Comment le Transforming Growth Factor bêta 1 contrôle-t-il le
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Comment le Transforming Growth Factor bêta 1 contrôle-t-il le développement de maladies auto-immunes? Comprendre comment notre système immunitaire est régulé est essentiel. Des déficiences dans cette régulation entraîne des troubles graves, parmi eux des maladies dites auto-immunes telles que le diabète de type I, la sclérose en plaque, les myocardites, thyroïdites, ou encore la polyarthrite rhumatoïde. Ces maladies reposent sur un même mécanisme de base : une perte de la tolérance au soi. Le Transforming Growth Factor bêta (TGF-b) est une cytokine polypeptidique dont la sécrétion est ubiquitaire. Les trois formes, TGF-bêta 1, 2 et 3 servent de régulateurs positifs et négatifs aux programmes de différenciations et de proliférations de nombreux types cellulaires. En se liant à leur récepteur commun, les trois isoformes du TGF-bêta induisent l’activité kinase du domaine intracellulaire de leur récepteur TGFbêta-RII qui, en retour, phosphoryle le domaine kinase la sousunité TGF-bêtaRI. La phosphorylation de cette dernière facilite la régulation de gènes « Smaddépendants » et active d’autres voies de signalisation indépendamment des facteurs de transcription Smad. Au sein du système immunitaire, le TGF-bêta1 est prévalant et joue un rôle crucial dans la régulation de la réponse immunitaire. Des souris déficientes en TGF-bêta1 développent des pathologies auto-immunes sévères, touchant différents organes (pancréas, foie, cœur), responsables de la mort des animaux dès 4 trois semaines de vie. Du fait des effets multiples du TGF-bêta sur une grande variété de tissus et, de la large distribution, au sein mais aussi en dehors du système immunitaire, du récepteur au TGF-bêta, la compréhension des mécanismes cellulaires responsables des graves troubles auto-immuns observés chez ces animaux déficients en TGF-bêta1 était très difficile. Julien Marie et son équipe ont entrepris de déterminer les cellules cibles de l’effet immuno-régulateur du TGF-bêta. Les lymphocytes T sont généralement impliqués dans un grand nombre de maladies auto-immunes. Par ailleurs, in vitro, la privation des lymphocytes T en TGF-bêta conduit à leur prolifération. Cette population lymphocytaire est donc apparue aux chercheurs, en toute logique, comme une cible potentielle des effets immuno-régulateurs du TGF-bêta sur le contrôle des maladies auto-immunes. Afin d’adresser le rôle du TGF-bêta spécifiquement sur la biologie des lymphocytes T, les chercheurs ont généré des souris dont uniquement les lymphocytes T (CD4 et CD8) sont déficients en TGF-bêtaRII. Privés ainsi de signaux émis par le TGF-bêta les lymphocytes T deviennent spontanément des cellules capables d’endommager de très nombreux organes comme le pancréas, le foie, le cœur, la moelle épinière etc, conduisant à de nombreuses maladie auto-imunes et à la mort des animaux des 4 semaines de vie. Ainsi la simple ablation de la voie de signalisation du TGF-bêta dans les lymphocytes T induit des symptômes similaires à la privation de la cytokine elle même, révélant l’activité régulatrice majeur du TGF-B au niveau des lymphocytes T. Si leur développement au sein du thymus semble non ou peu affecté, en périphérie les lymphocytes T privés de la voie de signalisation du TGF-bêta s’engage spontanément mais spécifiquement dans un programme de différenciation cytotoxique et pro-inflammatoire (Granzyme A+ et B+, Lamp1+, FasLHigh, IFN-ghigh, TNF-a high) à l’origine de la destruction de très nombreux organes. Cette perte de tolérance au soi a conduit Julien Marie à analyser les compartiments des lymphocytes T régulateurs CD4+ CD25+ (Treg) et NKT connus pour jouer un rôle majeur dans la régulation de nombreuses maladies auto-immune. Les Treg sont caractérisés par l’expression du facteur de transcription Foxp3 qui contrôle leur différenciation et fonction. Les cellules NKT, quant à elles, expriment des marqueurs de cellules « natural Killer » (NK) mais également des lymphocytes T dont