Quelle est actuellement la meilleure stratégie pour
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Actualité récente sur l’évaluation et la sélection des embryons : Quelle est actuellement la meilleure stratégie pour sélectionner le ou les embryons dans un laboratoire de PMA ? Vanderzwalmen P Chirec – Braine l’alleud - Cavell IVF unit Brussel Belgium Institut for Reproductive Medicine and Endocrinology, Bregenz, Austria GIGA-Research, Transgenic Platform, University of Liège, Liège, Belgium L´objectif final de l´exposé est de pouvoir répondre aux questions: Quel est à l´heure actuelle la meilleure stratégie pour sélectionner le ou les embryons de bonnes qualités ? Afin d´obtenir le plus rapidement une grossesse ? Et ne pas éliminer prématurément des embryons qui pourraient s´implanter ? Avec quelles méthodes et technologies pouvons nous atteindre cet objectif? Applicables dans nos activités de FIV Evaluation – sélection des embryons Un engouement croissant 1978 PU PU PU ? 2000 Une grossesse Nb embryons Transférés problèmes majeurs augmentent risques à la fois pour la mère et l’enfant, J2 – J3 – J5 aucune limite engendrent des coûts importants, socialement inacceptables par les parents But final d’une tentative de PMA Grossesse unique suivie d’une naissance d’un bébé en bonne santé Colloque d’étique et economie, 22 Janvier 2011 2000 Nouveau Challenge en AMP 2013 Réduction du nombre d´embryons à transférer PU PU ? ? ? DET Réduction du taux de grossesses multiples Naissance Unique SET Transfert UN embryon Quels sont les Challenges si introduction du SET « You can put back as many embryos as you like, but one at a time » (Carl Nygren, Sweden) Maintenir les chances de grossesses (cumulatives) pour les couples Rêve ou réalité? Tf frais + Tf cryo + Tf cryo SET UNE Ponction ovocytaire un bébé un bébé un bébé Quels sont les Challenges si introduction du SET Maintenir les chances de grossesses (cumulatives) pour les couples Obtenir et sélectionner les meilleurs gamètes Produire des embryons de qualités parfaites Sélectionner les meilleurs embryons Recherche de marqueurs (morphologiques, cinétiques, moléculaires, génétiques) reflétant la qualité embryonnaire Transférer au bon moment Programme de cryopréservation efficace METHODES D´EVALUATION DE LA QUALITE EMBRYONNAIRE A quelles conditions doit répondre une méthode de sélection dite „ideale“ Non invasive Résultats crédibles: prédiction élevée pour l´obtention de blastocystes, (20 % de centres avec culture J5) d´une grossesse, d´une naissance Applicable en routine Résultats rapides Facile d´application Reproductible Equipement simple Prix abordable Pas de problème d´orde éthique Application: dans quelques centres – recherche Expérimentale Doit encore faire ses preuves Méthodes d´évaluation et de sélection des gamètes et embryons Observation morphologique ponctuelle Observation morpho-cinétique continue Analyse métabolique Diagnostique Génétique OMICS diagnostique moléculaire OMICS Marqueurs Biochimiques Génétique transcriptOMICS proteOMICS metabolOMICS Une nouvelle approche non invasive : - pour déterminer des bio-marqueurs de la qualité ovocytaire ou embryonnaire par analyse de leur environnement (milieux de culture, fluide folliculaire) ou d´une population cellulaire (cellule du cumulus) - permet de comprendre les mécanismes impliqués dans le développement embryonnaire précoce. - définir le potentiel de développement Métabolomique et marqueurs Biochimiques Approche Non invasive PRODUCTION UPTAKE CO2 Pyruvate Lactate Lactate Amino Acids + Glucose NH4 Lipid Enzymes Amino Acids Culture medium Cytokines Technique pas validée Proteins Oxygen Other factors Pyruvate MicroGlucose fluorométrie Lactate 3AA / Gross O2 02 micro- sensor Hormones AA HPLC Recherche - Expérimentale NH3 Near spectro IR sHLA-G ELISA BIOPSY Embryo Diagnostics: PGS Blastomeres Vitrification du blasto: resulats 24h OBSERVATION DE LA MORPHOLOGIE DES EMBRYONS Méthode standard et la plus répandue d´évaluation de la qualité