Ghiglione
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BIOLOGIE DU DEVELOPPEMENT ANIMAL Partie de la biologie qui étudie comment se construit un organisme multicellulaire à partir d’une cellule unique, l’œuf fécondé. Discipline en plein essor car: - au cœur de toute la biologie - répond aux questions posées par les embryologistes - complexité (utilisation de l’embryologie, la biologie cellulaire et moléculaire, la génétique, l’imagerie…) - grands principes conservés au cours de l’évolution (retrouvés dans pratiquement tous les individus) - identification des gènes du développement (aussi conservés au cours de l’évolution) - 4% des bébés possèdent un défaut congénital visible - 1% des bébés naissent avec un défaut cardiaque - 20% de la mortalité néonatale est causée par des défauts congénitaux - les problèmes congénitaux sont la cause de 50% des admissions pédiatriques Ces défauts sont dus à des anomalies au cours des processus cellulaires du développement, qu’il faut comprendre pour soigner. Comment est-ce qu’une cellule unique, l’œuf fécondé, peut donner naissance à un organisme multicellulaire composé de centaines de types cellulaires différents? Valable chez la quasi totalité des animaux : les inférieurs (nématodes) comme les supérieurs (homme) Après la fécondation, se passe la phase de segmentation sans croissance : les cellules (blastomères) deviennent de plus en plus petites. Asymétrie : formation de deux cellules filles qui n’auront pas la même composition au niveau de leur cytoplasme ou formation de deux cellules qui n’ont pas la même taille. Différenciation grâce à une expression de gènes différentiels entre els différentes cellules. La différence entre les cellules est due aux différents pools de protéines qu’elles contiennent. Apoptose (mort cellulaire programmée) Les œufs se développement de manière différente en fonction de la présence ou non de vitellus. Stade phylotypique : tous les embryons se ressemblent énormément axe antéropostérieur avec tête, corde et tube neural. RAPPELS SUR LA GASTRULATION La blastula s’aplatie au niveau du pole végétatif, et micromères migrent à l’intérieur du blastocœle. Elles vont former les cellules du mésenchyme primaire à l’origine des spicules triradiées (squelette de la larve). Invagination de la plaque végétative, et formation du blastopore et archentéron qui va pénétrer dans le blastocœle et s’allonger de plus en plus. CARTE DES TERRITOIRE S PRESOMPTIFS DE L’EMBRYON DE XENOPE Territoire présomptif : destinée que la cellule aura. BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 1 Différentes techniques : utilisation de marqueurs naturels, de différenciation, greffe cellulaire ou marqueurs synthétiques (dextrans = polymères de glucose auxquels on peut greffer des fluorofores) Stade 32 cellules : injection de dextrans avec des micropipettes dans la cellule C3 par exemple afin de voir son devenir jusqu’à un certain stade. Ceci est possible car ces grosses molécules( FLDx est un polymère de glucose) ne peuvent pas diffuser de la cellule dans laquelle ils ont été injectés. On est ainsi sûrs que les cellules qui seront vertes sont les descendantes de la cellule injectée Ensuite on récupère l’embryon, on le fixe avec du formaldhéhyde et on fait des coupes histologique que l’ont regarde au microscope. Expériences de greffe : embryon de caille âgé de 1jour. On en prélève une partie que l’on transfecte au même endroit (cellules préalablement enlevées) dans un embryon de poulet qui a aussi 1 jour : obtention d’un embryon chimérique qui possèdera les cellules des deux organismes. Ces expériences ne sont possibles que si le développement des deux organismes est très proche. On distingue ensuite les différentes cellules grâce aux différents antigènes présents dans les cellules. On les détecte grâce aux anticorps mit sur les coupes (cellules de cailles en noir) : immunodétection. Elles se sont intégrées au niveau du tube neural : donc les cellules de caille étaient également impliquées dans la formation du tube neural chez la caille. Possible aussi sur l’hétérochromatine (celle de caille est plus condensée que celle du poulet). UTILISATION DE MARQUEURS GENETIQUES POUR SUIVRE LA DESTINEE DES CELLULES Le débat entre épigenèse et préformation fut un sujet de polémique jusqu’au 19ème siècle, et cessa quand on comprit que les embryons sont composés de cellules, unités de base de tous les êtres vivants (1838). L’évolution a créé une incroyable diversité. Pourtant tous ces organismes partagent des mécanismes développementaux qui ont été conservés au cours de l’évolution, ce qui prouve que nous sommes tous issus d’un ancêtre commun gènes du développement conservés. ORGANISMES MODELES Début du XXème siècle : un plan d’organisation primaire commun : - étapes du développement (fécondation, segmentation gastrulation neurulation) coordonnées dans l’espace et le temps - organogénèse - embryon tridermique (3 feuillets) LES VERTEBRES - Le xénope, œufs très robustes et embryons faciles à élever Le poulet, œufs fécondés très faciles à obtenir, micro chirurgie facilement réalisable, élevage de l’embryon hors de la coquille. Mais on ne connait presque rien au niveau du contrôle génétique de son développement. La souris, on connait très bien sa génétique du développement, animaux transgéniques très faciles à obtenir mais le développement est un peu long et à l’intérieur du corps de la mère. Le zebrafish, cribles génétiques à grande échelle afin d’identifier les gènes importants dans le développement. BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 2 LES INVERTEBRES - La drosophile, invertébré, 3 stades larvaires, crisallide puis métamorphose et éclosion. Cycle de vie court (seulement 10 jours) pas cher, facile à élever et données génétiques très importantes. Le nématode (Caenorhabditis elegans) LE PROBLEME DE LA DETERMINATION CELLULAIRE Comment est-ce que les cellules deviennent différentes au cours du développement? 