Développement d`un biosenseur utilisant le « Microarray » à

MAÎTRISER LA LUMIÈRE POUR NOS PARTENAIRES
CHALLENGING LIGHT FOR OUR PARTNERS
Développement d’un
biosenseur utilisant le
« Microarray » à anticorps
pour la détection de
bactéries
Jean-Pierre Bouchard
Fabien Claveau
Shu Chen
Marci Vernon
François Babin
François Roy-Moisan
Jocelyne Osouf
Martin Briand
Michel Fortin
Patrice Desroches
Stéphanie Jutras
René Beaulieu
Présenté par
Isabelle Noiseux
Québec, juin 2008
INO (Institut National d’Optique)
Québec, Canada
¾ Organisme privé sans but lucratif
¾ R et D contractuel en optique et photonique
Optical
Communications
Specialty
Optical
Fibres
Lasers
Fibre Optical
Components
Microsystems
(MEMS/MOEMS)
MicroMicro-fabrication
MicroMicro-optics
Optical
Design
Industrial
Optics
Industrial
Vision &
3D Sensors
Advanced
Imaging
Systems
Agrophotonics
BIOPHOTONICS
1
Objectif
CONTEXTE
¾ Pourquoi ce projet?
NOTRE CONCEPT
¾ Démarche technique
¾ Développement de méthode
¾ Test de quantification
VALIDATION
¾ Optimisation du prototype
¾ Validation avec salmonelle
¾ Conclusions et perspectives
Contexte
L’identification et la quantification des bactéries
soulèvent des préoccupations dans un certain
nombre de marchés diversifiés, y compris
l’agroalimentaire, l’environnement, la sécurité et la
pharmaceutique
Marché de la microbiologie industrielle
- 3,2 milliards en 2003
- 4,9 milliards en 2008
Marché des essais diagnostiques
- 28 milliards en 2003
- 39 milliards en 2008
2
Contexte
L’objectif visé était d’élaborer un système qui respectait
les exigences suivantes :
¾Détection, identification et quantification simultanées
de plusieurs espèces de bactéries
¾La méthode doit être objective et ne doit exiger
aucune compétence particulière
¾Le test doit être simple, rapide et peu coûteux
¾Le coût d’achat doit être faible et le délai de mise en
œuvre minimal
Approche technique : Biosenseur
3) Unité de
traitement
de signaux
Anticorps
Sandwich
2) Élément
détecteur
Anticorps
capturé
1) Élément
biologique
sensible
Antigène
(bactérie)
bactérie)
Support
3
Z11
Z21
Z12
Z22
Surface d’écriture
Démarche technique : Microarray à protéine
Élément biologique sensible
Impression de
l’anticorps sur la
lame porte-objet
à l’aide d’un
schéma
sélectionné
4
Notre démarche
7C4 1.0 mg/mL
7C4 2.0 mg/mL
2.5
0.5
7C4 3.0 mg/mL 5.0
7C4 4.0 mg/mL
NEG
0.5
2.5
2.5
POS
Surface d’écriture
7C4 0.5 mg/mL
NEG
0.5
0.5
8
0.5 0.5
12
2.5
Dimension en mm
Élément biologique sensible
Images fluorescentes des anticorps imprimés
0,5 mg/mL
1,0 mg/mL
2,0 mg/mL
3,0 mg/mL
4,0 mg/mL
5
Méthode
> Préparation des échantillons
> Étiquetage soit des bactéries ou des anticorps sandwich
> Bloquer l’adsorption non spécifique
par BSA
> Placer la chambre hybridée
> Ajouter l’échantillon et agiter
> Laver pour éliminer l’adsorption non
spécifique
> Ajouter l’anticorps sandwich au
besoin
> Laver au besoin
> Sécher par centrifugation
> Lecture
Élément détecteur
Révélation sous fluorescence de l’événement liant
0,5 mg/mL
1,0 mg/mL
2,0 mg/mL
3,0 mg/mL
4,0 mg/mL
6
Test de quantification
Thiothrix eikelboomii
Stage 2
Thiothrix eikelboomii
Stage 2
sur le microarray
Révélation de bactérie
spécifiquement capturée par
l’anticorps sandwich étiqueté;
détection par fluorescence
Image à contraste
de phase de la bactérie
Test de quantification
Signal de fluorescence [a.u.]