embryonnaire QUALITE EMBRYONNAIRE CRITERES MORPHOLOGIQUES DE J1 A J3 70 – 80% des centres de FIV OBSERVATION: PONCTUELLE – STATIQUE - SEQUENTIELLE IN VITRO CULTURE OOCYTE Early Cleavage Zygote quality & pronuclear morphology Multinucleation Day 2 embryo cell number and 0 17-20 25-26 42-44 Day 3 embryo morphological appearance 66-70 Marqueurs de la qualité embryonnaire de J1 à J3 J1 Score PN Pronoyaux Nucléoles J2 Clivage précoce (Nb- taille, position) Halo Position GP 16-18 h 26h Nb blastomères Taille Fragmentation multinucleation J3 Nb blastomères Taille Fragmentation multinucleation Marqueurs de la qualité embryonnaire de J1 à J3 J1 Score PN Pronoyaux Nucléoles J2 Clivage précoce (Nb- taille, position) Halo Position GP 16-18 h 26h Nb blastomères Taille Fragmentation multinucleation J3 Nb blastomères Taille Fragmentation multinucleation Snapshot observations at different Key developmental points to day 3 Good scoring zygotes: PN symetric, NPBs of equal number, angle B < 50° (17 –20h) • the embryos that cleave faster (Tesarik-Greco 1999, Balaban 2001) • less blastomere multinucleation (Tesarik-Greco 1999) • have better cleavage stage morphology (Tesarik-Greco 1999, Wittemer 2000, Scott 2000-2003, Balaban 2001) • reach the blastocyst stage more often (Scott 2000-2003, Balaban 2001) • give rise to better quality and hatching blastocysts (Scott 2000-2003) • higher pregnancy rate (Ludwig 2000, Lundqvist 2000) • reduced chromosomal abnormalities (Kahraman 2002, Gianaroli 2003) 2 cells stage at 25-26 h High rate of good quality 4cell , 7cell embryos (Sakkas 1998, Isiklar 2002) high rate of blastocyst (Isiklar 2002) high pregnancy rate (Shoukir 1997 con IVF, Sakkas 1998 ICSI, Platteau 1999,Isiklar 2002, Salumets 2003 ) after elective single embryo transfer on day 2 a higher implantation rate (Salumets 2003, Giorgetti 2007) 4-5 cells < 20% fragemtation at 42-44h, 6-8 cells < 20% fragemtation at 66-68h + Absence of multinucleation •higher implantation (Giorgetti 1995, Ziebe 1997, Gerris 1997, Van Royen, 1999,2001) compaction: increase implantation potential (Skiadas 2006) Observations morphologiques entre J1 et J3: Probabilité de formation de blastocystes ?? Quels sont ceux qui vont se devenir des blastocystes ? Lesquels vont s´implanter ? J3 (Rijnders 1998, Milki 2002, Racowsky. 2000 , Guerif. 2007) Observations morphologiques entre J1 et J3: Probabilité de formation de blastocystes ? Pouvons nous juger de la qualité des ces voitures par l´aspect extérieur ? Observations morphologiques entre J1 et J3: Probabilité de formation de blastocystes ? Pouvons nous juger de la qualité des ces voitures par l´aspect extérieur ? Parmi: • une cohorte de zygotes avec un bon score, • une cohorte d’embryon avec clivage précoce • avec des critères morphologiques normaux (TOP) à J2 ou J3, Il est impossible de prédire avec exactitude lequel va poursuivre son développement au moins jusqu’au stade de blastocyste. ?? 50 % J3 J5 (Rijnders 1998, Milki 2002, Racowsky. 2000 , Guerif. 2007) Selection et Transfert électif d´UN embryon (eSET) à J2 ou J3 : Affecte négativement les taux de grossesses Transfert UN (électif) DEUX Grossesses 31 % 47 % Jumeaux 0.6 % 35 % P<0.01 •Bergh HR 2005 (analyse 4 prospective randomized studies) •Lukassen HR 2005 (Total: 5 prospective randomized studies) The likelihood of live birth and multiple birth after single versus double embryo transfer at the cleavage stage: a systematic review and meta-analysis. Elective-SET of embryos at the cleavage stage reduces the likelihood of live birth by 38% multiple birth by 94%. Gelbaya T Fertil Steril. 