1) Spécification autonome et développement mosaïque 2) Spécification conditionnelle et développement régulatif ŒUFS MOSAÏQUES L’œuf est une mosaïque de déterminants localisés discrètement. Grâce à des divisions cellulaires asymétriques, les cellules-filles acquièrent leurs caractères et destinées à chaque division et deviennent progressivement différentes les unes des autres. En fait, la spécification est autonome par ségrégation de déterminants cytoplasmiques et non nucléaires. Ségrégation des granules P dans la lignée germinale de l’embryon du nématode C. elegans Granules P : complexes ribonucléoprotéiques (régulateurs de la traduction: hélicases, facteurs d’initiation) qui spécifient les cellules germinales Ils sont initialement distribués au hasard et migrent vers la cellule postérieure. Après le premier clivage, la cellule postérieure va contenir les granules, puis ils se retrouvent que dans une seule des 4 cellules après la division suivante. Nécessité microfilaments d’actine, Indépendant des microtubules ŒUFS A REGULATION 1890 : expérience de Hans Driesch, chez l’oursin Elimination d’un des deux blastomères blastula réduite larve de taille réduite Contradiction avec les expériences précédentes. Met en évidence un processus de régulation des déficiences Développement régulatif : Capacité de l’embryon à se développer normalement en compensant l’absence (ou le réarrangement) de certaines cellules. BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 3 L’expérience de Driesch démontre aussi que les potentialités d’un blastomère sont beaucoup plus grandes que son devenir effectif au sein de l’embryon. Le concept de régulation implique que les cellules interagissent entre elles. Contrairement aux mosaïques, il y a une communication entre les cellules. L’AXE ANIMAL-VEGETATIF A partir du stade 8, les blastomères ne sont plus identiques. Les blastomères de la moitié végétatifs sont plus importants que ceux de la partie animale. Il y a une différenciation progressive, elles perdent leur potentialité car elles deviennent spécialisées. INDUCTION Capacité des micromères à induire un deuxième archentéron chez l’embryon d’oursin. Formation des cellules du mésenchyme au niveau du pôle animal mais aussi formation d’un deuxième archentéron. Découverte en 1924 : le centre organisateur de Spemann. Embryon de triton non pigmenté, prélèvement d’un petit groupe de cellules dorsales du blastopore puis greffe sur un embryon hôte pigmenté au niveau ventral. Formation d’un embryon secondaire non pigmenté. Ces cellules font donc partie du centre organisateur capable de former un embryon. Grâce à des interactions cellulaires, un tissu contrôle le développement d’un tissu voisin, chez l’hôte. Le centre organisateur reprogramme ces cellules. Elles peuvent ainsi aider à la formation de l’embryon secondaire par la formation d’un second axe. Un centre inducteur (centre organisateur) est une région limitée de l’embryon qui exerce une influence particulière sur les tissus environnants et peut, de ce fait, orienter leur développement. COMMUNICATION, INDUCTION ET COMPETENCE COMMUNICATION Les signaux inducteurs peuvent être diffusibles ou agir par contact direct entre deux cellules. BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 4 INDUCTION ET COMPETENCE La réponse d’une cellule aux signaux inducteurs dépend de son état : compétence DEVELOPPEMENT PROGRESSIF Le développement est progressif et le devenir des cellules se détermine plus ou moins tôt Différence entre territoire présomptif, zone déterminée et zone spécifiée Si on prend une cellule de la région verte non déterminée (qui n’a pas acquis d’identité irréversible = étape ultime de la différenciation), elle formera les même cellules que le tissus jaune. Par contre, si elle est déjà déterminée, elle ne pourra pas former des hexagones. Spécification : un groupe de cellules a acquis une identité si il donne au sein d’un autre tissus, le même tissus que s’il était dans son tissu d’origine. Tous les embryons sont régulatifs et non mosaïques (même si quelques processus sont mosaïques) GENETIQUE Comment est-ce qu’une cellule unique, l’œuf fécondé, peut donner naissance à un organisme multicellulaire composé de centaines de types cellulaires différents, alors que toutes ces cellules ont le même génotype? BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 5 Clonage : - Cellule œuf d’un xénope auquel on enlève le noyau grâce à une micro pipette, implantation d’un noyau d’une cellule adulte. Exemple : Xénope + xénope issus de croisement de xénopes albinos : toute la descendance est albinos un noyau issu de cellules différenciée peut redonner tout type cellulaire : elle garde encore de la totipotence - Dolly : ovocyte de brebis, élimination du noyau + cellules de glandes mammaires (cellules somatiques adultes) d’une brebis d’une autre race, prélèvement du noyau d’une de ces cellules que l’on insère dans l’œuf embryon au stade blastocyte que l’on a implanté dans une mère porteuse. Génotype de dolly = génotype des glandes mammaires EXPRESSION DES GENES DU DEVELOPPEMENT Les gènes déterminent le comportement d’une cellule en contrôlant quelles protéines sont fabriquées par cette cellule Le développement et la différenciation cellulaire résultent de l’activation progressive et sélective des gènes du développement. Région promotrice avec TATA box, enhancer qui contrôlent l’expression spatio-temporelle du gène, silencer, gènes de ménages (indispensable pour que la cellule survive) et certains gènes du développement qui ne servent qu’à ça. Le contrôle de l’expression de ces gènes est donc très important car il faut qu’ils soient exprimés: - au bon moment: contrôle temporel (certains ARN sont produit dans l’œuf mais ne s’expriment qu’après la fécondation. - au bon endroit: contrôle spatial - en quantité adéquate : contrôle stoechiométrique MUTATION ANTENNAPEDIA Comme toutes les étapes clés du développement sont le relais de l’activité des gènes, on pourrait être tenté d’envisager le développement uniquement en terme de mécanismes de contrôle de l’expression génétique, mais ce serait une erreur grossière. En effet, cette expression n’est que le premier pas d’une cascade de phénomènes cellulaires qui modifient le comportement des cellules et ainsi dirigent le déroulement du développement embryonnaire. HYBRIDATION IN SITU Permet de localiser l’expression des ARN messagers. Synthèse d’une sonde antisens d’ARN marquée (surtout à la digoxygénine). La Digoxygénine synthétisée par des plantes, on ne peut donc pas la retrouver naturellement dans les embryons. Elle fixée covalemment à l’uridine et se complémente à l’ARN messager spécifique. Anticorps couplé à la phosphatase alcaline la reconnait. BCIP = substrat de la phosphatase alcaline : précipité bleu. Embryons à n’importe quel stade, que l’on fixe grâce à du formaldéhyde pour empêcher la dégradation des ARN et stabiliser l’embryon et on les perméabilise chaque cellule avec du détergent BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 6 IMMUNO-MARQUAGE Les anticorps primaires sont synthétisés par injection de la protéine d’intérêt dans un autre animal (son système immunitaire va sécréter des anticorps spécifiques pour lutter contre cette protéine étrangère). Les anticorps secondaires reconnaissent les IGg, sont couplés à des fluorochromes ou à une enzyme. Relavage et révélation des anticorps secondaires. C’est une immunoprécipitation de façon indirecte : comporte des anticorps secondaires. Elle est plus pratique car il suffit de faire produire les anticorps primaires et les anticorps secondaires sont achetés déjà tout prêts. Il est possible de réaliser ces deux techniques sur des embryons entiers ou sur des coupes. MORPHOGENE Gènes codant pour des protéines importantes dans la morphogénèse. Molécule soluble diffusant à partir d’une source selon un gradient décroissant de concentration et auquel les cellules répondent différemment à partir de certaines valeurs-seuils de concentration, en activant des gènes