RÉACTIFS D'IDENTIFICATION DES COLONIES BACTÉRIENNES Trois grandes réactions biochimiques sont utilisées pour identifier les colonies bactériennes obtenues par culture : L'oxydase La catalase La nitrate réductase OXYDASE Matériel : Réactif, papier buvard blanc, pipette Pasteur, tube à hémolyse 5 ml + bouchon opaque Préparation du réactif : Attention, le réactif est carcinogène : manipuler derrière un écran et porter gants et masque. Dans un petit tube à hémolyse de 5 ml, dissoudre une point de couteau de N, N, N' , N' tétraméthyl 1-4 phénylène diamine dans 5 ml d'eau distillée. Boucher puis agiter. Recouvrir le tube de papier aluminium, il est très sensible à la lumière. Le réactif conservé au réfrigérateur à l'abri de la lumière, il est stable 6 heures. Il est conseillé de pratiquer en parallèle un témoin positif (Neisseria) et un témoin négatif (entérobactérie) Test : il est déconseillé de pratiquer le test directement sur la gélose. Déposer quelques gouttes du réactif sur un papier buvard blanc. Prélever 2 ou 3 colonies avec une pipette Pasteur flambée et les mélanger à la goutte. Conclusion : Une coloration nettement bleue signe une oxydase positive. Pas de coloration ou décoloration signe une oxydase négative. CATALASE Matériel : Eau oxygénée 10 volumes, Tween 80 (ou à défaut liquide vaisselle), récipient de 125 ml, lames Préparation du réactif : Mélanger dans un récipient de 125 ml : 100 ml d'eau oxygénée à 10 volumes et 5 ml de Tween 80 (ou liquide vaisselle). Le réactif conservé au réfrigérateur est stable un an. Il est conseillé de pratiquer en parallèle un témoin positif (Staphylocoque) et un témoin négatif (Streptocoque, entérobactérie) Test : Déposer une goutte de réactif sur une lame propre. Délayer une colonie dans la goutte à l'aide d'une pipette Pasteur. Conclusion : Présence de bulles : catalase positive Absence de bulles : catalase négative NITRATE REDUCTASE Introduction : Différents états de l'azote organique : NO3 --> NO2 --> N Nitrate --> Nitrite --> Azote Nous disposons d'un milieu comportant des nitrates (eau nitratée), d'un test de mise en évidence des nitrites et d'un réactif catalysant la transformation nitrates --> nitrites. Matériel : Tubes 15 ml, KNO3, acide sulfanilique, acide acétique, a -naphtylamine, poudre de zinc, eau peptonée. Préparation des réactifs : Peptone nitratée : Ajouter 0.1 gramme de KNO3 à 100 ml de milieu nutritif peptoné, stériliser en tubes. Mise en évidence des nitrites : Réactif A : mélanger 0.8 gramme d'acide sulfanilique dans 100 ml d'acide acétique 5N Réactif B : mélanger 0.5 gramme d'a -naphtylamine dans 100 ml d'acide acétique 5N Mélanger juste avant le test 1 ml des solutions A et B : on obtient le réactif de Griess. Catalyse de la réaction nitrates--> nitrites : Poudre de zinc : attention il s'agit d'un réducteur fort. Test : Incuber à 37 ° pendant 24 heures une colonie bactérienne dans 5 ml d'eau peptonée nitratée Verser quelques gouttes du mélange A+B dans le tube. Si il n'y a pas apparition d'une couleur rouge, ajouter au tube une pincée de poudre de zinc Conclusion : différents cas sont possibles 1 2 3 Dans le cas 3, les nitrates ont été réduits en nitrites, eux-mêmes réduits en azote : on ne peut donc pas mettre en évidence les nitrites, bien que le test soit positif.