Anatomie du 23 octobre 2003. Il y a des protéines associés de façon lâche car possibilité de séparer de la membrane : c’est la membrane périphérique. D’autre part des protéines qui restent enchâssés dans la membrane : 2 sortes : les protéines transmembranaires ou intrinsèque ou intégrale qui traversent la membrane et un autre type plus récent de connaissance. Principes généraux concernant les protéines membranaires : Les protéines sont aussi indispensables que les lipides pour le fonctionnement, les besoins de la cellule. Une bicouche lipidique simple ne permet pas d’assurer échanges nécessités par besoins métaboliques de la cellule : import/ export doivent être contrôler pour assurer la constance du milieu intérieur et amener à l’intérieur tout ce qui est nécessaire à la cellule (ce qu’elle ne fabrique pas) et pour exporter les déchets. Les cellules très actives métaboliquement ont plus de protéines dans membrane que cellule inactive relativement. 1-En ordonnée c’est le pourcentage massique des protéines qui est en grisés, le reste étant des lipides en blanc. Colonne 1 : exemple de la myéline qui contient des cellules peu actives donc seulement 18% de protéines en masse par rapport à l’ensemble de la masse de la membrane biologique. En 6 on voit une membrane contenant plus de protéines : c’est celle de la mitochondrie qui a 2 membranes (interne et externe) et c’est la membrane interne dans laquelle se trouve les chaînes de transporteurs d’électrons qui jouent un rôle dans fabrication de l’ATP donc équivalent de la membrane des végétaux où a lieu la photosynthèse. La membrane externe est beaucoup moins importante que l’interne donc différence entre membrane externe composé de moitié de lipide, moitié de protéines et la membrane interne a 76% de protéines donc très actives. Le membrane interne du chloroplaste en comparaison qui a environ la même proportion de 76% de protéines : ça sert à fabriquer l’ATP dans les 2 cas. 2-on voit 2 protéines : Les extrémités C et N terminales sont inversés dans la glycophorine par rapport à la bande 3 donc pas de règle pour l’endroit où se trouve le C ou N terminal. Autre différence c’est une protéine avec un seul passage et l’autre avec plusieurs passages transmembranaires. Ici ce sont des protéines de la membrane du globule rouge et on voit qu’il y a des glucides sur une protéine : la glycophorine. Pas de règle pour la longueur d’un côté ou de l’autre. 3-La glycophorine : Avec un petit morceau C terminal intracytoplasmique et une grosse partie hydrophile à l’extérieur de la cellule dont on voit les AA en blanc et en noir la succession de sucres accrochés et certain sucres portent des charges négatives : il s’agit d’acide neuraminique ou acide sialique qui décore certaines glycoprotéines ; ça peut avec cette charge entré en combinaison d’interaction de charge avec autres molécules. 4-Systèmes enzymatique existant dans les polynucléaires neutrophiles ; les polynucléaires ayant un noyau polylobé mais pas plusieurs noyaux. Ce polynucléaire neutrophile est le premier agent de défense de l’organisme contre les bactéries et cette cellule lorsqu’elle est alerté va réagir en produisant différents produits pour tuer les bactéries et un de ces produits est l’anion superoxyde O2 . La NADPH oxydase est un ensemble de protéine et il peut y avoir nécessité de rassemblement de protéines pour avoir une fonction : Quand le récepteur est occupé par le ligand des protéines vont se coupler avec une enzyme qui va être activé. Dans la cellule au repos il n’y a pas de bactéries, il y a des protéines membranaires comme GP91 et lorsqu’une bactérie arrive les protéines cytoplasmiques viennent se coller, il y a phosphorylation donc ensemble devient cohésif donc il y a production de l’anion superoxyde. Dans la cellule il y a des principes généraux : régulation dans des limites contrôlés, principe de la compartimentation, et voici donc des associations fonctionnelles temporaires. GP91 va nous intéresser. 