cibles. Les morphogènes permettent aux cellules d’acquérir une information de position et donc une identité. Chaque cellule a la potentialité de prendre une couleur bleue, blanche ou rouge. Etablissement d’un gradient : la valeur de position de chaque cellule est définie par la concentration du morphogène. La valeur de position est ensuite interprétée par les cellules : au dessus d’une certaine concentration les cellules se colorent en bleu, au dessous elles se colorent en blanc et au dessous d’un autre seuil elles deviennent rouges. Au total, cela donne le motif bleu blanc rouge qui détermine l’axe antéro-postérieur. Les protéines sont exprimées dans certaines cellules ou à différents moments. Ex : l’ARN bicoïde est transcrit à partir du génome maternel, il est localisé au niveau antérieur. Sa traduction est bloquée jusqu’à la fécondation, il sera ensuite traduit en protéine formant un gradient de concentration (car diffusion libre) décroissant du pôle antérieur vers le pôle postérieur. Bicoïd responsable de la partie antérieure et nanos est localisé uniquement en partie postérieure : 2 gradients de morphogène opposés mise en place de l’axe antéropostérieur. Les cellules sont soumises à un gradient de DPP : elles vont ensuite exprimer de façon différente d’autres gènes selon la valeur seuil du gradient de concentration où elles se trouvent. Mais il se passe la même chose selon l’axe D-V. Chaque cellule de l’embryon possèdent des coordonnées (x ;y) qui lui donne une information de position et donc lui donne des informations sur quelle identité elle devra adopter. BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 7 Si une cellule se comporte mal, elle aura une influence sur les cellules voisines car elles communiquent entre elles. INHIBITION LATERALE Pour générer des motifs périodiques : utilisation de l’inhibition latérale. Seules certaines cellules devront former des plumes, mais il faut empêcher les cellules voisines de se différencier de la même façon. Les premières cellules émettent des molécules inhibitrices afin qu’elles n’adoptent pas la même différenciation. Si les structures en cours de développement émettent un inhibiteur qui empêche la formation de structures semblables à proximité immédiate, on peut arriver à une disposition régulière de ces structures. L’œuf fécondé contient un programme plus générateur que descriptif - Toute l’information concernant le développement embryonnaire est contenue dans l’œuf fécondé. - L’ADN ne contient pas une description complète de l’organisme auquel il va donner naissance. - Le génome contient une série d’instructions (un programme générateur) dans lequel les constituants cytoplasmiques du zygote et des cellules sont des acteurs essentiels à côté des gènes dont l’ADN code pour la séquence des AA dans une protéine. - Lors de la réalisation progressive de l’embryon, chaque cellule acquiert son propre programme de développement, résultante d’interactions cellulaires et de l’action de certains gènes sélectionnés. Morphogènes ARN localisés à un certain endroit gradients de protéines Première série de gènes zygotiques qui subdivisent l’embryon en de grosses parties, puis deuxième série de ce type de gènes … jusqu’à la formation de cellules différentes. LES GENES DU DEVELOPPEMENT 1. Constituent une petite fraction de l’ensemble du génome. 2. La plupart d’entre eux codent pour des facteurs de transcription ou des composants de voies de signalisation. 3. L’expression temporelle et spatiale de ces gènes correspond aux régions dans lesquelles ces gènes fonctionnent. 4. Les gènes du développement peuvent être classifiés selon les phénotypes causés par leurs mutations. 5. De nombreux gènes du développement sont conservés chez différents phylums. VOIE DE SIGNALISATION Ligand extracellulaire, récepteur, activation du facteur de transcription par phosphorylation (ou autrement) Chacune de ces voies est conservée chez les vertébrés. Elles interagissent souvent les unes avec les autres, ce qui augmente la complexité. Par exemple, Un gène peut contrôler l’expression d’autres gènes quand il code pour un facteur de transcription reconnu par plusieurs gènes qu’il va activer ou inhiber (boucle positive ou négative). Certains facteurs contrôlent leur propre expression DEUX TYPES DE FONCTIONNEMENT Génétique directe: c’est l’approche classique. Le gène est d’abord identifié par son phénotype mutant lors d’un crible génétique. Il est ensuite cloné et analysé. Génétique inverse : le gène est d’abord cloné et séquencé. On réintroduit alors dans le génome ce gène modifié contenant des mutations dans sa séquence et on analyse le phénotype résultant. IDENTIFICATION DES GENES PAR MUTATION SPONTANEE (TRES RARE) Récessif (white) ou semi-dominant (brachyury, létal pour les homozygotes) BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 8 PAR CRIBLE GENETIQUE - Mutagenèse au hasard avec des produits chimiques ou des rayonnements - Repérage et classification phénotypique - Analyse par complémentation pour classer les gènes touchés - Chaque mutant renferme une mutation différente conduisant à un allèle déficient du gène ° Animaux idéaux pour un crible (zebrafish, nematode, drosophile): - cycle vital court - qu’on peut obtenir en grande quantité - développement embryonnaire externe - génétique connue LA DROSOPHILE COMME ORGANISME MODELE * 1 siècle de génétique * génome séquencé * 14 000 gènes * forte conservation de pathologies (cancer, …) * cycle vital court (10 j) * 4 chromosomes (chromosomes polytènes, balanceurs) * transgenèse aisée et rapide * facilité de culture en laboratoire * Mutagenèse aisée (rayons X, EMS ou élément P) Collections de mutants : des dizaines de milliers d’allèles aux phénotypes divers Analyse clonale (FLP/FRT) de perte et gain de fonction Systèmes d’expression ectopique dirigée (UAS/Gal4) Inactivation génique ciblée (RNAi…) Chromosomes balanceurs MUTAGENESE Outil de base pour les gens qui étudient le développement Mutation spontanée très rare Agents mutagènes : - rayons X : remaniements chr (translocation, duplication…) - EMS (éthyl méthane sulfonate) : mutations ponctuelles - élément P : insertion d’un fragment d’ADN dans le génome Collections de mutants : plusieurs dizaines de milliers d’allèles aux phénotypes divers disponibles. CHROMOSOMES POLYTENES Les chromosomes polytènes (géants) retrouvés dans certains tissus larvaires (surtout le 3) dans les glandes salivaires (qui permettent la synthèse de la glu) permettent la corrélation entre la position cartographique des gènes (hybridation in situ) et les caractéristiques physiques de ces chromosomes. Ils permettent de déterminer les endroits de rupture des réarrangements chromosomiques. Ces chromosomes sont géants car dans certaines cellules, la réplication se fait sans division (ni nucléaire ni cellulaire) plusieurs cycles d’endoréplication : formation de chromosomes avec des milliers de molécules d’ADN reliés par un chromocentre. De plus ils sont peu condensés donc facilement