. 174. Lohmann, T., R. D. Leslie, and M. Londei. 1996. T cell clones to epitopes of glutamic acid decarboxylase 65 raised from normal subjects and patients with insulin-dependent diabetes. J Autoimmun 9:385-389. 175. Morgan, D. J., C. Kurts, H. T. Kreuwel, K. L. Holst, W. R. Heath, and L. A. Sherman. 1999. Ontogeny of T cell tolerance to peripherally expressed antigens. Proc Natl Acad Sci U S A 96:3854-3858. 176. Hoglund, P., J. Mintern, C. Waltzinger, W. Heath, C. Benoist, and D. Mathis. 1999. Initiation of autoimmune diabetes by developmentally regulated presentation of islet cell antigens in the pancreatic lymph nodes. J Exp Med 189:331-339. 177. Andre, I., A. Gonzalez, B. Wang, J. Katz, C. Benoist, and D. Mathis. 1996. deletion than for effector function. Nature 351:482-485. Checkpoints in the progression of autoimmune disease: lessons from diabetes models. Proc Natl Acad Sci U S A 93:2260-2263. 186. Jenkins, M. K., and R. H. Schwartz. 1987. Antigen presentation by chemically modified splenocytes induces antigen-specific T cell unresponsiveness in vitro and in vivo. The Journal of experimental medicine 165:302-319. 187. Keir, M. E., and A. H. Sharpe. 2005. The B7/CD28 costimulatory family in autoimmunity. Immunological reviews 204:128-143. 188. Macian, F., F. Garcia-Cozar, S. H. Im, H. F. Horton, M. C. Byrne, and A. Rao. 2002. Transcriptional mechanisms underlying lymphocyte tolerance. Cell 109:719-731. 189. Okazaki, T., and T. Honjo. 2006. The PD-1-PD-L pathway in immunological tolerance. Trends in immunology 27:195-201. 190. Krummel, M. F., and J. P. Allison. 1995. CD28 and CTLA-4 have opposing effects on the response of T cells to stimulation. The Journal of experimental medicine 182:459-465. 191. Ohashi, P. S., S. Oehen, K. Buerki, H. Pircher, C. T. Ohashi, B. Odermatt, B. Malissen, R. M. Zinkernagel, and H. Hengartner. 1991. Ablation of "tolerance" and induction of diabetes by virus infection in viral antigen transgenic mice. Cell 65:305-317. Watanabe-Fukunaga, R., C. I. Brannan, N. Itoh, S. Yonehara, N. G. Copeland, N. A. Jenkins, and S. Nagata. 1992. The cDNA structure, expression, and chromosomal assignment of the mouse Fas antigen. J Immunol 148:1274-1279. 192. Oldstone, M. B., M. Nerenberg, P. Southern, J. Price, and H. Lewicki. 1991. Virus infection triggers insulindependent diabetes mellitus in a transgenic model: role of anti-self (virus) immune response. Cell 65:319331. Takahashi, T., M. Tanaka, C. I. Brannan, N. A. Jenkins, N. G. Copeland, T. Suda, and S. Nagata. 1994. Generalized lymphoproliferative disease in mice, caused by a point mutation in the Fas ligand. Cell 76:969-976. 193. Rieux-Laucat, F., F. Le Deist, C. Hivroz, I. A. Roberts, K. M. Debatin, A. Fischer, and J. P. de Villartay. 1995. Mutations in Fas associated with human lymphoproliferative syndrome and autoimmunity. Science (New York, N.Y 268:1347-1349. 178. Niederkorn, J. Y. 2006. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nature immunology 7:354-359. 179. Abi-Hanna, D., D. Wakefield, and S. Watkins. 1988. HLA antigens in ocular tissues. I. In vivo expression in human eyes. Transplantation 45:610-613. 180. 181. 182. 183. 184. 185. T-cell Lampson, L. A., and C. A. Fisher. 1984. Weak HLA and beta 2microglobulin expression of neuronal cell lines can be modulated by interferon. Proc Natl Acad Sci U S A 81:6476-6480. Joly, E., L. Mucke, and M. B. Oldstone. 1991. Viral persistence in neurons explained by lack of major histocompatibility class I expression. Science (New York, N.Y 253:12831285. Kurts, C., J. F. Miller, R. M. Subramaniam, F. R. Carbone, and W. R. Heath. 1998. Major histocompatibility complex class Irestricted cross-presentation is biased towards high dose antigens and those released during cellular destruction. J Exp Med 188:409-414. Pircher, H., U. H. Rohrer, D. Moskophidis, R. M. Zinkernagel, and H. Hengartner. 1991. Lower receptor avidity required for thymic clonal 133 194. 195. Fisher, G. H., F. J. Rosenberg, S. E. Straus, J. K. Dale, L. A. Middleton, A. Y. Lin, W. Strober, M. J. Lenardo, and J. M. Puck. 1995. Dominant interfering Fas gene mutations impair apoptosis in a human autoimmune lymphoproliferative syndrome. Cell 81:935-946. Falcone, M., and B. R. Bloom. 1997. A T helper cell 2 (Th2) immune response against non-self antigens modifies the cytokine profile of autoimmune T cells and protects against experimental allergic encephalomyelitis. The Journal of experimental medicine 185:901-907. 196. Zitvogel, L., A. Tesniere, and G. Kroemer. 2006. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nature reviews 6:715-727. 197. Kullberg, M. C., E. J. Pearce, S. E. Hieny, A. Sher, and J. A. Berzofsky. 1992. Infection with Schistosoma mansoni alters Th1/Th2 cytokine responses to a non-parasite antigen. J Immunol 148:3264-3270. 198. 199. 200. Walker, L. S., A. Gulbranson-Judge, S. Flynn, T. Brocker, C. Raykundalia, M. Goodall, R. Forster, M. Lipp, and P. Lane. 1999. Compromised OX40 function in CD28-deficient mice is linked with failure to develop CXC chemokine receptor 5-positive CD4 cells and germinal centers. The Journal of experimental medicine 190:1115-1122. Ishikawa, S., T. Sato, M. Abe, S. Nagai, N. Onai, H. Yoneyama, Y. Zhang, T. Suzuki, S. Hashimoto, T. Shirai, M. Lipp, and K. Matsushima. 2001. Aberrant high expression of B lymphocyte chemokine (BLC/CXCL13) by C11b+CD11c+ dendritic cells in murine lupus and preferential chemotaxis of B1 cells towards BLC. The Journal of experimental medicine 193:1393-1402. Li, M. O., Y. Y. Wan, S. Sanjabi, A. K. Robertson, and R. A. Flavell. 2006. Transforming growth factor-beta regulation of immune responses. Annual review of immunology 24:99146. 134 201. Akbari, O., R. H. DeKruyff, and D. T. Umetsu. 2001. Pulmonary dendritic cells producing IL-10 mediate tolerance induced by respiratory exposure to antigen. Nature immunology 2:725-731. 202. Sun, C. M., J. A. Hall, R. B. Blank, N. Bouladoux, M. Oukka, J. R. Mora, and Y. Belkaid. 2007. Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid. The Journal of experimental medicine 204:1775-1785. 203. Coombes, J. L., K. R. Siddiqui, C. V. Arancibia-Carcamo, J. Hall, C. M. Sun, Y. Belkaid, and F. Powrie. 2007. A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism. The Journal of experimental medicine 204:1757-1764. 204. Moseman, E. A., X. Liang, A. J. Dawson, A. Panoskaltsis-Mortari, A. M. Krieg, Y. J. Liu, B. R. Blazar, and W. Chen. 2004. Human plasmacytoid dendritic cells activated by CpG oligodeoxynucleotides induce the generation of CD4+CD25+ regulatory T cells. J Immunol 173:4433-4442. 205. Ochando, J. C., C. Homma, Y. Yang, A. Hidalgo, A. Garin, F. Tacke, V. Angeli, Y. Li, P. Boros, Y. Ding, R. Jessberger, G. Trinchieri, S. A. Lira, G. J. Randolph, and J. S. Bromberg. 2006. Alloantigen-presenting plasmacytoid dendritic cells mediate tolerance to vascularized grafts. Nature immunology 7:652-662. 206. Mellor, A. L., B. Baban, P. R. Chandler, A. Manlapat, D. J. Kahler, and D. H. Munn. 2005. Cutting edge: CpG oligonucleotides induce splenic CD19+ dendritic cells to acquire potent indoleamine 2,3-dioxygenasedependent T cell regulatory functions via IFN Type 1 signaling. J Immunol 175:5601-5605. 207. Fallarino, F., U. Grohmann, K. W. Hwang, C. Orabona, C. Vacca, R. Bianchi, M. L. Belladonna, M. C. Fioretti, M. L. Alegre, and P. Puccetti. 