2010 eSET à J2 et J3: réduction du taux de grossesses !!! Un des objectifs souhaité lors de l´introduction du transfert d´un embryon était de maintenir les chances de grossesses, or celui-ci n´est pas atteint. Les raisons? Sélection pré-transcription génomique: trop précoces ? Chromatin decondensation Immaturity PATERNAL EFFECT DNA fragmentation Aneuploïdies Epigenetic and Genetic factors eSET à J2 et J3: réduction du taux de grossesses !!! Un des objectifs souhaité lors de l´introduction du transfert d´un embryon était de maintenir les chances de grossesses, or celui-ci n´est pas atteint. Les raisons? Sélection pré-transcription génomique: trop précoces ? Culture optimale ? Approche non invasive !!!!! eSET à J2 et J3: réduction du taux de grossesses !!! Journée porte ouverte Stress: pH – T° eSET à J2 et J3: réduction du taux de grossesses !!! Un des objectifs souhaité lors de l´introduction du transfert d´un embryon était de maintenir les chances de grossesses, or celui-ci n´est pas atteint. Les raisons? Sélection pré-transcription génomique: trop précoces ? Culture optimale ? Approche non invasive !!!!!! Critères morphologiques de sélection pas assez appropriés? Sont ils assez prédictifs pour prévoir le développement futur (au moins jusqu´au stade blastocyste) eSET à J2 et J3: réduction du taux de grossesses !!! Le biologiste: un spectateur impuissant des mystères de son incubateur D0 ? 0 D1 ? ? 24h ET 2 ? ET 3 ? ? 48h ? 72h ? 96h Observations de J0 à J3 entre 7h00 et 18h00 !!!!!!!!!!! 0 24h 48h Mon espoir l´analyse cinématographique Stress: pH – T° des gamètes et embryons 72h 96h Observation morpho-cinétique en continu par captation d´images en temps réel entre J0 et J3 Time lapse Comment devons-nous considérer l´introduction de la (Timelapse) dans nos activités de PMA ? Comme un incubateur performant? Prix abordable Excellent incubaeur Culture en groupe Comment devons-nous considérer l´introduction de la (Timelapse) dans nos activités de PMA ? Comme un outil didactique et une technologie nous permettant : D´observer en continu la morphologique et la cinétique au cours du développement embryonnaire ? Que pouvons-nous observer ? Observation DYNAMIQUE de la MORPHOLOGIE Résorbtion de fragments Division anormale 1 cell directement en 3 cellules Meseguer Time lapse: • Cinétique – Moment de l´apparition des 2PN – Moment de la Syngamie – Moments des divisons cellulaires – Divisons cellulaires • Durée des karyocinèse • Durée des cycles de divisions – Observation de Synchronisité des divisions Moment de l´apparition des 2PN Moment de la Syngamie T0 ICSI- IMSI tF Apparition des 2 PN ~ 8.5 h tC dernière observation des 2PN ~ 23 – 25 h Chamayou J Assist Reprod Genet 2013 Moments des divisons cellulaires Meseguer Comment devons-nous considérer l´introduction de la (Timelapse) dans nos activités de PMA ? Comme étant la solution nous permettant de sélectionner le ou les embryons en fonction d´un algorithme standard établit suivant des critères morphologiques et cinétiques au cours du développement embryonnaire ? Ellaboration d´un algorithme ? 100 % de prédiction ? “…. these studies suggest that time-lapse monitoring may provide new dynamic markers of embryo competence” ….. Kirkegaard et al., 2012, J Assist Reprod Genet CC2 36 hours Wong C 2010 Nature Biotechnology Critères cinétiques analysés t1 t2 t3 cc1 s2 cc2 t5 cc3 Time parameters t6 s3 t4 cc3 t7 t8 cc4 Morphological parameters t3 t5 CC2 (t3 –t2) Meseguer Literature concerning time lapse (early stage selection criteria) Que peut on analyser? Morphologie Cinétique algorithme Time lapse Valeur prédictive ? Sélection J2 J3 Meseguer Meseguer Meseguer Meseguer Literature concerning time lapse (early stage selection criteria) Conclusions ? Difficulté d´établir un algorithme standard Observation et sélection embryonnaire à J3 avec le time lapse: Pas encore d´algorithme permettant de sélectionner les embryons en fonctions de paramètres morpho-cinétique Prédiction de blastocystes Wong 2011 EEVA cell tracking 85 % J2 Conaghan 2013 EEVA + morpho day 3 Meseguer 2010 durée cytokinèse 1 PPV 70% Temps entre mitose 2 et 3 J3 Embryoscope t3 – t2 t3 Temps de division OBJECTIF: 100 % de sélectionner un blastocyste 65 % t5 Sélection entre jour 1 et 3: pronostic limité Observation morphologique ponctuelle Probabilité de sélectionner des futurs blastocystes 50% Observation morpho-cinétique continue 65 – 85 % option: