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La tuberculose
Outils immunologiques innovants de
détection de la tuberculose latente
Expérience au CHU de Nancy
avec le test T-Spot.TB™
Marcelo de Carvalho
PU-PH, Laboratoire d'Immunologie
CHU de Nancy, Université de Lorraine
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L’infection primaire et le
« priming » de la réponse immune
anti-tuberculose
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1er contact avec le bacille
Déposition alvéolaire de quelques bacilles,
chancre d’inoculation (foyer primaire)
Multiplication dans les macrophages
alvéolaires après phagocytose
Drainage vers le ganglion hilaire satellite, dissémination
(foyers 2aires)
Mise en place d’une réponse à médiation cellulaire
Accumulation de cellules monocytaires
d’allure épithélioïde avec couronne de
lymphocytes et nécrose caséeuse
Un tiers de la population mondiale est infectée (estim. 2
milliards d’individus) par Mycobacterium tuberculosis
9 millions de nouveaux cas et 1,4 Millions de décès en 2010
Maladie pulmonaire dans 70% des cas mais atteinte possible
d’autres organes
Tuberculose active et latente
Exposition à une personne présentant
une TB active
Si exposition insuffisante : tous les germes
disparaissent
- Les symptômes
suggèrent une TB
La personne devient infectée
- Pas de symptômes,
mais BK toujours
présent
- Pathogène non
détectable
- Examens radiologiques
pouvant être normaux
- Pas de réponse
Anticorps
5%
Contrôle initial de
l’ infection par les
cellules T, mais
l’infection est toujours
présente et
n
cliniquement sous
ivatio
jacente
Réact
5%
Maladie
symptomatique
Pathologie en cours
Les patients peuvent
alors infecter d’autres
personnes
- BK peut être détecté
dans l’expectoration ou
autres échantillons par
examen direct, culture
ou biologie moléculaire
- Les examens
radiologiques montrent
une pathologie
pulmonaire
Diagnostic difficile
- Détection par l’ IDR à la
tuberculine et
tests IGRAS
L’infection demeure
jusqu’à la mort
Sans traitement,
~50% décèderont
TB LATENTE
TB ACTIVE
- Diagnostic compliqué
dans la TB non
pulmonaire (enfants
particulièrement
vulnérables)
Immunité cellulaire
Immunité cellulaire
Lymphocytes T naïfs
IL-2
IL-4
• Génération de diversité du TCR dans le thymus
– Sélections positive et négative
– TCR spécifique d’Ag
• Circulent dans le sang périphérique et organes lymphoïdes
secondaires
IFNg
Interactions
CPA- cellules T
Sécrétion de
cytokines
–
–
–
–
TNFa
Cytotoxicité
Faible fréquence (~1/100.000 pour un Ag donné)
Expriment CCR7 (récepteur chémokines) et CD45RA
Passage par HEV vers la zone lymphocytaire T
« Scannent » les cellules dendritiques pour reconnaissance de l’Ag
Prolifération /
Apoptose
Réponses immunes cellulaires
spécifiques d’Ag
Phases de l’immunité adaptative
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•
•
•
Reconnaissance spécifique de l’antigène
Activation
Différentiation et expansion clonale
Contrôle de l’infection et contraction clonale
Mémoire (hétérogénéité)
Immunité cellulaire anti-TB
Mémoire immunologique
• Plus grande fréquence des clones spécifiques
~ 1/10.000
• Meilleur performance
– forte affinité de leur immunorécepteur
– seuil de déclenchement de leur activation plus
facilement atteint (dose moindre d’Ag)
– moindre exigence en signaux de costimulation
– sensibilité étendue aux différentes cytokines capables
d’induire leur prolifération (IL-2, IL-7, IL-15)
– fonction effectrice rapidement opérationnelle
– présence au sein même des tissus périphériques
O’Garra A et al. Ann Rev Immunol 2013
Réponse cellulaire TH1 anti-TB
• Facteurs indispensables pour le contrôle de la
tuberculose (réponse TH1)
– IL-12
– LT CD4
– IFN-γ
– TNF-α
• Autres acteurs
– LT CD8
– LTγδ et iNKT (reconnaissance de antigènes
lipidiques)
– LB (rôle mineur des Abs)
Tuberculose active et latente
•
Le développement de la maladie active (et sa sévérité) est multifactoriel
(interactions entre l’hôte, l’environnement et le bacille)
– Facteurs de risque connus
• Co-infection VIH et autres immunodéficiences, diabètes
• Malnutrition et pauvreté
– Equilibre entre facteurs protecteurs…
• IFN-γ, TNF-α, apoptose, TH1
– … et délétères de la réponse immunitaire
• Treg, IL-10, nécrose, immunopathologie de l’inflammation exacerbée (IL-17
et neutrophiles)
– Influence de la souche et quantité du bacille, polymorphismes génétiques
chez l’hôte, co-infections
Comment éradiquer la tuberculose ?