2003. Modulation of tryptophan Mak. 1992. Less mortality but more relapses in experimental allergic encephalomyelitis in CD8-/- mice. Science (New York, N.Y 256:12101213. catabolism by regulatory T cells. Nature immunology 4:1206-1212. 208. 209. 210. 211. 212. 213. 214. Baxter, A. G., S. J. Kinder, K. J. Hammond, R. Scollay, and D. I. Godfrey. 1997. Association between alphabetaTCR+CD4-CD8T-cell deficiency and IDDM in NOD/Lt mice. Diabetes 46:572-582. Lehuen, A., O. Lantz, L. Beaudoin, V. Laloux, C. Carnaud, A. Bendelac, J. F. Bach, and R. C. Monteiro. 1998. Overexpression of natural killer T cells protects Valpha14Jalpha281 transgenic nonobese diabetic mice against diabetes. The Journal of experimental medicine 188:1831-1839. van der Vliet, H. J., B. M. von Blomberg, N. Nishi, M. Reijm, A. E. Voskuyl, A. A. van Bodegraven, C. H. Polman, T. Rustemeyer, P. Lips, A. J. van den Eertwegh, G. Giaccone, R. J. Scheper, and H. M. Pinedo. 2001. Circulating V(alpha24+) Vbeta11+ NKT cell numbers are decreased in a wide variety of diseases that are characterized by autoreactive tissue damage. Clinical immunology (Orlando, Fla 100:144-148. Araki, M., T. Kondo, J. E. Gumperz, M. B. Brenner, S. Miyake, and T. Yamamura. 2003. Th2 bias of CD4+ NKT cells derived from multiple sclerosis in remission. International immunology 15:279-288. Roelofs-Haarhuis, K., X. Wu, and E. Gleichmann. 2004. Oral tolerance to nickel requires CD4+ invariant NKT cells for the infectious spread of tolerance and the induction of specific regulatory T cells. J Immunol 173:1043-1050. Cantor, H., J. Hugenberger, L. McVayBoudreau, D. D. Eardley, J. Kemp, F. W. Shen, and R. K. Gershon. 1978. Immunoregulatory circuits among Tcell sets. Identification of a subpopulation of T-helper cells that induces feedback inhibition. The Journal of experimental medicine 148:871-877. Koh, D. R., W. P. Fung-Leung, A. Ho, D. Gray, H. Acha-Orbea, and T. W. 135 215. Najafian, N., T. Chitnis, A. D. Salama, B. Zhu, C. Benou, X. Yuan, M. R. Clarkson, M. H. Sayegh, and S. J. Khoury. 2003. Regulatory functions of CD8+CD28- T cells in an autoimmune disease model. The Journal of clinical investigation 112:1037-1048. 216. Menager-Marcq, I., C. Pomie, P. Romagnoli, and J. P. van Meerwijk. 2006. CD8+CD28- regulatory T lymphocytes prevent experimental inflammatory bowel disease in mice. Gastroenterology 131:1775-1785. 217. Brimnes, J., M. Allez, I. Dotan, L. Shao, A. Nakazawa, and L. Mayer. 2005. Defects in CD8+ regulatory T cells in the lamina propria of patients with inflammatory bowel disease. J Immunol 174:5814-5822. 218. Hayday, A., E. Theodoridis, E. Ramsburg, and J. Shires. 2001. Intraepithelial lymphocytes: exploring the Third Way in immunology. Nature immunology 2:997-1003. 219. Jabri, B., and E. Ebert. 2007. Human CD8+ intraepithelial lymphocytes: a unique model to study the regulation of effector cytotoxic T lymphocytes in tissue. Immunological reviews 215:202-214. 220. Rifa'i, M., Y. Kawamoto, I. Nakashima, and H. Suzuki. 2004. Essential roles of CD8+CD122+ regulatory T cells in the maintenance of T cell homeostasis. The Journal of experimental medicine 200:1123-1134. 221. Xystrakis, E., A. S. Dejean, I. Bernard, P. Druet, R. Liblau, D. GonzalezDunia, and A. Saoudi. 2004. Identification of a novel natural regulatory CD8 T-cell subset and analysis of its mechanism of regulation. Blood 104:3294-3301. 222. Levings, M. K., S. Gregori, E. Tresoldi, S. Cazzaniga, C. Bonini, and M. G. Roncarolo. 2005. Differentiation of Tr1 cells by immature dendritic cells requires IL-10 but not CD25+CD4+ Tr cells. Blood 105:1162-1169. 223. 224. 225. 226. 227. 228. 229. Roncarolo, M. G., S. Gregori, M. Battaglia, R. Bacchetta, K. Fleischhauer, and M. K. Levings. 2006. Interleukin-10-secreting type 1 regulatory T cells in rodents and humans. Immunological reviews 212:28-50. Hawrylowicz, C. M., and A. O'Garra. 2005. Potential role of interleukin-10secreting regulatory T cells in allergy and asthma. Nat Rev Immunol 5:271283. Levings, M. K., R. Sangregorio, F. Galbiati, S. Squadrone, R. de Waal Malefyt, and M. G. Roncarolo. 2001. IFN-alpha and IL-10 induce the differentiation of human type 1 T regulatory cells. J Immunol 166:55305539. Kemper, C., A. C. Chan, J. M. Green, K. A. Brett, K. M. Murphy, and J. P. Atkinson. 2003. Activation of human CD4+ cells with CD3 and CD46 induces a T-regulatory cell 1 phenotype. Nature 421:388-392. Gregori, S., P. Mangia, R. Bacchetta, E. Tresoldi, F. Kolbinger, C. Traversari, J. M. Carballido, J. E. de Vries, U. Korthauer, and M. G. Roncarolo. 2005. An anti-CD45RO/RB monoclonal antibody modulates T cell responses via induction of apoptosis and generation of regulatory T cells. The Journal of experimental medicine 201:1293-1305. Dhodapkar, M. V., R. M. Steinman, J. Krasovsky, C. Munz, and N. Bhardwaj. 2001. Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells. The Journal of experimental medicine 193:233-238. Gilliet, M., and Y. J. Liu. 2002. Generation of human CD8 T regulatory cells by CD40 ligand-activated plasmacytoid dendritic cells. The Journal of experimental medicine 195:695-704. 136 230. Bilsborough, J., T. C. George, A. Norment, and J. L. Viney. 2003. Mucosal CD8alpha+ DC, with a plasmacytoid phenotype, induce differentiation and support function of T cells with regulatory properties. Immunology 108:481-492. 231. Steinbrink, K., M. Wolfl, H. Jonuleit, J. Knop, and A. H. Enk. 1997. Induction of tolerance by IL-10-treated dendritic cells. J Immunol 159:4772-4780. 232. Sato, K., N. Yamashita, M. Baba, and T. Matsuyama. 2003. Modified myeloid dendritic cells act as regulatory dendritic cells to induce anergic and regulatory T cells. Blood 101:35813589. 233. Menges, M., S. Rossner, C. Voigtlander, H. Schindler, N. A. Kukutsch, C. Bogdan, K. Erb, G. Schuler, and M. B. Lutz. 2002. Repetitive injections of dendritic cells matured with tumor necrosis factor alpha induce antigen-specific protection of mice from autoimmunity. The Journal of experimental medicine 195:15-21. 234. Gonzalez-Rey, E., A. Chorny, A. Fernandez-Martin, D. Ganea, and M. Delgado. 2006. Vasoactive intestinal peptide generates human tolerogenic dendritic cells that induce CD4 and CD8 regulatory T cells. Blood 107:3632-3638. 235. Yudoh, K., H. Matsuno, F. Nakazawa, T. Yonezawa, and T. Kimura. 2000. Reduced expression of the regulatory CD4+ T cell subset is related to Th1/Th2 balance and disease severity in rheumatoid arthritis. Arthritis and rheumatism 43:617-627. 236. Groux, H., A. O'Garra, M. Bigler, M. Rouleau, S. Antonenko, J. E. de Vries, and M. G. Roncarolo. 1997. A CD4+ T-cell subset inhibits antigen-specific T-cell responses and prevents colitis. Nature 389:737-742. 237. Gianfrani, C., M. K. Levings, C. Sartirana, G. Mazzarella, G. Barba, D. Zanzi, A. Camarca, G. Iaquinto, N. Giardullo, S. Auricchio, R. Troncone, and M. G. Roncarolo. 2006. Gliadin- thymectomized and irradiated Wistar rats. Clinical and experimental immunology 15:225-236. specific type 1 regulatory T cells from the intestinal mucosa of treated celiac patients inhibit pathogenic T cells. J Immunol 177:4178-4186. 238. 239. Akdis, M., J. Verhagen, A. Taylor, F. Karamloo, C. Karagiannidis, R. Crameri, S. Thunberg, G. Deniz, R. Valenta, H. Fiebig, C. Kegel, R. Disch, C. B. Schmidt-Weber, K. Blaser, and C. A. Akdis. 