culture jusque J5 ou J6 ARN Contribution MATERNEL et EMBRYONNAIRE au développement 100 80 % 60 35 Transcrits Maternels Transcrits Embryonnaires 30 Classification des blastocystes Early blastocyst: FBl blastocoel < half the volume of the embryo Full blastocyst: 2 -3 blastocoel Completely fills the embryo Expanded blastocyst: 4 blastocoel volume is now larger than that of the early embryo and the zona is thinning Hatching: 5 Hatched : 6 SET on day 2– 3 vs day 5 ( prospectives studies) Nb Cycles Zech (< 35y) TOP Non TOP Deliveries J3 J5 J3 J5 99 128 24% 36% P< 0.05 87% 60% 25% 41% P< 0.05 13% 40% 9% 21% P< 0.05 176 175 24% 37% P< 0.03 FS 2007 Papanikolaou NEJM 2006 Comment devons-nous considérer l´introduction de la (Timelapse) dans nos activités de PMA ? Comme un outil didactique et une technologie nous permettant : La compréhension du développement embryonnaire, (compaction, formation du blastocyste, expansion – collapsing) VOLUME boy Behavior of blastocyst development: Expansion contraction phases of blastocysts VOLUME boy VOLUME boy VOLUME girl VOLUME girl Vdzwalmen Zech IVF center Austria Comment devons-nous considérer l´introduction de la (Timelapse) dans nos activités de PMA ? Comme un outil didactique et une technologie nous permettant : Analyse rétrospective du développement De réaliser que trop d´embryons ne satisfaisant pas aux critères morpho-cinétiques à J3 sont éliminés à tort. Meseguer Case 1 (38 Years – attempt 1) Abnormalities Multinucleation at 2cell stage in 1 blastomere (Fig 1a) High degree of fragmentation Quality of transferred blastocyst 5BB (Fig 1b) deliveries female (52cm, 2960g) 3BC (Fig 1d) female (51cm, 2650g) Morphokinetics long t5=58,4 h (Fig 1c) Fig 1a Fig 1 b Zech IVF center, Stecher, Austria Fig 1 d Case 8 (34 year – attempt 2) Abnormalities Quality of transferred blastocyst Direct cleavage from 1 to 3 cell 4BC (Fig 8e) embryo (Fig8 a-c) High degree of fragmentation(Fig d) deliveries female (51cm, 3000g) Uneven blastomeres at 8 cell stage Fig 1 d Zech IVF center, Stecher, Austria Case 9 (35 year – attempt 2) Abnormalities Quality of transferred blastocyst deliveries divisions back and forward to a 2 cell embryo (Fig 9 a-d) 4BC (Fig 9g) male (53cm, 3605g) Blastocyst formation: 2 blastomeres were not incorporated in the blastocyst (Fig 9f) Zech IVF center, Stecher, Austria Comment devons-nous considérer l´introduction de la (Timelapse) dans nos activités de PMA ? Comme un outil didactique et une technologie nous permettant : D´observer un effet paternel Meseguer % of TOP quality blastocysts in relation to the kinetics parameters of embryo development and the type of spermatozoa % TOP Blastocysts P < 0.05 Morpho cinétique Comment devons-nous considérer l´introduction de la (Timelapse) dans nos activités de PMA ? Comme un outil didactique et une technologie nous permettant : Analyse rétrospective du développement pour sélectionner parmis une cohorte d´embryons de qualités morphologiques identiques ceux qui ont un potentiel plus élevés de développement. Which one to select ? Chamayou J Assist Reprod Genet 2013 Can predict which viable blastocyst will implant and produce a viable pregnancy after day 5 transfers (implantation-morphokinetic parameters, IMP-MKP) Fail to implant Cc3 t5 – t3 implant The morphokinetic parameter that was found to be significantly associated with implantation was the cc3. CC3 value of competent day 5 embryo to implant (Green) embryos that fail to implant if transferred on day 5 (Orange). + blasto naissance - Blasto pas de naissance Jour 3 Devenir des embryons qui ne satisfont pas aux critères morphocinétiques ???? Jour 5 algorithme Critères Morphocinétique Taux de blasto 65-85 % normaux I R 33% SELECTION ET TRANSFERT AU JOUR 3 I R > 40 % Si Top blasto CULTURE, SELECTION ET TRANSFERT AU JOUR 5 Jour 3 Devenir des embryons qui ne satisfont pas aux critères morphocinétiques ???? Jour 5 algorithme Critères Morphocinétique Taux de blasto 65-85 % normaux I R 33% SELECTION ET TRANSFERT AU JOUR 3 