•
Les nouveaux cas de TB sont générés
par le réservoir de TB latente.
•
Il faut éliminer ce réservoir infectieux.
•
Cette «épidémie masquée» de
personnes infectées par la TB latente
est énorme.
•
La croissance de la TB latente devient
une « bombe à retardement »
clinique.
•
Il faut désamorcer cette bombe en
dépistant et traitant les TB latentes.
- risque de réactivation divisé par 10
- mais effets adverses du traitement…
TB active
– 9 millions de nouveaux cas par an
- Malheureusement et uniquement la
partie émergée de l’iceberg !
TB Latente
- “Épidémie masquée”
-2 milliards de personnes
infectées
Test diagnostic cutané pour TB latente
Le diagnostic de la tuberculose latente repose sur un test cutané développé il y
a 100 ans : l’ IDR (intradermoréaction)
C’est le test diagnostic le plus ancien encore utilisé.
• Spécificité faible:
réactions croisées entre l’IDR et le BCG et/ou les
mycobactéries environnementales
• Sensibilité insuffisante :
75-90% pour les TB actives
– plus faible pour les TB disséminées ou les infections HIV,
– inconnu pour les TB latentes
•
Besoin de 2 visites : l’injection puis la lecture de
l’induration 2 jours après
•
Variabilité selon l’opérateur (inoculation & lecture)
•
•
Standardisation du réactif
Inflammation & cicatrisation douloureuses
Justification de l’approche immunologique cellulaire
T
•
M. tuberculosis : pathogène intracellulaire,
difficile à détecter et à isoler chez les
patients infectés
•
La réponse humorale aux infections à M.
tuberculosis est faible
•
L’infection à M. tuberculosis induit une forte
réponse immunitaire de type Th1
•
Les cellules T sécrétrices d’interférongamma spécifiques de M.tuberculosis
pourraient être un marqueur spécifique de
l’infection
De l’IDR aux IGRAs?
• Bases immunologiques
– Des cellules T
– Des cytokines
• Une réponse immunologique
in vivo (IDR)
• Réponse
immunologique
in vitro
– Dosages de cytokines
– Elisa, Elispot
– IGRAs = Interferon
Gamma Releasing
Assays
Principe des IGRAs
Introduction au test T-SPOT.TB™
Methodology
Méthodologie
• Culture cellulaire avec un pool de peptides des
épitopes immunodominants des protéines du BK non
présentes dans le BCG : CFP-10 et ESAT-6
– Présentation par les molécules HLA de classe I et classe II
(stimulation des Lymphos T CD4+ et CD8+)
• Quantification de la production d’IFN-γ
– ELISA
– ELISPOT
– (Marquage intracellulaires des cytokines, cytométrie en flux)
Etape 1 – Préparation des cellules
•Tube hépariné
•Séparation des cellules mononuclées par
gradient de densité (Ficoll)
•Recueil des lymphocytes, monocytes et
cellules dendritiques
•Lavage et comptage
•Ajouter 2.5x105 cellules par puits
•Ajouter antigènes aux puits
4 puits différents : témoin négatif, témoin positif,
panel A (ESAT-6), panel B (CFP-10)
•Incuber overnight
• Detects TB indirectly by measuring
the response of TB-specific effector
T cells
– Uses the generic ELISPOT technique
– Purified White Blood Cells (PBMCs)
challenged with TB-specific antigens
(ESAT-6, CFP10)
– The interferon gamma “footprint” of
each reacting T cell produces a “spot”
– Spots are measured to give quantitative
measure of the numbers of individual T
cells reacting
• The test can also be used on nonblood samples
– To detect TB-specific T cells in specific
body fluids (e.g. BAL, CSF)
– Results shown to help rule in active TB
disease in that location
Etape 2 – Révélation des spots
• Lavage plaques
• Ajouter réactif détection
pendant 60 minutes
• Lavage plaques
• Ajouter substrat; spots en 7
minutes
• Lavage et séchage des plaques
-ve
+ve
Etape 3 – Comptage des spots
Adaptable à la routine clinique
• Comptage des spots à l’oeil, loupe,
microscope
• Lecteur elispot automatisé
–
–
–
Lecture standardisée
Calcul du nombre de spots et
mémorisation des données
Automatisation possible des
settings
• Technique simple +/-,
rapide, automatisable +/-.