2004. Immune responses in healthy and allergic individuals are characterized by a fine balance between allergen-specific T regulatory 1 and T helper 2 cells. The Journal of experimental medicine 199:1567-1575. Xystrakis, E., S. Kusumakar, S. Boswell, E. Peek, Z. Urry, D. F. Richards, T. Adikibi, C. Pridgeon, M. Dallman, T. K. Loke, D. S. Robinson, F. J. Barrat, A. O'Garra, P. Lavender, T. H. Lee, C. Corrigan, and C. M. Hawrylowicz. 2006. Reversing the defective induction of IL-10-secreting regulatory T cells in glucocorticoidresistant asthma patients. The Journal of clinical investigation 116:146-155. 240. Roncarolo, M. G., and M. Battaglia. 2007. Regulatory T-cell immunotherapy for tolerance to self antigens and alloantigens in humans. Nature reviews 7:585-598. 241. Battaglia, M., A. Stabilini, E. Draghici, S. Gregori, C. Mocchetti, E. Bonifacio, and M. G. Roncarolo. 2006. Rapamycin and interleukin-10 treatment induces T regulatory type 1 cells that mediate antigen-specific transplantation tolerance. Diabetes 55:40-49. 242. Sakakura, T., and Y. Nishizuka. 1967. Effect of thymectomy on mammary tumorigenesis, noduligenesis, and mammogenesis in the mouse. Gann = Gan 58:441-450. 243. Nishizuka, Y., and T. Sakakura. 1969. Thymus and reproduction: sex-linked dysgenesia of the gonad after neonatal thymectomy in mice. Science (New York, N.Y 166:753-755. 244. Penhale, W. J., A. Farmer, R. P. McKenna, and W. J. Irvine. 1973. Spontaneous thyroiditis in 137 245. Penhale, W. J., W. J. Irvine, J. R. Inglis, and A. Farmer. 1976. Thyroiditis in T cell-depleted rats: suppression of the autoallergic response by reconstitution with normal lymphoid cells. Clinical and experimental immunology 25:6-16. 246. Sakaguchi, S., T. Takahashi, and Y. Nishizuka. 1982. Study on cellular events in post-thymectomy autoimmune oophoritis in mice. II. Requirement of Lyt-1 cells in normal female mice for the prevention of oophoritis. The Journal of experimental medicine 156:1577-1586. 247. Berland, R., and H. H. Wortis. 2002. Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5. Annual review of immunology 20:253-300. 248. Sakaguchi, S., K. Fukuma, K. Kuribayashi, and T. Masuda. 1985. Organ-specific autoimmune diseases induced in mice by elimination of T cell subset. I. Evidence for the active participation of T cells in natural selftolerance; deficit of a T cell subset as a possible cause of autoimmune disease. The Journal of experimental medicine 161:72-87. 249. Powrie, F., and D. Mason. 1990. OX22high CD4+ T cells induce wasting disease with multiple organ pathology: prevention by the OX-22low subset. The Journal of experimental medicine 172:1701-1708. 250. Powrie, F., and D. Mason. 1990. Subsets of rat CD4+ T cells defined by their differential expression of variants of the CD45 antigen: developmental relationships and in vitro and in vivo functions. Current topics in microbiology and immunology 159:7996. 251. Powrie, F., M. W. Leach, S. Mauze, L. B. Caddle, and R. L. Coffman. 1993. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B- Sakaguchi, T. W. Mak, and S. Sakaguchi. 2000. Immunologic selftolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. The Journal of experimental medicine 192:303-310. 17 scid mice. International immunology 5:1461-1471. 252. 253. 254. 255. 256. 257. 258. Morrissey, P. J., K. Charrier, S. Braddy, D. Liggitt, and J. D. Watson. 1993. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. The Journal of experimental medicine 178:237-244. Sakaguchi, S. 2004. Naturally arising CD4+ regulatory t cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Annu Rev Immunol 22:531-562. Sakaguchi, S., N. Sakaguchi, M. Asano, M. Itoh, and M. Toda. 1995. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol 155:1151-1164. Hall, B. M., N. W. Pearce, K. E. Gurley, and S. E. Dorsch. 1990. Specific unresponsiveness in rats with prolonged cardiac allograft survival after treatment with cyclosporine. III. Further characterization of the CD4+ suppressor cell and its mechanisms of action. The Journal of experimental medicine 171:141-157. Asano, M., M. Toda, N. Sakaguchi, and S. Sakaguchi. 1996. Autoimmune disease as a consequence of developmental abnormality of a T cell subpopulation. The Journal of experimental medicine 184:387-396. Read, S., V. Malmstrom, and F. Powrie. 2000. Cytotoxic T lymphocyteassociated antigen 4 plays an essential role in the function of CD25(+)CD4(+) regulatory cells that control intestinal inflammation. The Journal of experimental medicine 192:295-302. Takahashi, T., T. Tagami, S. Yamazaki, T. Uede, J. Shimizu, N. 138 259. McHugh, R. S., M. J. Whitters, C. A. Piccirillo, D. A. Young, E. M. Shevach, M. Collins, and M. C. Byrne. 2002. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoidinduced TNF receptor. Immunity 16:311-323. 260. Powell, B. R., N. R. Buist, and P. Stenzel. 1982. An X-linked syndrome of diarrhea, polyendocrinopathy, and fatal infection in infancy. The Journal of pediatrics 100:731-737. 261. Chatila, T. A., F. Blaeser, N. Ho, H. M. Lederman, C. Voulgaropoulos, C. Helms, and A. M. Bowcock. 2000. JM2, encoding a fork head-related protein, is mutated in X-linked autoimmunity-allergic disregulation syndrome. The Journal of clinical investigation 106:R75-81. 262. Bennett, C. L., J. Christie, F. Ramsdell, M. E. Brunkow, P. J. Ferguson, L. Whitesell, T. E. Kelly, F. T. Saulsbury, P. F. Chance, and H. D. Ochs. 2001. The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, Xlinked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nature genetics 27:20-21. 263. Wildin, R. S., F. Ramsdell, J. Peake, F. Faravelli, J. L. Casanova, N. Buist, E. Levy-Lahad, M. Mazzella, O. Goulet, L. Perroni, F. D. Bricarelli, G. Byrne, M. McEuen, S. Proll, M. Appleby, and M. E. Brunkow. 2001. X-linked neonatal diabetes mellitus, enteropathy and endocrinopathy syndrome is the human equivalent of mouse scurfy. Nature genetics 27:1820. 264. Godfrey, V. L., J. E. Wilkinson, and L. B. Russell. 1991. X-linked lymphoreticular disease in the scurfy development and function of human Tregs. The Journal of clinical investigation 116:1473-1475. (sf) mutant mouse. The American journal of pathology 138:1379-1387. 265. 266. Brunkow, M. E., E. W. Jeffery, K. A. Hjerrild, B. Paeper, L. B. Clark, S. A. Yasayko, J. E. Wilkinson, D. Galas, S. F. Ziegler, and F. Ramsdell. 2001. Disruption of a new forkhead/wingedhelix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. Nature genetics 27:6873. Lin, W., N. Truong, W. J. Grossman, D. Haribhai, C. B. Williams, J. Wang, M. G. Martin, and T. A. Chatila. 2005. Allergic dysregulation and hyperimmunoglobulinemia E in Foxp3 mutant mice. The Journal of allergy and clinical immunology 116:11061115. 267. Khattri, R., T. Cox, S. A. Yasayko, and F. Ramsdell. 2003. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature immunology 4:337-342. 268. Hori, S., T. Nomura, and S. Sakaguchi. 2003. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science (New York, N.Y 299:1057-1061. 269. Fontenot, J. D., M. A. Gavin, and A. Y. Rudensky. 2003. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature immunology 4:330-336. 270. Fontenot, J. D., J. P. Rasmussen, L. M. Williams, J. L. Dooley, A. G. Farr, and A. Y. Rudensky. 2005. Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor foxp3. Immunity 22:329-341. 271. Bacchetta, R., L. Passerini, E. Gambineri, M. Dai, S. E. Allan, L. Perroni, F. Dagna-Bricarelli, C. Sartirana, S. Matthes-Martin, A. Lawitschka, C. Azzari, S. F. Ziegler, M. K. Levings, and M. G. Roncarolo. 