un récepteur T présentant la particularité de reconnaître des antigènes lipidiques. Si le développement thymique des Treg semble normal, aucune cellule NKT ne se développe en l’absence de signalisation via le TGF-bêta. Par ailleurs, à la périphérie, les cellules régulatrices Foxp3+ sont quasi inexistantes. Ainsi, le TGF bêta joue une rôle fondamental dans le développement thymique des cellules NKT et dans la maintenance à la périphérie des Treg. Une analyse plus fine des populations lymphocytaires T a permis aux chercheurs de révéler la présence de cellules exprimant des marqueurs de cellules NK et un récepteur T qui, contrairement au cellules NKT conventionnelles, reconnaît des antigènes protéiques. Par analogie, ils ont qualifié cette population de ncNKT pour non-conventionnelle NKT. Les ncNKT représentent 20% des lymphocytes T spléniques chez les animaux déficients en TGF-bêtaRII au niveau de leur lymphocyte T, alors que d’ordinaire ils ne constituent que 1 à 2% des lymphocytes T. Les cellules ncNKT, semblent constituer un stade final de différenciation lymphocytaire T, expriment de très fort niveau de cytokine proinflammatoire et présentent une activité cytotoxique exacerbée contre les cellules du soi. En contrôlant le programme de différenciation cytotoxique des lymphocytes T, et le développement de 1 deux acteurs majeurs de la régulation de la réponse immunitaire (Treg et NKT), le TGF-bêta permet de maintenir un état de tolérance au soi et donc de prévenir du développement de maladies autoimmunes. Marie JC, Liggitt D, Rudensky AY. Cellular Mechanisms of Fatal Early-Onset Autoimmunity in Mice with the T Cell-Specific Targeting of Transforming Growth Factor-beta Receptor. Immunity 2006 Sep ; 25 (3) : 441-54. Contact Unité Inserm 404, Lyon : Julien Marie Titre du document / Document title ROLE D'UN INOSITOLPHOSPHATE GLYCANNE DANS LE MECANISME D'ACTION DU TRANSFORMING GROWTH FACTOR BETA 1 CHEZ LES CHONDROCYTES ARTICULAIRES = ROLE OF AN INOSITOLPHOSPHATE GLYCAN IN TRANSFORMING GROWTH FACTOR-BETA[1] SIGNALLING PATHWAYS IN ARTICULAR CHONDROCYTES Auteur(s) / Author(s) Bogdanowicz Patrick ; Pujol Jean-Pierre (Directeur de thèse) ; Affiliation(s) du ou des auteurs / Author(s) Affiliation(s) Université de Caen, Caen, FRANCE (Université de soutenance) Résumé / Abstract Le Transforming Growth Factor-béta[1] (TGF-béta[1]) est un facteur de croissance modulant la prolifération cellulaire et la synthèse des composants de la matrice extracellulaire. Les signaux de transduction impliqués dans ces différents effets sont très étudiés mais restent encore mal définis. Il semble qu'ils puissent varier en fonction du type cellulaire et des conditions expérimentales utilisées. Le but de notre travail a été d'étudier le rôle d'un inositolphosphate glycanne (IPG) dans les mécanismes de transduction du TGF-béta[1] dans les chondrocytes articulaires de lapin (CAL) où ce facteur stimule la prolifération cellulaire. L'étude du rôle des récepteurs du TGFbéta nous a conduit à étudier également cette voie de transduction dans une lignée de cellules épithéliales de poumon de vison (Mv[1]Lu) où le TGF-béta[1] inhibe très fortement la prolifération cellulaire. Dans ces deux types cellulaires, nos résultats mettent en évidence la présence de GPI qui semble être le précurseur membranaire de l'IPG libéré après traitement par le TGF-béta[1]. Ce pool d'IPG est constitué de différentes formes anioniques, le TGF-béta[1] stimulant la libération de la forme la plus anionique. La formation du complexe hétéromérique de récepteurs I et II du TGF-béta est indispensable à cette stimulation. Dans ces deux types cellulaires, cet IPG mime les effets du TGF-béta[1] sur la prolifération. Dans les cellules Mv[1]Lu, la présence du récepteur de type I du TGF-béta ne semble pas être nécessaire à l'inhibition de la prolifération induite par l'IPG. Par ailleurs, nous montrons que l'IPG ne semble pas contrôler la régulation de l'activité transcriptionnelle des gènes de la matrice extracellulaire. Nos résultats mettent également en évidence, chez les CAL, une