Message final Conclusions: Arguments en faveur du jour 5 Oui, il y a une place pour la culture au cinquième jour et le transfert d’un seul blastocyste Meilleure synchronisation physiologique de l ’embryon et de l ’utérus. Contractions utérine réduites Outil diagnostique permettant de Mieux déterminer la cause de l’infertilité S‘assurer de la qualité du laboratoire Meilleure sélection réduction du nombre d’embryons transférés augmentation de taux d ‘implantation Implantation supérieure à J2 ou J3 Survie acceptable après vitrification (grossesse cumulative) Actuellement aucun marqueur prédictif à plus de 70% de l´obtention de blastocyste (applicable dans un labo de routine). Conclusions du time lapse en 2013 • L´embryoscope est un outi intéressant pour la détection de points ou moments clés lors du développement embryonnaire. • Observation et sélection embryonnaire à J1 à J5 Conclusions du time lapse en 2013 • Outil qui permet d´observer, de comprendre, mais pas de sélectionner en fonction d´une règle bien établie. – Pas encoore d´algorithme permettant de sélectionner les embryons en fonctions de paramètres morpho-cinétique – Algorithme à définir en fonction: • Milieux de culture • Conditions du laboratoire (incubateur – gaz) • Stimulation, …… Conclusions du time lapse en 2013 • Jette à J3 trop d´embryons avec un potentiel implantatoire, car prédiction de max. 70% • Laissez les surnuméraires en culture jusque J5 • Permet d´observer l´effet paternel • Permet de comprendre le phénomène déxpansion et contraction des blastocystes • Analyse rétrospective à J5 • Bon incubateur, réduit le stress T° et pH. Méthodes non invasives d´évaluation et de sélection des ovocytes et embryons Morphologie Glucose AA O2 sHLA-G Métabolomique Applicables en routine Microscopie Classique Polarisée Omics CC ++++++ +++ non Valeurs prédictives élevées pour l´obtention de blastocystes, + + + (?) (?) (?) + ++ + (?) Résultats rapides +++++ +++++ ? + Facile d´emploi Reproductible inter-opérateur Equipement simple Prix abordable +++++ +++ +++++ +++++ ++ +++ +++ ++ ? ? non non ? + non non devel devel non si culture J2 – J3 d´une grossesse, Application: rare– développement Non – invasive oui oui oui/non oui CONCLUSIONS • Lorsque les techniques seront standardisées, la quantification noninvasive des secrétomes embryonnaires présents dans les milieux de culture en synergie avec l´analyse morphologique et dynamique de l´embryon devrait être une voie prometteuse afin d´optimiser la sélection du bon embryon pour le transfert unique. CHIREC, Belgium Lejeune, Delval , Imbert , Puissant , Greindel , Vanderzwalmen , Van Damme, Uranga , GIGA-Research, Transgenic Platform, University of Liège, Belgium Ectors , Grobet IVF Zentren Prof. Zech Römerstrasse 2 6900 Bregenz, Österreich Telefon: +43/5574/44 836 E-Mail: [email protected] Internet: www.ivf.at Bach, Baramsai, Neyer, Stecher, Wirleitner, Zints, Zech, Scherda Méthodes non invasives d´évaluation et de sélection des ovocytes et embryons Morphologie Glucose AA O2 sHLA-G Métabolomique Applicables en routine Microscopie Classique time lapse ++++++ +++ Valeurs prédictives élevées pour l´obtention de blastocystes, + + + (?) (?) (?) + + (?) (?) Résultats rapides +++++ +++++ (?) + Facile d´emploi Reproductible inter-opérateur Equipement simple Prix abordable +++++ +++ +++++ ++ ++++ ? ++ non non + non non Application: routine en aug. Exp/dev Exp/dev Omics CC non non si culture J2 – J3 d´une grossesse, Non – invasive oui oui oui/non non + non oui CONCLUSIONS • L´embryoscope est un outi intéressant pour le détection de points ou moments clés lors du développement embryonnaire. • En pratique, si les gamètes ou embryons satisfont aux critéres morphologiques mais non aux profils „omics“ ou biochimiques, vont ils être éliminés ? • Actuellement, la sélection des spermatozoïdes (IMSI) associée avec la culture prolongée au stade de blastocyste est la meilleure stratégie afin de garantir le succès dans un programme de transfert d´un embryon unique.