2006. Defective regulatory and effector T cell functions in patients with FOXP3 mutations. The Journal of clinical investigation 116:1713-1722. 272. Le Bras, S., and R. S. Geha. 2006. IPEX and the role of Foxp3 in the 139 273. Hori, S., T. Takahashi, and S. Sakaguchi. 2003. Control of autoimmunity by naturally arising regulatory CD4+ T cells. Advances in immunology 81:331-371. 274. Lahl, K., C. Loddenkemper, C. Drouin, J. Freyer, J. Arnason, G. Eberl, A. Hamann, H. Wagner, J. Huehn, and T. Sparwasser. 2007. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of experimental medicine 204:57-63. 275. Liu, W., A. L. Putnam, Z. Xu-Yu, G. L. Szot, M. R. Lee, S. Zhu, P. A. Gottlieb, P. Kapranov, T. R. Gingeras, B. Fazekas de St Groth, C. Clayberger, D. M. Soper, S. F. Ziegler, and J. A. Bluestone. 2006. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. The Journal of experimental medicine 203:1701-1711. 276. Seddiki, N., B. Santner-Nanan, J. Martinson, J. Zaunders, S. Sasson, A. Landay, M. Solomon, W. Selby, S. I. Alexander, R. Nanan, A. Kelleher, and B. Fazekas de St Groth. 2006. Expression of interleukin (IL)-2 and IL7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. The Journal of experimental medicine 203:1693-1700. 277. Yamaguchi, T., K. Hirota, K. Nagahama, K. Ohkawa, T. Takahashi, T. Nomura, and S. Sakaguchi. 2007. Control of immune responses by antigen-specific regulatory T cells expressing the folate receptor. Immunity 27:145-159. 278. Itoh, M., T. Takahashi, N. Sakaguchi, Y. Kuniyasu, J. Shimizu, F. Otsuka, and S. Sakaguchi. 1999. Thymus and autoimmunity: production of CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive T cells as a key function of the thymus in maintaining immunologic self-tolerance. J Immunol 162:5317-5326. 279. Bensinger, S. J., A. Bandeira, M. S. Jordan, A. J. Caton, and T. M. Laufer. 2001. Major histocompatibility complex class II-positive cortical epithelium mediates the selection of CD4(+)25(+) immunoregulatory T cells. The Journal of experimental medicine 194:427-438. 280. Ribot, J., P. Romagnoli, and J. P. van Meerwijk. 2006. Agonist ligands expressed by thymic epithelium enhance positive selection of regulatory T lymphocytes from precursors with a normally diverse TCR repertoire. J Immunol 177:11011107. 281. Ribot, J., G. Enault, S. Pilipenko, A. Huchenq, M. Calise, D. Hudrisier, P. Romagnoli, and J. P. van Meerwijk. 2007. Shaping of the autoreactive regulatory T cell repertoire by thymic cortical positive selection. J Immunol 179:6741-6748. 282. Romagnoli, P., D. Hudrisier, and J. P. van Meerwijk. 2002. Preferential recognition of self antigens despite normal thymic deletion of CD4(+)CD25(+) regulatory T cells. J Immunol 168:1644-1648. 283. Pacholczyk, R., P. Kraj, and L. Ignatowicz. 2002. Peptide specificity of thymic selection of CD4+CD25+ T cells. J Immunol 168:613-620. 284. Anderson, M. S., E. S. Venanzi, Z. Chen, S. P. Berzins, C. Benoist, and D. Mathis. 2005. The cellular mechanism of Aire control of T cell tolerance. Immunity 23:227-239. 285. 286. Aschenbrenner, K., L. M. D'Cruz, E. H. Vollmann, M. Hinterberger, J. Emmerich, L. K. Swee, A. Rolink, and L. Klein. 2007. Selection of Foxp3+ regulatory T cells specific for self antigen expressed and presented by Aire+ medullary thymic epithelial cells. Nature immunology 8:351-358. Jordan, M. S., A. Boesteanu, A. J. Reed, A. L. Petrone, A. E. Holenbeck, M. A. Lerman, A. Naji, and A. J. Caton. 2001. Thymic selection of CD4+CD25+ regulatory T cells induced by an agonist self-peptide. Nature immunology 2:301-306. 140 287. Hsieh, C. S., Y. Liang, A. J. Tyznik, S. G. Self, D. Liggitt, and A. Y. Rudensky. 2004. Recognition of the peripheral self by naturally arising CD25+ CD4+ T cell receptors. Immunity 21:267-277. 288. Lu, F. W., K. Yasutomo, G. B. Goodman, L. J. McHeyzer-Williams, M. G. McHeyzer-Williams, R. N. Germain, and J. D. Ashwell. 2000. Thymocyte resistance to glucocorticoids leads to antigenspecific unresponsiveness due to "holes" in the T cell repertoire. Immunity 12:183-192. 289. Stephens, G. L., and L. Ignatowicz. 2003. Decreasing the threshold for thymocyte activation biases CD4+ T cells toward a regulatory (CD4+CD25+) lineage. European journal of immunology 33:1282-1291. 290. Carter, J. D., G. M. Calabrese, M. Naganuma, and U. Lorenz. 2005. Deficiency of the Src homology region 2 domain-containing phosphatase 1 (SHP-1) causes enrichment of CD4+CD25+ regulatory T cells. J Immunol 174:6627-6638. 291. Schmidt-Supprian, M., G. Courtois, J. Tian, A. J. Coyle, A. Israel, K. Rajewsky, and M. Pasparakis. 2003. Mature T cells depend on signaling through the IKK complex. Immunity 19:377-389. 292. van Santen, H. M., C. Benoist, and D. Mathis. 2004. Number of T reg cells that differentiate does not increase upon encounter of agonist ligand on thymic epithelial cells. J Exp Med 200:1221-1230. 293. Salomon, B., D. J. Lenschow, L. Rhee, N. Ashourian, B. Singh, A. Sharpe, and J. A. Bluestone. 2000. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity 12:431-440. 294. Tang, Q., K. J. Henriksen, E. K. Boden, A. J. Tooley, J. Ye, S. K. Subudhi, X. X. Zheng, T. B. Strom, and J. A. Bluestone. 2003. Cutting edge: CD28 controls peripheral homeostasis of regulatory T cells. 171:3348-3352. 295. 296. 297. Tai, X., M. Cowan, L. Feigenbaum, and A. Singer. 2005. CD28 costimulation of developing thymocytes induces Foxp3 expression and regulatory T cell differentiation independently of interleukin 2. Nature immunology 6:152-162. Spence, P. J., and E. A. Green. 2008. Foxp3+ regulatory T cells promiscuously accept thymic signals critical for their development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105:973-978. Fisson, S., G. Darrasse-Jeze, E. Litvinova, F. Septier, D. Klatzmann, R. Liblau, and B. L. Salomon. 2003. Continuous activation of autoreactive CD4+ CD25+ regulatory T cells in the steady state. J Exp Med 198:737-746. 298. Fontenot, J. D., J. P. Rasmussen, M. A. Gavin, and A. Y. Rudensky. 2005. A function for interleukin 2 in Foxp3expressing regulatory T cells. Nature immunology 6:1142-1151. 299. Zorn, E., E. A. Nelson, M. Mohseni, F. Porcheray, H. Kim, D. Litsa, R. Bellucci, E. Raderschall, C. Canning, R. J. Soiffer, D. A. Frank, and J. Ritz. 2006. IL-2 regulates FOXP3 expression in human CD4+CD25+ regulatory T cells through a STATdependent mechanism and induces the expansion of these cells in vivo. Blood 108:1571-1579. 300. Wood, K. J., G. Feng, B. Wei, B. Sawitzki, and A. R. Bushell. 2007. Interferon gamma: friend or foe? Transplantation 84:S4-5. 301. Sawitzki, B., C. I. Kingsley, V. Oliveira, M. Karim, M. Herber, and K. J. Wood. 2005. IFN-gamma production by alloantigen-reactive regulatory T cells is important for their regulatory function in vivo. The Journal of experimental medicine 201:1925-1935. 302. function of induced regulatory T cells in vivo. Trends in immunology 27:183187. CD4+CD25+ J Immunol Wood, K. J., and B. Sawitzki. 2006. Interferon gamma: a crucial role in the 141 303. Gorelik, L., and R. A. Flavell. 2000. Abrogation of TGFbeta signaling in T cells leads to spontaneous T cell differentiation and autoimmune disease. Immunity 12:171-181. 304. Marie, J. C., J. J. Letterio, M. Gavin, and A. Y. Rudensky. 2005. TGF-beta1 maintains suppressor function and Foxp3 expression in CD4+CD25+ regulatory T cells. The Journal of experimental medicine 201:1061-1067. 