Ordre d`intervention des différentes protéines. Cours du 22

Ordre d’intervention des différentes protéines.
Cours du 22 Septembre 2008 : MD3
Pour déterminer cet ordre, on surexprimera une protéine situé en aval de la chaine pour voir si on ne
peut pas supprimer le phénotype des protéines en amonts. Comme Rad3 et Rad26 coimmunoprécipite, cela signifie que ces deux protéines doivent former un complexe, et se situe vers la
fin de la chaine de signalisation.
Des compléments d’études ont été réalisés : études par cristallographie.
On remarque un parallèle strict de structure entre le complexe clamp-loader et le complexe
9-1-1 qui est lui recruté sur un ADN simple brin.
La molécule RPA est une molécule qui se fixe sur de l’ADN simple brin pour le protéger. Le complexe
Rad26 et Rad3 viennent également interagir avec le complexe 9-1-1.
Mise en évidence de Chk1 : suppression de Rad3Δ
Forme phosphorylée de Cdc2 : forme inactive.
Est-ce que Rad3 phosphoryle directement cdc2 pour l’empêcher de rentrer en M tant que l’ADN
n’est pas réparé ? Ou existe-t-il des intermédiaires ? (Wee1 qui inactive Cdc2 : donc Rad3 peut-il
phosphoryler Wee1 pour l’activer afin qu’il inactive a son tour Cdc2 ?)
 Apres analyses biochimique, on s’aperçoit que Rad3 ne phosphoryle aucune de ses
protéines !
Conclusion : manque t’il une étape avec une protéine qui n’apparait pas dans les groupes de
complémentation ? Rad3 doit phosphoryler une autre protéine X.
Pour identifier la protéine X, on va la surexprimer. Problème : on ne connait pas cette protéine.
Donc on fait une banque génomique de S.pombe sauvage dans un vecteur qui peut être maintenu à
copies multiples dans la cellule.
On utilise des vecteurs navettes : vecteurs amplifiés chez la Bactérie puis mis dans des levures.
Les levures qui survient sur les milieux de sélection vont être analysées (les plasmides qu’elles
contiennent sont ou Rad3+, ou ont un suppresseur Chk1)
On fait alors de la génétique reverse : on a le gène, et à partir de ce gène on va créer le mutant
déficient en Chk1.
On isole le fragment d’ADN dans le vecteur qui code pour Chk1. On fabrique un gène Chk1 qui
contient le marqueur Leu2. On clone ceci dans un vecteur d’expression bactérien : gène Chk1 ::Leu2+
A partir de ce plasmide, on ressort l’insert. On transfecte des levures avec, les levures étant de
génotype Chk1+ Leu2Δ.
PS : il y a de fortes tendances chez la levure à faire des recombinaisons avec le chromosome,
en chassant le gène résident. De cette manière, on remplace le gène sauvage par le gène interrompu
par Leu2+.
On récupère les cellules qui poussent sur milieu sans Leucine, puis on irradie. Les cellules Chk1- sont
hypersensibles aux UV avec un phénotype « cut », mais ne sont pas sensible à HU.
Que se passe-t-il chez les mutants surexprimant Chk1 ?
On fait une construction sous contrôle de Nmt1, promoteur fort répressible par la thiamine.
 Obtention de souches létales avec un phénotype du genre G2/M : attendu car comme la
protéine est surexprimée, elle empêchera de rentrer en mitose même si il n’y a pas de
lésions.
Quel est l’état de phosphorylation de Cdc1, CDc2 et Cdc25 ?
-pCdc2 : phosphorylée sur la Tyr15 : inactive.
-pCdc25 : phosphorylée inactive.
-pWee1 : hyperphosphorylée : activatrice.
Mais problème : les mutants Chk1 ne sont pas sensibles à l’HU alors que les mutants Rad3 sont
sensibles à HU et aux radiations.
Mise en évidence de Cds1 : suppression de Swi7-H4 (TS)
On réalise les mêmes expériences que précédemment. On retrouve également des
survivants : certains codant pour Pol-α, d’autres pour Cds1 (Sér-Thr-Kinase). On casse également le
gène Cds1 par une cassette de Leu2. Il y a apparition de deux voies parallèles, l’une sensible aux UV
avec Chk1, l’autre sensible à HU avec Cds1.
Rad3 n’a pas d’affinité directe à Chk1 et Cds1. Il faut que ces protéines soient en présence de
protéines adaptatrice : Mrc1 pour Cds1 et Crb2 pour Chk1. Cela explique cette double voie car Mrc1
et Crb2 sont des protéines cycliques qui ne sont exprimées qu’a certains moments du cycle cellulaire.
-Mrc1 : exprimée plutôt en phase S
-Crb2 : exprimée plutôt en phase G2.
Il existe un seuil de RPA, qui, lorsqu’il sera franchi à cause d’un découplage partiel de l’hélicase avec
les polymérases, va activer les checkpoints.
Lors d’une cassure double brin, très rapidement arrivent des exonucléase qui libèrent du simple brin
et permettent le recrutement de RPA : checkpoint activé.
Le point de non-retour se situe à la limite Métaphase-Anaphase.
Branche intra-S du checkpoint.
Chez S.cerevisae, e mutant Rad53 = mutant Cds1 chez S.pombe.
En cas de stress, l’origine tardive ne se déclenche pas. L’absence de Cds1 empêche l’extinction des
origines tardives en cas de stress.
Point de contrôle chez les mammifères.
Technique des oligonucléotides dégénérés.
SP
SC
Homme :
--Mêmes motifs---aa1
aa2
aa3
aa1
aa2
aa3
--Motifs divergents-…
…
…
…
…
…
---Mêmes motifs--aax
aay
aaz
aax
aay
aaz
aa1
AAC
…
aax
aa2
CCG
CCA
aa3
…
…
aay
aaz
On fait synthétiser tous les oligonucléotides possibles du fait de la redondance du code génétique.
Puis on traire les ARN et on fait une PCR en mettant comme amorce l’ensemble des
oligonucléotides : un d’entre eux sera complémentaire entre la levure et le modèle humain. (RT-PCR
en fait)
On obtiendra alors une sonde parfaitement complémentaire au gène humain. On s’en servira pour
cibler une banque d’ADN humain.