Cours de Mécanique cellulaire

Cours de Mécanique cellulaire
Tronc commun du Master Biophysique Moléculaire et Cellulaire
UE UMBSR310
Gladys Massiera
Laboratoire des Colloïdes Verres et Nanomatériaux
(LCVN- UMR5587)
[email protected]
Brefs rappels sur la structure du cytosquelette
- les trois réseaux de biopolymères
- les protéines réticulantes
- les moteurs moléculaires
Plan du cours
Cours de Mécanique cellulaire
Intérêt de la mécanique cellulaire
Exemples de forces subies ou exercées par les cellules:
- surfaces souples ridées par des cellules
- mobilité des macrophages
- comportement sous flux d'un leukocyte
Quelques définitions de mécanique
- Définitions: contraintes, déformations, modules élastiques, viscosité
- Types de sollicitation: cisaillement, élongation...
Méthodes de mesure des propriétés mécaniques de la cellule
- Mesure à l'échelle cellulaire (étirement entre deux plaques, micropipettes)
- Mesure à partir d'une sonde locale extra-cellulaire (AFM, pincettes
optiques et magnétiques)
- Mesure à partir d'une sonde locale intra-cellulaire (sondes magnétiques,
microrhéologie à deux points)
- Microscopie de force de traction (Mesure des forces exercées par les
cellules sur une surface)
- Microfluidique (Comportement sous écoulement et/ou confinement)
Modèles de la mécanique cellulaire (Résultats et Interprétations)
- Modèle sol-gel
- Modèle de tenségrité
- Modèle du milieu vitreux mou
- autres modèles...
Lien avec l'adhésion
1. Intérêt de la mécanique cellulaire
La cellule est un objet très dynamique. Les contraintes et les déformations
mécaniques qui résultent de cette dynamique (polymérisation des filaments d'actine, des
microtubules, phénomènes de catastrophes, dynamique des moteurs moléculaires...)
jouent un rôle central dans de nombreux processus biologiques:
- contraction cellulaire
- étalement
- migration
- 'wound healing'
- division
- adhésion (transduction mécanique)
- passage au travers une constriction
- résistance au flux hydrodynamique dans les capillaires sanguins
- ...
L'environement mécanique agit également sur la régulation de l'expression de certaines
protéines et gènes, et sur la différentiation.
1. Intérêt de la mécanique cellulaire
A. Motilité des cellules
Rappel: Principe de l'action et de la réaction
Pour se déplacer, la cellule exerce donc des forces. La réaction du support
lui permet d'avancer.
1. Intérêt de la mécanique cellulaire
B. Forces exercées par la cellule: mise en évidence
Cellules (chick heart fibroblasts)
sur des substrats de silicone
(couche mince et déformable)
Harris, A. K., Science, 208, p.177 (1980)
1. Intérêt de la mécanique cellulaire
C. Forces subies par la cellule: cas du flux
hydrodynamique
1. Intérêt de la mécanique cellulaire
D. Questions soulevées par ces observations
expérimentales
Qu'est ce qui permet de sentir, de transmettre, et
d'exercer ces forces?
Comment les forces cellulaires sont elles régulées?
Comment les mesurer?
2. Brefs rappels sur la structure du cytosquelette
A. Les trois réseaux de biopolymères
Lp ~ 10 µm
Lp ~ 1 µm
Lp ~ 1 mm
2. Brefs rappels sur la structure du cytosquelette
B. Les protéines réticulantes
Leur rôle: associer les filaments entre eux pour former des réseaux
structurés et interconnectés qui procurent à la cellule une résistance
mécanique, un cytosquelette, et donc la possibilité de générer des
forces.
Fagots de filaments
(fimbrin, fascin, α-actinine...)
Arp 2/3:
Filamine:
2. Brefs rappels sur la structure du cytosquelette
C. Les moteurs moléculaires
Les moteurs associés aux filaments du cytosquelette:
Myosi nes associées aux filaments d'actine
Dynéine, et Kinésines associées aux microtubules
Autres moteurs (Cf cours Andréa Parmeggiani)
Les enzymes (polymérases...)
Les pompes à ions
3. Quelques définitions de grandeurs mécaniques
Remarque sur le module d'Young:
Le module d'Young décrit le module élastique en volume du corps
considéré (il ne tient pas compte de la géométrie de l'objet déformé
(fléchissement d'une poutre, cisaillement d'un cube...)
Dans le cas d'une élongation pure, le module d'Young est directement
donné par le rapport entre la contrainte et la déformation.
Dans le cas de déformation plus complexe et pour des solides isotropes, le
module d'Young peut être exprimé en fonction des modules de
compression et de cisaillement.