305. Liu, Y., P. Zhang, J. Li, A. B. Kulkarni, S. Perruche, and W. Chen. 2008. A critical function for TGF-beta signaling in the development of natural CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells. Nature immunology 9:632-640. 306. Rao, P. E., A. L. Petrone, and P. D. Ponath. 2005. Differentiation and expansion of T cells with regulatory function from human peripheral lymphocytes by stimulation in the presence of TGF-{beta}. J Immunol 174:1446-1455. 307. Chen, W., W. Jin, N. Hardegen, K. J. Lei, L. Li, N. Marinos, G. McGrady, and S. M. Wahl. 2003. Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3. The Journal of experimental medicine 198:1875-1886. 308. Fantini, M. C., C. Becker, G. Monteleone, F. Pallone, P. R. Galle, and M. F. Neurath. 2004. Cutting edge: TGF-beta induces a regulatory phenotype in CD4+CD25- T cells through Foxp3 induction and downregulation of Smad7. J Immunol 172:5149-5153. 309. Fantini, M. C., S. Dominitzki, A. Rizzo, M. F. Neurath, and C. Becker. 2007. In vitro generation of CD4+ CD25+ regulatory cells from murine naive T cells. Nature protocols 2:1789-1794. 310. Luo, X., K. V. Tarbell, H. Yang, K. Pothoven, S. L. Bailey, R. Ding, R. M. Steinman, and M. Suthanthiran. 2007. vitro-expanded human CD4(+)CD25(+) T-regulatory cells can markedly inhibit allogeneic dendritic cell-stimulated MLR cultures. Blood 104:453-461. Dendritic cells with TGF-beta1 differentiate naive CD4+CD25- T cells into islet-protective Foxp3+ regulatory T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104:2821-2826. 311. Selvaraj, R. K., and T. L. Geiger. 2007. A kinetic and dynamic analysis of Foxp3 induced in T cells by TGF-beta. J Immunol 178:7667-7677. 312. Davidson, T. S., R. J. DiPaolo, J. Andersson, and E. M. Shevach. 2007. Cutting Edge: IL-2 is essential for TGF-beta-mediated induction of Foxp3+ T regulatory cells. J Immunol 178:4022-4026. 313. Floess, S., J. Freyer, C. Siewert, U. Baron, S. Olek, J. Polansky, K. Schlawe, H. D. Chang, T. Bopp, E. Schmitt, S. Klein-Hessling, E. Serfling, A. Hamann, and J. Huehn. 2007. Epigenetic control of the foxp3 locus in regulatory T cells. PLoS biology 5:e38. 314. Peffault de Latour, R., H. C. Dujardin, F. Mishellany, O. Burlen-Defranoux, J. Zuber, R. Marques, J. Di Santo, A. Cumano, P. Vieira, and A. Bandeira. 2006. Ontogeny, function, and peripheral homeostasis of regulatory T cells in the absence of interleukin-7. Blood 108:2300-2306. 315. 316. Seddon, B., and D. Mason. 1999. Peripheral autoantigen induces regulatory T cells that prevent autoimmunity. The Journal of experimental medicine 189:877-882. Garza, K. M., S. S. Agersborg, E. Baker, and K. S. Tung. 2000. Persistence of physiological self antigen is required for the regulation of self tolerance. J Immunol 164:39823989. 317. Game, D. S., M. P. HernandezFuentes, and R. I. Lechler. 2005. Everolimus and basiliximab permit suppression by human CD4+CD25+ cells in vitro. Am J Transplant 5:454464. 318. Godfrey, W. R., Y. G. Ge, D. J. Spoden, B. L. Levine, C. H. June, B. R. Blazar, and S. B. Porter. 2004. In 142 319. Piccirillo, C. A., and E. M. Shevach. 2001. Cutting edge: control of CD8+ T cell activation by CD4+CD25+ immunoregulatory cells. J Immunol 167:1137-1140. 320. Thornton, A. M., and E. M. Shevach. 1998. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production. J Exp Med 188:287-296. 321. Mempel, T. R., M. J. Pittet, K. Khazaie, W. Weninger, R. Weissleder, H. von Boehmer, and U. H. von Andrian. 2006. Regulatory T cells reversibly suppress cytotoxic T cell function independent of effector differentiation. Immunity 25:129-141. 322. Lim, H. W., P. Hillsamer, A. H. Banham, and C. H. Kim. 2005. Cutting edge: direct suppression of B cells by CD4+ CD25+ regulatory T cells. J Immunol 175:4180-4183. 323. Miyara, M., and S. Sakaguchi. 2007. Natural regulatory T cells: mechanisms of suppression. Trends in molecular medicine 13:108-116. 324. Azuma, T., T. Takahashi, A. Kunisato, T. Kitamura, and H. Hirai. 2003. Human CD4+ CD25+ regulatory T cells suppress NKT cell functions. Cancer research 63:4516-4520. 325. Ghiringhelli, F., C. Menard, M. Terme, C. Flament, J. Taieb, N. Chaput, P. E. Puig, S. Novault, B. Escudier, E. Vivier, A. Lecesne, C. Robert, J. Y. Blay, J. Bernard, S. Caillat-Zucman, A. Freitas, T. Tursz, O. Wagner-Ballon, C. Capron, W. Vainchencker, F. Martin, and L. Zitvogel. 2005. CD4+CD25+ regulatory T cells inhibit natural killer cell functions in a transforming growth factor-betadependent manner. J Exp Med 202:1075-1085. 326. Misra, N., J. Bayry, S. LacroixDesmazes, M. D. Kazatchkine, and S. Hulme, C. Motzo, F. Cucca, J. F. Hess, M. L. Metzker, J. Rogers, S. Gregory, A. Allahabadia, R. Nithiyananthan, E. Tuomilehto-Wolf, J. Tuomilehto, P. Bingley, K. M. Gillespie, D. E. Undlien, K. S. Ronningen, C. Guja, C. Ionescu-Tirgoviste, D. A. Savage, A. P. Maxwell, D. J. Carson, C. C. Patterson, J. A. Franklyn, D. G. Clayton, L. B. Peterson, L. S. Wicker, J. A. Todd, and S. C. Gough. 2003. Association of the T-cell regulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease. Nature 423:506511. V. Kaveri. 2004. Cutting edge: human CD4+CD25+ T cells restrain the maturation and antigen-presenting function of dendritic cells. J Immunol 172:4676-4680. 327. Levings, M. K., R. Sangregorio, and M. G. Roncarolo. 2001. Human cd25(+)cd4(+) t regulatory cells suppress naive and memory T cell proliferation and can be expanded in vitro without loss of function. The Journal of experimental medicine 193:1295-1302. 328. Suvas, S., U. Kumaraguru, C. D. Pack, S. Lee, and B. T. Rouse. 2003. CD4+CD25+ T cells regulate virusspecific primary and memory CD8+ T cell responses. The Journal of experimental medicine 198:889-901. 329. Takahashi, T., Y. Kuniyasu, M. Toda, N. Sakaguchi, M. Itoh, M. Iwata, J. Shimizu, and S. Sakaguchi. 1998. Immunologic self-tolerance maintained by CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive T cells: induction of autoimmune disease by breaking their anergic/suppressive state. International immunology 10:19691980. 330. de la Rosa, M., S. Rutz, H. Dorninger, and A. Scheffold. 2004. Interleukin-2 is essential for CD4+CD25+ regulatory T cell function. European journal of immunology 34:2480-2488. 331. Pandiyan, P., L. Zheng, S. Ishihara, J. Reed, and M. J. Lenardo. 2007. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells induce cytokine deprivation-mediated apoptosis of effector CD4+ T cells. Nature immunology 8:1353-1362. 332. von Boehmer, H. 2005. Mechanisms of suppression by suppressor T cells. Nature immunology 6:338-344. 333. Ueda, H., J. M. Howson, L. Esposito, J. Heward, H. Snook, G. Chamberlain, D. B. Rainbow, K. M. Hunter, A. N. Smith, G. Di Genova, M. H. Herr, I. Dahlman, F. Payne, D. Smyth, C. Lowe, R. C. Twells, S. Howlett, B. Healy, S. Nutland, H. E. Rance, V. Everett, L. J. Smink, A. C. Lam, H. J. Cordell, N. M. Walker, C. Bordin, J. 143 334. Grossman, W. J., J. W. Verbsky, W. Barchet, M. Colonna, J. P. Atkinson, and T. J. Ley. 2004. Human T regulatory cells can use the perforin pathway to cause autologous target cell death. Immunity 21:589-601. 335. Cao, X., S. F. Cai, T. A. Fehniger, J. Song, L. I. Collins, D. R. PiwnicaWorms, and T. J. Ley. 2007. Granzyme B and perforin are important for regulatory T cellmediated suppression of tumor clearance. Immunity 27:635-646. 336. Zhao, D. M., A. M. Thornton, R. J. DiPaolo, and E. M. Shevach. 2006. Activated CD4+CD25+ T cells selectively kill B lymphocytes. Blood 107:3925-3932. 