repérables. Il est possible de les colorer et voir apparaitre une alternance de bandes sombres/claires. MODIFICATIONS GENETIQUES Inversion: quand 2 évènements de cassure et de réparation ont eu lieu sur le même chromosome, ce qui résulte en un segment inversé (les points de rupture sont schématisés par des parenthèses): BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 9 Translocation: les évènements de rupture ont eu lieu sur 2 chromosomes différents et ont été réparés de telle manière que les morceaux sont échangés: Déficience (délétion): quand 2 évènements de cassure se sont déroulés sur le même chromosome et que la réparation a ex clu le morceau Duplication: réarrangement dans lequel un morceau supplémentaire de chromosome est attaché ou inséré à un site ectopique EMS (éthyl méthane sulfonate): • Mutations sur une seule base (transitions):G devient A ou C devient T • Mutations subtiles: changement d’un acide aminé, codon stop prématuré • Difficiles à localiser UN TRANSPOSON BIEN PARTICULIER : L’ELEMENT P DE LA DROSOPHILE Elément P existe naturellement dans certaines souches de drosophiles. Il s’intègre aléatoirement dans le génome grâce aux extrémités de l’élément P : les pieds (répétitions inversées de plusieurs paires de bases) et à la transposase. Cette intégration n’est pas stable car elle subit une excision tout de suite après. Il faut donc enlever le gène codant pour la transposase et l’insérer dans le plasmide « helper ». Si le vecteur ne possède qu’un pied, il ne pourra pas s’intégrer au génome, c’est le cas du vecteur auxiliaire qui apporte le gène de la transposase. Le vecteur de transgénèse version modifié, on conserve les deux pieds mais on supprime la séquence de la transposable que l’on remplace par un gène d’intérêt + gène white (yeux rouges aux drosophiles normales) + gène de résistance. 1 : Le gène d’intérêt est cloné dans le plasmide de transformation qui contient également un gène dominant conférant les yeux rouges. 2 : Les deux plasmides sont co-injectés dans des œufs fécondés homozygotes pour le gène muté codant pour la couleur des yeux (n’exprime aucune couleur) ou dans la lignée germinale du côté postérieur de l’embryon. L’élément P s’insère dans les cellules germinales, donc les deux transgènes et le gène de la transposase ne seront transcrits et traduits que dans ces cellules. L’embryon va alors se développer en adulte aux yeux blancs. 3 : Croisement entre les descendants aux yeux blancs : obtention de mouches qui expriment le marqueur « couleur rouge » si le plasmide transformant s’est bien inséré dans les cellules parentales. On repère l’insertion de l’élément P grâce à une PCR. Pour repérer les individus qui ont intégré de façon stable l’élément P : on utilise des embryons issus d’un croisement de parents mutants pour le gène white (yeux blancs). Tous les individus de F1 auront les yeux blancs car élément P ne s’est intégré que dans la lignée germinale, ce ne sont que les individus transgéniques de F2 qui possèderont les yeux rouges MUTAGENESE D’INSERTION: DIFFERENTES FAÇONS DE MUTER UN GENE Si l’élément P s’intègre dans partie C-term, cela ne peut avoir aucune incidence sur la fonction de la protéine générée. Une excision imprécise : élément P « saute » mais pas proprement et peut emporter avec lui plusieurs paires de base ce qui conduit à une délétion des parties adjacentes de l’élément P. IDENTIFICATION DE MUTATIONS LETALES QUI ENTRAINENT DES STRUCTURES ANORMALES AU COURS DU DEVELOPPEMENT PRECOCE Crible génétique à très grande échelle pour analyser la quasi-totalité des gènes de la drosophile responsables du développement précoce. BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 10 Motifs de denticules au niveau ventral (petit crochet fait de chitine qui permet à la larve de se déplacer sur un support) alterné avec un motif de cuticule nue. Cet arrangement est toujours le même chez les sauvages. Certaines mutations peuvent entrainer des modifications de l’organisation de la cuticule. Mutagène des spermatozoïdes de mâles, puis croisement avec des femelles qui portent un chromosome balanceur. LES CHROMOSOMES BALANCEURS Ils portent de nombreuses inversions qui perturbent l’appariement des chromosomes homologues et «empêchent» la recombinaison méiotique. Ils portent au moins un marqueur qui est une mutation dominante (généralement homozygote létale) qui permet de les suivre à l’état hétérozygote au cours des croisements. Pour le chromosome X : utilisation du marqueur dominant Bar (œil plus petit et forme de haricot) Pour le chromosome II : utilisation de marqueur d’aile recourbée Pour le chromosome III : utilisation de marqueur d’aile échancrées. Nomenclature - une lettre qui définit leur chr (F pour First qui est le X, S pour le Second, T pour le Third). - un M pour « multiples inversions » - un chiffre - le symbole génétique du principal marqueur dominant - ex: - FM7, B pour le chr. X - SM6, Cy pour le chr. II - TM3, Ser pour le chr. III Par croisement d’un balanceur avec un chromosome portant une mutation récessive létale on obtient une structure hétérozygote parfaitement équilibrée (« balancée »), viable par complémentation, stable et reproductible au cours des générations: seulement les adultes doubles hétérozygotes pour le balanceur et pour la mutation survivront: mutation/mutation : létal balanceur/balanceur : létal mutation/balanceur : viable par complémentation - Grâce aux chromosomes balanceurs, des mutations récessives létales et stériles peuvent être maintenues. Chez la souris, pas de chromosomes balanceurs, on croise avec des individus sauvages et faire un génotypage à chaque génération. MUTATIONS A EFFET ZYGOTIQUE ET MUTATIONS A EFFET MATERNEL Parents hétéro pour la mutation, 25% des individus de F1 mutants. Une analyse phénotypique approfondie, incluant des tests de dominance et de récessivité, permet de: - classer les différents allèles mutants d’un gène selon des critères qualificatifs et quantificatifs relatifs à leur fonction. - leur affecter des qualificatifs appropriés. ALLELES PERTE DE FONCTION AMORPHE (= NUL) C’est un allèle qui résulte d’une mutation qui a entraîné une perte totale de fonction. Ce sont les plus fréquents Ex: délétion d’un locus= déficience (Df) Pour vérifier qu’un allèle est nul, on suppose m/m = m/Df = Df/Df (létal) et on cherche a calculer 2a. a/a = a/0 = 0 ? 