1 5- GP91 a 6 passages transmembranaires et les glucides des glycoprotéines membranaires sont toujours à l’extérieur. Les 2 extrémités N term et C term du même côté cytoplasmique de la membrane. Le transfère d’électrons pour produire l’anion superoxyde se produit dans l’extrémité C terminal, dans celui ci il y a un site de fixation pour NADPH, pour FAD et il y a des transfères mono électroniques qui vont avoir lieu à travers ce circuit ; c’est la partie terminale de GP91 avec ce passage transmembranaire qui est la machinerie nécessaire pour former l’anion superoxyde. Comment a t’on pu analyser les protéines transmembranaires ? On y est arrivé quand on a découvert l’utilisation des détergents pour extraire les protéines des membranes. 5-1-Variante d’accrochage de protéine dans une membrane différente d’un passage transmembranaire ? Il y a des protéines qui ont une partie très hydrophobe qui va les ancrer dans une monocouche membranaire. Sur des protéines peuvent se greffer par liaison covalente des acides gras ou des terpènes, et ce sont eux qui vont s’enchâsser dans la monocouche et qui vont ancrer la protéine qui elle reste à l’extérieur de la monocouche. - Avec l’acide méristique (14 :0) et l’acide palmitique (16 :0). On sait que certaine protéines sont amarrés à la membrane par une extrémité méristoyle parce qu’il y a une liaison covalente entre l’acide myristique et le NH2 de la glycine : c’est une liaison amide entre groupement carboxylique et un NH2 donc c’est solide. Avec l’acide palmitique c’est une cystéine qui et dans la chaîne d’AA donc pas terminal donc intramoléculaire. Ici on aura pas une amide mais une liaison Thio ester car avec un SH, liaison plus labile que la liaison amide. - Avec des terpènes (sans groupement carboxylique) : le farnésyle est un terpène à 15C donc résulte de l’association de 3 isoprènes : il se fixe sur une extrémité C d’une protéine et se fixe par une liaison covalente avec une cystéine. Mais ici il n’y a pas de groupement carboxylique comme pour l’acide palmitique donc une liaison Thio éther qui est plus stable que le Thio ester. Le Géranylgéranyl comporte 20 C donc représente structures à 4 isoprènes polymérisés avec même caractéristique que terpène précédent. 6- L’acide myristique : On voit la glycine et la liaison entre groupement carboxylique et le NH2 de la glycine avec élimination d’eau donc on a le N myristoylglycine car liaison sur la partie N terminale de la protéine. L’acide palmitique avec une cystéine intramoléculaire (sans COOH mais un SH) : liaison covalente avec élimination d’eau, c’est une liaison Thio ester. Les 2 terpènes ont des choses communs : mode de liaison sur les cystéines et dans les 2 cas c’est une liaison de type Thio éther. C’est donc S farnésylcystéine et S géranylgéranylcystéine. 7-Le GPI : glycosyl phosphatidyl inositol. Il y a une protéine qui est couplée de façon covalente avec quelque chose qui comporte du PI et il y a une partie qui est un sucre donc c’est pas le PI simple. Retenons que certaines protéines sont amarrés à la membrane par un bras GPI. Ceci veut dire qu’il faut s’imaginer que ces lipides vont venir enchâsser dans la monocouche interne et la protéine est juste à la surface membranaire du côté cytoplasmique et c’est une situation différente des protéines dites périphériques qui sont en interaction faible avec la face interne d’une membrane donc cas intermédiaire entre protéines périphériques et les protéines transmembranaires. 8- Passage de l’eau dans les membranes lipidiques sans protéine (bicouche lipidique artificielle IN VITRO) : Des entités hydrophobes passent très facilement les bicouches lipidiques. Les petites molécules polaires non chargées : perméabilité pas négligeable : 2 l’éthanol passe facilement à travers membrane lipidique donc quand on est ivre l’alcool pénètre dans cellule nerveuse. Grosses molécules polaires non chargés : ça passe moins bien. Les molécules polaires chargées passent difficilement : presque imperméable pour les AA, l’ATP, les ions qui ne passent pas la bicouche lipidique spontanément c’est pourquoi toutes les membranes ont des pompes à sodium, calcium, etc. 8-1-Cas de l’eau : Si on prends une protéine hydrophobe, sa vitesse de traversée sera élevée donc en haut à droite, si on prends un ion ou molécule très hydrophile ça passe plus lentement. Il y a une bonne corrélation entre hydrophilie/hydrophobicité et la vitesse de passage transmembranaire mais il y a une exception : l’eau. 9- On est là dans une membrane biologique : pourquoi l’eau passe si facilement ? On a découvert l’aquaporine qui équipent nos cellules, elle est spécialisée le passe de l’eau à travers la membrane. Il y a une sorte