stimulation de l'activité MAP kinase par le TGF-béta[1] et l'IPG. L'ensemble de ces résultats suggère que les effets du TGF-béta[1] sur la régulation de la croissance et sur la synthèse des protéines matricielles impliquent deux voies de signalisation différentes, l'IPG n'étant impliqué que dans la régulation de la prolifération cellulaire. De plus, la régulation de l'activité des MAP kinases pourrait être une étape clef dans le contrôle de la prolifération cellulaire par le TGFbéta[1] et l'IPG. Source / Source Travaux Universitaires - Thèse nouveau doctorat 1997, [Note(s) : 163] (290 ref.) (Année de soutenance : 1997) (No : 97 CAEN 2023) Langue / Language Français ; Mots-clés anglais / English Keywords Rabbit ; Chondrocyte ; Cartilage ; Transforming growth factor β1 ; Cell proliferation ; Signal transduction ; Inositol phosphate ; Glycan ; Biological receptor ; Regulation(control) ; Phosphatidylinositol ; Lagomorpha ; Mammalia ; Vertebrata ; Mots-clés français / French Keywords Lapin ; Chondrocyte ; Cartilage ; Facteur croissance transformant β1 ; Multiplication cellulaire ; Transduction signal ; Inositol phosphate ; Glycane ; Récepteur biologique ; Régulation ; Phosphatidylinositol ; Lagomorpha ; Mammalia ; Verteb http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6W8H-4BK14RTC&_user=1496867&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000053175 &_version=1&_urlVersion=0&_userid=1496867&md5=174c72b0ca8dc7b89c134e2a01c7a4e 1 Transforming growth factor-βs : signalisation et rôles physiopathologiquesTransforming growth factor-betas: smad signaling and roles in physiopathology 2 D. Javelaud and A. Mauviel , Inserm U532, institut de recherche sur la peau, université Paris-VII, hôpital Saint-Louis, 1, avenue Claude-Vellefaux, 75010, Paris, France Reçu le: 20 Octobre 2003; accepté le: 27 Octobre 2003. ; Available online 28 January 2004. Résumé Depuis sa découverte au début des années 1980, le Transforming Growth Factor-β (TGF-β) est apparu comme un facteur de croissance impliqué dans des processus physiologiques essentiels comme le développement embryonnaire, la réparation tissulaire, la différenciation et le contrôle de la croissance cellulaire. Les expériences d’invalidation des allèles codant pour les trois isoformes différentes du TGF-β chez la souris ont montré leur rôle majeur dans la régulation de l’inflammation et la réparation tissulaire. Le TGF-β est aussi impliqué dans certaines pathologies humaines, comme la fibrose tissulaire et la carcinogenèse, où il peut exercer à la fois un rôle de suppresseur de tumeur et des activités pro-oncogéniques, selon le stade de développement de la tumeur. La réponse cellulaire au TGF-β est initiée par sa fixation à des récepteurs membranaires de type sérine–thréonine kinase qui activent en aval les facteurs de transcription de la famille Smad. Abstract Transforming growth factor-β (TGF-β) family members are multifunctional peptide growth factors that regulate cell growth, differentiation, extracellular matrix production and cell migration and embryonic development. Knock-out experiments for the three mammalian isoforms of TGF-β in mice have demonstrated their importance in regulating inflammation and tissue repair. Also, TGF-β has been implicated in the pathogenesis of human diseases, including tissue fibrosis and carcinogenesis. In the latter case, it may exert both tumor suppressor and pro-oncogenic activities depending on the stage of the tumor. Smads proteins constitute the core components of the intracellular signaling cascade initiated by TGF-β receptors, as they carry signals from the cell surface directly to the nucleus; where they act as transcription factors. Mots-clé: TGF-beta; Smad; Cancer; Fibrose; Signalisation intracellulaireMots-clé: TGFbeta; Smad; Cancer; Fibrosis; Signal transduction 3 Bibliographie [1]. A.B. Roberts, Molecular and cell biology of TGF-beta. Miner Electrolyte Metab. 24 (1998), pp. 111–119. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (169) [2]. M.