2a = 0 ? BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 11 avec : « a » activité de l’allèle mutant « 0 » activité de la Df Si les phénotypes sont égaux (2a = 0), on a bien un allèle nul Si les phénotypes ne sont pas égaux (2a>a), on n’a pas un allèle nul HYPOMORPHE C’est un allèle qui résulte d’une mutation qui a entraîné une perte partielle de fonction. Le produit du gène peut être synthétisé en plus faible quantité que l’allèle sauvage ou bien manifester une fonction atténuée Généralement dû à un manque d’éléments de contrôle en cis, ce qui résulte en une efficacité de transcription réduite ou en une perte d’expression dans certains domaines Vérification que c’est un allèle hypomorphe hypo/hypo > hypo/Df > Df/Df en terme d’activité Hypomorphes très informatifs, mais nécessité de connaître le phénotype de l ‘allèle nul ex: mutations « température-sensibles » ALLELES GAIN DE FONCTION Ils sont rares car sont plus actifs ou plus exprimés mais sont dominant. ALLELE NEOMORPHE Ils sont soit le produit du gène mutant a une fonction différente de celle du produit du gène wt soit le produit est synthétisé à un moment inadéquat soit le produit est synthétisé de façon ectopique ex : Mutation Antennapedia Si on regarde au niveau de l’embryon Le produit du gène antpDom est normal, mais il s’exprime de façon ectopique, dans la tête. Pour classifier un néomorphe, sans connaître la fonction de la protéine pour laquelle il code: • On compare les phénotypes: - allèle dominant/+ : phénotype 1 - allèle dominant/+/+: phénotype 2 • Si phénotype 1= phénotype 2, on a bien un allèle néomorphe ALLELE HYPERMORPHE C’est le contraire d’hypomorphe Soit surexpression de l’allèle wt Soit code pour une forme hyperactive de son produit C’est le cas le plus rare Ex: ras V12 (petite GTPase) Phénotype du cas b plus sévère que cas a: On aggrave le phénotype en rajoutant une copie de l’allèle wt: on a donc un allèle hypermorphe ALLELE ANTIMORPHE C’est un allèle dont le produit possède une activité antagoniste de celle du produit wt BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 12 Le produit mutant est fabriqué, mais pas actif, et ça prend la place de la molécule wt: - compétition stoechiométrique - dominant-négatif Pour classifier un antimorphe • On compare les phénotypes: - allèle dominant/+ : phénotype 1 - allèle dominant/+/+: phénotype 2 • Si le phénotype 1 est plus sévère que le phénotype 2, on a bien un allèle antimorphe. L’ajout d’une copie wt « dilue » l’effet de la mutation • ex: μtubules sont fabriqués à partir de 2 ss-unités α et 2 ssunitésβ, et il y a ensuite polymérisation β2 tubuline D/+ mâles stériles spz inertes β2 tubuline D/+/+ mâles stériles spz bougent un peu ELEMENTS P ET LEURS APPLICATIONS - « Promoteur et gene-trap » : le gène rapporteur n’a pas de promoteur donc il n’y a expression que si l’insertion se fait dans une unité transcriptionnelle et dans la bonne orientation. La fluorescence de GFP permet de voir dans quelles cellules se fait l'expression du gène GFP. Il sert pour indiquer l'expression des gènes voisins du gène GFP. - "protein-trap" : insertion d’un exon artificiel contenant la GFP à) l’intérieur d’un intron. L’intron va ensuite subir l’épissage tout en laissant la GFP dans le génome. Cette dernière sera transcrite grâce au promoteur du gène en amont en fusion avec ce gène. Il est alors possible de suivre la localisation cellulaire et subcellulaire de notre protéine de fusion. - "enhancer-trap" : Cette technique se base sur l'insertion dans le génome, d'un transposon contenant un gène rapporteur placé sous le contrôle d'un promoteur minimal (une boîte TATA et un site d’initiation de la transcription incapable de piloter seul l’expression du gène rapporteur) et ubiquitaire. Le transposon s'insère fréquemment dans les régions régulatrices des gènes et se place ainsi sous leur contrôle. Dans ce cas, l'expression du transposon reflète celle du gène «hôte» et peut être suivie grâce au gène rapporteur. De plus, une telle insertion génère souvent une mutation. GENETIQUE INVERSE Le gène est cloné et sa séquence est connue. Pour déterminer la fonction de ce gène au cours du développement: - Inactivation du gène (réintroduction de ce gène, après modifications, dans le génome; RNAi…). - Expression ectopique (sur- et mis-expression). ARN ANTI-SENS Morpholinos: ARN anti-sens fabriqué en laboratoire. Ils peuvent boquer l’initiation de la traduction, modifier l’épissage du pré-ARNm (saut d’exons utiliser en thérapie) ou bloquer l’interaction d’autres ARNm avec des protéines ou des acides nucléiques. RNA-INTERFERENCE (RNAI) MECANISME D’ACTION DU RNAI L’ARN double brin est fragmenté en molécules de 21 à 23 nt par l’enzyme Dicer (enzyme de type RNaseIII). BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 13 Ces petits ARNdb (siRNA) sont ensuite assemblés dans un complexe contenant notamment une endoribonucléase : RISC (RNA-induced silencing complexes) Les ARNdb se dissocient en molécules simple brin pour former un complexe RISC actif, et guident le complexe protéique vers leurs homologues qui sont alors clivés. Ciblage de gènes: mutation par insertion et knock-out Gene knock-out à un tissu spécifique et / ou un moment particulier dans le développement est assuré par le système Cre-lox REDONDANCE Ex: différenciation du muscle strié en culture La perte de fonction du gène peut être masquée par une compensation due à l’activité d’un ou de plusieurs autres gènes dont les fonctions sont totalement ou partiellement redondantes avec celle du premier. L’augmentation de myf5 compense le manque de MyoD (par KO) car ils ont des structures très proches et sont exprimés au même moment. Avec une seule inactivation on ne voit pas de phénotype. Mais ce sont des souris élevées en cage, donc si elles étaient en plein air elles auraient peut être quelques problèmes. Par contre, si les souris sont double KO, elles auront une malformation des muscles. Systèmes permettant la sur- ou misexpression des gènes : expression du gène où normalement il ne s’exprime pas injection d’ARNm. SYSTEME UAS/GAL4 Mouche transgénique qui possède l’élément Pgal4 inséré aléatoirement dans le génome : si près d’un enhancer, il va contrôler son expression. Avec ce vecteur on peut cloner n’importe quel ADNc lignée effectrice UAS On réalise le croisement : Lignée pilote Gal4 (enhancer-trap) X Lignée effectrice UAS. Pour que le gène que l’on a cloné sous le contrôle des séquences UAS s’exprime, il faut que le facteur de transcription gal4 reconnaisse les UAS. (Système binaire) Gal4 est un facteur de transcription (issu de la levure) qui permet l'expression de gène en dehors de leur domaine d'expression par reconnaissance des sites UAS. On peut aussi remplacer LacZ/GFP par une toxine pour empêcher l'expression d'un gène et déterminer sa fonction. Sans gal4 : pas d’expression du gène X. Ce système permet de contrôler l’expression spatio-temporelle du gène X On a des centaines de lignées pilote différentes qui vont exprimer le facteur de transcription à des endroits et des moments différents car il sera inséré dans des endroits différents du génome donc sous le contrôle d’enhancers différents. BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 14 Pour voir où s’exprime Gal4 : hybridation in-situ immuno-fluorescence avec Ac anti-gal4 utilisation d’une lignée effectrice dans laquelle on a cloné le gène de la GFP en aval des UAS Les mouches qui n’auront pas le balanceur ont le bon génotype qui exprime RE-GAL4 et UAS-GFP pour que gal4 puisse activer les UAS et donc faire exprimer la GFP GENE-TRAP Contrairement à tout à