d’entonnoir, il y a une zone rétrécie où il y a une charge positive : la molécule d’eau arrive et cette charge dissociée une molécule d’eau individuelle de son réseau de liaison hydrogène donc molécules d’eau dissociées une à une pour passer une à une dans ce système. Donc la molécule qui s’apponte présente son O (qui possède délocalisation partielle électronique à charge -) en face de la charge positive. Ensuite la molécule d’eau passe dans ce conduit étroit et c’est une molécule d’eau individuelle qui passe et ensuite la molécule d’eau change de position quand elle passe dans l’autre position du canal. C’est un système qui fait que le passage de l’eau est privilégié dans nos cellules car il faut répondre rapidement aux variations rapides de l’osmolarité interne. Pour chaque canal d’aquaporine il passe 3.109 molécules d’eau par seconde. Les détergents : feuilles. -25-Cas général des détergents: Voici une protéine transmembranaire. Un des éléments de la stabilité de la bicouche lipidique c’est que les lipides qui les composent sont de nature cylindrique et que s’il y a trop de structure coniques il y a une moins grande stabilité. Cette protéine va donc sortir de la membrane désorganisée et va se trouvé apparemment solubilisé avec sa partie hydrophobe entouré de molécules de détergents et quelques GPL qui reste accroché. En solution aqueuse la molécule est individualisé mais elle n’a pas été solubilisé au sens stricte du terme. A côté il y aura des micelles mixtes avec les molécules de détergents et toutes les molécules de lipides qui ont étés désinsérés d’une bicouche. Cas particulier par détergents particuliers : les détergents reposant sur le principe de l’acide cholique ; çà concerne le cholate de sodium, le deoxycholate et le CHAPS. -schéma : normalement les détergents regardent la partie hydrophobe de la protéine dans son passage transmembranaire. Ceci n’est pas vrai pour les structures polycyclique (chargée positivement ou négativement) : il y a une surface polycyclique à l’horizontal et d’un côté il y a les OH donc il y a une surface plane avec une face hydrophile et une face hydrophobe donc celles ci se plaquent par leurs surface hydrophobe sur les parties hydrophobes de la protéine. -26- Surfactant physiologique : le surfactant pulmonaire. Ici c’est une alvéole. L’alvéole a une paroi et l’air contenu dans l’alvéole. La paroi est constitué de 2 types cellulaires : les pneumocytes de type 1 qui forment la paroi proprement dite et les pneumocytes de type 2 qui sont spécialisés dans la fabrication du surfactant alvéolaire. A l’intérieur de l’alvéole il y a une phase aqueuse adhérente : pellicule d’eau et donc les pneumocytes 2 fabrique un surfactant qui chemine dans cette face aqueuse et va venir à la surface interne de l’alvéole. Il 3 y a des éléments qui présentent leurs parties hydrophobes dans l’alvéole et la partie hydrophile dans la phase aqueuse. -27- Composition du surfactant : Il y a beaucoup de lipides et peu de protéines. On voit le dipalmityl phosphatidyl choline : il y a donc surtout des dérivés de la choline mais ne pas connaître vraiment la composition. Il y a du cholestérol esters et des protéines : SPA, SPB, SPC et il faut tout ça pour faire un bon surfactant. -28- Le rôle du surfactant : Ce système ne doit pas trop se dilater mais pas s’aplatir car les deux parois pourraient s’accoler et ne pas se détacher donc ce surfactant limite la dilatation et évite l’aplatissement complet de l’alvéole. Ces parties hydrophobes à l’intérieur de l’alvéole quand elle vont se rencontrer ont un effet répulsif. Le surfactant est un agent mouillant qui diminue la tension superficielle. Nous avons 300 millions d’alvéoles, ça fait 200m² de surface et la paroi est 50 fois plus mince qu’une feuille de papier. Tout ceci se gonfle/dégonfle 20000 fois par jour mais il y a des cas où ça marche pas bien. En effet avant la 35ème semaine les cellules de notre poumon ne fabriquent pas encore le surfactant correctement donc quand on a un prématuré avant la 35ème semaine : avant il mourrait d’asphyxie et quand on a connu le surfactant on a créer du surfactant qu’on donne au prématuré pour leur permettre de respirer et maintenant on fait de s surfactants artificiels. On ne connaît pas encore le mécanisme physique mais c’est une application médicale. -29- Microdomaines membranaires (et comment ces bactéries arrivent à maintenir constante la fluidité de leur membrane quand elles sont à température haute). 