337. Janssens, W., V. Carlier, B. Wu, L. VanderElst, M. G. Jacquemin, and J. M. Saint-Remy. 2003. CD4+CD25+ T cells lyse antigen-presenting B cells by Fas-Fas ligand interaction in an epitope-specific manner. J Immunol 171:4604-4612. 338. Piccirillo, C. A., J. J. Letterio, A. M. Thornton, R. S. McHugh, M. Mamura, H. Mizuhara, and E. M. Shevach. 2002. CD4(+)CD25(+) regulatory T cells can mediate suppressor function in the absence of transforming growth factor beta1 production and responsiveness. J Exp Med 196:237246. 339. Annacker, O., R. Pimenta-Araujo, O. Burlen-Defranoux, T. C. Barbosa, A. Cumano, and A. Bandeira. 2001. CD25+ CD4+ T cells regulate the S. Fauci. 1986. Production of transforming growth factor beta by human T lymphocytes and its potential role in the regulation of T cell growth. The Journal of experimental medicine 163:1037-1050. expansion of peripheral CD4 T cells through the production of IL-10. J Immunol 166:3008-3018. 340. 341. 342. Kingsley, C. I., M. Karim, A. R. Bushell, and K. J. Wood. 2002. CD25+CD4+ regulatory T cells prevent graft rejection: CTLA-4- and IL-10dependent immunoregulation of alloresponses. J Immunol 168:10801086. McGeachy, M. J., L. A. Stephens, and S. M. Anderton. 2005. Natural recovery and protection from autoimmune encephalomyelitis: contribution of CD4+CD25+ regulatory cells within the central nervous system. J Immunol 175:3025-3032. Uhlig, H. H., J. Coombes, C. Mottet, A. Izcue, C. Thompson, A. Fanger, A. Tannapfel, J. D. Fontenot, F. Ramsdell, and F. Powrie. 2006. Characterization of Foxp3+CD4+CD25+ and IL-10secreting CD4+CD25+ T cells during cure of colitis. J Immunol 177:58525860. 343. Moore, K. W., R. de Waal Malefyt, R. L. Coffman, and A. O'Garra. 2001. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol 19:683765. 344. Kryczek, I., S. Wei, L. Zou, G. Zhu, P. Mottram, H. Xu, L. Chen, and W. Zou. 2006. Cutting edge: induction of B7-H4 on APCs through IL-10: novel suppressive mode for regulatory T cells. J Immunol 177:40-44. 345. Groux, H., M. Bigler, J. E. and M. G. Roncarolo. 1998. and stimulatory effects of human CD8+ T cells. J 160:3188-3193. 346. 347. de Vries, Inhibitory IL-10 on Immunol Yamaguchi, Y., H. Tsumura, M. Miwa, and K. Inaba. 1997. Contrasting effects of TGF-beta 1 and TNF-alpha on the development of dendritic cells from progenitors in mouse bone marrow. Stem Cells 15:144-153. Kehrl, J. H., L. M. Wakefield, A. B. Roberts, S. Jakowlew, M. AlvarezMon, R. Derynck, M. B. Sporn, and A. 144 348. Sad, S., and T. R. Mosmann. 1994. Single IL-2-secreting precursor CD4 T cell can develop into either Th1 or Th2 cytokine secretion phenotype. J Immunol 153:3514-3522. 349. Briskin, M., M. D. Kuwabara, D. S. Sigman, and R. Wall. 1988. Induction of kappa transcription by interferongamma without activation of NF-kappa B. Science (New York, N.Y 242:10361037. 350. Petit-Koskas, E., E. Genot, D. Lawrence, and J. P. Kolb. 1988. Inhibition of the proliferative response of human B lymphocytes to B cell growth factor by transforming growth factor-beta. European journal of immunology 18:111-116. 351. Chen, M. L., M. J. Pittet, L. Gorelik, R. A. Flavell, R. Weissleder, H. von Boehmer, and K. Khazaie. 2005. Regulatory T cells suppress tumorspecific CD8 T cell cytotoxicity through TGF-beta signals in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 102:419-424. 352. Chen, Y., V. K. Kuchroo, J. Inobe, D. A. Hafler, and H. L. Weiner. 1994. Regulatory T cell clones induced by oral tolerance: suppression of autoimmune encephalomyelitis. Science (New York, N.Y 265:12371240. 353. Fahlen, L., S. Read, L. Gorelik, S. D. Hurst, R. L. Coffman, R. A. Flavell, and F. Powrie. 2005. T cells that cannot respond to TGF-beta escape control by CD4(+)CD25(+) regulatory T cells. J Exp Med 201:737-746. 354. Li, M. O., Y. Y. Wan, and R. A. Flavell. 2007. T cell-produced transforming growth factor-beta1 controls T cell tolerance and regulates Th1- and Th17-cell differentiation. Immunity 26:579-591. 355. Nakamura, K., A. Kitani, and W. Strober. 2001. Cell contact-dependent immunosuppression by CD4(+)CD25(+) regulatory T cells is mediated by cell surface-bound transforming growth factor beta. The Journal of experimental medicine 194:629-644. 356. Travis, M. A., B. Reizis, A. C. Melton, E. Masteller, Q. Tang, J. M. Proctor, Y. Wang, X. Bernstein, X. Huang, L. F. Reichardt, J. A. Bluestone, and D. Sheppard. 2007. Loss of integrin alpha(v)beta8 on dendritic cells causes autoimmunity and colitis in mice. Nature 449:361-365. 357. Collison, L. W., C. J. Workman, T. T. Kuo, K. Boyd, Y. Wang, K. M. Vignali, R. Cross, D. Sehy, R. S. Blumberg, and D. A. Vignali. 2007. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature 450:566-569. 358. 359. Morse, S. S., N. Sakaguchi, and S. Sakaguchi. 1999. Virus and autoimmunity: induction of autoimmune disease in mice by mouse T lymphotropic virus (MTLV) destroying CD4+ T cells. J Immunol 162:5309-5316. Lindley, S., C. M. Dayan, A. Bishop, B. O. Roep, M. Peakman, and T. I. Tree. 2005. Defective suppressor function in CD4(+)CD25(+) T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes 54:9299. 360. Viglietta, V., C. Baecher-Allan, H. L. Weiner, and D. A. Hafler. 2004. Loss of functional suppression by CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis. The Journal of experimental medicine 199:971-979. 361. Ehrenstein, M. R., J. G. Evans, A. Singh, S. Moore, G. Warnes, D. A. Isenberg, and C. Mauri. 2004. Compromised function of regulatory T cells in rheumatoid arthritis and reversal by anti-TNFalpha therapy. The Journal of experimental medicine 200:277-285. 362. L. D. Notarangelo, Z. Baz, A. Metin, F. Cattaneo, A. Villa, A. Aiuti, M. Battaglia, M. G. Roncarolo, and L. Dupre. 2007. WASP regulates suppressor activity of human and murine CD4(+)CD25(+)FOXP3(+) natural regulatory T cells. The Journal of experimental medicine 204:369-380. Marangoni, F., S. Trifari, S. Scaramuzza, C. Panaroni, S. Martino, 145 363. Yamanouchi, J., D. Rainbow, P. Serra, S. Howlett, K. Hunter, V. E. Garner, A. Gonzalez-Munoz, J. Clark, R. Veijola, R. Cubbon, S. L. Chen, R. Rosa, A. M. Cumiskey, D. V. Serreze, S. Gregory, J. Rogers, P. A. Lyons, B. Healy, L. J. Smink, J. A. Todd, L. B. Peterson, L. S. Wicker, and P. Santamaria. 2007. Interleukin-2 gene variation impairs regulatory T cell function and causes autoimmunity. Nature genetics 39:329337. 364. Encinas, J. A., L. S. Wicker, L. B. Peterson, A. Mukasa, C. Teuscher, R. Sobel, H. L. Weiner, C. E. Seidman, J. G. Seidman, and V. K. Kuchroo. 1999. QTL influencing autoimmune diabetes and encephalomyelitis map to a 0.15cM region containing Il2. Nature genetics 21:158-160. 365. Mills, K. H. 2004. Regulatory T cells: friend or foe in immunity to infection? Nature reviews 4:841-855. 366. Belkaid, Y., and B. T. Rouse. 2005. Natural regulatory T cells in infectious disease. Nature immunology 6:353360. 367. Lundgren, A., E. Suri-Payer, K. Enarsson, A. M. Svennerholm, and B. S. Lundin. 2003. Helicobacter pylorispecific CD4+ CD25high regulatory T cells suppress memory T-cell responses to H. pylori in infected individuals. Infection and immunity 71:1755-1762. 368. Kullberg, M. C., D. Jankovic, P. L. Gorelick, P. Caspar, J. J. Letterio, A. W. Cheever, and A. Sher. 2002. Bacteria-triggered CD4(+) T regulatory cells suppress Helicobacter hepaticusinduced colitis. The Journal of experimental medicine 196:505-515. 369. Belkaid, Y., C. A. Piccirillo, S. Mendez, E. M. Shevach, and D. L. Sacks. 