l’heure, on n’attrape pas des enhancer mais des gènes grâce à de nouveau vecteur. On ne clone pas de gène en aval des séquences UAS. Cet élément P s’intègre de façon aléatoire dans le génome. EP X pilote gal4 active la transcription d’un gène qui se trouve à proximité du site d’insertion de l’élément P Lignée pilote Gal4 (enhanceur-trap expression de gal4 dans l’aile) X Lignées effectrices UAS On n’analyse pas une seule lignée EP. À chaque lignée, on étudie un gène différent. UAS-RNAI LES MICRO-ARN Les microARNs, mode de régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique. DECOUVERTE Découverte du gène lin-4 : 693 pb sauvent le phénotype mutant Problème: ces 693 pb ne codent pas pour une protéine. Mais ces 693 pb produisent 2 petits ARNs: - de 61 nucléotides forme une structure hairpin (épingle à cheveux). - de 22 nucléotides correspond aux 22 premiers nt de l’ARN de 61 nt. Délétion des régions complémentaires phénotype gain de fonction BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 15 de Lin-14 Augmentation de la protéine Lin-14 Augmentation de Lin-4 diminution des protéines Lin-14 sans modification de la quantité des mRNA lin-14 lin-4 régule l’expression de lin-14 post-transcriptionnellement, via des séquences complémentaires présentes dans le 3’UTR de lin-14 IDENTIFICATION microRNAs identifiés chez: - les animaux - les plantes - certains virus expriment des microRNAs (les virus à ADN) Estimation : 300 microRNAs chez les vertébrés. Les microRNAs représentent 1 à 5% des gènes d’un génome.Il est possible de les détecter par in situ hybridation : expression tissu-spécifique des microRNAs : Expression au cours du développement Par génétique - chez C .elegans: 1rs microRNAs, lin-4 et let-7 - chez la drosophile: bantam Peu de microRNAs identifiés lors de crible génétique à cause de leur petite taille Par clonage de petits ARNs Clonage des premiers microRNAs chez la drosophile et l’homme IDENTIFICATION DES CIBLES Prédiction: 200 gènes cibles par microRNAs. Tous les types de protéines sont représentés, pas un type prédominant. Dans 98% des cas, 1 site de fixation pour un microRNA par 3’UTR Plusieurs microRNAs peuvent en théorie se fixer sur un même 3’UTR. 30% des gènes seraient régulés par les microRNAs. FONCTIONS Expression différente des microRNAs et des gènes cibles : exclusion mutuelle microRNAs interviennent pour éviter une expression incorrecte de gènes 50% des gènes de microRNAs sont localisés dans des régions génomiques associées à des cancers Les microRNAs pourraient jouer un rôle important dans la pathologie de certains cancers humains : oncogènes et suppresseur de tumeurs. Les profils d’expression entre cellules normales et tumorales différents selon le type de tumeurs et le stade de la tumeur. ORIGINES DES AXES EMBRYONNAIRES CHEZ LA DROSOPHILE Chez la drosophile et d’autres arthropodes, l’établissement des axes A-P et D-V se produit graduellement pendant l’ovogenèse. La première rupture de symétrie est liée à la détermination et au positionnement du futur ovocyte dans le germarium (structure particulière des ovaires de la drosophile au sein de laquelle débute l’ovogenèse). Chaque paire d’ovaires est constituée de groupes d’ovarioles (une quinzaine), unités comprenant un germarium antérieur et un vitellarium dans lesquelles se déroule l’ovogenèse. Progression linéaire de la formation des chambres d’œufs (monocouches de cellules folliculaires qui entourent 16 cellules germinales dont 1 ovocyte et 15 cellules nourricières). BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 16 La cellule souche germinale subit une division asymétrique qui aboutit à la formation d’une cellule souche et d’un cytoblaste. Il s’en suit 4 divisions avec cytocinèse incomplète qui aboutit à la formation d’un cyste constitué de 16 cellules. Les 16 cellules se retrouvent reliées entre elles par 1 à 4 ponts cytoplasmiques, le futur ovocyte étant sélectionné parmi les 2 cellules dotées de 4ponts cytoplasmiques. Les 15 cellules restantes deviennent polyploïdes (endoréplications sans division) et nourricières: elles synthétisent des macromolécules, parmi lesquelles les ARNm déterminants comme Bicoid et Oskar, qui sont acheminés dans l’ovocyte à travers les ponts cytoplasmiques, les canaux annulaires. Les cellules folliculaires se forment du côté postérieur puis migrent jusqu’à englober l’ovocyte au stade 10. Ces cellules permettent la synthèse du chorion et de la membrane vitelline (les membranes les plus externes, la plus interne étant la membrane plasmique). Le chorion permet à l’embryon de respirer et lui confère une protection mécanique et la membrane vitelline permet de conserver un bon niveau d’humidité. Ensuite, ces cellules folliculaires dégénèrent. La mise en place des axes du développement dépend des contributions des quinze cellules nourricières qui forment un syncitium avec l’ovocyte et lui transfèrent des centres organisateurs du cytosquelette microtubulaire (MTOC), des protéines et des ARN ce qui augmente le volume de l’ovocyte. Ce dernier dispose alors de toutes les informations maternelles pour son développement. Ces transferts sont suivis d’échanges de signaux entre l’ovocyte et les cellules folliculaires qui l’entourent. ETABLISSEMENT DE L’AXE A-P Cet axe est défini dès le stade 1 car l’ovocyte est déjà au pôle postérieur. L’ovocyte exprime de façon polarisée les protéines de type PAR, et communique avec les cellules folliculaires postérieures. Cette communication s’effectue via la synthèse et la sécrétion d’un facteur de croissance de type EGF (epidermal growth factor), la protéine Gurken dont l’ARNm est collé au noyau de l’ovocyte. L’ovocyte émet un signal inductif qui est perçu par les cellules folliculaire qui sont les plus proches Signal = ligand = Gurken Récepteur = récepteur à l’EGF (Torpedo) à activité tyrosine kinase (équivalent du TGFα des vertébrés.) Ces récepteurs se trouvent sur la membrane apicale de toutes les cellules, mais seules celles qui sont à coté du lieu de production de Gruken auront leurs récepteurs activés. Les cellules folliculaires répondent (le signal est inconnu) à partir du stade 7 et les microtubules de l’ovocyte sont réorganisés : leur extrémité + se retrouve dans la région postérieure. La vésicule germinative (noyau de l’ovocyte) et les MTOC (extrémité -) se relocalisent vers le pôle antérieur, ce qui permet le positionnement des ARNm déterminants, provenant des cellules nourricières, aux pôles de l’ovocyte (Bicoid au pôle antérieur, Oskar et Nanos au pôle postérieur). Ces ARNm localisés grâce à l’action du cytosquelette définissent l’axe embryonnaire A-P bien avant la maturation de l’ovocyte et sa fécondation. NB : Les récepteurs à l’EGF ne sont actifs que sous forme de dimère. On sait aujourd’hui forcer la dimérisation en remplaçant le domaine extracellulaire par un domaine de dimérisation du phage lambda. ETABLISSEMENT DE L’AXE D-V Comme pour la mise en place de la polarité AP, la polarisation dorso-ventrale implique