• Kits, équipements et logiciels
validés selon standards
internationaux.
• Robuste et reproductible.
• Adaptable à tout liquide
biologique contenant des LT
Un autre test IGRA:
Quantiferon®-TB Gold
Exemples de résultats
• PHA vs Panel A, Panel B
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•
•
•
Principe similaire au TSPOT.TB™
Méthode sur sang total
Prélèvement de sang directement dans 3 tubes:
Tube négatif
Tube Mitogène (PHA, contrôle +)
Tube Ags TB : CFP-10, ESAT-6 et TB 7.7
QuantiFERON®-TB Gold
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•
Critères pour le choix du test T-spot.TB™
Agitation vigoureuse des tubes (Ags sur la paroi)
Incubation à 37°C overnight
Centrifugation et recueil du plasma
Quantification d’IFNg plasmatique par ELISA
Différence 1
– Lavage (purification) et comptage
Correction des lymphopénies (250.000 cellules/puits)
Critères pour le choix du test T-spot.TB™
Différence 2
– Production cytokinique au niveau cellulaire
Pas de courbe standard Elisa
Critères pour le choix du test T-spot.TB™
Différence 3
– Mesure de cellules T individuelles
Ex: 1000pg IFNg/mL: 2 cellules produisant 500 pg chacune ou 1000
cellules produisant 1 pg chacune?
Critères pour le choix du test T-spot.TB™
• Moins d’influence de paramètres préanalytiques
– Tubes standards
– Pas d’agitation particulière
– Pas d’ordre de prélèvement des tubes
– Pas de tubes trop ou pas assez remplis
– Pas d’influence de l’attente pré-incubation
– Plus facile pour accréditation
• maîtrise à 100% du test par le laboratoire
Expérience du Laboratoire d’Immunologie
CHU de Nancy Brabois
Critères pour le choix du test T-spot.TB™
• Purification, Standardisation et comptage
– Cytokines ou médicaments (immunosuppresseurs) plasmatiques éliminés
de l’incubation avec l’Ag.
– Diminution du « bruit de fond » cytokinique. Pas d’interférence avec
l’activation lymphocytaire T
– Correction des lymphopénies (250.000 cellules/puits)
– Résultats standardisés permettant le monitoring longitudinal des
fréquences de lymphocytes spécifiques : avant – après traitement (antituberculeux, anti-TNF,…)
– Possibilité de réaliser l’analyse dans les liquides contenant de
lymphocytes T (LBA, ascite,…)
• Sensibilité accrue
– D’après la littérature au moins 10% de plus (?)