4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques
Cellule entière
Tsai, M. A. (1993)
La réponse mécanique est
fonction des échelles:
Desprat, N. (2005)
Fernandez, P. (2006)
Sonde externe
Alcaraz, J. (2003)
Kas, J. (2004)
Fredberg, Ingber,
Wang (Harvard)
Isabey (Créteil)
Gallet (SMC)
Sondes intracellulaires
F
Sackman E., Bausch A.
Wirtz, D.
Crocker, J. C.
-- de temps
-- de longueur sondée
-- des forces appliquées
…
- zone cellulaire sondée
-- type cellulaire
-- statistique
4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques
Biophys. J. (2004)
A. Mesure à l'échelle cellulaire Desprat,
Fernandez, Biophys. J. (2006)
Cas de l'étirement entre deux plaques
J(t) = ε(t)/σ0
J(t) =A tα
Cas de l'AFM
4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques
B. Mesure avec une sonde locale extra-cellulaire
Cas des pincettes optiques
Science 224,p.513, 1984 Valberg, P. A..
F0= 2 π R G(f) h(θ) x0
Balland (2002, 2005)
Cas des pincettes optiques: études sur des globules rouges
Pincettes magnétiques
B
 = M.
 ∇

F
Magnétorhéometrie Optique: le principe
Science 224,p.513, 1984 Valberg, P. A..
(RGD peptide)
RGD
H
Molecular Biology of the Cell, Alberts B. et al.
x(t)
- adhésion des particules
- magnétisation
- application du couple
diamètre 4.5 µm
M
Cellule
H jusqu’à 15 Gauss, ω: 0.1 to 1000 Hz
Filaments d’actine
Nos méthodes: (1) Laser tracking microscopy (LTM)
Science 224,p.513, 1984 Valberg, P. A..
Particule magnétique
4.5 µm
High resolution (0.1-1 nm)
High speed (10 µs)
ULN Laser
Optical
isolator
P
λ/4
Conjugate plane
5mW, λ = 633 nm
CO2 37°C control
Dark field
M ~ 450
Quadrant
photodiode
Beam
stop
Specimen plane
100 x oil objective
En appliquant un couple oscillatoire:
H (t)
d (t)
x (t)
t
σ = G * (ω ) γ
Mesure directe de la rhéologie dynamique
de cellules vivantes
G*(ω)
Milieu viscoélastique!
G * (ω ) =
G′ (ω )
élastique
+ i G′′ (ω )
visqueuse
4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques
C. Mesure avec une sonde locale intra-cellulaire
Traquer des particules intracellulaires?
Granules lipidiques!
Microscopie à contraste interférentiel
Condition de culture (37°C, 5% CO2)
10 µm
NIH 3T3
Fibroblaste
J774A.1 Macrophage
Sondes idéales:
- particules endogènes
- très réfringentes
- quasiment
sphériques (a ≈ 0.3 µm)
Méthode non-invasive
TC7 Endothéliale
F9 Carcinoma
Mesurer les fluctuations du réseau à
l’intérieur d’une cellule
Le mouvement des
particules endogènes est
traqué sous microscopie
à contraste interférentiel
NIH 3T3 Fibroblast
5 μm
1μm
• La cellule est filmée dans
son plan médian pendant
30mn (107 positions 2D).
• Les cellules sont
maintenues dans les
conditions de culture
(37°C, et 5% CO2)
Two-point microrheology (TPM)
Standard microrheology
∆ r 2 (ω ) =
k BT
π ω aG′′ (ω )
G′ (ω ), G′′ (ω )
Phys. Rev. Lett. 85, p. 1774, 2000 Levine A.. et al.
Phys. Rev. Lett. 85, p. 888, 2000 Crocker J. C. et al.
Two point microrheology
⇒ positive correlation
⇒ no correlation
Dα β (r ,τ ) = ∆ r (t ,τ )∆ rβ (t ,τ ) δ (r − R (t ))
i
α
j
ij
r (τ )
2
i ≠ j ,t
2
2r
=
Drr (r ,τ )
a
Milieu Continu
Drr diminue en 1/r sur des distances
interparticules comprises entre 2 et 8 µ
m
Le cytosquelette peut être considéré comme un milieu continu sur
les échelles de longueurs explorées.
Two-point microrheology in cells
DIC 37°C, pH=7.2
Tracking resolution 5-10 nm
Probed length scale ~ 2-8 µm
ω ~ 4-2.103 rad.sec-1
10 µm
Non-invasive method probing
intracellular mechanics
tracers
~ 0.3µm
3
a < r (t, τ ) > (µ m )
-2
10
Control
-3
10
TPM
-4
2
10
quasi-3D continuum
on 2-8 µm
-5
10
ATP depletion
-6
10
-4
10
-2
10
τ (sec.)