des signalisations réciproques entre l’ovocyte et les cellules folliculaires La polarisation dorso-ventrale de l’ovocyte et de ses enveloppes (coque) est coordonnée 1. De l’ovocyte aux cellules folliculaires: gurken (grk) torpedo (=egfr) (Les mutants ont un ovocyte et ses enveloppes ventralisés) 2. Des cellules folliculaires à l’ovocyte, signalisation ventrale: spatzle Toll (Les mutants ont une coque normale, un ovocyte dorsalisé) 3. Les facteurs zygotiques dorsalisants (dpp/sog) BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 17 LA REGION DORSALE Après la repolarisation des microtubules, Le noyau de l’ovocyte se déplace le long des microtubules, de l’arrière vers le bord de la partie antérieure. La protéine Gurken est sécrétée et spécifie les cellules folliculaires adjacentes (deuxième phase d’activation). Cette sécrétion localisée impose une identité dorsale aux cellules folliculaires voisines et une destinée ventrale aux cellules folliculaires opposées, et stimule la migration d’un groupe de cellules impliquées dans la formation du conduit (micropyle) qui permettra au spermatozoïde de féconder l’œuf. Les œufs pondus par des femelles mutantes grk ou egfr possèdent un 2ème micropyle, au pôle postérieur, à la place de l’aéropyle. Chez mutants grk et egfr, la détermination des CF post. Étant défectueuse, le signal retour n’a pas lieu: - Pas de repolarisation du réseau de microtubules - ARNm bicoid localisé aux pôles ant. et post. de l’ovocyte - ARNm oskar localisé au centre de l’oocyte De plus, le noyau de l’oocyte reste au pôle postérieur, ce qui entraîne une absence de différenciation des cellules folliculaires (CF) dorsales qui se différencient par défaut en CF ventrales. Ce défaut est facilement identifiable par l’absence de formation des appendices dorsaux du chorion. NB : gurken est transcrit par l’ovocyte et traduit localement; son récepteur est ubiquitaire Spitz est un autre ligand du récepteur EGFR. Lorsque sa concentration dépasse une certaine valeur seuil, il entraine la production d’une autre protéine : Argos. Cette dernière est un antagoniste de EGFR. Ensuite, la protéase Rhomboid clive Spitz. LA REGION VENTRALE Il existe 3 gènes qui ne s’expriment pas au niveau dorsal mais uniquement dans les CF ventrales : nudel, pipe et windbeutel. Ces trois protéines sont intégrées dans la membrane vitelline et permettent l’activation d’une cascade de protéases dans l’espace perivitellin. La production uniquement dorsale de gurken inhibe la synthèse de pipe au même endroit. Cette protéine ne sera donc produite que dans les CF ventrales. La cascade inclue les protéases snake et easter qui clivent le ligand Spätzle uniquement du côté ventral. Ce dernier se lie à son récepteur transmembranaire appelé Toll. Le récepteur Toll est présent de manière ubiquitaire sur la membrane de l’ovocyte. A ce moment, l’œuf a été fécondé et la division nucléaire a commencé. Cette interaction active des composants cytoplasmiques qui permettent de séparer deux protéines : cactus et dorsal. Cette dernière va alors pénétrer dans les noyaux au niveau ventral. Le gène dorsal est un morphogène maternel mais son arrivée dans le noyau provoque l’expression des gènes zygotiques. Il inhibe l’expression des gènes zen et ddp qui ne s’exprimeront donc que du côté dorsal mais il active la transcription des gènes twist et snail. Les cellules qui expriment twist deviendront les cellules du mésoderme qui s’invaginent lors de la gastrulation. Avant la fécondation, l’œuf possède : - des appendices dorsaux - un micropyle qui permet l’entrée du spermatozoïde - un opercule par lequel la larve pourra éclore avec 24h - un aéropyle du coté postérieur BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 18 Expression différentielle des gènes zygotiques grâce au gradient de concentration nucléaire du facteur de transcription dorsal. Au delà d’un seuil, sa concentration est la même dans l’ensemble de l’embryon ; c’est donc sa répartition intracellulaire (noyau ou cytoplasme) qui contrôle le développement. FONCTION DES GENES MATERNELS BICOID, NANOS ET TORSO DANS LA POLARITE A-P DE L'EMBRYON Système antérieur : Bicoid est un facteur de transcription qui active la transcription des gènes zygotiques en fonction de gradient de concentration dans la région antérieur de l’ovocyte. C’est par exemple le cas du gène hunchback (hb). L’activation est possible au dessus d’un certain seuil de concentration de la protéine (~55% de la longueur de l’œuf) Système postérieur : groupe de 9 gènes dont le but est de localiser l’ARNm de nanos (dans la partie postérieure de l’ovocyte) afin d’agir sur le contrôle de sa traduction. Il y a une délétion de l’abdomen si le gène nanos n’est pas exprimé correctement. Attention, nanos n’est pas un facteur de transcription mais il bloque la traduction du gène zygotique Hunchback (gène maternel au niveau postérieur) qui s’exprime de manière uniforme (sans gradient de concentration) dans l’œuf avant la fécondation mais le gradient se forme après la fécondation. Sept mutants (nanos, pumilo, oskar….) présentent une absence de segments abdominaux et de cellules polaires Seuls les mutants de nanos et de pumilo ont simplement une absence de segments abdominaux Système terminal : impliqué dans la mise en place de l’acron (au niveau antérieur) et du telson (postérieur). Gène torso code pour un récepteur tyrosine-kinase exprimé sur toute la surface de la membrane plasmique de l’œuf et nécessite la liaison avec le ligand torsolike pour s’activer. Torsolike est ensuite incorporé dans la membrane vitelline au niveau des 2 pôles donc le récepteur torso va être activé uniquement aux deux pôles et induire la cascade de signalisation Ras/Ran/Map kinase et ainsi permettre l’activation de gènes. Le mutant torso aura le même phénotype que le mutant torsolike. LA DETERMINATION DE LA METAMERISATION AU COURS DE LA SEGMENTATION ET DE LA GASTRULATION CHEZ LA DROSOPHILE La segmentation est contrôlée par des gènes zygotiques de segmentation, eux-mêmes contrôlés par des facteurs maternels responsables de la polarité antéro-postérieure de l’embryon. Des mutations dans ces gènes font perdre certains parasegments, certains segments ou certaines parties de segments. 