2002. and proliferation independent. Cancer research 66:4488-4495. CD4+CD25+ regulatory T cells control Leishmania major persistence and immunity. Nature 420:502-507. 378. Woo, E. Y., C. S. Chu, T. J. Goletz, K. Schlienger, H. Yeh, G. Coukos, S. C. Rubin, L. R. Kaiser, and C. H. June. 2001. Regulatory CD4(+)CD25(+) T cells in tumors from patients with earlystage non-small cell lung cancer and late-stage ovarian cancer. Cancer research 61:4766-4772. 379. Ahmadzadeh, M., and S. A. Rosenberg. 2006. IL-2 administration increases CD4+ CD25(hi) Foxp3+ regulatory T cells in cancer patients. Blood 107:2409-2414. 380. Tafuri, A., J. Alferink, P. Moller, G. J. Hammerling, and B. Arnold. 1995. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science (New York, N.Y 270:630-633. 381. Le Bouteiller, P. 2003. [HLA-G and local placental immunity]. Gynecologie, obstetrique & fertilite 31:782-785. Curiel, T. J. 2007. Tregs and rethinking cancer immunotherapy. The Journal of clinical investigation 117:1167-1174. 382. Liu, V. C., L. Y. Wong, T. Jang, A. H. Shah, I. Park, X. Yang, Q. Zhang, S. Lonning, B. A. Teicher, and C. Lee. 2007. Tumor evasion of the immune system by converting CD4+CD25- T cells into CD4+CD25+ T regulatory cells: role of tumor-derived TGF-beta. J Immunol 178:2883-2892. Aluvihare, V. R., M. Kallikourdis, and A. G. Betz. 2005. Tolerance, suppression and the fetal allograft. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany) 83:88-96. 383. Aluvihare, V. R., M. Kallikourdis, and A. G. Betz. 2004. Regulatory T cells mediate maternal tolerance to the fetus. Nature immunology 5:266-271. 384. Polanczyk, M. J., B. D. Carson, S. Subramanian, M. Afentoulis, A. A. Vandenbark, S. F. Ziegler, and H. Offner. 2004. Cutting edge: estrogen drives expansion of the CD4+CD25+ regulatory T cell compartment. J Immunol 173:2227-2230. 385. Munn, D. H., M. Zhou, J. T. Attwood, I. Bondarev, S. J. Conway, B. Marshall, C. Brown, and A. L. Mellor. 1998. Prevention of allogeneic fetal rejection by tryptophan catabolism. Science (New York, N.Y 281:1191-1193. 386. Mottet, C., H. H. Uhlig, and F. Powrie. 2003. Cutting edge: cure of colitis by CD4+CD25+ regulatory T cells. J Immunol 170:3939-3943. 370. Yurchenko, E., M. Tritt, V. Hay, E. M. Shevach, Y. Belkaid, and C. A. Piccirillo. 2006. CCR5-dependent homing of naturally occurring CD4+ regulatory T cells to sites of Leishmania major infection favors pathogen persistence. The Journal of experimental medicine 203:2451-2460. 371. Suffia, I. J., S. K. Reckling, C. A. Piccirillo, R. S. Goldszmid, and Y. Belkaid. 2006. Infected site-restricted Foxp3+ natural regulatory T cells are specific for microbial antigens. The Journal of experimental medicine 203:777-788. 372. 373. 374. 375. Salazar-Onfray, F. 1999. Interleukin10: a cytokine used by tumors to escape immunosurveillance. Medical oncology (Northwood, London, England) 16:86-94. Gabrilovich, D. I., H. L. Chen, K. R. Girgis, H. T. Cunningham, G. M. Meny, S. Nadaf, D. Kavanaugh, and D. P. Carbone. 1996. Production of vascular endothelial growth factor by human tumors inhibits the functional maturation of dendritic cells. Nature medicine 2:1096-1103. 376. Zou, W. 2006. Regulatory T cells, tumour immunity and immunotherapy. Nature reviews 6:295-307. 377. Valzasina, B., S. Piconese, C. Guiducci, and M. P. Colombo. 2006. Tumor-induced expansion of regulatory T cells by conversion of CD4+CD25- lymphocytes is thymus 146 387. 388. Tang, Q., J. Y. Adams, A. J. Tooley, M. Bi, B. T. Fife, P. Serra, P. Santamaria, R. M. Locksley, M. F. Krummel, and J. A. Bluestone. 2006. Visualizing regulatory T cell control of autoimmune responses in nonobese diabetic mice. Nature immunology 7:83-92. 389. Korn, T., J. Reddy, W. Gao, E. Bettelli, A. Awasthi, T. R. Petersen, B. T. Backstrom, R. A. Sobel, K. W. Wucherpfennig, T. B. Strom, M. Oukka, and V. K. Kuchroo. 2007. Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation. Nature medicine 13:423-431. 390. Martin, P. J., J. A. Hansen, C. D. Buckner, J. E. Sanders, H. J. Deeg, P. Stewart, F. R. Appelbaum, R. Clift, A. Fefer, R. P. Witherspoon, and et al. 1985. Effects of in vitro depletion of T cells in HLA-identical allogeneic marrow grafts. Blood 66:664-672. 391. Curtis, R. E., L. B. Travis, P. A. Rowlings, G. Socie, D. W. Kingma, P. M. Banks, E. S. Jaffe, G. E. Sale, M. M. Horowitz, R. P. Witherspoon, D. A. Shriner, D. J. Weisdorf, H. J. Kolb, K. M. Sullivan, K. A. Sobocinski, R. P. Gale, R. N. Hoover, J. F. Fraumeni, Jr., and H. J. Deeg. 1999. Risk of lymphoproliferative disorders after bone marrow transplantation: a multiinstitutional study. Blood 94:22082216. 392. 393. CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality. Blood 99:3493-3499. Tarbell, K. V., L. Petit, X. Zuo, P. Toy, X. Luo, A. Mqadmi, H. Yang, M. Suthanthiran, S. Mojsov, and R. M. Steinman. 2007. Dendritic cellexpanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice. The Journal of experimental medicine 204:191-201. Alvegard, T. A., G. P. Herzig, and R. G. Graw, Jr. 1975. Allogeneic marrow transplantation for the treatment of leukaemia. A review. Scandinavian journal of haematology 15:287-305. Taylor, P. A., C. J. Lees, and B. R. Blazar. 2002. The infusion of ex vivo activated and expanded 147 394. Hara, M., C. I. Kingsley, M. Niimi, S. Read, S. E. Turvey, A. R. Bushell, P. J. Morris, F. Powrie, and K. J. Wood. 2001. IL-10 is required for regulatory T cells to mediate tolerance to alloantigens in vivo. J Immunol 166:3789-3796. 395. Cohen, J. L., A. Trenado, D. Vasey, D. Klatzmann, and B. L. Salomon. 2002. CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T Cells: new therapeutics for graftversus-host disease. J Exp Med 196:401-406. 396. Hoffmann, P., J. Ermann, M. Edinger, C. G. Fathman, and S. Strober. 2002. Donor-type CD4(+)CD25(+) regulatory T cells suppress lethal acute graftversus-host disease after allogeneic bone marrow transplantation. The Journal of experimental medicine 196:389-399. 397. Edinger, M., P. Hoffmann, J. Ermann, K. Drago, C. G. Fathman, S. Strober, and R. S. Negrin. 2003. CD4+CD25+ regulatory T cells preserve graftversus-tumor activity while inhibiting graft-versus-host disease after bone marrow transplantation. Nature medicine 9:1144-1150. 398. Trenado, A., F. Charlotte, S. Fisson, M. Yagello, D. Klatzmann, B. L. Salomon, and J. L. Cohen. 2003. Recipient-type specific CD4+CD25+ regulatory T cells favor immune reconstitution and control graft-versushost disease while maintaining graftversus-leukemia. The Journal of clinical investigation 112:1688-1696. 399. Gross, D. A., M. Leboeuf, B. Gjata, O. Danos, and J. Davoust. 2003. CD4+CD25+ regulatory T cells inhibit immune-mediated transgene rejection. Blood 102:4326-4328. 400. Gross, D. A., P. Chappert, M. Leboeuf, V. Monteilhet, L. Van Wittenberghe, O. Danos, and J. Davoust. 2006. Simple conditioning with monospecific CD4+CD25+ regulatory T cells for bone marrow engraftment and tolerance to multiple gene products. Blood 108:1841-1848. 401. Shevach, E. M., R. A. DiPaolo, J. Andersson, D. M. Zhao, G. L. Stephens, and A. M. Thornton. 2006. The lifestyle of naturally occurring CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells. Immunological reviews 212:6073. 402. Sakaguchi, S., M. Ono, R. Setoguchi, H. Yagi, S. Hori, Z. Fehervari, J. Shimizu, T. Takahashi, and T. Nomura. 2006. Foxp3+ CD25+ CD4+ natural regulatory T cells in dominant self-tolerance and autoimmune disease. Immunological reviews 212:827. 