10
0
Consensual power law rheology
4 Methods
G*(ω) = A ωβ + B ω3/4
Intracellular probe
TPM
β1 = 0.24
β2 = 0.16
3/4
LTM (phagocytozed bead)
Extracellular probe
LTM-MTC
LTM (RGD externally
attached beads)
B. D. Hoffman, G. Massiera, et al. (2006), PNAS , 103, p.10259
4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques
D. Force traction microscopy
4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques
D. Force traction microscopy
4. Méthodes de mesure des propriétés mécaniques
E. Microfluidique
Development of a
measurement technique:
Coupled measure of
deformation and pressure
drop variations
Entry of a RBC and a WBC in time
Abkarian, Faivre, Stone, PNAS (soumis) (2005)
40
Rapid prototyping with Soft lithography
An elastic polymer (PDMS) mold of a relief designed on a Si wafer
by photolithography is cured and placed on a substrate to form
virtually any shape for channels.
Multiphase fluid flow Pressure
or
Syringe
pump
High speed camera + Objective
http://gmwgroup.harvard.edu/
5. Modèles théoriques pour la réponse mécanique
A. Modèle sol-gel
Ce modèle considère le cytosquelette de filaments d'actine comme analogue à celui d'un
gel qui passerait d'un état liquide (sol) à un état gel par une transition liée à la
polumérisation induite des filaments. Elle s'appuie sur les travaux de Janmey Stossel
(1990) sur le comportement mécanique de solution d'actine reconstituée.
B. Modèle de tenségrité
Ingber, Wang
et al. Harvard.
Le principe qui est issu du domaine de l'architecture, est celui d'un équilibre entre des
éléments sous compression (microtubules) et des éléments sous tension (F-actine).
5. Modèles théoriques pour la réponse mécanique
C. Modèle du milieu vitreux mou (soft glassy material)
PRL, Fabry 2001
PRE, Sollich, 1998
Principe: Les contraintes appliquées sur le milieu sont relaxées par
des fluctuations non-thermiques, décrites par une température
effective reliée à l'exposant de la loi de puissance obtenue pour les
modules élastiques en fonction de la fréquence.
Ce modèle correspond à un état figé des éléments mésoscopiques du
milieu dans un désordre structural pour lequel les puits de potentiels
sont distribués de façon exponentielle.
5. Modèles théoriques pour la réponse mécanique
D. Autres modèles
Power-law rheology:
very broad distribution of relaxation time
Power-law rheology is ATP independent:
relaxation modes are thermally activated
Ingredients of the model:
G', G" (arb. units)
Summary of experimental results:
0
10
-1
10
ATP depletion
-2
10
-1
10
1
10
10
-1
ω (rad.sec )
3
In vitro model of crosslink actin: M. L. Gardel, PRL 96 088102 (2006).
Rief Science(1997),
Furuike FEBS(2001)
? Can we obtain a broad distribution of relaxation times
in a sheared network of unfoldable crosslinkers?
Network under shear at T=0
Force distribution:
γ = 1000 sec-1 γ = 7 sec-1
γ = 1.5
P(τ), relaxation time distribution
Maxwell modes superposition
weighted with P(τ)
⇒ G’(ω), G’’(ω)
B.Hoffman, G. Massiera, J. C. Crocker, to appear in PRE (2007),
available on http://arxiv.org/pdf/physics/0504051
6. Lien avec l'adhésion
Les adhésions focales permettent à la cellule pour s'ancrer sur la matrice
extracellulaire et pour transmettre les forces de l'ECM vers la cellule et vice versa
Associées aux fibres de contraintes, les adhésions focales permettent aussi de générer
une précontrainte cellulaire qui influence fortement la réponse mécanique cellulaire:
elle devient plus rigide sous tension.
6. Lien avec l'adhésion
6. Lien avec l'adhésion
Mise en évidence du lien entre précontrainte et
module élastique du cytosquelette
Articles relatifs au cours de mécanique cellulaire:
1- Etirement entre deux plaques
2- Etirement entre deux plaques (régime non-linéaire)
3- Pincettes optiques et étirement entre deux plaques
4- Pincettes magnétiques (force appliquée)
5-'Magnetic twisting cytometry' (couple appliqué)
6- Microrheologie à deux points
7- Microscopie à traction de force (utilisation des billes fluo)
8- Microscopie à traction de force (fléchissement des plots)
9- Microscopie à traction de force (fléchissement des plots)
10- Microfluidique appliqué à l'étude de la mécanique de globules
rouges
11- Modèle sol-gel
12- Modèle de Tenségrité
13- Modèle du milieu vitreux mou
14- Modèle à partir de la dénaturation de protéines réticulant le réseau
15- Rôle de l'environnement mécanique
16- Rôle de l'environnement mécanique (mesure de forces de traction)
17- Transduction mécanique et adhésion