-H. Barcellos-Hoff, Latency and activation in the control of TGF-beta. J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia 1 (1996), pp. 353–363. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (55) [3]. J. Massague and Y.G. Chen, Controlling TGF-beta signaling. Genes Dev. 14 (2000), pp. 627–644. 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Mauviel, Transforming growth factor-Beta signaling through the smad pathway: role in extracellular matrix gene expression and regulation. J. Invest. Dermatol. 118 (2002), pp. 211–215. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (125) [20]. S. O’Kane and M.W. Ferguson, Transforming growth factors-betas and wound healing. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 29 (1997), pp. 63–78. [21]. W. Chen and S.M. Wahl, TGF-beta: receptors, signaling pathways and autoimmunity. Curr. Dir. Autoimmun. 5 (2002), pp. 62–91. View Record in Scopus | Cited By in Scopus (29) [22]. J. Varga, Scleroderma and Smads: dysfunctional Smad family dynamics culminating in fibrosis. Arthritis Rheum. 46 (2002), pp. 1703–1713. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (52) [23]. M. Reiss, TGF-beta and cancer. Microbes Infect. 1 (1999), pp. 1327–1347. SummaryPlus | Full Text + Links | PDF (255 K) | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (74) [24]. R.J. Akhurst, TGF-beta antagonists: why suppress a tumor suppressor?. J. Clin. Invest. 109 (2002), pp. 1533–1536. Full Text via CrossRef | View Record in Scopus | Cited By in Scopus (53) http://fr.wikipedia.org/wiki/Voie_de_signalisation_des_Smad La voie de signalisation des Smad concerne les facteurs de croissance de la famille du TGFβ permettant la transduction du signal lorsque le facteur de croissance se lie aux récepteurs membranaires de type I et II. Les réponses cellulaires induites par cette voie peuvent varier pour un même type cellulaire selon le contexte cellulaire. C’est donc un système de signalisation très dynamique. Présentation des protéines de la famille Smad : Les protéines Smad sont apparentées et se divisent en trois catégories : les R-Smad : les récepteurs aux BMP vont transduire le signal par le biais de Smad 1, 5 ou 8 et mad chez la drosophile ; les récepteurs aux TGFβ et aux activines Smad 2 et 3 et dSmad 2 pour la drosophile ; 6 les Co-Smad (Smad 4 et 4b et Medea pour la drosophile) ; les Anti-Smad (Smad 6 et 7 et Dad pour la drosophile). Ces protéines possèdent toutes en commun deux domaines fortement conservés : MH1 qui se lie à l’ADN et MH2 qui sert à la translocation du Smad vers le noyau. Ces deux domaines sont séparés par un linker, dont la séquence est très variable. Les R-Smad possèdent en plus la partie carboxy-terminale une séquence SSxS qui est phosphorylée par le récepteur. Ce qui peut se résumer de la manière suivante : Type de Smad NH2 variable MH1 Linnker MH2 SSxS C term R-Smad (BMP) non oui oui oui oui R-Smad (TGF/activine) non oui oui oui oui Co-Smad oui oui oui oui non Anti-Smad oui oui oui oui non Fonctionnement de la voie de signalisation [modifier] L’activation de la voie des Smad : Il y a à la surface des cellules des récepteurs de type I, de type II et de type III ce dernier étant encore appelé β glycan. La spécificité ligand récepteur n’est pas très forte du fait que les facteurs de croissance de la famille du TGFβ ont une action paracrine ou autocrine car l’action étant locale (exception faite pour les inhibines), les concentrations en substances sont faibles à l’échelle de l’organisme. Le ligand de la famille du TGF se fixe sur les récepteurs de type II et III ensemble. Ce complexe peut alors s’associer au récepteur de type I et phosphoryle le récepteur de type I dans sa partie GS. Ce dernier devient alors actif et capable d’activer les R-Smad. 7 Quand le récepteur de type I activé peut alors phosphoryler le R-Smad correspondant dans sa partie SSxS (C-term). Cette phosphorylation empêche l’interaction entre les parties MH1 et 2 du R-Smad qui s’inhibent réciproquement. Le R-Smad migre alors vers le noyau. Au cours de cette migration vers le noyau, R-Smad activé forme un complexe avec un Co-smad (molécule de la famille smad mais dénuée du domaine SSxS) par le biais de leurs régions MH2. Comme l’ensemble des Co-Smad peuvent s’associer avec l’ensemble des R-Smad, les possibilités de réponses sont importantes. La régulation de l’activation de la voie des Smad : Le processus d’activation de la voie de signalisation Smad est contrôlé à la fois positivement et négativement. Le récepteur de type III (β glycan) a pour fonction d’accroître l’affinité entre le récepteur de type II et le ligand. De même R-Smad peut être associé à un Facteur appelé SARA qui augmente l’affinité de R-Smad pour le complexe ligand récepteurs. A contrario l’inhibine en masquant le site de fixation du ligand sur les récepteurs, les facteurs protéiques FKBP12 (masquant le domaine GS sur les récepteurs de type I) et BAMBI (formant des dimères inactifs avec le récepteur de type I) régulent négativement l’activation de la voie des Smad. De manière identique, Smad 6 constitue un leurre pour Smad 4 ce qui diminue sa profusion dans le cytoplasme et Smad 7 bloque les récepteurs de type I activés. ERK kinase (activée par Ras) phosphoryle le linker des R-Smad ce qui empêche l’accumulation nucléaire des complexes R-Smad Co-Smad et enfin Smurf I (ubiquitine ligase) régule le niveau cytoplasmique de Smad 1. L’ubiquitinylation de Smad 2 est, quant à elle, réalisée au niveau du noyau. La spécificité de la réponse est déterminée lors de l’activation : Il y a deux types de récepteurs de type I qui reconnaissent deux types de RSmad contrôlant des gènes différents permettant de produire des réponses cellulaires très différentes. 8 L’origine de cette différence se trouve au niveau des séquences d’acides aminés de la boucle L45 du récepteur de type I et de la boucle L3 du MH2 chez R-Smad. Les fonctions de la liaison à l’ADN des Smad : Une fois la liaison ADN complexe Smad établie, la transcription du gène est activée, donc la liaison à l’ADN est une des étapes clé qui détermine quels gènes seront activés. R-Smad et Co-Smad peuvent se lier de manière optimale à la séquence CAGAC, même si la séquence AGAC est suffisante. Ces séquences s’appellent « éléments de liaison des Smad » ou SBE pour Smad binding element. Néanmoins la présence de cet élément n’est pas indispensable à la fixation du complexe et la séquence elle-même peut être modifiée. D’autre part le contact de toutes les sous-unités du complexe n’est pas indispensable à l’activation de la transcription, d’ailleurs certains isoformes de Smad2 ne possèdent pas de site de liaison à l’ADN. Les SBE (éléments de liaison des Smad) sont des séquences courtes et donc peu spécifiques, on en trouve une tous les 1024 paires de bases, si elles sont localisées au hasard sur l’ADN. On sait aussi que le complexe Smad est incapable d’activer la transcription par du SBE seul pour plusieurs raisons : 1. la constant de dissociation entre la séquence et le complexe est trop faible pour que ce dernier puisse se lier au SBE in vivo ; 2. le SBE est valable pour Smad1, 3 et 4, il n’est donc pas assez spécifique pour expliquer la variété des réponses observées. On en conclue qu’il y a probablement d’autres séquences d’ADN qui permettent une liaison plus de plus haute affinité et d’une plus grande spécificité. Le choix de partenaires de liaison détermine le choix des gènes activés : En s’associant avec des partenaires de liaison à l’ADN, les Smad forment des complexes spécifiques et peuvent ainsi s’engager dans des interactions spécifiques et sélectives et les domaines de liaison des Smad et de leurs 9 partenaires peuvent agir en synergie, à condition que les séquences de liaison se trouvent à une distance adéquate du promoteur du gène activé. Exemple des partenaires FAST dans la voie Nodal: FAST est un membre de la famille WH (winged-Helix) qui possèdent 3 hélices et deux boucles qui leurs sont associées et qui par ce biais sont capables de se fixer à l’ADN. Chez les mammifères FAST1 et 2 participent à l’activation du gène homéotique goosecoid. Ce gène est activé par nodal et Lefty2 (deux membres de la famille du