403. Izcue, A., J. L. Coombes, and F. Powrie. 2006. Regulatory T cells suppress systemic and mucosal immune activation to control intestinal inflammation. Immunological reviews 212:256-271. 404. Belkaid, Y., R. B. Blank, and I. Suffia. 2006. Natural regulatory T cells and parasites: a common quest for host homeostasis. Immunological reviews 212:287-300. 405. Rouse, B. T., P. P. Sarangi, and S. Suvas. 2006. Regulatory T cells in virus infections. Immunological reviews 212:272-286. 406. Beyer, M., and J. L. Schultze. 2006. Regulatory T cells in cancer. Blood 108:804-811. 407. 408. Joffre, O., T. Santolaria, D. Calise, T. Al Saati, D. Hudrisier, P. Romagnoli, and J. P. van Meerwijk. 2008. Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes. Nat Med 14:88-92. Joffre, O., N. Gorsse, P. Romagnoli, D. Hudrisier, and J. P. van Meerwijk. 2004. Induction of antigen-specific tolerance to bone marrow allografts with CD4+CD25+ T lymphocytes. Blood 103:4216-4221. 148 409. Pree, I., S. Bigenzahn, D. Fuchs, Z. Koporc, P. Nierlich, C. Winkler, G. Brandacher, M. Sykes, F. Muehlbacher, F. Langer, and T. Wekerle. 2007. CTLA4Ig promotes the induction of hematopoietic chimerism and tolerance independently of Indoleamine-2,3-dioxygenase. Transplantation 83:663-667. 410. Brandacher, G., R. Margreiter, and D. Fuchs. 2008. Clinical relevance of indoleamine 2,3-dioxygenase for alloimmunity and transplantation. Current opinion in organ transplantation 13:10-15. 411. Brandacher, G., R. Margreiter, and D. Fuchs. 2007. Implications of IFNgamma-mediated tryptophan catabolism on solid organ transplantation. Current drug metabolism 8:273-282. 412. Taylor, P. A., A. Panoskaltsis-Mortari, J. M. Swedin, P. J. Lucas, R. E. Gress, B. L. Levine, C. H. June, J. S. Serody, and B. R. Blazar. 2004. L-Selectin(hi) but not the L-selectin(lo) CD4+25+ Tregulatory cells are potent inhibitors of GVHD and BM graft rejection. Blood 104:3804-3812. 413. Yamazaki, S., T. Iyoda, K. Tarbell, K. Olson, K. Velinzon, K. Inaba, and R. M. Steinman. 2003. Direct expansion of functional CD25+ CD4+ regulatory T cells by antigen-processing dendritic cells. The Journal of experimental medicine 198:235-247. 414. Wood, K. J., and S. Sakaguchi. 2003. Regulatory T cells in transplantation tolerance. Nature reviews 3:199-210. 415. Battaglia, M., A. Stabilini, and M. G. Roncarolo. 2005. Rapamycin selectively expands CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood 105:4743-4748. 416. Zeiser, R., D. B. Leveson-Gower, E. A. Zambricki, N. Kambham, A. Beilhack, J. Loh, J. Z. Hou, and R. S. Negrin. 2008. Differential impact of mammalian target of rapamycin inhibition on CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells compared with N. Korda. 1971. Long-term observations of skin grafts between chimeric cattle twins. Transplantation 12:421-428. conventional CD4+ T cells. Blood 111:453-462. 417. 418. 419. Battaglia, M., A. Stabilini, B. Migliavacca, J. Horejs-Hoeck, T. Kaupper, and M. G. Roncarolo. 2006. Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients. J Immunol 177:8338-8347. Thornton, A. M., and E. M. Shevach. 2000. Suppressor effector function of CD4+CD25+ immunoregulatory T cells is antigen nonspecific. J Immunol 164:183-190. Tarbell, K. V., S. Yamazaki, K. Olson, P. Toy, and R. M. Steinman. 2004. CD25+ CD4+ T cells, expanded with dendritic cells presenting a single autoantigenic peptide, suppress autoimmune diabetes. The Journal of experimental medicine 199:1467-1477. 420. Tang, Q., K. J. Henriksen, M. Bi, E. B. Finger, G. Szot, J. Ye, E. L. Masteller, H. McDevitt, M. Bonyhadi, and J. A. Bluestone. 2004. In vitro-expanded antigen-specific regulatory T cells suppress autoimmune diabetes. The Journal of experimental medicine 199:1455-1465. 421. Min, W. P., D. Zhou, T. E. Ichim, G. H. Strejan, X. Xia, J. Yang, X. Huang, B. Garcia, D. White, P. Dutartre, A. M. Jevnikar, and R. Zhong. 2003. Inhibitory feedback loop between tolerogenic dendritic cells and regulatory T cells in transplant tolerance. J Immunol 170:1304-1312. 422. Sporri, R., and C. Reis e Sousa. 2005. Inflammatory mediators are insufficient for full dendritic cell activation and promote expansion of CD4+ T cell populations lacking helper function. Nature immunology 6:163-170. 423. Streilein, J. W. 1991. Neonatal tolerance of H-2 alloantigens. Procuring graft acceptance the "oldfashioned" way. Transplantation 52:110. 424. Stone, W. H., R. G. Cragle, D. F. Johnson, J. A. Bacon, S. Bendel, and 149 425. Stone, W. H., R. G. Cragle, E. W. Swanson, and D. G. Brown. 1965. Skin Grafts: Delayed Rejection between Pairs of Cattle Twins Showing Erythrocyte Chimerism. Science (New York, N.Y 148:13351336. 426. Sena, J., S. S. Wachtel, and G. Murphy. 1976. A comparison of the survival of H-Y incompatible ear, tail, and body skin grafts. Transplantation 21:412-416. 427. Mathieson, B. J., L. Flaherty, D. Bennett, and E. A. Boyse. 1975. Differences in the rejection of trunk skin and tail skin allografts involving weak histocompatibility loci. Transplantation 19:525-527. 428. O'Garra, A., P. L. Vieira, P. Vieira, and A. E. Goldfeld. 2004. IL-10-producing and naturally occurring CD4+ Tregs: limiting collateral damage. J Clin Invest 114:1372-1378. 1 1 RESUME Thibault Santolaria INDUCTION DE TOLERANCE AUX ALLOGREFFES D’ORGANES SOLIDES PAR LES LYMPHOCYTES T REGULATEURS CD4+CD25+FOXP3+ Directeur de Thèse : Joost van Meerwijk Thèse soutenue à Toulouse, le 26 janvier 2009 La principale limite à la transplantation d’organe réside dans l’initiation d’une forte réponse immune dirigée contre le greffon. Si l’utilisation de drogues immunosuppressives a largement permis de contrôler l’apparition du rejet aigu, de nombreux patients souffrent d’un rejet chronique qui conduit inévitablement à la destruction de l’organe transplanté. L’induction d’une tolérance immunologique vis-àvis des antigènes du greffon pourrait permettre de s’affranchir du rejet ainsi que de la nécessité d’un traitement à vie avec des drogues immunosuppressives. Une tolérance similaire existe déjà à l’état physiologique vis-à-vis des antigènes du soi. Elle est médiée en périphérie par une sous population lymphocytaire douée de propriétés immunosuppressives : les lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+. Lors de ce travail de thèse, j’ai pu montrer que, chez des souris irradiées à des doses cliniquement applicables, l’injection de cellules régulatrices CD4+CD25+Foxp3+ stimulées in vitro avec des alloantigens, induit une tolérance durable et spécifique vis-à-vis d’une greffe de moelle osseuse et, par la suite, de cœur ou de peau. Les Tregs spécifiques pour les antigènes présentés par la voie directe d’alloreconnaissance inhibent uniquement le développement du rejet aigu, en dépit de l’état de chimérisme induit. En revanche, des Tregs spécifiques pour les antigènes présentés par les voies directe et indirecte de reconnaissance préviennent l’apparition des phases de rejet aigu et chronique. Nos résultats démontrent ainsi le fort potentiel des Tregs, activés de manière appropriée, pour de futures approches de thérapie cellulaire, dans le but d’induire une tolérance durable aux greffes allogéniques. Mots clés : lymphocytes T régulateurs, transplantation, mécanismes d’action Discipline : Immunologie Equipe Tolerance et Autoimmunité INSERM U563, Hôpital Purpan 31024 Toulouse cedex 3 8