4 générations de gènes s’expriment successivement pendant la segmentation et la gastrulation. BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 19 GENES ZYGOTIQUES GAP(8 CONNUS) hunchback, giant, Krüppel, knirps, tailless Ils s‘expriment au cours de la segmentation et sont régulés par des gènes à effet maternel. Ils déterminent la division de l’embryon en grandes régions réunissant plusieurs ébauches segmentaires. Leur mutation provoque la délétion de toute une région du corps. Par exemple, les 3 segments thoraciques et les 5 premiers abdominaux : A1-5, dans le cas du gène Krüppel. Ces gènes s’expriment selon des bancs perpendiculaires à l’axe A-P. S’ils sont mutés, il y aura un gros trou dans l’embryon. Par exemple, l’expression de hunchback est directement contrôlée par le morphogène antérieur bicoïd, d’où sa localisation que dans le tiers antérieur suivant un gradient de concentration. Le gène Krüppel est contrôlé par hunchback. La concentration de hunchback doit être comprise entre deux seuils pour avoir une expression en bande du gène Krüppel. Si un embryon est mutant pour bicoïd, il n’y aura plus de huchback zygotique mais il reste du huchback d’origine maternelle (de faible amplitude) suffisant pour atteindre le suil d’activation de Krüppel mais jamais le seuil de répression donc toute la partie antérieure exprime Krüppel. Il y a des inhibitions croisées entre les différents gènes gap car ce sont tous des facteurs de transcription. GENES PAIR-RULES(9 CONNUS) Ils s’expriment au stade blastoderme syncitial pendant le 13ème cycle de division et sont contrôlés par les gènes gap précédents. L’expression de ces gènes est périodique et régulière et subdivise les domaines plurisegmentaires des gènes gap en 14 parasegments embryonnaires (7 bandes perpendiculaires à l’axe A-P). La mutation de ces gènes conduit à l’absence d’un parasegment sur deux : les parasegments pairs dans les mutants even-skipped (eve), les parasegments impairs dans les mutants fushi tarazu (ftz) (révélés grâce à des anticorps sur la photo ci-contre) Dès que giant/kruppel augmente eve est inhibée. Il existe une séquence de régulation particulière différente pour chaque parasegment. Exemple : pour le parasegment 3 : entre -1550 et -1070pb avec plusieurs sites de fixation ce qui permet à différents facteurs de transcription d’agir sur ce parasegment. GENE DE POLARITE SEGMENTAIRE (8 CONNUS) Ils s‘expriment au stade blastoderme cellulaire puis au cours de la gastrulation. Leur expression est contrôlée par les gènes pair-rule. Elle est périodique et régulière comme celle des gènes pair-rule, mais elle n’intéresse qu’une partie d’un parasegment. Les mutants possèdent le nombre normal de segments, mais une partie de chaque segment est absente et la partie restante, toujours située en arrière de la partie normale, est ‘dupliquée’ et sa polarité inversée. Ces gènes vont agir dans l’environnement cellulaire : il y a donc une cellularisation de l’embryon qui passe d’un embryon syncicial à cellulaire. BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 20 Engrailed est le premier gène de polarité qui s’exprime dans la partie antérieure de chacun des parasegments (dans la rangée de cellules la plus antérieure). Il en est de même pour Hedgehog. Le gène wingless est à l’inverse dans la partie postérieure. Lorsque celui-ci est traduit, la protéine va être perçue par les récepteurs frizzled des cellules voisines. Le gène patched code pour le récepteur de hedgehog. L’expression de engrailed et wingless détermine une limite de restriction clonale entre antérieur et postérieur par des rétro-contrôles négatifs. De tels domaines de restriction clonale sont appelés des compartiments. La partie antérieure des denticules sur la cuticule tand is que la partie postérieure aura une cuticule nue. Les gènes de polarité segmentaire structurent les segments et stabilisent les frontières des segments et des parasegments Rappel : 1 segment = partie postérieure parasegment 1 + partie antérieure parasegment 2 Avant la métamorphose : formation de disques imaginaux par les cellules du blastoderme à cheval sur deux parasegments. Tous les organes adultes se divisent en deux compartiments antérieur et postérieur mais on ne peut pas déterminer morphologiquement la limite. Il est possible de muter des cellules et d’obtenir des clondes de cellules (générés chez l’embryon précoce). Ce clone ne sera que dans un seul des deux compartiements, jamais un clone ne sera à cheval sur les deux. GENES HOMEOTIQUES Gènes dont la mutation peut transformer un segment du corps en un autre segment (homéose) . Ils codent pour des facteurs de transcription. Appelés gènes Hox car ils possèdent une “homéobox” de 180 pb. Ils sont portés par un même chromosome et son organisés de la même façon chez tous les bilatéraux : ils suivent la règle de colinéarité qui reflète leur expression spatio-temporelle. Les différences entre les segments traduisent des différences dans l’expression des gènes Hox dans l’espace mais aussi dans le temps. Les caractères de chaque segment sont spécifiés par les gènes des complexes bithorax et antennapedia agissant de façon combinée afin d’induire l’identité segmentaire. BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 21 Le complexe bithorax réunit 3 gènes déterminant l’identité du 3ème segment thoracique et des 8 segments abdominaux. Parmi eux, le gène Ultrabithorax (Ubx) détermine l’identité du 3ème segment thoracique. Quand il ne s’exprime pas, ce segment, qui porte normalement une paire d’altères à la place des ailes forme un second segment thoracique portant une paire d’ailes, d’où une mouche à deux paires d’ailes. Le complexe antennapedia regroupe 5 gènes déterminant les segments céphaliques et les 2 premiers segments thoraciques. Parmi eux le gène antennapedia (Antp) détermine l’identité du deuxième segment thoracique caractérisé par une paire de patte. Dans le mutant antennapedia dominant, le gène s’exprime dans la tête aussi bien que dans le thorax et une paire de pattes se développe à la place des antennes dans le segment antennaire. Le mutant Antennapedia récessif n’exprime pas le gène dans le 2ème segment thoracique où une paire d’antennes apparait à la place d’une paire de pattes. Conclusions du travail sur les gènes homéotiques : 1. Il existe un ensemble de gènes dont la seule fonction est de programmer l'identité des différents segments de l'animal 2. Ces gènes sont hautement conservés entre vertébrés et insectes 3. Des changements héritables dans le déploiement de ces gènes sous-tendent l'évolution des morphologies Donc chez la drosophile, la détermination des axes et de la segmentation est le fait d’une cascade de gènes qui s’expriment progressivement dans le temps, interagissent entre eux et exercent par ailleurs un contrôle sur les gènes de la génération suivante. - Des gènes à effet maternel déterminent les axes antéro-postérieur et dorso-ventral et contrôlent les gènes zygotiques gap. - Des gènes gap interagissent entre eux pour déterminer des ensembles plurisegmentaires et contrôler l’expression des gènes pair-rule. - Les gènes pair-rule interagissent entre eux pour déterminer la segmentation de ces régions plurisegmentaires et contrôler les gènes de polarité segmentaire. 8 - Enfin les gènes gap et pair-rule interagissent pour contrôler les gènes homéotiques qui déterminent la structure de chaque segment. Remarque : Des gènes homologues aux gènes du développement ont été identifiés chez les insectes autres que la drosophile, chez des crustacés et des annélides (sangsue). Toutefois, leurs rôles semblent différents, car les modalités de mise en place de la métamérie divergent de celles observées chez la drosophile. BDA- Ghiglione (2010-2011) Page 22