TGFb). FAST interagit avec les complexes Smad2-Smad4 ou Smad3-Smad4. Cette spécificité d’interaction est due à un certain nombre de résidus de la partie MH2 de Smad2 et Smad3 dans le complexe. La présence de FAST est nécessaire pour que le complexe Smad se lier efficacement à l’enhancer de goosecoid. De même le complexe Smad2 ou Smad3 avec Smad4 est nécessaire pour que la transctivation du gène à partir de l’élément de réponse à l’activine soit efficace. http://fr.wikipedia.org/wiki/SnoN Voie de signalisation TGF-β [modifier] Le TGF-β est sécrété en situation de stress ou dans un contexte inflammatoire par les lymphocytes, les mastocytes et les macrophages. Le TGF-β est aussi sécrété par les plaquettes. Le TGF-β se lie à son récepteur sur la cellule cible. Le récepteur du TGF-β est un récepteur Sérine/Thréonine kinase de type II. Suite à la liaison du TGF-β, le récepteur de type II recrute par phosphorylation un autre récepteur Sérine/Thréonine kinase, mais de type I cette fois. Le récepteur type I recruté se dimérise avec le récepteur de type II et phosphoryle les protéines Smad-2 et Smad-3. Ces deux effecteurs se dimérisent pour ensuite formé un complexe avec la protéine co-Smad-4. Le complexe en question est ensuite transloqué dans le noyau. Le facteur de transcription TFE-3 se joint au complexe qui se lie ensuite à l’ADN. Le complexe des Smads se lie sur le motif SBE de l’ADN, tandis que le 10 facteur de transcription TFE-3 se lie au motif E-box de l’ADN. Finalement, il y a transcription des gènes ciblés par la voie de signalisation TGF-β. Rôle de la voie de signalisation TGF-β [modifier] Les gènes transcrits par la voie de signalisation TGF-β activent la voie des MAP kinases et de ERK, en plus d’effectuer, entre autre, les actions suivantes. Tout d’abords, il y a dégradation de Ski/SnoN par la voie du protéasome via les ubiquitines ligases Anaphase Promoting Complex (APC) et Smurf2. L’ubiquitination se produit sur les résidus Lys440, Lys446, Lys 449. Ainsi, il y a augmentation de la disponibilité des Smads et amplification de la voie de signalisation. Ensuite, il y a activation des protéines p21 et p15, ce qui a pour effet d’arrêter le cycle cellulaire en phase G1. Ainsi, la cellule est disposée à la différentiaton cellulaire. De plus, il y aura induction de l’apoptose. Finalement, dans un délai de 2 heures après l’activation de la voie de signalisation, il y aura expression de Ski/SnoN et régulation négative de la voie de signalisation TGF-β. http://www.biocarta.com/pathfiles/h_tgfbPathway.asp TGF beta signaling pathway 11 TGF-beta regulates growth and proliferation of cells, blocking growth of many cell types. The TGF-beta receptor includes type 1 and type 2 subunits that are serine-threonine kinases and that signal through the SMAD family of transcriptional regulators. Defects in TGF-beta signaling, includes mutation in SMADs, have been associated with cancer in humans. Prior to activation, receptor regulated SMADs are anchored to the cell membrane by factors like SARA (SMAD Anchor for Receptor Activation) that brings the SMADs into proximity of the TGF receptor kinases. Binding of TGF induces phosphorylation and activation of the TGF-beta R1 receptor by the TGF-beta R2 receptor. The activated TGF-beta R1 phosphorylates SMAD2 and SMAD3, which bind to the SMAD4 mediator to move into the nucleus and form complexes that regulate transcription. SMADs regulate transcription in several ways, including binding to DNA, interacting with other transcription factors, and interacting with transcription corepressors and coactivators like p300 and CBP. SMAD-7 represses signaling by other SMADs to down-regulate the system. Other signaling pathways like the MAP kinase-ERK cascade are activated by TGF-beta signaling, modulate SMAD activation. SnoN also regulates TGFbeta signaling, by binding to SMADs to block transcriptional activation. TGF-beta signaling causes degradation of SnoN, releasing SMADs to regulate transcription, and also activates expression of SnoN, to down-regulate SMAD signaling at later times. 12