1) Puits tapissés ou puits recouvert qui est la traduction de Coated pits. 2) Les cavéoles 3) Les radeaux lipidiques ou rafts en anglais. -30-Les puits tapissés : Le foi fabrique des lipoprotéines VLDL dégraissés par les lipoprotéines lipases dans le sang et donc transformés en LDL qui vont être reconnu par des récepteurs spécifiques de nos cellules. Quand cette particule arrivent en face d’une cellule elle s’apponte grâce à son apo B-100. On sait que ceci se fait dans des zones spécialisées pour l’internalisation de ces lipoprotéines et de leurs récepteurs et on a découvert que ces puits sont tapissés d’assemblage de molécules qui font une sorte de cage et qui nous rappel le terme de clathrate donc ici c’est la clathrine. -31-Les cavéoles : Ce sont des microdomaines tapissés par des molécules de cavéolines : protéines qui sont enchâssés dans une monocouche (ne traverse pas la bicouche) avec un double passage. C’est une façon d’internaliser une portion de la membrane. -32-La transcytose : Au niveau des cellules endothéliales, ici il y a la membrane basale, en haut l’intérieur du vaisseau et bien il se forme une sorte de vésicule qui chemine à travers la cellule endothéliale et va s’ouvrir de l’autre côté. Toutes les cellules ont besoin de lipoprotéines LDL parce qu’elles leur rapporte des choses qu’elles ne fabriquent pas donc la cellule endothéliale évidemment internalise du LDL mais la cellule endothéliale est une barrière vis à vis des cellules qui sont derrière elles dans la paroi de l’artère. Il y a 2 façons d’ouvrir la paroi artériel : par l’extérieur, l’adventice mais aussi on suppose par l’intérieur pour les cellules qui sont juste derrière les cellules endothéliales par une transcytose donc on suspecte que les cavéoles permettraient d’englober des lipoprotéines, de leur faire traverser la cellule et de délivrer ces lipoprotéines aux cellules qui sont derrières la barrière endothéliale. Au début on avait imaginé que les LDL traversaient la barrière endothéliale entre 2 cellules écartées mais l’hypothèse de transcytose a retrouvé gain. 4 -33- Les radeaux lipidiques ou raft. Ce sont des radeaux lipidiques qui ont une composition particulière, d’abord il y a plus de cholestérol, plus de sphingolipides, plus d’acides gras saturés long et ça créé un paquet de lipides assez cohésif entre eux et plus solide que les AG insaturés avec moins de cholestérol etc. donc ce sont des îlots de lipides. On les a découvert en travaillant avec le détergent X100. La définition des radeaux lipidiques est opérationnel : les membranologues arrivaient à solubiliser les membranes presque complètement mais lorsqu’ils travaillaient avec du X-100 à 1% et à 4° on arrive à dissocier les membranes sauf des petits agrégats qui restent et on a vu que dedans il y avait cette composition des rafts. En plus des lipides mentionnés, il faut mentionner des protéines transmembranaires qui étaient des résidents permanents dans ces zones là et dans certaines circonstances il y a des protéines voisines qui viennent se mettre dans ce radeau lipidique pour jouer un rôle en association fonctionnel temporaire (comme pour les protéines de la NADPH oxyade) à ses radeaux lipidiques et on sait pas vraiment à quoi ça sert. -34- On voit des agents infectieux qui interagissent avec la cellule au niveau des cavéoles et des radeaux lipidiques pour induire des effets intracellulaires. C’est important car si ça se confirme ça permettra d’avoir une meilleur compréhension de l’interaction aux agents pathogènes et ça nous donnera des outils pour lutter contre les agents pathogènes. -35-Adaptations membranaires aux variations de température : Si on prends un acide gras à 40°C il est fluide mais si la température descend il va se figer (solide) c’est la température de transition ou de changement de phase ou de fusion. Ceci est quand la solution comporte un acide gras unique identique. S’il y a une variété d’AG : cas des membranes, la température de fusion de chacun des AG étant différents cette zone de transition pour une membrane va être plus étalés. Quand la bicouche lipidique est au dessus de la température de transition c’est moins compacte qu’au dessous de la température de