Stage 4
10
Stage 4
8
6
4
Stage 2
Stage 3
2
Stage 2
0
0
5
10
15
20
25
Concentration de bactérie en %
(Stage 6 = 100%)
7
Prototype INO
A
B
C
K
D
A: Caméra
B: Lentilles d’imagerie
C: Filtre d’excitation
D: Lentilles de collimation d’excitation
E: Fibre optique multimodale
F: DÉL à 532 nm
G: Lentilles d’injection à l’intérieur
de la fibre
H: Objectif
I: Foyer
J: Dichroïque
K: Filtre d’émission
G
F
J
E
I
H
Microarray
Algorithme de traitement de l’image
Obtenir une image-gradient
Binariser l’image-gradient
Étiqueter et calculer les surfaces-gradient pur
chaque élément fluorescent
Image d'entrée
Module du gradient
370
370
380
380
390
390
Analyserchaque élément fluorescent
Aller à l’élément
suivant
Surface de gradient
supérieur à la
plage de dimension
400
400
480
OUI
Segmenter chaque spécimen à l’intérieur de
l’élément fluorescent
Remplir tous les trous qui se trouvent dans
chaque élément fluorescent
490
500
510
480
Image des blobs
490
500
510
Image des blobs découpés
370
370
380
380
390
390
400
400
480
490
500
510
480
490
500
510
Étiqueter et calculer les surfaces pour
chaque élément fluorescent
Éliminer les éléments fluorescents qui
sont trop gros
Identifieret compter les éléments fluorescents
8
Notre démarche
Image à haute résolution de chaque point
Lecteur
commercial
Lecteur
INO
Collaboration
Dr. S. Chen des Services de
laboratoire (Université de Guelph,
Ontario) a effectué ce qui suit :
> Impression d’anticorps sur les porte-objets du
microarray
> Test de validation effectué sur la salmonelle (pathogène
de niveau 2) : sélection des anticorps et des bactéries,
réalisation des expériences
> Lecture des porte-objets du microarray à l’aide d’un
système commercial
9
Test de validation avec la salmonelle
¾ Impression de 5 anticorps différents
¾ Étiquetage des bactéries à l’aide d’Alexa fluor 555
¾ Comparaison des résultats du lecteur INO à ceux du
lecteur commercial
1. Limite de détection
- Concentrations mises à l’essai : 1.2X109, 1.2X108, 1.2X107,
1.2X106, 1 .2X1 05, 1 .2X1 04, 1 .2X1 03 et 1 .2X1 02
2. Spécificité : mélange de salmonelle avec d’autres bactéries
avant d’ajouter l’échantillon
- Citrobacter freundii, Escherichia coli, Klebsiella pneumonie et
Serratia marcescens
3. Amplification : mettre à l’essai différentes périodes
d’amplification
- Inoculation à l’aide de 10 CFU dans 25 g de poulet haché
Limite de détection - Salmonelle
Meilleur que le lecteur commercial,
sensibilité de 105 CFU
10
Essai de spécificité - Salmonelle
La « concurrence » n’a pas eu d’effet sur la
liaison de la Salmonelle
Faux décomptes ~ 103
Essai d’amplification - Salmonelle
INO MicroArrayReader
Commercial MicroArrayReader
4.5
6.4
3
ON+6h
TBG
ON+3h
BHI
OverNight
ON+6h
TBG
ON+3h
BHI
OverNight
6h
None
6h
6.2
2.5
None
Log(total signal)
3.5
6.8
Signal détectable après amplification
après la « nuit »
Système hautement concurrentiel avec les systèmes
commerciaux
6.6
Log(total signal)
4
7
11
Conclusion
Biosenseurs fondés sur la technologie de microarray des
anticorps :
¾ Détection / identification de plusieurs espèces de bactéries
simultanément
¾ Possibilité de quantification spécifique
¾ Aucune interprétation de données nécessaires, ainsi la méthode
est objective
¾ Possibilité d’utiliser différents anticorps pour différentes
applications
¾ Analyse et instrumentation peu coûteux
¾ Meilleurs résultats qu’avec les lecteurs commerciaux
dispendieux
Perspectives
Système disponible pour transfert technologique
¾ Négociations en cours
Brevet en instance
¾ « Système d’analyse de Microarray et méthode connexe »,
J.-P. Bouchard, F. Claveau, I. Noiseux, présenté au Bureau des
brevets des États-Unis, janvier 2007
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