Expérience nancéienne
• Services
– De 2004 à 2007
- Depuis juin 2004
- Sources des prélèvements
- Luxembourg (dans la journée)
- Région (dans la journée)
- CHU
- Séries
- 5 - 10 patients par jour,
- ~2000/an
- du lundi au jeudi
• Rhumatologie
– Depuis 2007
• Rhumatologie
• CLAT
• Tous services cliniques (Gastroentérologie, Maladies Infectieuses,
Médecine Interne, Dermatologie, Réa …)
• Médecine du Travail
• Indéterminés
~7% (5% ctrl PHA négatif et 2% témoin négatif
réactif)
• Positifs
– 17,5%
Haut Conseil de la Santé Publique
Avis relatif à l’utilisation des tests de détection
de la production d’interféron-g
Haut Conseil de la Santé Publique
Avis relatif à l’utilisation des tests de détection
de la production d’interféron-g
• Ne doivent être utilisés que pour le seul diagnostic de
l’infection tuberculeuse latente et uniquement dans
l’objectif de la traiter
• Pas indiqués dans le diagnostic de la tuberculose
maladie, mais aide dans certains cas de diagnostic
difficile chez l’enfant (<5 ans)
• Diagnostic de l’infection tuberculeuse latente
– Formes pauci-bacillaires
– Chez l’adulte en cas de certains cas de TB extra-pulmonaire
– Dépistage d’infections récentes
• enquêtes autour des cas
– Dépistage des infections anciennes réactivation par
l’immunodépression
• avant mise sous traitement par anti-TNF alpha
• patients infectés par le VIH
– Dépistage et surveillance
• migrants récents et personnels de santé.
Perspectives
• Évaluation de l’immunité anti-tuberculose
avant et après traitement
– Comparaison cytokines intracellulaires par
cytométrie en flux et ELISPOT
– Challenge = différencier tuberculose active et
latente
Évaluation de la sécrétion de cytokines
par marquage intracytoplasmique
• Évaluation globale de l’immunité cellulaire T
– Complémentaire et plus informative que la recherche par
ELISPOT de lymphocytes T sécrétant IFNg
(la réponse IFNg isolée n’est pas suffisante pour évaluer la
magnitude et la présence ou absence d’une immunité
spécifique vis-à-vis des pathogènes)
– Développement de nouvelles pistes dans le management
clinique des infections
Évaluation des lymphocytes
spécifiques de M. tuberculosis
Analyse
• Sélection des sous populations lymphocytaires T
CD4+ et CD8+ et de mémoire
Culture cellulaire avec l’Ag
• Cellules : PBMC
• Antigène
– Pool de peptides des épitopes immunodominants CFP-10 et ESAT6
(15aa, overlap de 11 aa)
• présentation par les molécules HLA de classe I et classe II
• stimulation des lymphocytes T CD4+ et CD8+
– Contrôles négatif (milieu seul) et positif (mitogène)
• Culture overnight
• Phénotypage et acquisition au cytomètre en flux
Conclusion
Réponses polyfonctionnelles
• IGRAS
– Aide au diagnostique de la TB latente
– Suivi « longitudinal »?
• Après traitement par anti-TNF?
• Après traitement anti-TB?
• Place à l’évaluation globale de l’immunité
anti-TB (réponses polyfonctionnelles)
T-spot.TB™ vs. Quantiferon®-TB Gold
T-spot.TB™ vs. Quantiferon®-TB Gold
avantages et inconvénients
avantages et inconvénients
T-spot.TB™
Pré-analytique
T-spot.TB™
Quantiferon-TB Gold
Pas de tubes
spécifiques
Pas de manipulations
ou volumes sanguins
particuliers
Tubes spécifiques
Ordre de prélèvement (?)
Volumes sanguins
particuliers
Agitation particulière des
tubes
Quantiferon-TB Gold
3 antigènes
Analytique
Correction des
lymphopénies
Résultats quantitatifs
(cellules
individuelles)
Possibilité d’évaluer
autres liquides
biologiques (LBA,…)
Plus grande
technicité requise
(personnel et
matériel)
Technicité plus simple
Coût plus élevé (BHN Moindre coût (BHN200)
400)
T-spot.TB™ vs. Quantiferon®-TB Gold
avantages et inconvénients
Post-analytique
T-spot.TB™
Quantiferon-TB Gold
Possibilité d’un
rendu des
résultats rapide
(24hs)
Attente pour remplir une
plaque Elisa avant de
rendre les résultats
Plus d’information
(nombre de
cellules positives):
résultats
standardisés
permettant le suivi
longitudinal