transition. C’est donc une petite pellicule relativement solide à l’extérieur mais à l’intérieur c’est quasiment de l’huile mais quand on passe au dessous de la température de transition ça s’aligne, les interactions hydrophobes vont augmenter et donc ça se compacte. A droite c’est un état cristallin solide (aspect solide, figé) et à gauche on appel ça état liquide cristallin (car pas totalement fluide). -36-Cas d’une bactérie qu’on peut cultivé à 27 ou 37° : elle s’adapte pour garder malgré le changement de température une fluidité membranaire constante. Si on la cultive à 37° ma viscosité de la membrane est identique qu’à 27°. Comment ça marche ? la bactérie fabrique des AG de façons différenciés : -37- A 10° les acides gras saturés à 22%, les AG insaturés à 64%. A 40° les AG saturés sont devenus 56% et les AG insaturés à 21% donc inversion. Autrement dit quand la température augmente ça entraîne une plus grande fluidité de la membrane et la bactérie qui a comprit le signal diminue le nombre d’AG insaturés et augmente le nombre d’AG saturés éventuellement plus long. A l’inverse quand on revient à température plus basse elle fabrique plus d’AG insaturés et moins d’acide gras insaturés donc la composition de la membrane varie pour garder fluidité constante. Le rapport insaturés/saturés est de 2.9 à 10° mais plus faible quand 40° car moins d’acides gras insaturés. -38- On voit la monocouche. Le glycérol n’est pas parallèle à la surface mais légèrement enfouit donc si 2 AG de même longueur dans la monocouche ne se termine pas à la même hauteur et il y a un petit espace de liberté. Une façon de combler cette espace de liberté et de diminuer la fluidité est de mettre un 16 :0 qui comble le petit trou donc les interactions hydrophobes se déroulent jusqu’au bout donc plus grande rigidité de membrane. Il y a donc des permutations grâce à des enzymes. A plus forte température il y a donc 14 :0, 16 :0 mais 5 la bactérie est capable d’inverser ces AG donc si elle introduit le 16 :0 sur le Carbonne 1 et le 14 :0 sur le Carbonne 2 il y a un degré de liberté plus grand donc ça va dans une structure liquide cristalline. Le fait que glycérol soit incliné, la bactérie peut jouer sur la longueur des AG. Donc la position des AG dans les GPL peut déjà contribuer à la fluidité. Bien sur ça se fait dans des limites. 39- Hyperthermophiles : Les bactéries qui vivent très bien à 121°C est la bactérie nommée souche 121 trouvé dans une source hydrothermale au fond de l’océan et cette bactérie ne survie pas, elle vit très bien à 121° C. Ces bactéries n’ont pas d’oxygène mais sont autotrophes avec substances inorganiques mais à température élevée il y a une pression considérable sur les membranes (2 ou 3 kms d’eau sur la tête). Dans la membrane ces bactéries fabriquent quelque chose inséré dans les bicouches lipidiques : on a vu que la vitamine E pouvait être considéré comme une porte coupe feu, et bien là ce sont de véritables « briques » insérés dans les bicouches lipidiques pour donner cette résistance à chaleur et pression. 40- il y a deux diterpènes de 20 atomes de carbones qui sont condensés donc liés de façon 4-4 donc ça fait une chaîne linéaire d’hydrocarbure C40. Ces deux chaînes d’hydrocarbures sont pontés par du glycérol par une liaison Ether-oxyde bien plus solide que liaison ester et finalement ce Glycérol dialkyle Glycérol tétraéther est une structure très solide sur le plan physique donc c’est un des éléments qui fait que la membrane des bactéries peut résister à des températures et pressions élevées. -40-1 : Aucun vivant sans membrane, sans milieu intérieur, sans compartimentation. Il y a des théories pour comment la vie aurait commencée ? On dit que ça a forcément commencé par des acides nucléiques et par des molécules auto multiplicatives et pourquoi pas des enzymes. Le choix s’est porté sur les ARN car un ARN est capable d’avoir une activité enzymatique (lunardi) ; mais les lipidologues remarquent que sans membrane la vie ne pourrait peut être pas exister car si on imagine ces réactions qui caractérisent le vivant dilués dans un océan sans aucune compartimentation comment faire évoluer un système de façon cohérente donc si la vie est apparu c’est qu’il y a eu une compartimentation donc voilà l’intérêt de molécules lipidiques soit amphiphiles qui ont formés les compartiments. 6