Diaporama groupe 3 ( PDF
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Dialogue entre les cellules immunitaires. Cytokines Cytokines CD4 LB Ag TCR LT4 Non activé CMH CD3 CD3 TCR LT8 Non activé CD8 Problématique Quelle est la ou les cytokine(s) secrétée(s) suite à l’activation des Lymphocytes T4 (LT4)? Laquelle des molécules (CD3 ou CD4) permet la production de cytokine(s)? Hypothèse: Nous savons que les LT4 actives sécrètent des cytokines contribuant à la neutralisation d’un corps étranger dans l’organisme. Donc, nous supposons que la cytokine secrétée par les LT4 stimulés pourrait être Interleukine-2 (IL-2). Matériel et méthode On a réalisé le test ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) : Test colorimétrique permettant de détecter les protéines et de les doser. Matériel et méthode Puits 1 Puits 2 Milieu seul (Ctrl-) Puits 3 et 4 ? ? ? Surnageant LT4 non stimulés (Ctrl-) Puits 5 et 6 ? ? ? LT4 Surnageant LT4 stimulés par un anti CD3 ( Puits 3 : 1µg/ml Puits 4 : 20µg/ml) Incubation pendant 24H à 37°C Surnageant LT4 stimulés par un anti CD4 (Puis 5 : 1µg/ml ou Puits 6 : 20µg/ml) IL-2 ?? Principe d’une réaction ELISA Gamme étalon 0ng/ml . . . . . . .1/64 1/32 1/16 1/4 1/2 5ng/ml Sub TMB M S- SCD3 1 SCD3 20 SCD4 1 SCD4 20 Sub Prod Prod TMB Prod Sub E Microplaque spéciale pour ELISA TMB E E Détail d’un puits 1 -Habillage (coating) avec un anticorps Iaire (de capture) (2H, 37°C). 3X lavages, flicker et essuyer le plaque. 2-Saturation avec du PBS/BSA (1H, TA) et flicker. 2-Incubation des dilutions r-IL2 et les surnageants à tester (toute la nuit, 4°C) 2X lavages, flicker et essuyer la plaque. 3-Incubation avec l’anticorps IIaire anti-antigène (IL-2) couplé à l’enzyme (1H30mn, 37°C). 3X lavages, flicker et essuyer la plaque. 4-Incubation avec le substrat TMB (Révélation enzymatique) (10mn, TA) 5-Stopper la réaction avec du HCL et lire l’absorbance à 450nM. Résultats Gamme étalon Absorbance (DO) Absorbance (DO) Gamme étalon 1,5 1 0,5 0 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 2 6 (ng/ml) 4 0 Gamme étalon 2 3 4 5 6 (ng/ml) Gamme étalon 1,5 2 Absorbance (DO) Absorbance (DO) 1 1 0,5 0 0 2 4 6 (ng/ml) 1,5 1 0,5 0 0 2 4 6 (ng/ml) Résultats Absorbance (DO) M LTCD4 S- LTCD4 LTCD4 LTCD4 LTCD4 CD3(20µg/ml) CD4(1µg/ml) CD4(20µg/ml) CD3(1µg/ml) 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 La stimulation par les Anticorps anti-CD3 a permis la production de l’IL-2 par les LT4. Conclusion Coopération cellulaire lors de la réponse immunitaire IL-2 IL-2 CD4 LB Ag TCR LT4 Non activé CMH IL-2 CD3 CD3 TCR Plasmocyte LT8 Non activé LTCD4 activés AC Clones de LTCD4 Sécrétant IL-2 et d’autres cytokines Clones de plasmocytes secrétant des anticorps CD8 LTCD8 activés Clones de LTCD8 cytotoxiques préts à attaquer les cellules de l’organisme infectées par le virus IL-2 et d’autres cytokines Merci de votre attention!! Nous sommes prêts maintenant à répondre aux questions !
